HU216316B - Eljárás véralvadási faktorok aktiválására - Google Patents

Abstract

A találmány véralvadási faktőrők tripszinnel való aktiválását szőlgálóeljárásra vőnatkőzik. Az eljárás szerint a véralvadási faktőrtprőtrőmbinkőmplex-tartalmú frakcióból izőlálják, amely t ezűtán vízbenőldhatatlan hőrdőzón immőbilizált tripszinnel kezelnek. A véralvadásifaktőr aktiválása űtán az immőbilizált tripszint leválasztják. ŕ

Description

A találmány véralvadási faktorok tripszinnel való aktiválására szolgáló eljárásra vonatkozik, valamint ezen eljárásnak trombin előállítására való alkalmazására.

A véralvadás egymást követő reakciók sorozatán keresztül megy végbe, amelyekben véralvadási faktorok aktiválódnak, és ezek újrakatalizálják a következő reakciókat. Végül az aktivált protrombinnak a fibrinogénre gyakorolt hatása következtében fibrin képződik. A véralvadási faktorok aktiválódása általában egy zimogén proteolízise révén megy végbe, amikor is proteolitikusan hatékony enzim keletkezik.

Ez az aktiválódási reakció részleteiben még nem ismert, ezért a véralvadási faktorok in vitro aktiválása nehezen ellenőrizhető. A protrombinnak trombinná való átalakulása például egyedül a Xa faktor és kalcium hatására nagyon nehezen következik be, és csak akkor megy végbe optimálisan, ha egy több faktorból álló komplex (protrombinázkomplex) szintén jelen van. A Xa faktoron kívül ehhez a komplexhez tartozik az V faktor, bizonyos foszfolipidek és a kalcium. A Xa faktor proteolitikusan hasítja a protrombinmolekulát (molekulatömeg: 68000 D) és így keletkezik az aktív trombinenzim (molekulatömeg: 30 000 D).

A plazmaproteáz trombin egy többfunkciós enzim, amely az alvadásra nemcsak úgy hat, hogy a fibrinogént fibrinné hasítja, hanem úgy is, hogy az V, VIII és XIII faktorokat is aktiválja, és saját proenzimét (protrombin) is hasítja. A terápiában a trombint magában vagy fíbrinogénnel együtt vérzések csillapítására vagy a sebészetben szövetragasztásra alkalmazzák.

A protrombin aktiválását, amely a protrombinázkomplex segítségével megy végbe, ex situ nehéz utánozni, ezért kísérleteket végeznek abból a célból, hogy emberi vagy állati eredetű proteázok segítségével trombint állítsanak elő.

A protrombinnak marha Xa faktorral vagy marhatripszinnel való aktiválására irányuló kísérletek azt mutatták, hogy a tripszines aktiválás ugyanolyan fiziológiai köztitermékeken keresztül fut le, mint a Xa faktorral végzett aktiválás esetén. A kitermelés azonban maximum 50%-os, minthogy a tripszin esetében a proteolízis továbbmegy, ami a trombin lebomlásához, illetve alacsony molekulatömegű termékek keletkezéséhez vezet [Kisiel és Hanahan, Biochim. Biophys. Acta, 329, 221-232.(1973)].

A trombinkitermelés adalékanyagok - ilyen a szérumalbumin vagy a glicerin magas koncentrációkban - hozzáadásával javítható [Landaburu et al., Am. J. Physiol., 201, 298-302. (1961.)]. Mindenesetre az aktiválási reakció után a terméket gondosan meg kell tisztítani a tripszintől és a különböző adalékanyagoktól, mielőtt biológiailag elviselhető készítménnyé dolgozzák fel.

A tripszin eltávolítását a reakcióelegyből lényegesen megkönnyítené immobilizált enzim alkalmazása. Immobilizált tripszin alkalmazása protrombin aktiválására azonban eddig lehetetlennek tűnt. Kísérletek azt mutatták, hogy citrátplazmában a protrombinnak trombinná való aktiválásához, ellentétben az oldható tripszinnel, az immobilizált tripszin nem alkalmas [Zubairov és Zinkevics, Vosprosy meditsinkskoi khimii, 22, 187-191. (1976.)].

A találmánynak az a feladata, hogy a véralvadási faktorok aktiválására olyan egyszerű eljárást bocsásson rendelkezésre, amely lehetővé teszi, hogy nagy kitermeléssel jussunk aktivált enzimekhez anélkül, hogy költséges tisztítási lépéseket kellene alkalmazni az aktiválási reakció után.

Ezt a feladatot a találmány szerint olyan eljárással oldjuk meg, amely szerint a véralvadási faktorokat tripszinnel aktiváljuk. Az eljárás szerint a protrombinkomplex-tartalmú frakcióból nyert véralvadási faktort vízben oldhatatlan hordozón immobilizált tripszinnel kezeljük, és az immobilizált tripszint a véralvadási faktor aktiválása után leválasztjuk. Vízben oldhatatlan hordozóként cellulózt, dextránokat, agarózt, akrilátokat vagy szilikátokat alkalmazunk.

Az eljárás különösen a következő véralvadási faktorok aktiválására alkalmas: protrombin, IX faktor és X faktor.

A találmány egy előnyös kiviteli alakja szerint a protrombin, vagy a IX faktor, vagy a X faktor aktiválását 5,8-7,9 pH-tartományban végezzük 5-25 mS vezetőképesség és 2-45 °C hőmérséklet mellett.

A találmány szerinti eljárás különösen alkalmas a trombinnak protrombinból való előállítására. Egy tisztított protrombint tartalmazó frakció ellenőrzött kezelése immobilizált tripszinnel magába foglalja a tripszin gyors és teljes eltávolítását egy előre meghatározott kezelési időtartam után. A termék így lényegében nem tartalmaz bomlásterméket. A szokásos stabilizátorok így 50% glicerin - hozzáadásától is el lehet tekinteni. A trombint tartalmazó frakciót a szokásos módon lehet gyógyszerkészítménnyé feldolgozni.

Egy véralvadási faktorból az aktivált enzimet úgy állítjuk elő, hogy vagy a tisztított véralvadási faktort aktiváljuk, vagy a véralvadásifaktor-komplexet, amikor is ez utóbbi esetben az aktivált enzimet előnyös módon tovább tisztítjuk. A trombint szintén vagy a tisztított protrombin, vagy a protrombinkomplex aktiválása révén kaphatjuk meg.

A találmány további előnyét jelenti, hogy a véralvadási faktor aktiválásával egyidejűleg a vírusaktivitás jelentősen csökken, amennyiben olyan kiindulási anyagot használunk, amely vírussal fertőzött poolból származik.

A véralvadási faktort tartalmazó frakcióban lévő immobilizált tripszin vírusinaktiváló hatása meglepő volt. A szaporodásra képes, szűrhető kórokozók inaktiválására alkalmazott kezelés immobilizált neutrális hidrolázokkal eddig csak immunglobulin-6-tartalmú frakciók esetében volt ismert (EP-A-0 247 998).

A találmány szerinti eljárás keretében természetesen további műveleteket is végezhetünk az adott esetben jelen lévő fertőző anyagok inaktiválására. így például a benedvesített, liofilizált kiindulási anyagot gőzzel hőkezelhetjük.

Az alábbi példákkal részletesebben ismertetjük a találmányt, anélkül azonban, hogy a példák a találmány oltalmi körét korlátoznák.

HU 216 316 Β

7. példa

Tripszin immobilizálása

1,2 g tripszint (Type III, Sigma, cikkszám: T 8253) 350 ml (100 g por) bróm-ciánnal aktivált Sepharose 4B-hez (Pharmacia) kötünk, az előállító cég előírásai szerint.

2. példa

Protrombin aktiválása protrombinkomplex-tartalmú frakcióban

Brummelhuis ismert eljárása [J. M. Curling: „Methods of Plasma Fractionation”, Acad. Press (1980.)] szerint 50 liter krioprecipitátum-szegény, emberi vérplazmából anioncserélőre való adszorbeálással, protrombinkomplexet izolálunk. A protrombintartalmú frakció sókoncentrációját diaszűréssel 150 mM nátrium-klorid-tartalomra csökkentjük, és a terméket liofilizáljuk.

Abból a célból, hogy az esetleg jelen lévő kórokozókat inaktiváljuk, ezt a frakciót az AT-B-385.657 számú szabadalmi leírás szerint, vízgőz jelenlétében 10 órán át 60 °C-on, és 1 órán át 80 °C-on melegítjük.

A felmelegített port oly módon oldjuk fel, hogy az oldat ml-enként 25 egység (E) protrombint tartalmazzon (proteinkoncentráció: 12 mg/ml), majd 1 ml Sepharose-on immobilizált tripszinnel, lassú keverés mellett, 150 percig 25 °C-on kezeljük. A kezelés után 1980 E/ml trombinaktivitást és 165 E/mg protein specifikus aktivitást kaptunk.

3. példa

A 2. példában kapott trombin további tisztítása

A 2. példa szerint előállított trombint a továbbiakban egy 45 ml-es S-Sepharose oszlopon (Pharmacia) a következőképpen tisztítjuk. Az oszlopot 25 mmólos trinátrium-citrát-oldattal (pH=6,2) hozzuk egyensúlyba. A trombint (105 000 E 25 mM trinátrium-citrátban) az S-Sepharose oszlopra kötjük, az oszlopot azonos pufferrel mossuk, majd 150 ml 450 mmólos nátriumklorid-oldattal eluáljuk.

A trombinkihozatal több, mint 94%-os, a specifikus aktivitás 1735 E/mg protein volt. A kapott trombint g/1 nátrium-klorid és 5 g/1 glicin jelenlétében liofilizáltuk, és így stabil készítményhez jutottunk.

4. példa

Tisztított protrombin aktiválása

A 2. példa szerinti eljárással gőzzel kezelt protrombinkomplexet állítunk elő a plazmából.

A vírusinaktivált termék a protrombin mellett még IX és X faktort tartalmaz. Szulfátos Sephadex G50 oszlopon (Pharmacia) való kromatográfiás elválasztással [Miletich et al., Analyt. Biochem., 705, 304-310. (1980.)] a IX és X faktort elválasztjuk a protrombintól. A tisztított protrombint a 2. példa szerint trombinná aktiváltuk, s így 745 E/mg protein specifikus aktivitást kaptunk.

5. példa

A 4. példa szerint előállított trombin további tisztítása

110 000 E 4. példa szerint előállított trombint 45 mles S-Sepharose oszlopon tovább tisztítottunk. Tisztítás után a kapott trombin specifikus aktivitása 3240 E/mg protein volt.

Claims (4)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás véralvadási faktorok tripszinnel való aktiválására, azzal jellemezve, hogy a véralvadási faktort protrombinkomplex-tartalmú frakcióból izoláljuk, majd vízben oldhatatlan hordozón immobilizált tripszinnel kezeljük, és a véralvadási faktor aktiválása után az immobilizált tripszint leválasztjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a véralvadási faktor vagy protrombin, vagy IX faktor, vagy X faktor.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protrombin, IX faktor vagy X faktor aktiválását 5,8-7,9 pH-tartományban, 5-25 mS vezetőképesség mellett, 2-45 °C hőmérsékleten végezzük.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás alkalmazása trombinnak protrombinból való előállítására.