KR20200139154A - 리포 단백 콜레스테롤의 정량 방법, 정량 시약, 및 정량 키트 - Google Patents
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Abstract
피검 시료 중의 리포 단백 콜레스테롤을 보다 정확하게 정량할 수 있는 방법, 이 방법에 사용되는 정량 시약, 및 정량 키트를 제공한다. 본 발명은 리포 단백을 포함하는 피검 시료 중의 리포 단백 콜레스테롤을 소망에 의해 정량 시약을 사용해서 정량하는 리포 단백 콜레스테롤의 정량 방법이며, 상기 피검 시료 중 또는 상기 정량 시약 중에 인지질을 첨가하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 사용되는 리포 단백 중의 콜레스테롤의 정량 시약으로서, 인지질을 함유하는 정량 시약이다. 또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 사용되는 리포 단백 콜레스테롤의 정량 키트로서, 인지질을 포함하는 정량 키트이다.
Description
본 발명은 리포 단백 중의 콜레스테롤의 정량 방법, 정량 시약, 및 정량 키트에 관한 것이다.
혈액 중에 포함되는 리포 단백은 초원심 분리에 의한 밀도의 상위함으로부터 카일로미크론, 초저밀도 리포 단백(이하, VLDL이라고 부르는 경우가 있다), 중간 밀도 리포 단백(이하, IDL이라고 부르는 경우가 있다), 저밀도 리포 단백(이하, LDL이라고 부르는 경우가 있다), 고밀도 리포 단백(이하, HDL이라고 부르는 경우가 있다)으로 나누어진다. 최근에는 이들 리포 단백은 비중이나 크기에 따라 더 세분화되어 있으며, 예를 들면 LDL 중에서 소형이며, 고밀도인 것으로서 소립자 저밀도 리포 단백(이하, small, dense LDL 또는 sdLDL이라고 부르는 경우가 있다) 등이 있다. 이들 리포 단백은 트리글리세리드나 콜레스테롤 등의 지질이나 단백 등의 함유량이 상위해 있으며, 각각 생체 내에서 상이한 작용을 나타내는 것이 알려져 있다.
현재까지 알려져 있는 리포 단백 중의 콜레스테롤의 측정법으로서 초원심법, NMR법 등이 존재한다. 초원심은 원심에 의해 리포 단백의 밀도의 차를 이용해서 획분하는 방법이며, 작업에 숙련이 필요한 점, 일수가 걸리는 점, 또한 비용도 고액이 되는 결점이 있다. NMR법은 자기 공명에 의해 리포 단백의 입자 수를 계측하는 방법이지만 특수한 기계가 필요하며, 일반적이지는 않다.
최근, 이들의 번잡한 조작이 불필요하며, 자동 분석 장치에 있어서 사용 가능한 다이렉트법이 급속하게 보급되어 왔다. HDL을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 특허문헌 1에는 응집제로서 황산화 시클로덱스트린을 사용해서 HDL 이외의 리포 단백을 충분히 반응시킨 후 폴리에틸렌글리콜에 의해 수식한 효소를 작용시키고, HDL 중의 콜레스테롤을 특이적으로 측정하는 방법이 개시되어 있다. 특허문헌 2에는 HDL 이외의 리포 단백에 대해서 반응 저해성의 계면활성제와, HDL을 특이적으로 용해하는 계면활성제를 사용하는 방법이 개시되어 있다. 특허문헌 3에는 제 1 공정에 의해 HDL 이외의 리포 단백을 카탈라아제로 소거하고, 제 2 공정에 의해 HDL에 특이적으로 작용하는 계면활성제를 사용해서 HDL을 측정하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 4에는 처음에 HDL 이외의 리포 단백에 대한 항체를 작용시키고, 이어서 HDL의 용해를 행하여 콜레스테롤을 검출하는 방법이 개시되어 있다. small, dense LDL을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 특허문헌 5에는 제 1 공정에 의해 small, dense LDL 이외의 리포 단백의 콜레스테롤을 small, dense LDL 이외에 작용하는 계면활성제를 사용해서 소거하고, 이어서 잔존한 small, dense LDL 중의 콜레스테롤을 정량하는 방법이 개시되어 있다. 특허문헌 6에는 제 1 공정에 의해 스핑고미엘리나아제를 사용해서 small, dense LDL 이외의 LDL의 리포 단백의 콜레스테롤을 소거하고, 이어서 잔존한 small, dense LDL 중의 콜레스테롤을 정량하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 카일로미크론(카일로미크론 렘넌트를 포함한다), VLDL(VLDL 렘넌트를 포함한다), 및 IDL을 합한 밀도 1.019g/cm3 미만의 트리글리세리드 리치 리포 단백(TRL)의 측정 방법으로서는 특허문헌 7에는 TRL 이외의 리포 단백의 콜레스테롤을 TRL 이외에 작용하는 계면활성제를 사용해서 소거하고, 이어서 잔존한 TRL 중의 콜레스테롤을 정량하는 방법이 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 피검 시료 중의 리포 단백 콜레스테롤을 보다 정확하게 정량할 수 있는 방법, 이 방법에 사용되는 정량 시약, 및 정량 키트를 제공하는 것이다.
본원 발명자들은 예의 연구한 결과, 피검 시료 중 또는 정량 시약 중에 인지질을 첨가함으로써 측정값의 직선성(피검 시료의 희석 레벨과 콜레스테롤의 반응 흡광도의 상관의 직선성)이 향상되는 것을 발견했다. 이 지견을 이용함으로써 보다 정확하게 리포 단백 중의 콜레스테롤을 측정할 수 있는 것에 상도하여 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 리포 단백을 포함하는 피검 시료 중의 리포 단백 콜레스테롤을 소망에 의해 정량 시약을 사용해서 정량하는 리포 단백 콜레스테롤의 정량 방법으로서, 상기 피검 시료 중 또는 상기 정량 시약 중에 인지질을 첨가하는 것을 포함하는 정량 방법.
[2] [1]에 있어서, 상기 인지질이 포스파티딜콜린(PC) 또는 리조포스파티딜콜린(LPC)인 방법.
[3] [1]에 있어서, 상기 인지질이 인지질 형태 계면활성제인 방법.
[4] [1]에 있어서, 상기 인지질이 정량되는 콜레스테롤을 포함하는 리포 단백과는 상이한 리포 단백질인 방법.
[5] [4]에 있어서, 상기 인지질이 고밀도 리포 단백질(HDL)인 방법.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 리포 단백이 트리글리세리드 리치 리포 단백(TRL)인 방법.
[7] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 리포 단백이 small, dense LDL인 방법.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 리포 단백 콜레스테롤을 정량 시약을 사용해서 정량하는 방법.
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법에 사용되는 리포 단백 중의 콜레스테롤의 정량 시약으로서, 인지질을 함유하는 정량 시약.
[10] [9]에 기재된 시약의 리포 단백을 포함하는 피검 시료 중의 리포 단백 콜레스테롤을 정량하기 위한 시약으로서의 사용.
[11] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법에 사용되는 리포 단백 콜레스테롤의 정량 키트로서, 인지질을 포함하는 정량 키트.
[12] [11]에 기재된 키트의 리포 단백을 포함하는 피검 시료 중의 리포 단백 콜레스테롤을 정량하기 위한 키트로서의 사용.
(발명의 효과)
본 발명에 의해 피검 시료 중의 리포 단백 콜레스테롤을 보다 정확하게 정량할 수 있는 새로운 방법, 이 방법에 사용되는 정량 시약 및 정량 키트가 제공되었다.
도 1a는 실시예 1에 있어서 희석 계열 1(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 1b는 실시예 1에 있어서 희석 계열 2(인간 혈청을 HDL을 포함하는 희석액 A로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 1c는 실시예 1에 있어서 희석 계열 3(인간 혈청을 HDL을 포함하는 희석액 B로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 2a는 실시예 2에 있어서 희석 계열 4(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 sdLDL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 2b는 실시예 2에 있어서 희석 계열 5(인간 혈청을 HDL을 포함하는 희석액 B로 희석)의 희석 레벨에 대해서 sdLDL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 3a는 실시예 1의 TRL-C 시약 1-1(HDL-C: 0㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 3b는 실시예 3의 TRL-C 시약 1-2(HDL-C: 2㎎/dL)를 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 3c는 실시예 4의 TRL-C 시약 1-3(HDL-C: 3㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4a는 실시예 1의 TRL-C 시약 1-1(인지질: 0㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4b는 실시예 5의 TRL-C 시약 1-4(인지질 PC: 400㎎/dL)를 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4c는 실시예 6의 TRL-C 시약 1-5(인지질 PC: 800㎎/dL)를 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4d는 실시예 7의 TRL-C 시약 1-6(인지질 PC: 1600㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4e는 실시예 8의 TRL-C 시약 1-7(인지질 LPC: 400㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4f는 실시예 9의 TRL-C 시약 1-8(인지질 LPC: 800㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4g는 실시예 10의 TRL-C 시약 1-9(인지질 LPC: 1600㎎/dL)를 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 5a는 실시예 1의 TRL-C 시약 1-1(LIPIDURE 비첨가)을 사용했을 경우에 희석 계열 1(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 5b는 실시예 11의 TRL-C 시약 1-10(LIPIDURE BL206)을 사용했을 경우에 희석 계열 1(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 5c는 실시예 12의 TRL-C 시약 1-11(LIPIDURE BL1002)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 5d는 실시예 13의 TRL-C 시약 1-12(LIPIDURE SF08)를 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 5e는 실시예 14의 TRL-C 시약 1-13(LIPIDURE SF16)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 1b는 실시예 1에 있어서 희석 계열 2(인간 혈청을 HDL을 포함하는 희석액 A로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 1c는 실시예 1에 있어서 희석 계열 3(인간 혈청을 HDL을 포함하는 희석액 B로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 2a는 실시예 2에 있어서 희석 계열 4(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 sdLDL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 2b는 실시예 2에 있어서 희석 계열 5(인간 혈청을 HDL을 포함하는 희석액 B로 희석)의 희석 레벨에 대해서 sdLDL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 3a는 실시예 1의 TRL-C 시약 1-1(HDL-C: 0㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 3b는 실시예 3의 TRL-C 시약 1-2(HDL-C: 2㎎/dL)를 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 3c는 실시예 4의 TRL-C 시약 1-3(HDL-C: 3㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4a는 실시예 1의 TRL-C 시약 1-1(인지질: 0㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4b는 실시예 5의 TRL-C 시약 1-4(인지질 PC: 400㎎/dL)를 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4c는 실시예 6의 TRL-C 시약 1-5(인지질 PC: 800㎎/dL)를 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4d는 실시예 7의 TRL-C 시약 1-6(인지질 PC: 1600㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4e는 실시예 8의 TRL-C 시약 1-7(인지질 LPC: 400㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4f는 실시예 9의 TRL-C 시약 1-8(인지질 LPC: 800㎎/dL)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 4g는 실시예 10의 TRL-C 시약 1-9(인지질 LPC: 1600㎎/dL)를 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 5a는 실시예 1의 TRL-C 시약 1-1(LIPIDURE 비첨가)을 사용했을 경우에 희석 계열 1(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 5b는 실시예 11의 TRL-C 시약 1-10(LIPIDURE BL206)을 사용했을 경우에 희석 계열 1(인간 혈청을 생리 식염수로 희석)의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 5c는 실시예 12의 TRL-C 시약 1-11(LIPIDURE BL1002)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 5d는 실시예 13의 TRL-C 시약 1-12(LIPIDURE SF08)를 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
도 5e는 실시예 14의 TRL-C 시약 1-13(LIPIDURE SF16)을 사용했을 경우에 희석 계열 1의 희석 레벨에 대해서 TRL-C의 반응 흡광도를 플롯한 도면이다.
본 발명은 피검 시료 중의 리포 단백에 포함되는 콜레스테롤을 소망에 의해 정량 시약을 사용해서 정량하는 데에 있어서 피검 시료 중 또는 정량 시약 중에 인지질을 첨가하는 것을 특징으로 한다.
리포 단백 중에 포함되는 콜레스테롤로서는 에스테르형 콜레스테롤(콜레스테롤에스테르) 및 유리형 콜레스테롤이 있다. 본 발명에 있어서 간단히 「콜레스테롤」이라고 할 경우에는 이들 양자를 포함한다.
본 발명의 방법으로 정량하고자 하는 리포 단백 중의 콜레스테롤이란 트리아실글리세롤(트리글리세리드, 중성 지방) 및 세포의 생명 유지에 불가결한 콜레스테롤을 많이 포함하는 구형상 입자에 포함되는 콜레스테롤이다.
콜레스테롤을 포함하는 리포 단백은 전기 영동법 또는 초원심에 의해 분류되고, 카일로미크론, 초저밀도 리포 단백질(VLDL), 중간 밀도 리포 단백질(IDL), 저밀도 리포 단백질(LDL), small, dense LDL, 고밀도 리포 단백질(HDL) 등을 들 수 있다. 또한, 리포 단백으로서는 카일로미크론(카일로미크론 렘넌트를 포함한다), VLDL(VLDL 렘넌트를 포함한다), 및 IDL을 합한 밀도 1.019g/㎤ 미만의 트리글리세리드 리치 리포 단백(TRL)을 들 수도 있다.
본 발명의 방법에 제공되는 피검 시료(검체)로서는 리포 단백을 포함하고, 리포 단백 중의 콜레스테롤을 정량하고자 하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 통상 혈액(전혈, 혈청, 및 혈장을 포함한다) 등의 체액이나 그 희석물이다.
본 발명의 리포 단백 콜레스테롤의 정량 방법은 이 분야에 있어서 주지의 어느 방법도 채용할 수 있다. 예를 들면, 정량 시약을 사용해서 콜레스테롤에 콜레스테롤 옥시다아제 및 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시켜 생성한 과산화수소를 페록시다아제와 수소 공여체 및 수소 수용체에 의해 퀴논 색소로 변화시키고, 상기 색소를 흡광도 측정해서 정량하는 방법을 들 수 있다. 이들은 널리 사용되어 있는 주지의 효소적인 정량 방법이며, WO 98/47005나 WO 98/26090에도 기재되어 있다. 또한, 본 발명에 있어서는 피검 시료 중에 인지질을 첨가할 수 있으면 콜레스테롤을 어떠한 방법으로도 측정할 수 있다. 예를 들면, 정량 시약을 사용하지 않는 방법으로서는 초원심법이나 NMR법 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 소망에 의해 사용하는 콜레스테롤의 정량 시약으로서는 후술하는 인지질 외에, 예를 들면 콜레스테롤 옥시다아제, 콜레스테롤 에스테라아제, 페록시다아제, 수소 공여체 및 수소 수용체를 함유하는 시약을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제공되는 인지질은 부분 구조로서 인산 에스테르를 갖는 지질이며, 생체 중에서 주로 세포막의 주요 구성 성분으로서 존재하고 있다. 본 발명에 있어서의 인지질로서는 글리세롤을 골격으로 하는 글리세로인지질이나 스핑고신을 골격으로 하는 스핑고인지질을 들 수 있다. 글리세로인지질로서는 포스파티딜콜린(PC), 리조포스파티딜콜린(LPC), 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 및 포스파티딜글리세롤 등을 들 수 있다. 스핑고인지질로서는 스핑고미에린 및 스핑고에탄올아민 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 인지질에는 인지질 형태 계면활성제 및 인지질을 부분 구조로서 포함하는 물질도 포함된다. 인지질 형태 계면활성제란 부분 구조로서 인산 에스테르를 갖는 계면활성제이며, 인지질 형태 계면활성제로서는 포스포릴콜린기(PC기)를 갖는 구조인 것이 바람직하고, 구체적으로는 LIPIDURE BL206(NOF CORPORATION), LIPIDURE BL1002(NOF CORPORATION), LIPIDURE SF08(NOF CORPORATION), LIPIDURE SF16(NOF CORPORATION) 등을 들 수 있다. 인지질을 부분 구조로서 포함하는 물질로서는 리포 단백, 리포솜, 세포막 등의 생체막 등을 들 수 있고, 리포 단백으로서는, 예를 들면 카일로미크론, 초저밀도 리포 단백질(VLDL), 중간 밀도 리포 단백질(IDL), 저밀도 리포 단백질(LDL), small, dense LDL, 고밀도 리포 단백질(HDL) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 인지질로서 리포 단백을 사용할 경우에는 본 발명의 방법으로 정량하고자 하는 콜레스테롤을 포함하는 리포 단백과는 상이한 리포 단백을 사용한다. 예를 들면, 트리글리세리드 리치 리포 단백(TRL) 중의 콜레스테롤을 정량할 경우에는 TRL과는 상이한 리포 단백, 예를 들면 고밀도 리포 단백질(HDL)을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 인지질은 단독으로 사용해도 좋고, 복수 종류를 조합해서 사용해도 좋다.
본 발명에 있어서는 반응액 중에 일정량 이상의 인지질이 존재하고 있으면 좋고, 피검 시료 중 또는 정량 시약 중에 인지질을 첨가한다. 인지질은 피검 시료(검체)를 희석할 때 등에 사용하는 희석액에 첨가함으로써 피검 시료 중에 첨가해도 좋고, 또한 인지질을 정량 시약 중에 미리 첨가해 두고, 측정 시에 첨가되도록 구성해도 좋다.
인지질의 첨가량은 인지질을 피검 시료 중에 첨가할 경우에는 피검 시료를 희석하기 위한 희석액 중의 인지질의 농도가 통상 1~1000㎎/dL, 바람직하게는 10~500㎎/dL, 더 바람직하게는 50~300㎎/dL의 범위가 되도록 첨가하는 것이 좋다.
인지질을 정량 시약 중에 첨가할 경우의 인지질의 첨가량은 인지질의 종류에 따라 상이하다. 예를 들면, 인지질이 글리세로인지질 또는 스핑고인지질일 경우에는 정량 시약 중의 인지질이 통상 50~5000㎎/dL, 바람직하게는 200~3000㎎/dL, 더 바람직하게는 500~2000㎎/dL의 범위가 되도록 첨가하는 것이 좋다. 또한, 인지질이 리포 단백질일 경우에는 정량 시약 중의 리포 단백 콜레스테롤이 통상 0.05~100㎎/dL, 바람직하게는 0.1~50㎎/dL, 더 바람직하게는 0.5~10㎎/dL의 범위가 되도록 첨가하는 것이 좋다.
본 발명의 방법은 리포 단백을 포함하는 피검 시료에 상기 정량 시약을 그대로 반응시켜서 콜레스테롤을 정량하는 것도 가능하지만 피검 시료 중의 정량 대상이 되는 리포 단백 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 제 1 공정(공정 (1))과, 반응계 내에 잔존하는 정량 대상이 되는 리포 단백 중의 콜레스테롤을 정량하는 제 2 공정(공정 (2))에 의해 본 발명의 방법을 행하면 정량 대상이 되는 리포 단백 중의 콜레스테롤을 보다 정확하게 정량할 수 있다.
본 발명 중에 있어서 리포 단백에 대해서 「반응한다」라는 말을 사용할 경우에는 계면활성제나 효소에 의해 리포 단백의 구조가 변화되고, 내부의 콜레스테롤에 대해서 효소가 작용하기 쉬워지는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서의 공정 (1)에서는 정량 대상이 되는 리포 단백 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 선택적으로 소거한다. 여기에서 「소거」란 콜레스테롤을 분해하고, 또한 그 분해물이 다음 공정 (2)에서 검출되지 않도록 하는 것을 의미한다. 정량 대상이 되는 리포 단백 이외의 리포 단백에 포함되는 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 방법으로서는, 예를 들면 피검 시료에 콜레스테롤 옥시다아제 및 콜레스테롤 에스테라아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 제거하는 방법을 들 수 있다. 과산화수소를 제거하는 방법으로서는 카탈라아제를 작용시켜서 물과 산소로 분해하는 방법 또는 페록시다아제의 작용에 의해, 예를 들면 과산화수소와 반응해서 무색 퀴논을 발생하는 수소 공여체 화합물을 무색 퀴논으로 전화(轉化)하는 방법 등을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 제 1 공정에 있어서 특정 리포 단백 중의 콜레스테롤을 선택적으로 소거하는 방법은 LDL 콜레스테롤의 정량 방법(예를 들면, WO 98/47005 등)이나 HDL 콜레스테롤의 정량 방법(예를 들면, WO 98/26090 등) 등에 널리 채용되어 주지가 되어 있는 것이다. 본 발명의 공정 (1)도 이들 주지의 방법에 의해 실시하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서의 인지질은 상기 공정 (1)에 있어서 첨가하면 측정값의 직선성(피검 시료의 희석 레벨과 콜레스테롤의 반응 흡광도의 상관의 직선성)이 더 향상된다는 점에서 바람직하다.
계속해서, 공정 (2)에서는 상술한 주지의 방법에 의해 상기 공정 (1)에서 소거되지 않고 잔존하는 정량 대상이 되는 리포 단백 중의 콜레스테롤을 효소적으로 정량한다. 상기 공정 (1)에서 콜레스테롤 옥시다아제 및 콜레스테롤 에스테라아제를 사용할 경우에는 공정 (2)에서는 공정 (1)에서 사용한 콜레스테롤 옥시다아제 및 콜레스테롤 에스테라아제를 그대로 사용할 수 있어 새롭게 첨가할 필요는 없다.
또한, 공정 (1)에 있어서 발생한 과산화수소를 카탈라아제로 분해하고, 공정 (2)에서 이 카탈라아제를 저해할 필요가 있을 경우에는 공정 (2)에 있어서, 예를 들면 아지드화나트륨과 같은 카탈라아제 저해제를 사용해서 카탈라아제를 저해한다.
본 발명의 공정 (1) 및 공정 (2)에 있어서는 적어도 1종의 계면활성제를 사용할 수 있다. 적합한 계면활성제를 사용하면 각각의 공정에 있어서의 효소 반응을 촉진할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 콜레스테롤 옥시다아제로서는 콜레스테롤을 산화해서 과산화수소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 동물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 옥시다아제를 들 수 있다. 이들은 유전자 조작에 의해 제작된 것이어도 좋고, 화학 수식의 유무도 상관없다. 또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 콜레스테롤 에스테라아제로서는 에스테르형 콜레스테롤에 작용하는 것이면 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제의 각 효소의 사용량은 특별히 제한되는 것은 아니고, 적당히 설정할 수 있지만 통상 0.001U~2000U/mL이며, 바람직하게는 0.1~1000U/mL로 사용된다.
본 발명에서 사용하는 수소 공여체로서는 아닐린 유도체가 바람직하고, 아닐린 유도체로서는 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린(MAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N-(3-술포프로필)아닐린(HALPS), N-(3-술포프로필)-3-메톡시-5-아닐린(HMMPS) 등을 들 수 있다.
수소 수용체로서는 4-아미노안티피린이나 메틸벤조티아졸론히드라존 등을 사용할 수 있다.
반응액에는 통상의 생화학 반응에 사용되는 각종 완충액을 사용할 수 있고, 완충액의 pH는 5~8 사이인 것이 바람직하다. 용액으로서는 굿, 트리스, 인산, 글리신의 완충 용액이 바람직하고, 굿 완충액인 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시에틸)메탄(Bis-Tris), 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산)(PIPES), 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산), 1.5나트륨염, 1수화물(PIPES1.5Na), 2-히드록시-3-모르폴리노프로판술폰산(MOPSO), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES), 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산(HEPES), 및 피페라진-1,4-비스(2-히드록시-3-프로판술폰산)(POPSO)이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 각 공정은 pH5~pH10에서 행하는 것이 바람직하고, pH6~pH8에서 행하는 것이 더 바람직하다.
반응 온도는 각 공정 모두 20℃~45℃에서 행하는 것이 바람직하고, 25℃~40℃에서 행하는 것이 더 바람직하다. 반응 시간은 각 공정 모두 1~10분간에서 행하는 것이 바람직하고, 3~7분에서 행하는 것이 더 바람직하다.
본 발명의 정량 방법을 실시하는 데에 있어서 사용하는 시약을 복수의 시약 조성물로 나누어도 좋다. 본 발명에 있어서는 시약으로서는, 예를 들면 정량 대상이 되는 리포 단백 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 공정(즉, 공정 (1))을 행하기 위한 시약 조성물(제 1 시약)과, 정량 대상이 되는 리포 단백 중의 콜레스테롤을 측정하는 공정(즉, 공정 (2))을 행하기 위한 시약 조성물(제 2 시약)의 2종류의 시약 조성물을 조제하고, 이들 2종류의 시약 조성물을 조합한 것을 리포 단백 콜레스테롤의 정량 키트라고 할 수 있다.
공정 (1)을 행하기 위한 시약 조성물에는 상술한 바와 같은 정량 대상이 되는 리포 단백 이외의 리포 단백 중의 콜레스테롤을 소거하는 데에 적합한 계면활성제가 포함된다. 상기 시약 조성물에는 콜레스테롤 옥시다아제, 콜레스테롤 에스테라아제, 아닐린 유도체 등의 수소 공여체, 과산화수소를 소거하는 카탈라아제 등을 더 포함시키면 좋다.
공정 (2)를 행하기 위한 시약 조성물에는 적어도 상술한 바와 같은 모든 리포 단백에 대해서 반응하는 계면활성제가 포함된다. 상기 시약 조성물에는 4-아미노안티피린 등의 수소 수용체, 페록시다아제 등을 더 포함시킬 수 있다.
본 발명에 있어서의 인지질은 공정 (1)을 행하기 위한 시약 조성물(제 1 시약) 중에 함유시키면 측정값의 직선성(피검 시료의 희석 레벨과 콜레스테롤의 반응 흡광도의 상관의 직선성)이 더 향상된다는 점에서 바람직하다.
시약 조성물 중의 인지질의 함유량은 인지질의 종류에 따라 상이하지만 인지질이 글리세로인지질 또는 스핑고인지질일 경우에는 시약 조성물 중의 인지질의 농도는 통상 50~5000㎎/dL, 바람직하게는 200~3000㎎/dL, 더 바람직하게는 500~2000㎎/dL의 범위이다. 또한, 인지질이 리포 단백질일 경우에는 시약 조성물 중의 리포 단백 콜레스테롤의 농도는 통상 0.05~100㎎/dL, 바람직하게는 0.1~50㎎/dL, 더 바람직하게는 0.5~10㎎/dL의 범위이다.
공정 (1)을 행하기 위한 시약 조성물 및 공정 (2)를 행하기 위한 시약 조성물에는 필요에 따라 1가의 양이온(예를 들면, 1가의 금속 이온), 2가의 양이온(예를 들면, 2가의 금속 이온) 또는 그들의 염, 폴리 음이온(예를 들면, 헤파린, 덱스트란황산염, 인텅스텐산염), 혈청 알부민을 첨가해도 좋다. 또한, 각 시약 조성물의 pH는 중성 부근, 예를 들면 pH5~pH9, 바람직하게는 pH6~8이며, 완충액을 첨가해서 pH를 조정하면 좋다.
본 발명의 방법에 의해 정량 대상이 되는 리포 단백 중의 콜레스테롤을 정량하기 위해서는 피검 시료에 공정 (1)을 행하기 위한 시약 조성물을 첨가해서 반응시키고, 이어서 공정 (2)를 행하기 위한 시약 조성물을 첨가해서 반응시켜 흡광도를 측정함으로써 행하면 좋다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예)
실시예 1
시판된 HDL 농축액(Bioresource Technology, Inc.)을 HDL-C 농도가 약 50㎎/dL가 되도록 생리 식염수로 희석한 희석액 A 및 HDL-C 농도가 약 100㎎/dL가 되도록 생리 식염수로 희석한 희석액 B를 조제했다.
인간 혈청 1을 생리 식염수를 사용해서 하기 표 1과 같이 5단계 희석한 희석 계열 1, 희석액 A를 사용해서 하기 표 2와 같이 5단계 희석한 희석 계열 2, 희석액 B를 사용해서 하기 표 3과 같이 5단계 희석한 희석 계열 3을 조제했다.
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-1), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-1)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
TRL-C 측정용 시약을 사용해서 희석 계열 1, 희석 계열 2, 희석 계열 3을 검체로 했을 때의 반응 흡광도를 HITACHI 7180형 자동 분석 장치에 의해 이하의 방법으로 측정했다.
검체 3μL에 제 1 시약을 150μL 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시키고, 이어서 제 2 시약을 50μL 첨가하여 5분간 반응시킨 후에 반응 흡광도를 주파장 600㎚, 부파장 700㎚로 측정했다.
희석 계열 1, 희석 계열 2, 희석 계열 3의 각 희석 레벨을 x축으로, TRL-C의 반응 흡광도를 y축으로 했을 때의 결과를 도 1a~도 1c에 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이 생리 식염수를 사용해서 조제된 희석 계열 1에 비해 HDL을 포함하는 희석액 A 또는 희석액 B를 사용해서 조제된 희석 계열 2 및 희석 계열 3의 쪽이 양호한 희석 직선성을 나타냈다.
실시예 2
인간 혈청 2를 생리 식염수를 사용해서 하기 표 4와 같이 5단계 희석한 희석 계열 4, 실시예 1에 기재된 희석액 B를 사용해서 하기 표 5와 같이 5단계 희석한 희석 계열 5를 조제했다.
DENKA SEIKEN Co., Ltd.제의 sdLDL-C 측정용 시약을 사용해서 희석 계열 4, 희석 계열 5를 검체로 했을 때의 반응 흡광도를 HITACHI 7180형 자동 분석 장치에 의해 이하의 방법으로 측정했다.
검체 3μL에 제 1 시약을 150μL 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시키고, 이어서 제 2 시약을 50μL 첨가하여 5분간 반응시킨 후에 반응 흡광도를 주파장 600㎚, 부파장 700㎚로 측정했다.
희석 계열 4, 희석 계열 5의 각 희석 레벨을 x축으로, sdLDL-C의 반응 흡광도를 y축으로 했을 때의 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타낸다.
도 2에 나타낸 바와 같이 생리 식염수를 사용해서 조제된 희석 계열 4에 비해 HDL을 포함하는 희석액 B를 사용해서 조제된 희석 계열 5의 쪽이 양호한 희석 직선성을 나타냈다.
실시예 3
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-2), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
HDL 농축액
2㎎/dL(HDL-C)
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 4
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-3), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-3)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
HDL 농축액
3㎎/dL(HDL-C)
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 1, 실시예 3~4에 기재된 TRL-C 측정용 시약을 사용해서 실시예 1에 기재된 희석 계열 1을 검체로 했을 때의 TRL-C의 반응 흡광도를 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 각각 측정했다. 희석 계열의 희석 레벨을 x축으로, TRL-C의 반응 흡광도를 y축으로 했을 때의 결과를 도 3a~도 3c에 나타낸다.
도 3a~도 3c에 나타낸 바와 같이 HDL을 포함하지 않는 TRL-C 시약을 사용해서 측정한 경우에 비해 HDL을 포함하는 TRL-C 시약을 사용해서 측정한 경우의 쪽이 양호한 희석 직선성을 나타냈다.
실시예 5
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-4), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-4)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
인지질(포스파티딜콜린(PC))
400㎎/dL
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 6
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-5), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-5)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
인지질(포스파티딜콜린(PC))
800㎎/dL
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 7
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-6), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-6)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
인지질(포스파티딜콜린(PC))
1600㎎/dL
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 8
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-7), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-7)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
인지질(리조포스파티딜콜린(LPC))
400㎎/dL
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 9
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-8), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-8)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
인지질(리조포스파티딜콜린(LPC))
800㎎/dL
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 10
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-9), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-9)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
인지질(리조포스파티딜콜린(LPC))
1600㎎/dL
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 1, 실시예 5~10에 기재된 TRL-C 측정용 시약을 사용해서 실시예 1에 기재된 희석 계열 1을 검체로 했을 때의 TRL-C의 반응 흡광도를 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 각각 측정했다. 희석 계열의 희석 레벨을 x축으로, TRL-C의 반응 흡광도를 y축으로 했을 때의 결과를 도 4a~도 4g에 나타낸다.
도 4a~도 4g에 나타낸 바와 같이 인지질을 포함하지 않는 TRL-C 시약을 사용해서 측정한 경우에 비해 인지질을 포함하는 TRL-C 시약을 사용해서 측정한 경우의 쪽이 양호한 희석 직선성을 나타냈다.
실시예 11
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-10), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-10)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
인지질 형태 계면활성제(LIPIDURE BL206(NOF CORPORATION))
0.25%(w/v)
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 12
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-11), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-11)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
인지질 형태 계면활성제(LIPIDURE BL1002(NOF CORPORATION))
0.25%(w/v)
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 13
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-12), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-12)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
인지질 형태 계면활성제(LIPIDURE SF08(NOF CORPORATION))
0.25%(w/v)
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 14
이하의 제 1 시약(TRL-C 시약 1-13), 제 2 시약(TRL-C 시약 2)으로 이루어지는 TRL-C 측정용 시약을 조제했다.
제 1 시약(TRL-C 시약 1-13)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
콜레스테롤 에스테라아제
2U/mL
콜레스테롤 옥시다아제
2U/mL
카탈라아제
1200U/mL
TOOS
2.0m㏖/L
폴리옥시에틸렌디스티렌화페닐에테르[HLB: 12.8]
0.25%(w/v)
인지질 형태 계면활성제(LIPIDURE SF16(NOF CORPORATION))
0.25%(w/v)
제 2 시약(TRL-C 시약 2)
PIPES, pH6.8
50m㏖/L
4-아미노안티피린
4.0m㏖/L
페록시다아제
20단위/mL
아지드화나트륨
0.05%(w/v)
폴리옥시에틸렌알킬에테르
0.5%(w/v)
실시예 1, 실시예 11~14에 기재된 TRL-C 측정용 시약을 사용해서 실시예 1에 기재된 희석 계열 1을 검체로 했을 때의 TRL-C의 반응 흡광도를 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 각각 측정했다. 희석 계열의 희석 레벨을 x축으로, TRL-C의 반응 흡광도를 y축으로 했을 때의 결과를 도 5a~도 5e에 나타낸다.
도 5a~도 5e에 나타낸 바와 같이 인지질 형태 계면활성제를 포함하지 않는 TRL-C 시약을 사용해서 측정한 경우에 비해 인지질 형태 계면활성제를 포함하는 TRL-C 시약을 사용해서 측정한 경우의 쪽이 양호한 희석 직선성을 나타냈다.
Claims (12)
- 리포 단백을 포함하는 피검 시료 중의 리포 단백 콜레스테롤을 소망에 의해 정량 시약을 사용해서 정량하는 리포 단백 콜레스테롤의 정량 방법으로서,
상기 피검 시료 중 또는 상기 정량 시약 중에 인지질을 첨가하는 것을 포함하는 정량 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 인지질이 포스파티딜콜린(PC) 또는 리조포스파티딜콜린(LPC)인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 인지질이 인지질 형태 계면활성제인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 인지질이 정량되는 콜레스테롤을 포함하는 리포 단백과는 상이한 리포 단백질인 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 인지질이 고밀도 리포 단백질(HDL)인 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리포 단백이 트리글리세리드 리치 리포 단백(TRL)인 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리포 단백이 small, dense LDL인 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리포 단백 콜레스테롤을 정량 시약을 사용해서 정량하는 방법. - 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용되는 리포 단백 중의 콜레스테롤의 정량 시약으로서,
인지질을 함유하는 정량 시약. - 제 9 항에 기재된 시약의 리포 단백을 포함하는 피검 시료 중의 리포 단백 콜레스테롤을 정량하기 위한 시약으로서의 사용.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용되는 리포 단백 콜레스테롤의 정량 키트로서,
인지질을 포함하는 정량 키트. - 제 11 항에 기재된 키트의 리포 단백을 포함하는 피검 시료 중의 리포 단백 콜레스테롤을 정량하기 위한 키트로서의 사용.
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