JP2005257308A - 高比重リポ蛋白中コレステロール分析用乾式分析素子 - Google Patents

Abstract

【課題】 安価なかつ安全性の高い材料を用いて、ＨＤＬ以外のリポ蛋白の反応を阻害し、短時間にコレステロール濃度を測定するための試薬、及びそれを用いた測定方法を提供する。
【解決手段】 コレステロールを測定する酵素、発色剤、界面活性剤及びリポ蛋白と同様の形状と表面電荷を有する物質を含有する高比重リポ蛋白中コレステロールの濃度測定用試薬、及びそれを用いた高比重リポ蛋白中コレステロールの濃度測定方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、検体中の高比重リポ蛋白中コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）分析用乾式分析素子に関する。

ＨＤＬ−Ｃは、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となることが知られている。

従来のＨＤＬ−Ｃの定量法は、大きく分けて分画操作と定量操作の２段階からなる。分画操作法としては超遠心分離法、免役化学的方法、電気泳動法、沈殿法などが知られており、一般的には沈殿法が広く用いられている。この方法では、検体に沈殿剤を加えて高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）以外のリポ蛋白を凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたＨＤＬのみを含む上清中のコレステロールを測定する。しかし、この方法は、沈殿剤を添加して分離する操作を含むために、比較的多量の検体を要すること、遠心分離機等の設備が必要であること、更に人為的操作による誤差を含みやすいこと、等の欠点がある。

近年、これらの煩雑な操作が不要で、自動分析装置において使用可能なダイレクト法が急速に普及してきた。例えば、特許文献１には、凝集剤として硫酸化シクロデキストリンを用いて、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を十分に反応させた後、ポリエチレングリコールで修飾した酵素を作用させて、ＨＤＬ中のコレステロールを特異的に測定する方法が開示されている。特許文献２には、ＨＤＬ以外のリポ蛋白に対して反応阻害性の界面活性剤と、ＨＤＬを特異的に溶解する界面活性剤を使用する方法が開示されている。特許文献３には、第一工程でＨＤＬ以外のリポ蛋白をカタラーゼで消去し、第二工程でＨＤＬに特異的に作用する活性剤を用いてＨＤＬを測定する方法が開示されている。更に特許文献４には、初めにＨＤＬ以外のリポ蛋白に対する抗体を作用させ、次いでＨＤＬの溶解を行い、コレステロールを検出する方法が開示されている。

乾式分析素子を用いるドライケミストリーの分野においても沈殿法が主流だったが、近年ダイレクト法を利用したドライ式の新しい試験片が開発され、特許文献５に開示されている。しかし、この試験片においてはフェニルエーテル系の界面活性剤を用いており、かれらの界面活性剤は分解反応で環境懸念物質であるアルキルフェニルエーテルが生成する問題がある。更に、試験片の製造には多段階の高低を経る必要があり、コスト的にも問題が残る。
特開平８−１３１１９７号公報 特開平１１−５６３９５号公報 ＷＯ９８／２６０９０号公報 特開平９−９６６３７号公報 特開２００２−１４２７９９号公報

本発明は、安全性の高い材料を用いて、選択的にＨＤＬ以外のリポ蛋白の反応を阻害し、短時間にコレステロール濃度を測定するために使用する乾式分析素子を開発することを課題とする。

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、コレステロールを検出する試薬系（酵素及び発色剤）に、リポ蛋白と同様の形状と表面電荷を有する物質を共存させることにより検体開示のＬＤＬの反応を阻害し、ＨＤＬ中のコレステロールのみを効率よく選択的に測定できることを見いだして、本発明を完成させた。即ち、本発明の課題は、コレステロール測定用酵素及びＨＤＬ以外のリポ蛋白と同様の性状と表面電荷を有する物質を含有する乾式分析素子により達成された。

本発明の乾式分析素子により、検体中のＨＤＬ−Ｃを簡便迅速に定量でき、特に多量の検体の迅速な測定が求められる臨床検査分野において大きな効果を発揮する。

乾式分析素子の種々の形態については数多くの特許公報その他文献により当業者に公知であり、詳細な説明は省略する。本発明においては、基本的な形態を持っていれば、即ち、水不透過性透明支持体上に、水溶性高分子化合物、例えばＰＶＡ、ＰＶＰ、ＰＡＡ、あるいはゼラチン等からなる少なくとも一層の水浸透性層、及び液体を水平方向に均一に展開する展開層がこの順に設けられていればよく、本発明で使用する、以下に説明する試薬類は、水不透過性透明支持体以外の任意の層内に含有させることができる。

ＨＤＬ以外のリポ蛋白と同様の性状と表面電荷を有する物質（ＬＤＬ様物質）としては、直径が２０ｎｍ〜１００ｎｍの粒形で、中性付近でカチオン性の官能基を表面に有しており、血清中には、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン等が挙げられる。

これは、表面をＮＨ₂基や４級アミン基で修飾したビーズ、又は脂質膜で構成されたリポソーム等によって実現できる。表面をアミノ基で修飾したビーズとしては「マイクロスフィア・アミノ基修飾体」（Ｂａｎｇｓ社製）等を用いることが出来る。具体的には、多くのリン脂質、グリセロ糖脂質を少なくとも５０％以上の水に、その脂質固有のゲル液晶相転移温度以上で懸濁させると、自動的に脂質二重層より成る閉鎖小胞が形成される。機械的な振動を与えながら作ると、直径０．１〜１０μｍの多重の小胞ができる。

リン脂質で構成されたリポソームの表面のカチオン性は、例えば、下記のホスファチジルコリンとホスファチジルセリンを適当な割合で混合することによって達成することができる。

具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンの適切な量を分取して水溶液とする。これを超音波処理することにより、リポソームの懸濁液が生成できる。ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリンの混合比率は、１０〜０．１、好ましくは５〜０．５である。リポソーム全体としての好ましい濃度範囲は、１〜１００ｍｇ／ｍ²、特に５〜３０ｍｇ／ｍ²である。

酵素としては、一般的にコレステロールを測定する為に使用される酵素であればよく、由来等の制限はない。具体的には、コレステロールエステラーゼ（EC3.1.1.13）、コレステロールオキシダーゼ（EC3.1.1.6）及びペルオキシダーゼ（EC1.11.1.7）が挙げられる。単位面積当たりのこれらの使用量は、下記のとおりであり、測定は２５〜４５℃で実施する。
コレステロールエステラーゼ： ０．１〜１０Ｕ／ｍ²
コレステロールオキシダーゼ： ０．０１〜１Ｕ／ｍ²
ペルオキシダーゼ： ２〜２００Ｕ／ｍ²

上記のＬＤＬ様物質と酵素とは、別々の層に入れるのが好ましい。特に、コレステロール測定酵素は下層（水浸透性層）で、ＬＤＬ様物質は上層（展開層）にあったほうが望ましい。その理由は、スライド作成時に、酵素とＬＤＬ様物質が共存することで、コンプレックス形成により、酵素の活性が低下することを防ぐからである。

本発明の乾式分析素子には、上記以外の試薬等を含有させることができる。例えば、ＨＤＬコレステロールの量を色素濃度に変換する場合の発色系としては、ペルオキシダーゼの存在下、Ｈ₂Ｏ₂の酸化作用により４アミノアンチピリンと縮合して発色するトリンダー試薬（例えばＡＤＡＰＳ、ＡＬＰＳ、ＤＡＰＳ、ＨＡＤＡＰＳ、ＭＡＰＳ、ＴＯＰＳ、ＡＤＯＳ、ＡＬＯＳ、ＤＡＯＳ、ＨＤＡＯＳ等）、ペルオキシダーゼの存在下、Ｈ₂Ｏ₂により発色するロイコ色素（例えばＤＡＢ、ＨＰＰＡ、ＴＭＢＺ、ＤＡ−６７、ＤＡ６４等）などを使用できる。酸化的縮合による発色試薬としては４−アミノアンチピリン（和光純薬）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（同仁化学研究所）等が挙げられる。これらの使用量は０．１〜１０ｇ／ｍ²の範囲が好ましい。

界面活性剤も使用することができる。測定対象成分（コレステロール）の反応を促進させる効果のあるもののうち、環境汚染の懸念がない、非エンドクリン化合物が好ましい。この様な界面活性剤としては、ノニオン系界面活性剤、特にポリオキシエチレンアルキルエーテル誘導体が好ましい。具体的には、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル等が挙げられる。これらは、単独で用いても、適宜混合して用いてもよい。

本発明の乾式分析素子に対しては、血液、尿などのＨＤＬを含有する体液を試料として適用できる。以下実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

参考例として、リポソームの製造方法を説明する。
参考例１．ＰＣ／ＰＳリポソームの製造方法
フォスファチジルコリン（ＰＣ）５０ｎｍｏｌ（卵黄由来、和光純薬製品）とファオスファチジルセリン（ＰＳ）５０ｎｍｏｌ（牛脳由来．Ａｖａｎｔｃ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ ｌｎｃ．製品）のクロロホルム溶液を正確に測り取り、エヴァポレーターにて、溶剤のクロロホルムを蒸発させる。十分に乾固させた後、このものを１ｍＬ生理食塩水に懸濁し、超音波で分散させ、リポソームを形成せしめる。

参考例２．ＰＣリポソームの製造方法
フォスファチジルコリン（ＰＣ）１００ｎｍｏｌ（卵黄由来、和光純薬製品）のクロロホルム溶液を正確に測り取り、エヴァポレーターにて、十分に乾固させた後、このものを１ｍL生理食塩水に懸濁し、超音波で分散させ、リポソームを形成せしめる。

実施例１用に、以下の通り、リポソームを用いた乾式分析素子を作成した。ゼラチン下塗りされている１８０μｍのポリエチレンテレフタレ−ト無色透明平滑フィルムにＰＶＡ（ポリビニルアルコール）水溶液を、乾燥後の厚さが１４μｍになるように塗布し、乾燥した。次に上記フィルム上に約３０ｇ／ｍ²の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、５０デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥させた。上記の布地上に下記組成の水溶液（ｐＨ＝７．０）を塗布し乾燥した。

ＰＩＰＥＳ緩衝液 ｐＨ７．０ １．９ｇ／ｍ²
コレステロールエステラーゼ ６．４Ｕ／ｍ²
コレステロールオキシダーゼ ０．５Ｕ／ｍ²
ペルオキシダーゼ １２．８Ｕ／ｍ²
４−アミノアンチピリン １．０ｇ／ｍ²
ＤＡＯＳ １．０ｇ／ｍ²
ポリオキシエチレンモノラウリルエーテル ０．１ｇ／ｍ²
リポソーム水溶液（参考例１で作成したもの） １０．１ｍｇ／ｍ²
ＰＩＰＥＳ：ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）
ＤＡＯＳ：N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン,ナトリウム塩

コレステロール濃度１００ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、ＬＤＬの精製した試料及び、７％ＨＳＡ水溶液を、上記方法により製造した分析素子に１０μＬ点着し、３７℃でインキュベートしながら、６００ｎｍにおけるタイムコースを測定した。結果を図１に示す。

図１から明らかなように、本発明の乾式分析素子を用いると、ＨＤＬはおよそ５分で完全に発色するが、ＬＤＬのＯＤは実質的に変化しない。これにより、ＨＤＬのみを特異的に定量できる。

比較例１

トリコット編み物布地に塗布し乾燥する試薬液の組成を下記に変えた以外は、実施例１と同様にして、比較例１の乾式分析素子を作成した。

ＰＩＰＥＳ緩衝液 ｐＨ７．０ １．９ｇ／ｍ²
コレステロールエステラーゼ ６．４Ｕ／ｍ²
コレステロールオキシダーゼ ０．５Ｕ／ｍ²
ペルオキシダーゼ １２．８Ｕ／ｍ²
４−アミノアンチピリン １．０ｇ／ｍ²
ＤＡＯＳ １．０ｇ／ｍ²
ポリオキシエチレンモノラウリルエーテル ０．１ｇ／ｍ²

コレステロール濃度１００ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ、ＬＤＬの精製した試料及び、７％ＨＳＡ水溶液を、上記方法にて製造した分析素子に１０μＬ点着し、３７℃でインキュベートしながら、６００ｎｍにおけるＯＤタイムコースを測定した。結果を図２に示す。

図２から明らかなように、上記乾式分析素子の場合には、ＬＤＬに対する反応性は低いものの、ＨＤＬに対する反応性も高くはなく、ＨＤＬ特異的に反応するとはいい難い。

比較例２

リポソームとして、参考例２で作成したものを用いた以外は、実施例１と同様にして乾式分析素子を作成した。以下、比較例１と同様にして、タイムコースを測定した。結果を図３に示す。

図３から明らかなように、上記方法で製造した乾式分析素子では、ＬＤＬに対する反応性も、ＨＤＬに対する反応性も高くなり、ＨＤＬ特異的に反応するとはいい難い。

本発明の乾式分析素子を用いることにより、煩雑な前処理を必要としないで、検体中のＨＤＬコレステロールの量を、定量的に測定できる。

本発明の乾式分析素子を用いた場合の光学濃度測定のタイムコースを示す。 比較の乾式分析素子を用いた場合の光学濃度測定のタイムコースを示す。 比較の乾式分析素子を用いた場合の光学濃度測定のタイムコースを示す。

Claims (11)

1. 水不透過性透明支持体上に少なくとも一層の水浸透性層、及び液体を水平方向に均一に展開する展開層がこの順に設けられた乾式分析素子において、前記水浸透性層又は展開層中に、コレステロール測定用酵素、及びＨＤＬ以外のリポ蛋白と同様の性状と表面荷電を有する物質が存在することを特徴とする乾式分析素子。
2. ＨＤＬ以外のリポ蛋白と同様の性状と表面荷電を有する物質が、直径が２０〜１００ｎｍであり、かつ表面荷電を有するラテックスビーズである請求項１に記載の乾式分析素子。
3. ＨＤＬ以外のリポ蛋白と同様の性状と表面荷電を有する物質が、直径が２０〜１００ｎｍであるリン脂質又はリン脂質類似基含有化合物から構成されるリポソームである請求項１に記載の乾式分析素子。
4. 前記リポソームが、フォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチダルコリン、フォスファチダルセリン及びフォスファチダルエタノールアミンの少なくとも一種の化合物により構成される請求項３に記載の乾式分析素子。
5. 前記リポソームが、フォスファチジルコリン及びフォスファチジルセリンにより構成される請求項３に記載の乾式分析素子。
6. 前記リポソームを構成するフォスファチジルコリンとフォスファチジルセリンの比率が１／１０〜１０／１である請求項５に記載の乾式分析素子。
7. 前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含む請求項１〜６のいずれかに記載の乾式分析素子。
8. 前記酵素試薬が、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロキナーゼを含む請求項１〜６のいずれかに記載の乾式分析素子。
9. ＨＤＬを可溶化する界面活性剤を更に含む請求項１〜８のいずれかに記載の乾式分析素子。
10. 前記ＨＤＬを可溶化する界面活性剤がノニオン系界面活性剤である請求項９に記載の乾式分析素子。
11. 前記ノニオン系界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテル誘導体である請求項１０に記載の乾式分析素子。

Images