CN112074743A - 脂蛋白胆甾醇的定量方法、定量试剂和定量试剂盒 - Google Patents
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Abstract
提供能够更准确地定量待测试样中的脂蛋白胆甾醇的方法、该方法所使用的定量试剂和定量试剂盒。本发明是脂蛋白胆甾醇的定量方法，其根据期望使用定量试剂对含有脂蛋白的待测试样中的脂蛋白胆甾醇进行定量，该定量方法包括向前述待测试样中或前述定量试剂中添加磷脂。此外，本发明是定量试剂，其是在前述本发明的方法中使用的脂蛋白中的胆甾醇的定量试剂，且其含有磷脂。进而，本发明是定量试剂盒，其是在前述本发明的方法中使用的脂蛋白胆甾醇的定量试剂盒，且其含有磷脂。
Description
技术领域
本发明涉及脂蛋白中的胆甾醇的定量方法、定量试剂和定量试剂盒。
背景技术
血液中包含的脂蛋白因基于超离心分离的密度差异而分为乳糜微粒、超低密度脂蛋白（以下有时称为VLDL）、中密度脂蛋白（以下有时称为IDL）、低密度脂蛋白（以下有时称为LDL）、高密度脂蛋白（以下有时称为HDL）。近年来，这些脂蛋白根据比重、大小而进一步细细分化，例如，在LDL之中作为体积小且密度高的脂蛋白，有小粒子低密度脂蛋白（以下有时称为小而密LDL或sdLDL）等。已知这些脂蛋白中的甘油三酯、胆甾醇等脂质、蛋白等的含量不同，分别在生物体内显示出不同的作用。
作为至今为止已知的脂蛋白中的胆甾醇的测定法，存在超离心法、NMR法等。超离心是通过离心并利用脂蛋白的密度差来分级的方法，存在需要熟练操作、耗时多天且费用高昂的缺点。NMR法是通过磁共振来计测脂蛋白的粒子数的方法，但需要特殊设备，并不普遍。
近年来，无需这些复杂操作且能够在自动分析装置中使用的直接法正在快速普及。作为测定HDL的方法，例如专利文献1公开了下述方法：作为聚集剂而使用硫酸化环糊精，使其与除HDL之外的脂蛋白充分反应后，使被聚乙二醇修饰的酶发挥作用，从而特异性地测定HDL中的胆甾醇。专利文献2公开了下述方法：对于除HDL之外的脂蛋白，使用反应阻碍性的表面活性剂和特异性溶解HDL的表面活性剂。专利文献3公开了下述方法：在第一工序中利用过氧化氢酶去除除HDL之外的脂蛋白，并在第二工序中使用特异性地作用于HDL的表面活性剂来测定HDL。进而，专利文献4公开了下述方法：首先使对于除HDL之外的脂蛋白的抗体发挥作用，接着进行HDL的溶解，并检测胆甾醇。作为测定小而密LDL的方法，例如专利文献5公开了下述方法：在第一工序中，使用作用于除小而密LDL之外的表面活性剂来去除除小而密LDL之外的脂蛋白的胆甾醇，接着，对残留的小而密LDL中的胆甾醇进行定量。专利文献6公开了下述方法：在第一工序中使用鞘磷脂酶去除除小而密LDL之外的LDL的脂蛋白的胆甾醇，接着，对残留的小而密LDL中的胆甾醇进行定量。此外，作为乳糜微粒（含有乳糜微粒残粒）、VLDL（含有VLDL残粒）和IDL的总密度小于1.019g/cm3的富含甘油三酯的脂蛋白（TRL）的测定方法，专利文献7公开了下述方法：使用作用于除TRL之外的表面活性剂去除除TRL之外的脂蛋白的胆甾醇，接着，对残留的TRL中的胆甾醇进行定量。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平8-131197号公报
专利文献2：日本特开平11-56395号公报
专利文献3：WO98/26090号公报
专利文献4：日本特开平9-96637号公报
专利文献5：日本特开2013-148589号公报
专利文献6：WO09/048143号公报
专利文献7：日本特开2017-209035号公报。
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的是提供能够更准确地定量待测试样中的脂蛋白胆甾醇的方法、该方法所使用的定量试剂和定量试剂盒。
用于解决技术问题的手段
本发明人等经深入研究的结果发现：通过向待测试样中或定量试剂中添加磷脂，测定值的线性（待测试样的稀释水平与胆甾醇的反应吸光度的相关线性）提高。并想到：通过利用该见解，能够更准确地测定脂蛋白中的胆甾醇，由此完成了本发明。
即，本发明如下所示。
[1] 定量方法，其是根据期望使用定量试剂对含有脂蛋白的待测试样中的脂蛋白胆甾醇进行定量的脂蛋白胆甾醇的定量方法，其包括：向前述待测试样中或前述定量试剂中添加磷脂。
[2] 根据[1]所述的方法，其中，前述磷脂为磷脂酰胆碱（PC）或溶血磷脂酰胆碱（LPC）。
[3] 根据[1]所述的方法，其中，前述磷脂为磷脂样表面活性剂。
[4] 根据[1]所述的方法，其中，前述磷脂是与含有要定量的胆甾醇的脂蛋白不同的脂蛋白。
[5] 根据[4]所述的方法，其中，前述磷脂为高密度脂蛋白（HDL）。
[6] 根据[1]~[5]中任一项所述的方法，其中，前述脂蛋白为富含甘油三酯的脂蛋白（TRL）。
[7] 根据[1]~[5]中任一项所述的方法，其中，前述脂蛋白为小而密LDL。
[8] 根据[1]~[7]中任一项所述的方法，其中，使用定量试剂对前述脂蛋白胆甾醇进行定量。
[9] 定量试剂，其是在[1]~[8]中任一项所述的方法中使用的脂蛋白中的胆甾醇的定量试剂，且其含有磷脂。
[10] [9]所述的试剂的作为用于对含有脂蛋白的待测试样中的脂蛋白胆甾醇进行定量的试剂的用途。
[11] 定量试剂盒，其是在[1]~[8]中任一项所述的方法中使用的脂蛋白胆甾醇的定量试剂盒，且其含有磷脂。
[12] [11]所述的试剂盒的作为用于对含有脂蛋白的待测试样中的脂蛋白胆甾醇进行定量的试剂盒的用途。
发明效果
通过本发明，可提供能够更准确地定量待测试样中的脂蛋白胆甾醇的新型方法、该方法中使用的定量试剂和定量试剂盒。
附图说明
图1-1是在实施例1中对于稀释系列1（将人血清用生理盐水进行稀释）的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图1-2是在实施例1中对于稀释系列2（将人血清用含有HDL的稀释液A进行稀释）的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图1-3是在实施例1中对于稀释系列3（将人血清用含有HDL的稀释液B进行稀释）的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图2-1是在实施例2中对于稀释系列4（将人血清用生理盐水进行稀释）的稀释水平，标绘sdLDL-C的反应吸光度而得的图。
图2-2是在实施例2中对于稀释系列5（将人血清用含有HDL的稀释液B进行稀释）的稀释水平，标绘sdLDL-C的反应吸光度而得的图。
图3-1是在使用实施例1的TRL-C试剂1-1（HDL-C：0mg/dL）的情况下，对于稀释系列1（将人血清用生理盐水进行稀释）的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图3-2是在使用实施例3的TRL-C试剂1-2（HDL-C：2mg/dL）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图3-3是在使用实施例4的TRL-C试剂1-3（HDL-C：3mg/dL）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图4-1是在使用实施例1的TRL-C试剂1-1（磷脂：0mg/dL）的情况下，对于稀释系列1（将人血清用生理盐水进行稀释）的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图4-2是在使用实施例5的TRL-C试剂1-4（磷脂PC：400mg/dL）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图4-3是在使用实施例6的TRL-C试剂1-5（磷脂PC：800mg/dL）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图4-4是在使用实施例7的TRL-C试剂1-6（磷脂PC：1600mg/dL）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图4-5是在使用实施例8的TRL-C试剂1-7（磷脂LPC：400mg/dL）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图4-6是在使用实施例9的TRL-C试剂1-8（磷脂LPC：800mg/dL）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图4-7是在使用实施例10的TRL-C试剂1-9（磷脂LPC：1600mg/dL）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图5-1是在使用实施例1的TRL-C试剂1-1（未添加LIPIDURE）的情况下，对于稀释系列1（将人血清用生理盐水进行稀释）的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图5-2是在使用实施例11的TRL-C试剂1-10（LIPIDURE BL206）的情况下，对于稀释系列1（将人血清用生理盐水进行稀释）的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图5-3是在使用实施例12的TRL-C试剂1-11（LIPIDURE BL1002）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图5-4是在使用实施例13的TRL-C试剂1-12（LIPIDURE SF08）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
图5-5是在使用实施例14的TRL-C试剂1-13（LIPIDURE SF16）的情况下，对于稀释系列1的稀释水平，标绘TRL-C的反应吸光度而得的图。
具体实施方式
本发明的特征在于，在根据期望使用定量试剂对待测试样中的脂蛋白所含的胆甾醇进行定量时，向待测试样中或定量试剂中添加磷脂。
作为脂蛋白中含有的胆甾醇，有酯型胆甾醇（胆甾醇酯）和游离型胆甾醇。本发明中，简称为“胆甾醇”时包括这两者。
想要利用本发明的方法进行定量的脂蛋白中的胆甾醇是指含有大量三酰基甘油（甘油三酯、中性脂肪）和对于维持细胞生命而言不可欠缺的胆甾醇的球状粒子中含有的胆甾醇。
含有胆甾醇的脂蛋白通过电泳法或超离心来进行分类，可列举出乳糜微粒、超低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）、小而密LDL、高密度脂蛋白（HDL）等。此外，作为脂蛋白，也可列举出乳糜微粒（含有乳糜微粒残粒）、VLDL（含有VLDL残粒）和IDL的总密度小于1.019g/cm3的富含甘油三酯的脂蛋白（TRL）。
作为供于本发明方法的待测试样（样本），只要是含有脂蛋白且想要定量脂蛋白中的胆甾醇的试样即可，没有特别限定，通常是血液（包括全血、血清和血浆）等体液或其稀释物。
本发明的脂蛋白胆甾醇的定量方法也可采用在该领域中公知的任意方法。可列举出例如下述方法：使用定量试剂，使胆甾醇氧化酶和胆甾醇酯酶作用于胆甾醇，将生成的过氧化氢利用过氧化物酶和氢供体和氢受体转变为醌色素，并对该色素进行吸光度测定来定量。它们是广泛使用且公知的酶学定量方法，在WO98/47005、WO98/26090中也有记载。需要说明的是，本发明中，只要能够向待测试样中添加磷脂，则可以利用任意方法来测定胆甾醇。例如，作为不使用定量试剂的方法，可列举出超离心法、NMR法等。
本发明中，作为根据期望而使用的胆甾醇的定量试剂，可以使用除了后述磷脂之外还含有例如胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶、过氧化物酶、氢供体和氢受体的试剂。
本发明的方法中供给的磷脂是作为部分结构而具有磷酸酯的脂质，其在生物体中主要作为细胞膜的主要构成成分而存在。作为本发明中的磷脂，可列举出以甘油作为骨架的甘油磷酸酯、以鞘氨醇作为骨架的神经鞘氨糖脂。作为甘油磷酸酯，可列举出磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油等。作为神经鞘氨糖脂，可列举出鞘磷脂和鞘乙醇胺等。
此外，本发明的磷脂还包括磷脂样表面活性剂和含有磷脂作为部分结构的物质。磷脂样表面活性剂是指作为部分结构而具有磷酸酯的表面活性剂，作为磷脂样表面活性剂，优选具有磷酰胆碱基（PC基）的结构，具体而言，可列举出LIPIDURE BL206（日油公司）、LIPIDURE BL1002（日油公司）、LIPIDURE SF08（日油公司）、LIPIDURE SF16（日油公司）等。作为含有磷脂作为部分结构的物质，可列举出脂蛋白、脂质体、细胞膜等生物体膜等，作为脂蛋白，可列举出例如乳糜微粒、超低密度脂蛋白（VLDL）、中间密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）、小而密LDL、高密度脂蛋白（HDL）等。
作为本发明的磷脂而使用脂蛋白时，使用与包含想要利用本发明的方法进行定量的胆甾醇的脂蛋白不同的脂蛋白。例如，对富含甘油三酯的脂蛋白（TRL）中的胆甾醇进行定量时，可以使用与TRL不同的脂蛋白、例如高密度脂蛋白（HDL）。
本发明中的磷脂可以单独使用，也可以组合使用多种。
本发明中，只要在反应液中存在一定量以上的磷脂即可，向待测试样中或定量试剂中添加磷脂。磷脂可以通过添加至在稀释待测试样（样本）时等使用的稀释液中而添加至待测试样中，此外，也可以将磷脂预先添加至定量试剂中，以在测定时进行添加的方式构成。
关于磷脂的添加量，在将磷脂添加至待测试样中的情况下，可以以用于稀释待测试样的稀释液中的磷脂浓度通常达到1~1000mg/dL、优选达到10~500mg/dL、进一步优选达到50~300mg/dL的范围的方式进行添加。
将磷脂添加至定量试剂时的磷脂添加量因磷脂的种类而异。例如，在磷脂为甘油磷酸酯或鞘磷脂的情况下，可以以定量试剂中的磷脂通常达到50~5000mg/dL、优选达到200~3000mg/dL、进一步优选达到500~2000mg/dL的范围的方式进行添加。此外，磷脂为脂蛋白时，可以以定量试剂中的脂蛋白胆甾醇通常达到0.05~100mg/dL、优选达到0.1~50mg/dL、进一步优选达到0.5~10mg/dL的范围的方式进行添加。
本发明的方法中，也可以使上述定量试剂直接与含有脂蛋白的待测试样发生反应来定量胆甾醇，但通过选择性地去除除了在待测试样中成为定量对象的脂蛋白之外的脂蛋白中的胆甾醇的第一工序（工序（1））以及对残留至反应体系内的成为定量对象的脂蛋白中的胆甾醇进行定量的第二工序（工序（2））来进行本发明的方法时，能够更准确地定量成为定量对象的脂蛋白中的胆甾醇。
本发明中，使用与脂蛋白发生“反应”这一词语时，是指：通过表面活性剂、酶而使脂蛋白的结构发生变化，酶容易作用于内部的胆甾醇。
本发明的工序（1）中，选择性地去除除了成为定量对象的脂蛋白之外的脂蛋白中的胆甾醇。此处“去除”是指将胆甾醇分解且其分解物在后续的工序（2）中检测不到。作为选择性地去除除了成为定量对象的脂蛋白之外的脂蛋白所包含的胆甾醇的方法，可列举出例如使胆甾醇氧化酶和胆甾醇酯酶作用于待测试样，去除所生成的过氧化氢的方法。作为去除过氧化氢的方法，可列举出使过氧化氢酶发挥作用而分解成水和氧的方法；或者将通过过氧化物酶的作用而与例如过氧化氢反应并生成无色醌的氢供体化合物转化成无色醌的方法等，但不限定于它们。
需要说明的是，在第一工序中选择性地去除特定脂蛋白中的胆甾醇的方法在LDL胆甾醇的定量方法（例如WO98/47005等）、HDL胆甾醇的定量方法（例如WO98/26090等）等中广泛采用，是公知的方法。本发明的工序（1）也可以通过这些公知方法来实施。
在上述工序（1）中添加本发明的磷脂时，从测定值的线性（待测试样的稀释水平与胆甾醇的反应吸光度的相关线性）进一步提高的方面出发是优选的。
在后续的工序（2）中，通过前述公知的方法，对前述工序（1）中未被去除而残留的成为定量对象的脂蛋白中的胆甾醇进行酶学定量。在前述工序（1）中使用胆甾醇氧化酶和胆甾醇酯酶时，可以在工序（2）中直接使用工序（1）所使用的胆甾醇氧化酶和胆甾醇酯酶，无需重新添加。
需要说明的是，将工序（1）中生成的过氧化氢用过氧化氢酶进行分解，且工序（2）中需要抑制该过氧化氢酶的情况下，在工序（2）中使用例如叠氮化钠之类的过氧化氢酶抑制剂来抑制过氧化氢酶。
在本发明的工序（1）和工序（2）中，可以使用至少1种表面活性剂。如果使用适合的表面活性剂，则能够促进各个工序中的酶反应。
作为本发明中能够使用的胆甾醇氧化酶，只要是具有将胆甾醇氧化而生成过氧化氢这一能力的酶，就没有特别限定，可列举出例如来自动物或微生物的胆甾醇氧化酶。它们可以是通过基因操作而制作的酶，有无化学修饰均可。此外，作为本发明中能够使用的胆甾醇酯酶，只要是作用于酯型胆甾醇的酶，就没有特别限定。
本发明中使用的胆甾醇酯酶和胆甾醇氧化酶的各酶的用量没有特别限定，可以适当设定，通常使用0.001U~2000U/mL，优选使用0.1~1000U/mL。
作为本发明中使用的氢供体，优选为苯胺衍生物，作为苯胺衍生物，可列举出N-乙基-N-（2-羟基-3-磺基丙基）-3-甲基苯胺（TOOS）、N-乙基-N-（2-羟基-3-磺基丙基）-3,5-二甲基苯胺（MAOS）、N-乙基-N-（3-磺基丙基）-3-甲基苯胺（TOPS）、N-（2-羟基-3-磺基丙基）-3,5-二甲氧基苯胺（HDAOS）、N-（3-磺基丙基）苯胺（HALPS）、N-（3-磺基丙基）-3-甲氧基-5-苯胺（HMMPS）等。
作为氢受体，可以使用4-氨基安替比林、甲基苯并噻唑酮腙等。
反应液可以使用通常用于生化学反应的各种缓冲液，缓冲液的pH优选在5~8之间。作为溶液，优选为Good’s、Tris、磷酸、甘氨酸的缓冲溶液，更优选作为Good’s缓冲液的双（2-羟基乙基）亚氨基三（羟基乙基）甲烷（Bis-Tris）、哌嗪-1,4-双（2-乙磺酸）（PIPES）、哌嗪-1,4-双（2-乙磺酸）1.5钠盐一水合物（PIPES1.5Na）、2-羟基-3-吗啉基丙磺酸（MOPSO）、N,N-双（2-羟基乙基）-2-氨基乙磺酸（BES）、2-[4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）和哌嗪-1,4-双（2-羟基-3-丙磺酸）（POPSO）。
本发明的各工序优选在pH5~pH10的条件下进行，进一步优选在pH6~pH8的条件下进行。
关于反应温度，各工序均优选在20℃~45℃下进行，进一步优选在25℃~40℃下进行。关于反应时间，各工序均优选进行1~10分钟，进一步优选进行3~7分钟。
实施本发明的定量方法时，可以将所用试剂分成多个试剂组合物。本发明中，作为试剂，可以制备例如用于进行将除了成为定量对象的脂蛋白之外的脂蛋白中的胆甾醇去除的工序（即工序（1））的试剂组合物（第一试剂）以及用于进行对成为定量对象的脂蛋白中的胆甾醇加以测定的工序（即工序（2））的试剂组合物（第二试剂）这两种试剂组合物，并将这两种试剂组合物加以组合，将由此得到的产物作为脂蛋白胆甾醇的定量试剂盒。
用于进行工序（1）的试剂组合物包括对于去除除了上述那样的成为定量对象的脂蛋白之外的脂蛋白中的胆甾醇而言适合的表面活性剂。该试剂组合物只要进一步含有胆甾醇氧化酶、胆甾醇酯酶、苯胺衍生物等氢供体、去除过氧化氢的过氧化氢酶等即可。
用于进行工序（2）的试剂组合物至少包括与上述那样的全部脂蛋白发生反应的表面活性剂。该试剂组合物可以进一步含有4-氨基安替比林等氢受体、过氧化物酶等。
在用于进行工序（1）的试剂组合物（第一试剂）中含有本发明的磷脂时，从测定值的线性（待测试样的稀释水平与胆甾醇的反应吸光度的相关线性）进一步提高的观点出发是优选的。
试剂组合物中的磷脂含量因磷脂的种类而异，磷脂为甘油磷酸酯或鞘磷脂时，试剂组合物中的磷脂浓度通常为50~5000mg/dL、优选为200~3000mg/dL、进一步优选为500~2000mg/dL的范围。此外，磷脂为脂蛋白时，试剂组合物中的脂蛋白胆甾醇的浓度通常为0.05~100mg/dL、优选为0.1~50mg/dL、进一步优选为0.5~10mg/dL的范围。
可以根据需要向用于进行工序（1）的试剂组合物和用于进行工序（2）的试剂组合物中添加1价阳离子（例如一价的金属离子）、2价阳离子（例如二价的金属离子）或它们的盐、聚阴离子（例如肝素、葡聚糖硫酸盐、磷钨酸盐）、血清白蛋白。此外，各试剂组合物的pH为中性附近，例如为pH5~pH9、优选为pH6~8，可以添加缓冲液来调整pH。
为了利用本发明的方法对成为定量对象的脂蛋白中的胆甾醇进行定量，通过向待测试样中添加用于进行工序（1）的试剂组合物并使其反应，接着，添加用于进行工序（2）的试剂组合物并使其反应，测定吸光度来进行即可。
以下，基于实施例来具体说明本发明，但本发明不限定于下述实施例。
实施例
实施例1
制备将市售的HDL浓缩液（BRT公司）以HDL-C浓度达到约50mg/dL的方式用生理盐水稀释而得的稀释液A以及以HDL-C浓度达到约100mg/dL的方式用生理盐水稀释而得的稀释液B。
制备将人血清1用生理盐水如下述表1那样地稀释5个阶段而得的稀释系列1、使用稀释液A如下述表2那样地稀释5个阶段而得的稀释系列2、使用稀释液B如下述表3那样地稀释5个阶段而得的稀释系列3。
[表1]
（稀释系列1）
| 稀释水平 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 人血清1 | 0μL | 100μL | 200μL | 300μL | 400μL | 500μL |
| 生理盐水 | 500μL | 400μL | 300μL | 200μL | 100μL | 0μL |
[表2]
（稀释系列2）
| 稀释水平 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 人血清1 | 0μL | 100μL | 200μL | 300μL | 400μL | 500μL |
| 稀释液A | 500μL | 400μL | 300μL | 200μL | 100μL | 0μL |
[表3]
（稀释系列3）
| 稀释水平 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 人血清1 | 0μL | 100μL | 200μL | 300μL | 400μL | 500μL |
| 稀释液B | 500μL | 400μL | 300μL | 200μL | 100μL | 0μL |
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-1）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-1）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
使用TRL-C测定用试剂，利用日立7180型自动分析装置，按照下述方法来测定以稀释系列1、稀释系列2、稀释系列3作为样本时的反应吸光度。
向样本3μL中添加第一试剂150μL，以37℃使其反应5分钟，接着，添加第二试剂50μL而使其反应5分钟后，在主波长600nm、副波长700nm下测定反应吸光度。
将以稀释系列1、稀释系列2、稀释系列3的各稀释水平作为x轴，且以TRL-C的反应吸光度作为y轴时的结果示于图1-1~图1-3。
如图1所示那样，与使用生理盐水而制备的稀释系列1相比，使用含有HDL的稀释液A或稀释液B而制备的稀释系列2和稀释系列3显示出良好的稀释线性。
实施例2
制备将人血清2用生理盐水如下述表4那样稀释5个阶段而得的稀释系列4、用实施例1所述的稀释液B如下述表5那样稀释5个阶段而得的稀释系列5。
[表4]
（稀释系列4）
| 稀释水平 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 人血清2 | 0μL | 100μL | 200μL | 300μL | 400μL | 500μL |
| 生理盐水 | 500μL | 400μL | 300μL | 200μL | 100μL | 0μL |
[表5]
（稀释系列5）
| 稀释水平 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 人血清2 | 0μL | 100μL | 200μL | 300μL | 400μL | 500μL |
| 稀释液B | 500μL | 400μL | 300μL | 200μL | 100μL | 0μL |
使用デンカ生研公司制的sdLDL-C测定用试剂，利用日立7180型自动分析装置，按照下述方法来测定以稀释系列4、稀释系列5作为样本时的反应吸光度。
向样本3μL中添加第一试剂150μL，以37℃使其反应5分钟，接着，添加第二试剂50μL而使其反应5分钟后，在主波长600nm、副波长700nm下测定反应吸光度。
将以稀释系列4、稀释系列5的各稀释水平作为x轴，且以sdLDL-C的反应吸光度作为y轴时的结果示于图2-1和图2-2。
如图2所示那样，与使用生理盐水而制备的稀释系列4相比，使用含有HDL的稀释液B而制备的稀释系列5显示出良好的稀释线性。
实施例3
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-2）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
HDL浓缩液 2mg/dL（HDL-C）
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
实施例4
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-3）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-3）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
HDL浓缩液 3mg/dL（HDL-C）
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
使用实施例1、实施例3~4所述的TRL-C测定用试剂，利用与实施例1相同的方法分别测定以实施例1所述的稀释系列1作为样本时的TRL-C的反应吸光度。将以稀释系列的稀释水平作为x轴，且以TRL-C的反应吸光度作为y轴时的结果示于图3-1~图3-3。
如图3-1~图3-3所示那样，与使用不含HDL的TRL-C试剂而测定的情况相比，使用含有HDL的TRL-C试剂进行测定时显示出良好的稀释线性。
实施例5
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-4）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-4）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
磷脂（磷脂酰胆碱（PC）） 400mg/dL
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
实施例6
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-5）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-5）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
磷脂（磷脂酰胆碱（PC）） 800mg/dL
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
实施例7
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-6）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-6）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
磷脂（磷脂酰胆碱（PC）） 1600mg/dL
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
实施例8
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-7）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-7）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
磷脂（溶血磷脂酰胆碱（LPC）） 400mg/dL
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
实施例9
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-8）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-8）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
磷脂（溶血磷脂酰胆碱（LPC）） 800mg/dL
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
实施例10
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-9）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-9）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
磷脂（溶血磷脂酰胆碱（LPC）） 1600mg/dL
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
使用实施例1、实施例5~10所述的TRL-C测定用试剂，利用与实施例1相同的方法分别测定以实施例1所述的稀释系列1作为样本时的TRL-C的反应吸光度。将以稀释系列的稀释水平作为x轴，且以TRL-C的反应吸光度作为y轴时的结果示于图4-1~图4-7。
如图4-1~图4-7所示那样，与使用不含磷脂的TRL-C试剂进行测定的情况相比，使用含有磷脂的TRL-C试剂进行测定时显示出良好的稀释线性。
实施例11
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-10）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-10）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
磷脂样表面活性剂（LIPIDURE BL206（日油公司）） 0.25%（w/v）
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
实施例12
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-11）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-11）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
磷脂样表面活性剂（LIPIDURE BL1002（日油公司）） 0.25%（w/v）
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
实施例13
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-12）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-12）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
磷脂样表面活性剂（LIPIDURE SF08（日油公司）） 0.25%（w/v）
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
实施例14
制备包含下述第一试剂（TRL-C试剂1-13）、第二试剂（TRL-C试剂2）的TRL-C测定用试剂。
第一试剂（TRL-C试剂1-13）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
胆甾醇酯酶 2U/mL
胆甾醇氧化酶 2U/mL
过氧化氢酶 1200U/mL
TOOS 2.0mmol/L
聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚[HLB：12.8] 0.25%（w/v）
磷脂样表面活性剂（LIPIDURE SF16（日油公司）） 0.25%（w/v）
第二试剂（TRL-C试剂2）
PIPES、pH6.8 50mmol/L
4-氨基安替比林 4.0mmol/L
过氧化物酶 20单位/mL
叠氮化钠 0.05%（w/v）
聚氧乙烯烷基醚 0.5%（w/v）。
使用实施例1、实施例11~14所述的TRL-C测定用试剂，利用与实施例1相同的方法分别测定以实施例1所述的稀释系列1作为样本时的TRL-C的反应吸光度。将以稀释系列的稀释水平作为x轴，且以TRL-C的反应吸光度作为y轴时的结果示于图5-1~图5-5。
如图5-1~图5-5所示那样，与使用不含磷脂样表面活性剂的TRL-C试剂进行测定的情况相比，使用含有磷脂样表面活性剂的TRL-C试剂进行测定时显示出良好的稀释线性。
Claims (12)
1.定量方法，其是根据期望使用定量试剂对含有脂蛋白的待测试样中的脂蛋白胆甾醇进行定量的脂蛋白胆甾醇的定量方法，其包括：向所述待测试样中或所述定量试剂中添加磷脂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磷脂为磷脂酰胆碱（PC）或溶血磷脂酰胆碱（LPC）。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磷脂为磷脂样表面活性剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磷脂是与含有要定量的胆甾醇的脂蛋白不同的脂蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述磷脂为高密度脂蛋白（HDL）。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的方法，其中，所述脂蛋白为富含甘油三酯的脂蛋白（TRL）。
7.根据权利要求1~5中任一项所述的方法，其中，所述脂蛋白为小而密LDL。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的方法，其中，使用定量试剂对所述脂蛋白胆甾醇进行定量。
9.定量试剂，其是在权利要求1~8中任一项所述的方法中使用的脂蛋白中的胆甾醇的定量试剂，且其含有磷脂。
10.权利要求9所述的试剂的作为用于对含有脂蛋白的待测试样中的脂蛋白胆甾醇进行定量的试剂的用途。
11.定量试剂盒，其是在权利要求1~8中任一项所述的方法中使用的脂蛋白胆甾醇的定量试剂盒，且其含有磷脂。
12.权利要求11所述的试剂盒的作为用于对含有脂蛋白的待测试样中的脂蛋白胆甾醇进行定量的试剂盒的用途。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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