CN104076158B

CN104076158B - 一种用于测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒

Info

Publication number: CN104076158B
Application number: CN201410328097.9A
Authority: CN
Inventors: 袁锦云; 时敏; 韦锐; 叶强; 张华杰
Original assignee: Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co Ltd
Current assignee: Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co Ltd
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-07-10
Also published as: CN104076158A

Abstract

本发明涉及一种用于测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒。所述试剂盒包括第一试剂和第二试剂，其中，第一试剂包括抑制非高密度脂蛋白溶解的表面活性剂I和溶解高密度脂蛋白的表面活性剂II，所述表面活性剂I和所述表面活性剂II混合后的HLB值在13～14范围内，表面活性剂I和表面活性剂II在第一试剂中的体积比为1:30～1:1。该试剂盒通过几种成分的协同作用，提高了试剂盒的稳定性，能特异性释放HDL，同时能特异掩蔽抑制非HDL的解离，并可消除血清中其他成分的干扰，保证测量的准确性。

Description

一种用于测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒

技术领域

本发明涉及胆固醇的测定技术领域，尤其涉及一种用于测定高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒。

背景技术

人体血液中的胆固醇除了游离胆固醇，大部分与极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等脂蛋白结合成脂蛋白胆固醇形式存在。其中，HDL亦称为a1脂蛋白，比较富含磷脂质，在血清中的含量约为300mg/dl。其蛋白质部分，A－I约为75％，A－II约为20％。HDL接受来自于包括动脉壁的各组织的胆固醇，通过直接逆转运或间接逆转运，将其运入肝脏，再清除出血液，因此HDL与积累于细胞内的胆固醇的除去作用相关。因此高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)是动脉粥样硬化(AS)、冠心病(CHD)的等各种动脉硬化症的危险预防因子(呈负相关)，其在血液中的水平对动脉硬化性疾病的诊断有特异的辅助作用。

HDL-C增高最主要的临床价值是能够将动脉粥样硬化斑块的泡沫细胞转移至肝脏排出体外，可见于原发性高密度脂蛋白血症(家族性高α-脂蛋白血症)，并发现此群家族中长寿者多。接受雌激素胰岛素或某些药物(如烟酸、维生素E，肝素等)治疗者，亦可增高，虾青素可显著提升人类高密度脂蛋白胆固醇。高密度脂蛋白胆固醇降低常见于脑血管病冠心病、高甘油三酯血症、肝功能损害如急慢性肝炎、肝硬化、肝癌、糖尿病、吸烟、缺少运动等其降低可作为冠心病的危险指标。因此，体内高密度脂蛋白胆固醇浓度测定对诊断冠心病、心脑血管病、肝炎、肝硬化等疾病具有一定的参考意义。

目前HDL-C含量测定在临床试验中已经常规化。美国胆固醇教育计划(NCEP)对HDL-C测定的建议中指出：HDL-C测定的准确性非常重要，因为HDL-C在一个很窄的浓度范围内与冠心病呈负相关；CHD危险增高的界限是在HDL-C浓度范围的低端，测定的细小误差会产生相对大的影响。

测定高密度脂蛋白胆固醇的方法很多，目前市场上流通的主要是匀相测定法，包括PEG修饰酶法、选择抑制法、清除法和免疫分离法。

PEG修饰法是用PEG修饰改性胆固醇酯酶(CEH)和胆固醇氧化酶(COD)，修饰酶对脂蛋白的结构具有选择性，其次序是LDL＜VLDL＜CM＜HDL；另外葡聚糖、α-环糊精硫酸盐(α-SCD)和Mg²⁺与非HDL形成复合物，可以避免修饰酶对非HDL的作用，因此在葡聚糖、Mg²⁺、α-环糊精硫酸盐和修饰酶作用下可以直接测定HDL-C。

选择抑制法(PPD法)是在R1(第一试剂)中含表面活性剂I(HDL-C的反应抑制剂)、聚阴离子和某种盐，乳糜微粒(CM)、VLDL、LDL在多聚阴离子—盐环境下发生凝聚，同时表面活性剂Ⅰ与凝聚的脂蛋白的疏水基团有高度亲和力，能吸附在凝聚的脂蛋白的颗粒表面形成遮蔽，抑制非HDL-C的反应，同时，HDL上也有表面活性剂I，但由于亲和力较弱，反应是可逆的；R2(第二试剂)中含有对HDL亲水基团有高度亲和力的表面活性剂II(HDL-C的反应促进剂)，其对HDL的吸附不仅置换出第一反应中与HDL亲和的表面活性剂I，还能使HDL形成可溶性复合物，使HDL-C参与反应。

清除法是利用表面活性剂对脂蛋白的亲和性差异。在R1(第一试剂)反应促进剂(表面活性剂I)的作用下，血清中非HDL形成可溶性复合物，可溶性复合物表层的游离胆固醇在COD催化下反应生成H₂O₂，通过过氧化物酶(POD)(或过氧化氢酶(CAT)，R1中不加POD，不加叠氮钠)除去H₂O₂；然后，加入R2(第二试剂)，在特殊选择性表面活性剂作用下，只有HDL可溶，所释放的胆固醇在胆固醇酯酶(CEH)和COD作用下，生成H₂O₂，通过POD(如果R1中用CAT除去H₂O₂，则R2中要添加叠氮钠抑制其作用)、4-AAP和色原，发生显色反应，直接测定HDL-C。

免疫分离法有两种，一是PEG/抗体包裹法，用低浓度的PEG4000包裹非HDL，加入特异性抗apoB、apoCIII抗体，使非HDL颗粒复合物凝聚，然后加入胆固醇酶试剂，检测HDL-C，最后加入盐酸胍试剂，终止酶促反应和溶解含apoB脂蛋白复合物，避免干扰吸光度测定；二是抗体免疫分离法，R1中的抗人β脂蛋白抗体首先与血清中非HDL结合形成不溶性抗原-抗体复合物，加入R2后，复合物不与酶试剂起反应，只有HDL-C与酶试剂发生反应，生成H₂O₂，最后通过Trinder反应测定HDL-C含量。

PEG修饰法需要对酶进行修饰，很大程度上降低了酶的活性，造成成本增加；免疫分离法特异性抗体价格昂贵且反应步骤多，实用性差；清除法和选择抑制法主要关键是表面活性剂的选择，但表面活性剂的使用比较困难，对非HDL的掩蔽抑制不完全，同时对HDL的释放不彻底。

针对上述问题，非常有必要开发一种对HDL-C的检测更加灵敏的产品。

发明内容

本发明提供了一种测定高密度脂蛋白中的胆固醇的试剂盒，可简单、高效地检测高密度脂蛋白胆固醇的含量。

本发明提供的用于测定高密度脂蛋白中的胆固醇的试剂盒包括包括第一试剂(R1)，所述R1包括抑制非高密度脂蛋白溶解的表面活性剂I和溶解高密度脂蛋白的表面活性剂II，并且所述表面活性剂I和所述表面活性剂II混合后的亲水疏水平衡值(Hydrophile-Lipophile Balance Number，HLB值)为13～14。其中，HLB值也称水油度，它既与表面活性剂的亲水亲油性有关，又与表面活性剂的表面(界面)张力、界面上的吸附性、乳化性及乳状液稳定性、分散性、溶解性、去污性等基本性能有关，还与表面活性剂的应用性能有关。HLB值越大代表亲水性越强，HLB值越小代表亲油性越强，一般而言，HLB值从1～40之间。亲油性表面活性剂HLB较低，亲水性表面活性剂HLB较高。亲水亲油转折点HLB为10。HLB小于10为亲油性，大于10为亲水性。HLB在实际应用中有重要参考价值。

在本申请中，除非标明或毫无疑义的表明HLB值是公式计算值还是实际测量值，否则在本申请中均指实际测量值。

在一个具体的实施方案中，所述表面活性剂I在所述R1中的体积含量为0.1～3.0％。在一个优选的实施方案中，所述表面活性剂I在所述R1中的体积含量为0.3～1.0％。

在一个具体的实施方案中，所述表面活性剂II在所述R1中的体积含量为0.1～3.0％。在一个优选的实施方案中，所述表面活性剂II在所述R1中的体积含量为1.0～2.5％。

在一个具体的实施方案中，所述表面活性剂I和所述表面活性剂II在所述R1中的体积比为1:30～1:1。在一个优选的实施方案中，所述表面活性剂I和所述表面活性剂II在所述R1中的体积比为1:20～1:1。在一个进一步优选的实施方案中，所述表面活性剂I和所述表面活性剂II在所述R1中的体积比为1:15～1:1.5。

在一个具体的实施方案中，所述表面活性剂I选自聚氧乙烯烷基醚、(聚氧丙烯-聚氧乙烯)嵌段聚合物和壬基酚聚氧乙烯醚中的一种或多种；和/或所述表面活性剂II选自聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚、聚氧乙烯烷基醚、失水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯油酸酯中的一种或多种。例如，所述表面活性剂I选自Emulgen系列(如Emulgen A90、Emulgen 220和Emulgen LS114等)、Pluronic系列(如Pluronic F-88、Pluronic L121和Pluronic F127等)、NP系列(如NP-30、NP-10和NP-7等)中的任一种或多种；表面活性剂II选自Emulgen系列(Emulgen B66、Emulgen LS110、Emulgen 709等)、Pionin系列(如Pionin D6512、Pionin YE309等)、Noigen系列(Noigen EA-157、Noigen EA-167、Noigen EA-177等)中的任一种或多种。

在一个具体的实施方案中，所述R1还包括CAT和COD。将COD和CAT添加于R1中，能够消除游离胆固醇产生的H₂O₂，从而消除游离胆固醇的干扰。并且CAT的使用浓度优选为100-1000KU/L，COD的使用浓度优选为1-50KU/L。

在一个具体的实施方案中，所述R1还包括抗坏血酸氧化酶和/或胆红素氧化酶，分别用于氧化抗坏血酸和氧化胆红素。并且抗坏血酸氧化酶的使用浓度选自1-20KU/L，胆红素氧化酶的使用浓度选自1-20KU/L。因为胆固醇测试原理是COD氧化胆固醇形成H₂O₂最终H₂O₂+4-AAP+TOOS在过氧化物酶作用下生成醌类物质，在546nm的波长下测试其吸光度。如果不加入抗坏血酸氧化酶，抗坏血酸会还原H₂O₂，消耗掉H₂O₂，对测试结果有影响；抗坏血酸氧化酶可将抗坏血酸氧化成去氢抗坏血酸，而去氢抗坏血酸不能还原H₂O₂，从而提高了测试结果的准确性。胆红素本身有在450nm左右有吸收峰，会干扰吸光度，造成测试结果不准确。胆红素氧化酶能氧化胆红素成为胆绿素，而胆绿素在546nm波长附近无吸收峰。

在一个具体的实施方案中，所述R1还包括聚阴离子、Mg²⁺、α-环糊精硫酸盐、显色剂、第一防腐剂、第一保护剂和第一缓冲液。聚阴离子和Mg²⁺共同沉淀非HDL，α-SCD有内空腔的疏水环境，有微弱的极性与脂蛋白的疏水性基团结合，分子空腔外侧为亲水性基团，能包裹沉淀的非HDL，同时环糊精的磺酸基团可使CM、VLDL颗粒进入环状的糊精结构，可以避免酶的催化作用，其能力还与盐浓度有关。

在一个具体的实施方案中，试剂盒中还包括第二试剂，所述第二试剂包括助色剂、过氧化物酶、胆固醇酯酶、第二防腐剂和第二缓冲液，并任选地包括第二保护剂。因为显色剂和助色剂(例如4-AAP)放置一起，会缓慢反应形成显色物质，影响吸光度读取，因此有必要分开，把显色剂放在R1中，助色剂放在R2中；或把助色剂放在R1中，显色剂放在R2中。因为整个反应是酶的反应，要保证R1和R2中的pH和离子强度不影响酶的活性，因此要有合适的浓度和pH的缓冲液，即所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液，然后再加酶保护剂。另外，第一保护剂和第二保护剂可以相同，也可以不同，优选它们相同；第一缓冲液可以相同，也可以不同，优选它们相同。

在一个具体的实施方案中，所述聚阴离子的使用浓度选自0.1-5g/L，且所述聚阴离子选自硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖盐、肝素、肝素盐、钨磷酸、钨磷酸盐、硫酸寡糖、硫酸寡糖盐和硫酸软骨素中的一种或多种。

在一个具体的实施方案中，所述α-环糊精硫酸盐的使用浓度选自0.1-2g/L，且所述α-环糊精硫酸盐选自钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐中的任一种或多种。

在一个具体的实施方案中，所述显色剂的浓度为0.5-5mmol/L。所述显色剂选自苯胺类化合物或苯酚类化合物；所述苯胺类化合物选自N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-3-甲基苯胺、N,N-二(3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N＇-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N＇-乙酰乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)中的任一种；所述苯酚类化合物选自苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)中的任一种。

在一个具体的实施方案中，所述助色剂的使用浓度选自1-10mmol/L。所述助色剂选自4-氨基安替比林(4-AAP)或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮肼。

在一个具体的实施方案中，所述POD的使用浓度为1-50KU/L。

在一个具体的实施方案中，所述CEH的使用浓度为1-50KU/L。

在一个具体的实施方案中，所述第一防腐剂的使用浓度为0.1-1ml/L，所述第二防腐剂的使用浓度为0.1-2g/L。且所述第一防腐剂选自山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或多种；所述第二防腐剂为叠氮钠。

在一个具体的实施方案中，所述第一保护剂的使用浓度选自1-10g/L，所述第二保护剂的使用浓度选自1-20g/L，且所述第一保护剂和所述第二保护剂各自独立的选自甘油、白蛋白、蔗糖、NaCl、EDTA中的任一种或多种。保护剂通过与酶的基团结合，能够降低其它成分对酶的抑制作用，提高酶的效率；或者与酶发生键合作用，稳定酶的构象；或者与重金属离子结合，避免重金属对酶活性的抑制；或者促进反应的进行。

在一个具体的实施方案中，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液的使用浓度各自独立的选自0.01-0.5mol/L，pH各自独立的选自6.0-8.0，且所述第一缓冲液的溶剂和所述第二缓冲液的溶剂各自独立地选自三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、Good’s缓冲剂、硼酸缓冲剂中的任一种或多种。其中，所述Good’s缓冲剂选自2-吗啉乙磺酸(MES)、二(2-羟基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N＇-二(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基甲磺酸(BES)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基甲磺酸(TES)、2-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]乙烷磺酸(HEPES)、3-[N,N＇-二(2-羟甲基)氨]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N＇-二(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N＇-二(2-羟甲基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基甲磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)中的任一种或多种。

在本发明的一个具体的实施方案中，第一试剂包括如上所述的表面活性剂I、所述表面活性剂II、聚阴离子、Mg²⁺、第一防腐剂、第一保护剂、第一缓冲液、显色剂、CAT、COD、抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶和α-SCD；第二试剂包括如上所述的第二缓冲液、第二保护剂、第二防腐剂、助色剂、POD和CEH。

在测定HDL-C时，许多厂家把表面活性剂I和表面活性剂II分别放置在R1和R2中，没有考虑表面活性剂的复配作用，或者考虑了复配作用，但是这些厂家忽略了测定过程中的酶反应是一个极快速的反应，两种表面活性剂在复配的同时，酶同样作用于非HDL，造成测试结果不准确。

而在本发明中的反应的第一阶段，两种表面活性剂同时在R1中混合，混合后的表面活性剂通过疏水键、氢键等作用，所述表面活性剂的CMC值、HLB值等都会有复杂的变化，因而表面活性剂I和II的作用也不再是简单的1+1＝2的结果，而是具有协同增效作用。例如，把表面活性剂I和表面活性剂II复配添加在第一试剂中，表面活性剂I为掩蔽非HDL的主要表面活性剂，而表面活性剂II一方面辅助表面活性剂I抑制非HDL的解离，另一方面又促进HDL的释放，使得HDL在仅有第一试剂参与反应的第一阶段就释放完全，并与非HDL的掩蔽同步进行。

对于表面活性剂复配的HLB值，有研究通过公式(1)计算得到，但计算结果和实验测量结果最多可以相差1-2个HLB值，同时复配方案较少，没有形成最佳复配方案。

用水数法、浊点法或色谱法为实验测量方法测定HLB值。水数法即将0.2g表面活性剂试样溶解在20ml二恶烷/苯(96/4，V/V)中，用水滴定至明显可见的浑浊，以ml为单位，计算滴定至终点的用水量，即水数W。浊点法即将10％的表面活性剂水溶液置于大试管中，液面高50mm，在甘油浴中边搅拌边缓慢加热，当溶液透明度降低而变浑浊时，试管内的温度即表面活性剂浊点。色谱法是以非离子表面活性剂为基质，特定条件下测定乙醇和正己烷的保留时间比，与HLB值有一定的线性关系。HLB值按表1公式计算。

取三组不同类型表面活性剂按比例混合后分别按公式(1)和实验测量法计算混合表面活性剂的HLB值(用表1中相对应表面活性剂实验法计算公式)，结果如表2。从表2中可以看出，按经验公式(1)计算出的HLB值与实验测量的HLB值差别较大，而复配的表面活性剂往往不是同一类型的表面活性剂，也难以用实验测量得出HLB。

因此本发明以经验公式(1)为参考，计算出复配表面活性剂的混合比例(13＜HLB＜14值)，以减少实验量；再用硫酸葡聚糖-Mg沉淀法，得到较纯的HDL和非HDL样本，通过大量表面活性剂复配方案配成HDL-C测定试剂盒，测试较纯的HDL和非HDL样本，最终找到几组较好的表面活性剂复配方案，能特异掩蔽抑制非HDL的解离，同时特异释放HDL，准确测试HDL-C。

表1浊点、水数法计算HLB值公式

表2公式计算HLB值与实验测量HLB值比较

而第二阶段即为已释放的HDL参与显色反应，这样缩短反应时间，并消除了HDL与表面活性剂I结合之后加入含有表面活性剂II的R2，再将表面活性剂I中的HDL释放到溶液中而呈现可溶状态带来的HDL从表面活性剂I中释放不充分造成的检测误差的问题；同时，表面活性剂I和表面活性剂II之间有严格的配比关系，能够到最佳复配效果。

有益效果和显著优点：

本发明通过优化实验条件，找到一种可准确测量HDL-C的试剂盒，通过该试剂盒测量HDL-C，不仅可以缩短测量时间，提高效率，带来经济效益，更重要的是，该试剂盒通过几种成分的协同作用，提高了试剂盒的稳定性，能特异性释放HDL，同时能特异掩蔽抑制非HDL的解离，并可消除血清中其他成分的干扰，保证测量的准确。

具体实施方式

以下以具体实施例对本发明进行详细说明，但本发明的范围并不限于此。

其中表面活性剂I中的Emuleng 220的主要化学组分为聚氧乙烯十六烷基醚，NP-7的主要化学组分为壬基酚聚氧乙烯醚，PluronicL127的组要化学组分为聚氧丙烯和聚氧乙烯嵌段聚合物，表面活性剂II中的Emulgen B66的主要化学组分为聚氧乙烯基衍生物，Emulgen 709的主要化学组分为聚氧乙烯烷基醚，Pionin D-6512的主要化学组分为失水山梨糖醇脂肪酸酯，Noigen EA-157的主要化学组分为聚氧乙烯油酸酯。

实施例1

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表3)：

表3

R2包括如下组分(表4)：

表4

实施例2

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表5)：

表5

R2包括如下组分(表6)：

表6

实施例3

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表7)：

表7

R2包括如下组分(表8)：

表8

实施例4

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表9)：

表9

R2包括如下组分(表10)：

表10

实施例5

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表11)：

表11

R2包括如下组分(表12)：

表12

实施例6

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表13)：

表13

R2包括如下组分(表14)：

表14

实施例7

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表15)：

表15

R2包括如下组分(表16)：

表16

实施例8

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表17)：

表17

R2包括如下组分(表18)：

表18

实施例9

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表19)：

表19

R2包括如下组分(表20)：

表20

对比例1

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表21)：

表21

R2包括如下组分(表22)：

表22

对比例2

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表23)：

表23

R2包括如下组分(表24)：

表24

对比例3

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表25)：

表25

R2包括如下组分(表26)：

表26

对比例4

一种具体的高密度脂蛋白中的胆固醇的检测试剂盒(检测结果见表30)。其中，R1包括如下组分(表27)：

表27

R2包括如下组分(表28)：

表28

实施例10

操作步骤：以上各实施例以及对比例分别为不同表面活性剂复配的优选方案，利用公式计算出HLB值，并实际测量出HLB值，见表29。

设定BC1200全自动生化分析仪(新产业生物医学工程股份有限公司)反应温度为37℃，反应方法为2点终点法，测定波长为505/660nm，反应方向为向上，样本：R1：R2加样量为3μL：180μL：60μL，反应时间为10分钟。用朗道校准血清定标后，用以上实施例和对比例试剂盒测定朗道质控和伯乐质控，结果见表30。

表29

表30

从表30可见，各实施例测试结果与靶值具有良好的线性相关性，尤其以实施例1和实施例2为优选实施例，其次为实施例4。

实施例1相对于实施例8，试剂增加了抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶，抗坏血酸和胆红素增加了对测试结果的准确性。因为胆固醇测试原理是COD氧化胆固醇形成H₂O₂最终H₂O₂+4-AAP+TOOS在过氧化物酶作用下生成醌类物质，在546nm的波长下测试其吸光度。抗坏血酸会还原H₂O₂，消耗掉H₂O₂，对测试结果有影响；胆红素本身有在450nm左右有吸收峰，会干扰吸光度，造成测试结果不准确。抗坏血酸氧化酶可将抗坏血酸氧化成去氢抗坏血酸，而去氢抗坏血酸不能还原H₂O₂，从而提高了测试结果的准确性；胆红素氧化酶能氧化胆红素成为胆绿素，胆绿素在546nm波长附近无吸收峰。

实施例1相对于实施例9，试剂中加入了BSA作为保护剂，BSA不仅能稳定试剂，在反应过程中还起到加快正反应的作用，因而增加了测试结果的准确性。

实施例1相对于对比例1增加了表面活性剂复配对测量结果的影响，因而实施例1中对HDL的释放和对非HDL和掩蔽的特异性更好，进一步增加了测试结果的准确性，从而其测量效果明显优于对比例1。同理，实施例2的测量效果明显优于对比例2，实施例5的测量效果明显优于对比例3，实施例7的测量效果明显优于对比例4。

虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。

Claims

1.一种用于测定高密度脂蛋白中的胆固醇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一试剂，所述第一试剂包括抑制非高密度脂蛋白溶解的表面活性剂I和溶解高密度脂蛋白的表面活性剂II，并且所述表面活性剂I和所述表面活性剂II混合后的亲水疏水平衡值为13～14；

所述第一试剂还包括过氧化氢酶和胆固醇氧化酶；

所述表面活性剂I选自(聚氧丙烯-聚氧乙烯)嵌段聚合物和壬基酚聚氧乙烯醚中的一种或多种；所述表面活性剂II选自聚氧乙烯烷基醚、失水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯油酸酯中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂I在所述第一试剂中的体积含量为0.1～3.0％。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂II在所述第一试剂中的体积含量为0.1～3.0％。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂I和所述表面活性剂II在所述第一试剂中的体积比为1:30～1:1。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂还包括抗坏血酸氧化酶和/或胆红素氧化酶。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂还包括聚阴离子、Mg²⁺、α-环糊精硫酸盐、显色剂、第一防腐剂、第一保护剂和第一缓冲液。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二试剂，所述第二试剂包括助色剂、过氧化物酶、胆固醇酯酶、第二防腐剂和第二缓冲液。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第二试剂还包括第二保护剂。

9.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述聚阴离子选自硫酸葡聚糖、硫酸葡聚糖盐、肝素、肝素盐、钨磷酸、钨磷酸盐、硫酸寡糖、硫酸寡糖盐和硫酸软骨素中的一种或多种；

所述α-环糊精硫酸盐选自钠盐、钾盐、铵盐、镁盐和钙盐中的任一种或多种；

所述显色剂选自苯胺类化合物或苯酚类化合物；所述苯胺类化合物选自N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺、N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N,N-二甲基-3-甲基苯胺、N,N-二(3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’乙酰乙二胺和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺中的任一种；所述苯酚类化合物选自苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚和3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸中的任一种；

所述助色剂选自4-氨基安替比林或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮肼；

所述第一防腐剂选自山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠和Proclin系列中的任一种或多种；

所述第二防腐剂为叠氮钠；

所述第一保护剂和所述第二保护剂各自独立地选自甘油、白蛋白、蔗糖、NaCl和乙二胺四乙酸二钠中的任一种或多种；

所述第一缓冲液的溶剂和所述第二缓冲液的溶剂各自独立地选自三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、Good’s缓冲剂和硼酸缓冲剂中的任一种或多种；其中，所述Good’s缓冲剂选自2-吗啉乙磺酸、二(2-羟基)亚氨基三(羟甲基)甲烷、N-(2-乙酰胺)亚氨基二乙酸、哌嗪-N,N’-二(2-乙烷磺酸)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基甲磺酸、3-吗啉代丙磺酸、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基甲磺酸(TES)、2-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]乙烷磺酸、3-[N,N’-二(2-羟甲基)氨]-2-羟基丙磺酸、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸、哌嗪-N,N’-二(2-羟基丙磺酸)、3-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]-2-羟基丙磺酸、3-[4-(2-羟甲基)-1-哌嗪]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸、N,N’-二(2-羟甲基)甘氨酸、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、N-环己基-2-氨基甲磺酸、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸和N-环己基-3-氨基丙磺酸中的任一种或多种。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第二试剂中不包括表面活性剂。