JPS6031819B2 - 新規コリン誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は一般式（１） 〔式中ＡはＢが−Ｒ−ＣＯＯ−（式中Ｒは炭素数２−６
の低級アルケニル基を表わす）で表わされるアルケニル
ェステル基である時にはベンゼン環のパラ位に置換され
たメチル基もしくはメトキシ基を表わし、Ｂが式−ＣＯ
Ｏ−で表わされるカルボキシル基である時はベンゼン環
のオルソ位に置換されたメチル基もしくはメタ位に置換
された水酸基を表わし、×はハロゲン原子を表わす〕で
表わされる新規コリン議導体に関する。 本発明化合物はコリンェステラーゼの基質として有用な
化合物である。 本発明により提供される一般式（１）で示される化合物
として具体的な化合物をその物性値と共に第１表に示す
。 これらの化合物はいずれも実施例に示す如く、コリン誘
導体合成の常法に従い酸誘導体とハロゲン化コリンから
合成される。 第１表中： 化合物１，ロの類似化合物として式（０）〔但し、式中
Ｚは−Ｎ０２または を表 わす〕で表わされる化合物（ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔ
ｒａｃｔ，５８，５９４０ｈ）が知られている上記２化
合物はコリンェステラ−ゼの阻害剤であって基質として
は利用できない。 又、式（ｎ）においてＺ＝日の化合物も公知であるが、
この化合物は後記第８表に見られる如く、ベンゾィルコ
リンに比べて分解速度が早く不安定で基質として実用的
に使用し難い。化合物ｍの類似化合物としては○−メチ
ル基が○−ニトロ基に代った化合物、０−メチル基がｍ
−クロルに代った化合物が知られている。 （ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔ ７２，Ｐ，５３
９７が）しかしいずれの化合物も植物の成長抑制効果を
示すのみで、コリンェステラーゼの基質として用いられ
ることを何んら示唆していない。 化合物Ｗの類似化合物として化合物Ｎのｍ−ハイドロキ
シ基が○ーハィドロキシ基に代った化合物等が知られて
いる。〔茂ｒｉｃｈｔｅ ６３，３１９０（１９３０）
，Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ ｓ ＺｅｉＰｃｈｍ
ｔ ｆｕｒ Ｐｈ＊ｉｏｌｏｇｓｃｈｅＣｈｅｍｉｅ．
Ｂｅｒｌｉｎ ２８８，５１（１９５１）〕しかし、こ
の既知化合物をコリンヱステラーゼの基質として用いた
時には反応速度が遅く、基質としては使えないことがむ
しろ示唆されている。次に参考例をあげて本発明化合物
がコリンェステラーゼの基質として有用であることを示
す。参考例 １＜本願発明基質を便して、コリンオキシ
ターゼを用いるコリンェステラーゼの活性測定法＞式（
ロ） ィ 試薬液の調製 常法により０．０９のートリス塩酸緩衝液（ＰＨ７．５
）３泌中に下記の成分を含有させた試薬液を作成する。 ４ーアミノアンチピリン ３雌フエノール
２．８の９コリンオキ
シダ−ゼ（参考例２で作成したもの）
７．０５Ｕパーオキシダーゼ（Ｗ
ｏｒ比ｉｎｇｔｏ材生製） ９．１Ｕ基質（オルソーメ
チルベンゾィルコリン塩酸塩）
０．２の２ロ 分析法上記の如く作成した各
試薬液３Ｍに２０ム１の被験血清ならびに標準血清Ｑ−
ＰＡＫ１（／・ィランド社製（米国）、コリンェステラ
ーゼ活性値１４５８Ｕ／のとのもの）２０ｗｌを入れ、
３７００で第２表記教の時間インキュベートし、ネオス
ティブミン２の９を加えて反応を停止し、次いで分光々
度計で、波長５０仇ｍでの夫々の吸収を測定する。 得られた夫々の測定値を第２表に示す。尚、参考の為に
基質を既知のペンゾィルコリンに代えて測定した時の結
果も併せ示す。尚、ベンゾィルコリンを含む試薬液は常
法により３の‘の０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ＰＨ７
．５）中に下記の成分を含有させて作成する。４ーアミ
ノアンチピリン ０．５の９フエノール
１．４の９コリンオキシ
ダーゼ ７．１５Ｕｎｉｔパーオキ
シダーゼ １０．３Ｕｎｉｔ基質
ペンゾィルコリン ０．５のｐ第 ２
表オルソーメチルベンゾィルコリン塩酸塩を基質として
用いた場合、次式に示す如き比例配分法により患者血清

【１１中のコリンェステラーゼ活性は約８４１ｍＵ／机
上と求められた。 コリンェステラーゼ− １４５８ × 患者血
清活 性 値 標準血清の吸光度 の吸光度同様に患
者血清｛１’をペンゾイルコリン酸塩を基質として用い
た場合も同様に、４分目、１び分目の測定値より比例配
分法によりコリンェステラーゼ活性は約８４４ｍＵ／の
‘と求められた。 但し、２０分目、４０分目の測定値は正確な値を示さな
い。同様に患者血清■をオルソーメチルゾィルコリン塩
酸塩を用いて測定した場合には、２２６肌Ｕ／泌と求め
られた。一方、ベンゾィルコリン塩酸塩を基質として用
いた場合には、４分目の測定値のみ２２５肌Ｕ／地と正
確な値を示すが、それ以後の測定値は吸光度が頭打ちと
なり正確な値を示さない。これはペンゾィルコリンの反
応が早すぎる為コリンオキシダーゼが必要とする溶存酸
素が不足し、正常値を示さないものと考えられる。この
場合は血清希釈を行なわないと正確な測定値は得られな
いが、現実的には不可能に近い操作である。又、実用的
には４分間で測定を停止するのは誤差要因も多く不利が
多い。一方本願発明による基質を用いると、コリンェス
テラーゼ活性値が高くても、相当長時間の反応でも、吸
光度が飽和しないで正確な測定値を与えるので、その有
用性は極めて大である。 尚、参考の為に本発明およびペンゾィルコリンを含有す
る試薬液中の各化成分の濃度を示すと次の如くである。 第 ３ 表第３表から明らかな如く、ベンゾィルコリン
の濃度範囲は本発明物質を基質として用いる時と比較し
て狭く、それだけ使用範囲が狭いことを意味する。 一方発明物質を基質として用いると使用範囲が広く使い
易いことを意味する。実施例１と同様にして、用いる基
質を○ーメチルベンゾィルコリン塩酸塩に代えて第４表
記教の化合物を用いて、標準血清および肝疾患者血清を
測定した時の測定値（吸光度）を同様に第４表に示す。 いずれの基質を用いても測定値は飽和することなく正確
な測定値を与えていることが判かる。 第 ４ 表参考例 ２ 本発明において用いるコリンオキシターゼは以下の如く
に調製する。 尚、活性は以下の如くに定める。 ィ 活性測定法 コリンオキシダーゼによりコリンが酸化される際に生成
する過酸化水素をベルオキシダーゼで分解し、フェノー
ル４−アミノアンチピリン発色系に導く方法により測定
する。 この測定法の詳細は次の通りである。すなわち、４−ア
ミノアンチピリン、フェノール各々０．０１ｍｏｌ／そ
を含むし０．０５ｍｏｌノートリスバッフアー溶液（ｐ
Ｈ７．０）にパーオキシダーゼを該溶液１００の【あた
り５００Ｕ含有させたものを発色液とする。該発色液３
泌に活性を測定すべき酵素溶液０．１の‘／、１／３肌
ｏｌ／１塩化コリン溶液０．１の‘を添加し、３７ｏｏ
で２０分間反応後、５０仇ｍの吸光度を測定する。活性
の単位Ｕは１分間に１仏ｍｏｌの基質を分解する酵素力
価とする。ロ コリン・オキシダーゼ調製法 種菌としてブレビバクテリウム・アルバムＫＹ４３１９
（徴工研寄託受理番号第３７７７号、ＮＲＲＬＢ−１１
０４６）を使用する。 塩化コリン２ｇ／の、コーン・スチーブ・リカー０．５
ｇ／ｄ‘、酵母エキス０．５ｇ／ｄ‘、グルタミン酸ソ
ーダ０．雛′の、リン酸二カリウム０．１ｇ／ｄ‘、硫
酸マグネシウム・７水塩０．０５ｇ′ｄ‘（ｐＨ７．２
）よりなる種培養培地を７０叫客大型試験管に１０の【
分注し、１２『０で１筋ご殺菌する。 該培地に前記菌株を１白金耳接種し、３０００で４斑時
間振濠培養する。ついで得られる培養液のすべてを２１
容三角フラスコに分注した前記と同じ種培養培地３００
の‘に接種し、３０℃、４即時間振糧培養する。培養終
了後、培養液のすべてを５１ジアーフア−メンター中の
３．０１の同上培地に接種し、３０℃、５０仇．ｐ．ｍ
．，通気１１／１（渚地）／ｍｉｎで本培養を行い、２
岬時間で培養を終了する。 コリン・オキシダーゼ生産量は培養液１の【あたり０．
６２Ｕである。培養終了液からコリン・オキシダーゼを
採取するため、該液を遠心分離して菌体を得、これをｐ
Ｈ８．０の０．０靴ｏｌ／１トリス・バッファー１１に
懸濁ちたのち、ダイノ・ラボラトリー・ミル（Ｄ如ｏい
ｂｏｒａｔｏひ ｍｍ）ＫＤＬ型（Ｗｉｌｌｙ Ａ，Ｂ
ａｃｈｏｆｅｎｌｎｃ．ＳＷｉｔｚｅｒ−ｌａｎｄによ
り製造されている）にて菌体を破砕し、菌体破砕液を得
る。菌体破砕液を遠心分離して上清液を得る（前記培養
終了液中のコリン・オキシダーゼの生産量はこの上清液
を酵素溶液としてコリン・オキシダーゼの活性を測定す
ることにより求められたものである）。この上情液に硫
酸アンモニムを添加して、硫酸アンモニウム３０％飽和
とし、沈澱物を遠心分離により除き、上清液を得、この
上清液に硫酸アンモニウムを添加して、硫酸アンモニウ
ム６０％飽和とし、沈澱物を遠心分離により集める。こ
の沈澱物をｐＨ８．０の０．０８ｈｏｌ／１のトリス・
バッファーに溶解し、同バッファーで一夜５℃でセロハ
ン・チューブを透析膜として透析する。透析チューブ内
液を０．０５ｍｏｌ／１塩化ナトリウムを含むトリス・
バッファー（ｐＨ８．０）で平衡にした１１のＤＥＡＥ
セル０‐スカラムにチセージし、０．０靴０１／ー塩化
ナトリウムを含むトリス・バッファー（ｐＨ８．０）１
１で洗浄後、塩化ナトリウム０．０５〜０．４５ｍｏｌ
ノーの濃度勾配で溶出を行う。コリン・オキシダーゼの
溶出区分を集め、硫酸アンモニウム６０％飽和とし、沈
澱物を遠心分離により集める。この沈澱物をｐＨ８．０
の０．０８ｈｏｌ／１トリス・バッファーに溶解し、ｐ
Ｈ８．０の０．０５ｈｏｌ／１トリス・バッファーで平
衡にした５００叫のセフアデツクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
）Ｇ−１５０（デキストラン誘導体よりなる分子筋の商
標名：Ｐｈａ皿ａｃｉａ ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ
Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．により製造されている）にチャ
ージし、同バッファーで溶出する。 コリン・オキシダーゼの溶出区分を集め、硫酸アンモニ
ウム６０％飽和とし、沈澱物を遠心分離により集める。
この沈澱物をｐＨ８．０の０．０８ｈｏｌ／１トリス・
バッファーに溶解し、同バッファーで一夜５℃でセロハ
ンチューブを透析膜として透析する。透析後、０．１ｍ
ｏｌ／１塩化ナトリウムを含む０．０５ｈｏｌ／】トリ
ス・バッファー（ｐＨ８．０）で平衡にしたＤＥＡＥ−
セフアデツクスＡ−５０（弱塩基性陰イオン交換樹脂の
商標名：ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌ
ｓ Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．により製造されている）５
００Ｍにチャージし、０．１ｍｏｌ／１塩化ナトリウム
を含む０．０８ｈｏｌ／１トリス・バッファー（ｐＨ８
．０）５００の‘で洗浄し、次に塩化ナトリウム０．１
〜０．５ｍｏｌノーの濃度勾配で溶出を行う。コリン・
オキシダーゼ溶出区分を集め、ｐＨ８．０の０．０５ｍ
ｏｌ／１トリス・バツフアーでセロハン・チューブを透
析膜として透析後、凍結乾燥する。約１０％の活性収率
でコリン・オキシダーゼを採取する。活性２．２Ｕ／の
９蛋白。参考例 ３ ＜本願発明物質を基質を用い、柴田−高橋法に準じるコ
リンェステラーゼの活性測定法＞１ 試薬の調製法 ｍ ベロナール・Ｂーグリセロリン酸緩衝液（ｐＨ８．
３）５，５−ジェチルバルビッール酸ナトリウム３．０
雌を約５００の‘の水に溶解し、次に５，５一ジェチル
バルピッール酸１．０腿を加え加温熔解する。 冷却後８ーグリセロリン酸ナトリウム５．００ｇを溶解
しＱＯを加て１０００の‘とする。■ 基質溶液 ィ 塩化アセチルコリン１ｇに水１０の‘を加えて溶解
する。 ロ ○−メチルベンジルコリン塩酸塩０．５ｇに水１０
のを加えて溶解する。 （３｝ フェノールレッド溶液（４０の９／ｄ‘）フェ
ノールレッド１００雌に０．１Ｎ水酸化ナトリウム液３
．０柵および水７．５の‘を加え６０ｑｏくらいの傷浴
中で溶解する。 冷却後水を加えて２５０の‘とする。 ‘４１ ェゼリン溶液（０．１ｇ′の） サリチル酸フイゾスチグミン０．１ｇを水に溶解し１０
０Ｍとする。 ｛５｝ リン酸緩衝液（１／ｌａＭ） ■ リン酸二水素カリウムＫＨ２Ｐ０４９．０雛を水に
溶かして１０００私とする。 ■ リン酸−水素ナトリウムＮａＨＰｏ４・２ＬＯｌｌ
．繁迄を水に溶かしてｌ０００の‘とする。 ２ 反応試液の調製 １ べロナールー８−グリセロリン酸緩衝液１．５の‘
２ 基質溶液 ０．２５の【３
フェノールレッド溶液 ０．１の【４ 水
３．０５叫上記の容
量比で混合した溶液を反応謎液とする。 ３ 検量線作成 リン酸緩衝液（リン酸二水素カリウム、リン酸−水素ナ
トリム）にてｐＨ５．９〜８．３の緩衝液系列を作り、
各ｐＨ緩衝液５．０の【にフェールレッド溶液０．１の
Ｚずつを加えて混合したのち２０ｑｏ±１℃に溶液温を
保ちながら水を対照として５７仇ｍにおける吸光度を測
定する。 この吸光度と表示ｐＨをプロットｐＨ−吸光度検出量線
を作る。４ 測定操作 盲検おび検体（血清）用容器を用意し、反応試験液４．
９の‘を分注し、３７０５分間予備保温する。 しかるのち盲検用に水０．１の‘、検体用に血清０．１
Ｍを加え混合したのち３７℃６０分間正確に反応を行い
、ェゼリン溶液０．１の‘ずつを加え室温に放置する。
しかるのち２０ｑｏ水槽にて試験管内の液温が２０℃（
±２℃）となるまで（約１０分間）放置後水を対照に５
７仇ｍの吸光度を測定する。あらかじめ求めていた検量
線よりｐＨＢｌａｎｋ、ｐＨＳｅｒ皿ｍを求め、ｐＨＢ
ｌａｎｋよりｐＨＳｅｒｕｍを差し引いた値△ｐＨは次
の如くであった。結果を第５表に示す。第 ５ 表第５
表の結果から、アセチルコリン塩酸塩の△ｐＨと０−メ
チル−ペンゾィルコリン塩酸塩の△ｐ則こは極めてよい
相関が認められる。 相関係数 ０．９９３ 回帰直線 ｙ＝０．９２松十０．５６４ （但しｙは本発明の基質○−メチルベンゾィルコリン塩
酸塩による測定値、ｘはァセチルコリン塩酸塩を用いる
測定値を表わ す。 ）従って、既に求められているアセチルコリン塩酸塩の
△ｐＨとコリンェステラーゼ活性（ＩＵ）との相関表よ
り、検体中のコリンェステラーゼ活性は簡単に求められ
ることが判る。 参考例 ４ 参考例３で測定した検体（血清５）を用いて参考例３と
同様な操作で繰返し測定した値は第６表の通りであった
。 第６表の結果から明らかな如く、本発明基質を用いた場
合には変動係数が非常に小さく正確な分析値を与えるこ
とを示している。 第６表 次に本発明に用いられる一般式（１）で表わされる化合
物（基質）および既知の基質をコリンェステラーゼの基
質として用いた時の夫々の反応速度の比較を第７表に示
す。 表示は従来用いられている代表的基質ペンゾィルコリン
の反応速度を１として比反応速度で表わす。測定方法は
以下の通り。 ４−アミノンチピリン ３の９フエノール
２．８の９コリン
オキシダーゼ※１ ７．０５Ｕパーオ
キシダーゼ２ ９．１Ｕを含有
する３の【の０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５
）に第２表記戦の各種基質を各０．２ｍ９ずつ添加する
。 ３７００で１粉ふ間予備加溢したのち、標準血清を各々
２０〆１ずつ加え、波長５０皿ｍでの吸光度を経時的に
測定する。 得られた吸光度より単位時間（分）当りの上昇吸光度を
求める。夫々の単位時間当りの上昇吸光度をペンゾィル
コリンを１とした場合の比率で表わす。※１ コリンオ
キシダーゼは前記参考例２より得られたものを使用した
。 第 ７ 表 又、本発明によって得られる一般式（１）で表わされる
化合物（基質）および既知の基質の溶液安定性を以下の
如く測定し、ベンゾィルコリンを１として相対比で表わ
した。 結果は第８表に示す。測定方法は以下の通り。 化合物０．６１５ｈｍｏｌ／３の‘〔０．０８Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）〕溶液を作成し、３７０で３
日間放置した後、該化合物から生成したコリン量を求め
て分解速度を求めた。 生成したコリンの測定法は前記した如くコリンオキシダ
ーゼを作用させ生成した過酸化水素に４−アミノアンチ
ピリンを作用させ、生成したキノンィミン系色素を５０
仇ｍの吸光度を測定するとにより求めた。この色素量は
コリンの生成量に対応する。数字が小さい程、分解速度
が遅い、即ち安定性が良好なことを示す。 第 ８ 表 第８表の結果より明らかな如く、ベンゾィルコリン、ア
セチルコリン等の既知基質は経時的に分解が進み、ブラ
ンク値が上昇する。 従って基質含有試薬液を調製後、日数が経過すると高値
を与える。一方本願発明の基質はいずれも既知基質に比
べて分解速度が遅く、保存安定性が良好であることを示
している。これらの性質がコリンェステラーゼ活性の測
定に好都合であることは言うまでもないことである。 実施例 １ 本発明において提供される各種化合物（基質）は下記の
如くに合成される。 ィ オルソーメチルベンゾィルコリン・塩酸塩の合成オ
ルソベンゾイル・クロライド２５ｇとコリン・塩酸塩（
塩化コリン）２２．蜜を１２０−１４０℃で４時間還流
し、次いで反応液を濃縮乾固する。 ｎーヘキサン１００加えよく洗浄した後、ｎーヘキサン
を炉去し、ｔｅｎ−ブタ／ール４０の‘を加え加熱溶解
し、次いで冷蔵庫（５℃）中で一夜放置し結晶化させる
。結晶を炉取し、３０の‘のにｒｔープタノールーヱタ
ノール容量比３：１）混合溶媒から再結晶し、結晶を炉
取、減圧乾燥する。収量３錐（収率約８０％）函虫点１
４２−１４ｙｏ他の物性値は第１表記載の通りで、表記
化合物と同定される。 他の基質も上記と同様に相当する酸クロラィドおよび塩
化コリンを用いて合成され、夫々の物性値は第１表記戦
の通りである。第 １ 表第 １ 表（続き）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式（I） ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＡはＢが−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯ−で表わされる
   時は、ベンゼン環のパラ位に置換された、メチル基もし
   くはメトキシ基を表わし、Ｂが式−ＣＯＯ−で表わされ
   るカルボキシル基である時は、ベンゼン環のオルソ位に
   置換されたメチル基もしくはメタ位に置換された水酸基
   を表わし、Ｘはハロゲン原子を表わす〕で表わされるコ
   リン誘導体。