JPH0426624B2 - - Google Patents

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JPH0426624B2
JPH0426624B2 JP62018752A JP1875287A JPH0426624B2 JP H0426624 B2 JPH0426624 B2 JP H0426624B2 JP 62018752 A JP62018752 A JP 62018752A JP 1875287 A JP1875287 A JP 1875287A JP H0426624 B2 JPH0426624 B2 JP H0426624B2
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formula
block
carbon atoms
alkyl group
hydrolyzable
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JP62018752A
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Edowaado Batsubu Buruusu
Torokonisu Berii Robaato
Marii Sensunii Patorishia
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Eastman Kodak Co
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Eastman Kodak Co
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B3/00—Dyes with an anthracene nucleus condensed with one or more carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description

【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕 本発明は、加水分解可能な化合物（以下、基質
ということがある）並びにそれを含む分析組成物
及び分析素子並びにそれを用いる分析方法に関す
る。 〔従来の技術〕 水、ミルク及び生物学的流体などの液体の化学
分析は、健康の維持及び診断治療のためにしばし
ば望ましいか或いは必要となる。このような分析
を容易にするために種々の分析組成物や素子（一
般に要素といわれていることもある）が知られて
いる。かかる材料は通常分析下の物質（本明細書
では被分析物という）を測定するための試薬組成
物を含む。被分析物は、例えば酵母細胞、白血球
細胞もしくはその他の生きている有機体（生物）
などのような生きている細胞又は生きていない化
学物質とすることができる。被分析物と相互作用
又は反応する試薬組成物は、何んらかの方法で定
量できる検出可能な変化（例えば色素又は染料形
成）を生ずる。 生物学的流体中の特定の加水分解酵素の分析は
或る種の疾病の診断及び治療に有用である。この
分析は、有機体の代謝は広範囲の酵素の存在に依
存するので、或る種の微生物の存在を測定するの
にも有用である。 問題の酵素の基質を分解して検知可能な部分を
放出する多数の分析方法が開発されている。これ
らの方法は発色及び螢光染料（又は色素）の両者
を有している。 螢光分析は一般的には感度が大きいので好まれ
ている。しかし公知の螢光分析は多くの欠点を有
している。例えばこの分析は最大生物学的活性の
生理的PHで行われているが、PHは続いて最大螢光
効率を得るために11まで上げる。このようなPHの
変化を必要とする分析は高度に自動化された分析
方法に対しては容易には適合しない。 米国特許第4409140号は８未満のPHで実施する
蛋白分解酵素の分析を記載している。この分析は
505nｍで螢光を発する発色団を放出するクマリ
ン系物質を使用する。 〔解決すべき問題点〕 しかしながら、従来使用されている比較的短い
波長では、ヘモグロビン及びビリルビンの特異的
妨害が有意となり、分析の感度が著しく限定され
る。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明に従えば、式（）： BLOCK−Ｘ−Rf−Ｈ （） 〔式中、BLOCKは−CO−R1（式中、R1は水素又
は炭素数１〜３のアルキル基を示す）又は単糖類
から誘導された基を示し、 Ｘは−Ｏ−又は−NR−（式中、Ｒは水素又は
炭素数１〜３のアルキル基を示し、そして Rfは
【式】又は
【式】 を示す〕で表される加水分解可能な化合物が提供
される。 本発明の分析組成物は前記加水分解可能な化合
物を含む、PH９以下に緩衝されたものである。 更に、本発明は、前記加水分解可能な化合物を
含む分析要素を提供する。 更に、本発明に従つた加水分解性被分析物の測
定方法は、 Ａ 加水分解条件下に、加水分解性被分析物を含
むと思われる液体試料を前記加水分解可能な化
合物と接触せしめ、そして Ｂ 被分析物の存在の結果として加水分解により
前記化合物から放出された螢光部分を530nｍ
を超える波長で励起後580nｍ又はそれ以上の
波長で測定する 工程を含んで成る。 実施態様 本発明は加水分解性被分析物（生存又は非生存
を定性又は定量的に測定するのに使用することが
できる。本明細書において使用する「加水分解性
被分析物」なる語は、本発明の基質をPH９又はそ
れ以下で加水分解することにより基質分子の
BLOCKを分子の他の部分から開裂せしめること
ができる物質（化学物質、酵素又はその他の有機
体）を意味する。本発明は、エステラーゼ、アミ
ダーゼ、プロテアーゼのような加水分解酵素及び
これらの酵素を含む微生物（例えばNissera
spp）ならびにPCT公表公報80／02433に掲げら
れている酵素や微生物などの分析に特に有用であ
る。本発明の基質は適当なBLOCK基及び結合で
設計することにより特定の被分析物を測定するこ
とができる。例えば、本発明は、BLOCKが単糖
類部分から誘導されたものであり、Ｘがオキシの
場合には、エンテロバクタークロアカエ
（Enterobacter cloacae）及びクレブシーラニユ
ーモニアエ（Klebsiella pneumoniaeを同定する
のに使用することができる。 本発明の基質は、種々の水性液体、例えば生物
学的流体、製造プロセス、廃水又は食品原料など
の分析的測定に使用することができる。本発明の
基質は以下に更に詳しく説明するように特定の結
合分析においてラベル又はリガンドアナローグと
して使用することができる。測定は、基質の加水
分解及び螢光染料の放出を引き起す単一の反応又
は一連の反応によつて実施することができる。 本発明は例えば尿、脳脊髄液、血液、リンパ
液、組織ホモジネート、粘液、唾液又は便分泌液
などの生物学的流体中の加水分解酵素、細胞又は
微生物の測定に特に有用である。 本発明に係る前記式（）の加水分解可能な化
合物（又は基質）において、BLOCKは９又はそ
れ以下のPHで分子の残部から開裂し得る加水分解
可能な遮断基で−COR1（R1は水素又はメチル、
エチル、イソプロピルなどの炭素数１〜３のアル
キル基を示す）又は単糖類から誘導された基を示
し、Ｘはオキシ基（−Ｏ−）又はイミノ基（−
NR−、式中、Ｒは水素又はメチル、エチル、プ
ロピル、イソプロピルなどの炭素数１〜３のアル
キル基を示す）を示し、Rfは以下の式で表され
るフエナレノン又はベンズフエナレノン螢光化合
物から誘導された基でBLOCKが加水分解によつ
て分子の残部から開裂された場合に生じる加水分
解された基（すなわち−Ｘ−Rf−Ｈ）が水性環
境中で９又はそれ以下のPH、特に約６以下のPH、
で検出することができ、更に、530nｍを超える
波長で励起させた場合に、加水分解された部分が
580nｍ又はそれ以上の波長で最大螢光を発する
ようにする。
【式】及び
【式】 これらの部分が誘導される代表的化合物は以下
の通りである。
【式】
【式】
【式】および
〔実施例〕
以下、実施例に従つて本発明を更に詳しく説明
するが、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に
限定するものではないことはいうまでもない。 例 １ 単糖類遮断基を有する基質の製造 １，２，３，４−テトラアセチル−Ｄ−キシロ
ピラノールの製造： 以下の化合物を製造した。 この物質はM.L.Wolfrom及びA.Thompsonの
“Methods in Carbohydrate Chemistry”、、
211頁（R.L.Whistler及びM.L.Wolfrom編集、ニ
ユーヨーク、Academic Press 1983年刊）に記
載の方法によつて製造した。Ｄ−キシロース50ｇ
から中間体A88ｇを得た。 １−ブロモ−２，３，４−トリアセチル−β−
Ｄ−キシロピラノースの製造： この物質はK.Bock、C.Pederson及びP.
Rasmussenの“Acta Chem.Scand.、B29
（1975）、389〜393頁の方法によつて製造した。
１，２，３，４−テトラアセチル−Ｄ−キシロピ
ラノース2.5ｇから中間体Ｂ（mp.97〜98℃）１ｇ
を得た。 １−（６−オキシフエナレノン）−２，３，４−
トリアセチル−β−Ｄ−キシロピラノースの製
造： ６−ヒドロキシフエナレノン（4.8ｇ、29ｍ
mol）及び炭酸銀（7.9ｇ、29ｍmol、D.R.
LinebackのMethods in Carbohydrate
Chemistry、341頁（R.L.Whistler及びM.L.
Wolfrom編、ニユーヨーク、Academic Press、
1963）〕のピリジン（105ml）混合物に、中間体Ｂ
（６ｇ、17ｍmol）を加えた。この混合物の暗所
において室温で18時間撹拌し、その後10％HCl／
氷水溶液中に注いだ。沈澱物質を濾過し、氷水で
洗浄し、風乾した。粗中間体Ｃ（17ｇ）を中性ア
ルミナのクロマトグラフにかけた（溶出液：60/4
０ジクロロメタン／酢酸エチル）。このようにして
13.8ｇの生成物を得た。 １−（６−オキシフエナレノン）−β−Ｄ−キシ
ロピラノースの製造： １−（６−オキシフエナレノン）−２，３，４−
トリアセチル−β−Ｄ−キシロピラノシド（3.8
ｇ、8.4ｍmol）の無水メタノール25ml懸濁液に
ナトリウムメトキシド（8.4ml、１モル濃度溶液）
を添加した。この混合物を45分間撹拌し、その後
黄色固体沈澱を濾過し、メタノールで注ぎ、乾燥
した。この物質はゆつくり分解し約215℃で最終
分解した。 分析： 計算値（C18H16O6） Ｃ＝65.8、Ｈ＝4.9、Ｏ＝29.2 実測値 Ｃ＝64.8、Ｈ＝5.0、Ｏ＝29.3 例 ２ Enterobacter cloacae及び
Klebsiellapneumoniae 細胞を以下のようにして調製した。 β−Ｄ−キシロシダーゼ誘導培地を、１モル濃
度のリン酸ナトリウム、カリウム緩衝剤（PH＝
7.0）350μに、５％酵母エキス25μ、４％
（NH4）2HPO4及び１％KCl50μ、0.0075％
MnSO4・H2O及び0.01％FeSO4・7H2O50μを
この順に添加して調製した。この混合物30分間オ
ートクレーブし、次いで冷却した。接種直前に20
％キシロース溶液25μ及び２％MgSO4・7H2O
（予じめ別々にフイルター殺菌又はオートクレー
ブしたもの）を添加した。 Klebsiella pneumonial（ATCC 13882）及び
Enterobacter cloacae（ATCC 23355）の両者を
この培地において37℃で18時間生長させた。細菌
10mlを遠心法で採取し、洗浄し、0.1モル濃度の
リン酸カリウム緩衝液（PH7.0）に再懸濁させた。
細胞濃度を約５×108細胞／ml（光学濃度620nｍ
で0.800）に調整した。 ２mlHA96ウエルタイトレーシヨンプレートに
上記細胞懸濁液200mlを入れた。プレートNo.１に
は、界面活性剤を加えることなく（リン酸カリウ
ム緩衝液9μ中のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド10μｇ／μ）、例１の基質容液100μを添加
した。プレートNo.２には界面活性剤を加えた基質
溶液（リン酸カリウム緩衝液9μ中のＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド10μｇ／μ及びTRITON
Ｘ−100界面活性剤）を添加した。 基質添加後、最初の読みを記録し、プレートを
37℃に保持し、そして５，10，15，30及び60分後
に読んだ。３個の繰り返し実験の平均値を用い
た。螢光の測定には、540nｍの励起フイルター、
620nｍの発光フイルター、200ワツトタングステ
ンランプ及び加熱エレメントで修正した標準ダイ
ナテツクミクロフロールリーダー（Dynatech
Microfluor Reader）を用いた。対照は細胞を含
まないものである。 以下の第１表に示した結果は、両基質溶液は微
生物を15分間で迅速に測定するのに使用すること
ができることを示している。
【表】 例 ３ エステラーゼ酵素の溶液分析 無水酢酸20ml中の６−ヒドロキシフエナレノン
３ｇを撹拌下に溶液が得られるまで加熱すること
によつて上記基質を調製した。減圧下に過剰の無
水酢酸を除いた。残渣を温メタノールに溶解し、
冷却し、そして生成物が沈澱しはじめるまで水で
処理した。固型物を濾過によつて集め、乾燥して
2.6ｇの生成物を得た。マススペクトル分析で前
記構造を確認した。 基質の緩衝溶液を以下のようにして調製した。
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の基質（16mg／
ml溶媒）をTRITON Ｘ−100界面活性剤500μ
に添加し、得られた溶液を撹拌下にリン酸カリウ
ム緩衝液（0.05モル濃度、PH7.5）25mlに添加し
た。 基質を含む緩衝溶液３mlを２つの石英セルに入
れた。一方のセルにはジアセチナーゼを含む溶液
10μ〔リン酸カリウム緩衝液（PH7.5）μ当り
ジアセチナーゼ0.218I.U.〕を添加した。第二のセ
ルは対照である。各セル溶液の相対螢光を種々の
時間で標準フルオロメータ（励起540nｍ、最大
発光620nｍ）を用いてPH7.5及び25℃で測定した。
第２表に示したように、これらの結果はエステラ
ーゼ酵素ジアセチナーゼを含むセルでは螢光が迅
速に発生したことを示している。対照は最小の螢
光増加を示したに過ぎなかつた。
【表】
【表】 例 ４ 白血球細胞中のエステラーゼ活性の測定 この例はエステラーゼ基質が白血球細胞
（White blood cells）の存在の分析に使用するこ
とができることを示すものである。 健常成人供血者（ACD予備充填血液採取管−
酸、クエン酸塩、デキストローズＢ−D4606−で
採血）の血液から白血球富化層を10ml血液管にデ
キストランT70 1.5ml（平衡塩溶液中６％）を添
加することによつて精製した。これらの血液管を
１時間静止し、次に血漿層を15ml遠心管に移し、
この管をリン酸塩緩衝液（0.05モル濃度のリン酸
カリウム緩衝液中に塩化ナトリウム8.5ｇ、PH
7.5）で7.5mlまで充満した。管を1000RPMで10分
間遠心分離した。得られた細胞ペレツトを10mlの
溶解溶液（lysing solution）（水100ml中に、塩化
アンモニウム0.83ｇ、重炭酸ナトリウム0.1ｇお
よび（エチレンジニトリロ）テトラ酢酸ジナトリ
ウム塩0.003ｇを含む。PH7.2）中に懸濁させ、管
を溶液が透明になるまで静置した。管を再び遠心
分離し、ペレツトを洗浄し、緩衝溶液中に再懸し
た。細胞を数え、約106細胞／mlに調節した。 リン酸カリウム緩衝液（0.05モル濃度、PH7.5）
中の種々の白血球濃度の液３mlを例３の基質
（10.77ml／μメタノール）10μと混合し、そ
して励起波長540nｍ及び発光波長620nｍで相対
螢光を測定した。結果は第３表に示す。
【表】 例 ５ 種々の加水分解酵素の測定 本例は上記基質が種々の加水分解酵素に対する
分析に使用することができることを示す。 上記基質は、無水酢酸10ml中の６−アミノフエ
ナレノン0.6ｇの溶液に酢酸ナトリウム１ｇ及び
無水酢酸２mlを添加し、この混合物を溶液が得ら
れるまで加熱することに調製した。薄層クロマト
グラフイー（シリカ、３：２酢酸エチル：トルエ
ン）は出発物質が含まれていないことを示した。
この溶液を水（100ml）に添加し、そしてこの混
合物を酢酸エチルで数回抽出した。合併した抽出
物を乾燥し、そして減圧下に濃縮して生成物0.3
ｇを得た。マススペクトル分析で上記構造のもの
であることを確認した。 試験溶液を、基質（１mg／μメタノール）
50μ、下記PHの0.05モル濃度リン酸カリウム緩
衝液（各酵素の最適PH近傍）及び酵素10μから
調製した。測定すべき酵素はカルボキシルエステ
ラーゼ型（PH7.8）及び型（PH6.0）、アミノ
アシラーゼ（グレード）（PH7.0）並びにトリプ
シン型及び型（PH7.8）を含むものであつた。
試料調製及び試験は光の当らない場所で実施し
た。酵素溶液は使用前は０℃に保持し、分析は、
励起540nｍ及び発光595nｍで螢光測定し、25℃
で行なつた。結果は以下の第４表に示す。
【表】
〔発明の効果〕
本発明は９以下のPHでイオン化して生理学的PH
にて最大螢光を示す螢光染料を放出する新規な基
質を提供する。これらの染料は生物学的流体に普
通に遭遇するスペクトル妨害物質とは離れた輻射
を吸収及び放出する。更に放出した染料の螢光発
光スペクトルがシフトし、即ち基質自体のスペク
トルとは異なる。 前記基質を用いる本発明の分析は迅速で感度が
高く、そして自動化分析法にも適合性がある。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 式（）： BLOCK−Ｘ−Rf−Ｈ （） 〔式中、BLOCKは−CO−R1（式中、R1は水素
    又は炭素数１〜３のアルキル基を示す）又は単
    糖類から誘導された基を示し、 Ｘは−Ｏ−又は−NR−（式中、Ｒは水素又
    は炭素数１〜３のアルキル基を示し、そして Rfは 【式】又は 【式】 を示す〕で表される加水分解可能な化合物。 ２ 式（）： BLOCK−Ｘ−Rf−Ｈ （） 〔式中、BLOCKは−CO−R1式中、R1は水素
    又は炭素数１〜３のアルキル基を示す）又は単
    糖類から誘導された基を示し、 Ｘは−Ｏ−又は−NR−（式中、Ｒは水素又
    は炭素数１〜３のアルキル基を示し、そして Rfは 【式】又は 【式】 を示す〕で表される加水分解可能な化合物を含
    んでなるPH９以下に緩衝された分析組成物。 ３ 式（）： BLOCK−Ｘ−Rf−Ｈ （） 〔式中、BLOCKは−CO−R1（式中、R1は水素
    又は炭素数１〜３のアルキル基を示す）又は単
    糖類から誘導された基を示し、 Ｘは−Ｏ−又は−NR−（式中、Ｒは水素又
    は炭素数１〜３のアルキル基を示し、そして Rfは 【式】又は 【式】 を示す〕で表される加水分解可能な化合物を含
    んで成る分析素子。 ４ 水性液体中の加水分解性被分析物を測定す
    るにあたり、 Ａ 加水分解条件下に、加水分解性被分析物を
    含むと思われる液体試料を式（）： BLOCK−Ｘ−Rf−Ｈ （） 〔式中、BLOCKは−CO−R1（式中、R1は、水
    素又は炭素数１〜３のアルキル基を示す）又は
    単糖類から誘導された基を示し、 Ｘは−Ｏ−又は−NR−（式中、Ｒは水素又
    は炭素数１〜３のアルキル基を示し、そして Rfは 【式】 又は【式】 を示す〕で表される加水分解可能な化合物と接
    触させて、加水分解性被分析物の存在の結果と
    して螢光染料を生成させ、そして Ｂ 被分析物の存在の結果として加水分解により
    前記化合物から放出された螢光部分を530nｍ
    を超える波長で励起後580nｍ又はそれ以上の
    波長で測定する 工程を含む加水分解性被分析物の測定方法。
JP62018752A 1986-01-31 1987-01-30 加水分解可能な化合物並びにそれを含む分析組成物及び分析素子並びにそれを用いる分析方法 Granted JPS62215399A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US824756 1986-01-31
US06/824,756 US4812409A (en) 1986-01-31 1986-01-31 Hydrolyzable fluorescent substrates and analytical determinations using same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62215399A JPS62215399A (ja) 1987-09-22
JPH0426624B2 true JPH0426624B2 (ja) 1992-05-07

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ID=25242238

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Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62018752A Granted JPS62215399A (ja) 1986-01-31 1987-01-30 加水分解可能な化合物並びにそれを含む分析組成物及び分析素子並びにそれを用いる分析方法

Country Status (5)

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US (1) US4812409A (ja)
EP (1) EP0231125B1 (ja)
JP (1) JPS62215399A (ja)
CA (1) CA1336306C (ja)
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