JPH0380099A - 化学発光を用いる酵素的無機リンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、化学発光を用いる酵素的無機リンの測定方
法に関し、更に詳しくは臨床化学、生物化学、環境衛生
、分析化学等の分野において、微量の無機リン（有機物
を灰化して得られる無機リンを含む）を高感度に（精度
良く）測定することができる化学発光を用いる酵素的無
機リンの測定方法に関するものである。

〈従来の技術と発明が解決しようとする問題点〉生体中
のリン化合物としては、核酸、リン脂質等の種々の化合
物が知られており、それぞれ代謝反応において重要な役
割を果している。

特に臨床検査においては、血中無機リンの測定は、副甲
状腺機能亢進、ビタミンＤ欠乏症、ファンコニ症候群等
の診断に重要な情報を与える。

また、今日問題となっているリン酸誘導体による環境汚
染においても、無機リン及び有機りんの測定は重要であ
る。

さて従来より無機リンの測定は、リンモリブデン酸複合
体の発色に基づくソイスケ−サバロー法、及びその変法
が広く行われてきた。しかし、これらの方法は強酸を用
いなければならず、操作が煩雑であると共に感度が低い
欠点があった。これを改良するために、最近酵素を使用
する測定法が開発されてきたが、生体内の無機リンや、
環境中の微量の無機リンの測定には更に高い感度を持つ
測定法の開発が望まれていた。

そこで発明者等は、前記酵素法を更に改良し、酵素法と
化学発光を組み合わせることによって、温和な測定条件
で特異性が高く、高感度かつ操作が簡便で、しかも自動
分析が可能な無機リンの測定方法の開発を行い、本発明
を完成した。

〈問題点を解決するための手段〉 すなわち本願は、前記した無機リンｑ測定方法の欠点を
改良するためになされたもので、次の（１）〜（５）の
請求項から構成されている。

（１）連続して起こる次の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の
反応により生ずる過酸化水素量を測定して、（Ａ）中の
無機リンの量に対応させる酵素的無機リンの測定方法に
おいて、生じた過酸化水素を、酸化触媒の存在下でルミ
ノールと反応させ、発生する化学発光の強さを測定して
過酸化水素（無機リン）量に対応させることを特徴とす
る化学発光を用いる酵素的無機リンの測定方法。

（Ａ）　ニ プリンヌクレオサイドフォスフォリラーゼ無機リン＋イ
ノシンーーーーー−−−−→ヒボキサンチン＋リボース
ー１リン酸 （Ｂ）　： ヒボキサンチン＋Ｈ２ Ａサンチンオキシターゼ Ｑ　　＋　　０　２　−一一一一一 尿酸＋２Ｈ２ ２ （Ｃ）　： （２）酸化触媒として、ミクロペルオキシダーゼを使用
する特許請求の範囲第１項記載の化学発光を用いる酵素
的無機リンの測定方法。

（３）無機リンの試料として、有機リン化合物な灰化し
て使用する特許請求の範囲第１項記載の化学発光を用い
る酵素的無機リンの測定方法。

（４）連続して起こる次の（Ａ、）、（Ｂ）、及び（Ｃ
）の反応により生ずる過酸化水素量を測定して、（Ａ）
中の無機リンの量に対応させる酵素的無機リンの測定方
法において、（Ａ）中のプリンヌクレオサイドフォスフ
ォリラーゼ、（Ｂ）中のキサンチンオキシダーゼ、及び
（Ｃ）中のウリカーゼを担体に固定化させて使用すると
共に、生じた過酸化水素を、酸化触媒の存在下でルミノ
ールと反応させ、発生する化学発光の強さを測定して過
酸化水素（無機リン）量に対応させることを特徴とする
化学発光を用いる酵素的無機リンの測定方法。

（Ａ）： （Ｂ）　： キサンチンオキシダーゼ ヒボキサンチン十ＨｇＯ＋０２−−−−−→尿酸＋２Ｈ
２０２ （Ｃ）　： （５）酸化触媒として、ミクロペルオキシダーゼを使用
する特許請求の範囲第４項記載の化学発光を用いる酵素
的無機リンの測定方法。

本願発明の化学発光を用いる酵素的無機リンの測定方法
は、前記（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の反応により、１
当量の無機リンから３当量の過酸化水素を生じさせ、引
き続いて次に示す（Ｄ）の反応により光りに変換し、こ
の化学発光の強さを測定して、（Ａ）中の無機リンの量
に対応させるものである。なお、この際使用する酸化触
媒としては、ミクロペルオキシダーゼが最適である。

（Ｄ）： ミクロペルオキシダーゼ ２Ｈ２０２＋３ルミノールーーーーーーーアミノフター
ル酸＋Ｎ２＋光 この（Ｄ）の反応により発生する光を測定することによ
り、従来行われていた、吸光度測定を用いる酵素的無機
リン酸測定法（マチダら：アグリ力ルチャル　ケミスト
リー　４０巻、８０７〜８０８頁、１９８２年）に比較
して約１０倍の感度で測定できることが判明した。

また本願発明の化学発光を用いる酵素的無機リンの測定
方法は、自動分析装置に組み込んで測定することが可能
となり、更にプリンヌクレオサイドフォスフォリラーゼ
、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ等の酵素をを担
体に固定化させて固定化酵素として使用するフローイン
ジェクション法を用いることにより、より高感度で簡便
な測定法にも応用できる。

〈実施例１〉 プリンヌクレオサイドフォスフォリラーゼ、（０，３単
位／ｍｌ、）、キサンチンオキシダーゼ（７ｍ単位／　
ｍ　Ａ　）ウリカーゼ（８０ｍ単位／ｍβ）、及びイノ
シン（０，３ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（１０ｍ　
Ｍ　％ｐ　Ｈ８、５）　０　、３　ｍ４にリン酸１ナト
リウム溶液２５μ℃を加え、室温で２０分間放置し、こ
れにルミノール（０，１ｍ　Ｍ　）を含む炭酸緩衝液（
０，２Ｍ、ｐＨ１０゜４）５０ＬＬＩ２を加え、更にミ
クロペルオキシダーゼ（２０μＭ）を含む炭酸緩衝液（
０，２Ｍ、ｐＨ１０，４）５０ＩＬｆｌを加えて、発生
する発光をケミフロフォトメーター（アミコン社）によ
り、発光反応開始から１分間の発光強度を積算し、測定
した。

前記した測定方法を使用して無機リンを測定した時の検
量線を第１図に示す。

この測定方法による無機リンの検出限界は１００１００
ｐ／試験であり、吸光度測定を用いたマチダ等の方法に
比べて約１０倍高感度に測定できる。

〈実施例２〉 操作ｌ：固定化担体の活性化 アミノプロピル　ガラス　ビーズ（エレクトロヌクレオ
ニクス社、１２０−２００メツシユ、中心ポアサイズ　
４９１ｎｍ）０．５ｇにグルタルアルデヒド（５％）を
含むリン酸緩衝液（０、１Ｍ　、　ｐ　Ｈ７）　２　ｍ
　４２を加え、減圧下で１時間撹拌し、残存する試薬を
除去し更に５０ｍｎの精製水で洗浄し活性化担体とした
。

操作２：固定化酵素の担体の作製 プリンヌクレオサイドフォスフォリラーゼ、（７０単位
）をリン酸緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ７）２ｍｊ２に溶解
し、これに操作１で調製した活性化担体０．５ｇを加え
、４℃で２４時間撹拌し、反応した担体を精製水１００
ｍｊ２．１Ｍ食塩溶液１００ｒｎＪ２、及び精製水１０
０１００Ｏで順次洗浄して、プリンヌクレオサイドフォ
スフォリラーゼ固定化担体とした。またキサンチンオキ
シダーゼ（２，７単位）、及びウリカーゼ（２５単位）
をリン酸緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ７）２ｍＩ２に溶解し
、同様に活性化担体と反応させてキサンチンオキシダー
ゼ・ウリカーゼ固定化担体とした。

操作３：フローインジェクションシステム第２図に示す
フローダイヤグラムをポリトリフロロエチレンチュウブ
（φ＝０．２５ｍｍ）を用いて連結し測定する。キャリ
ア液としては２５μＭのイノシンを含むＨＥ　Ｐ　Ｅ　
Ｓ　−Ｎ　ａ　ＯＨ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７，５）を
１ｍｆｆ／分の速度でポンプを用いて送り込む。検体は
インジェクターを用いて１０〜５０ＩＬ℃をキャリア液
流に注入する。検体はプリンヌクレオサイドフォスフォ
リラーゼ固定化担体カラム及び、キサンチンオキシダー
ゼ・ウリカーゼ固定化担体カラム（φ＝３ｍｍ、　Ｉ２
＝５０ｍｍ）を通り発光測定装置に送られる。同時にル
ミノール（１０μＭ）及びミクロペルオキシダーゼ（０
，８μＭ）を含む炭酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ’１０．
５）を１ｍ１２７分で供給し、生じる発光強度の積算値
、または発光ピークの高さを測定する。

操作４：無機リンの測定 種々の濃度のリン酸２カリ溶液を検体として操作３に従
い、５０ＩＬＩ２を注入し発光量を測定した。このとき
の各濃度での発光パターンを第３図に示す。また、各濃
度と発光強度の関係を第４図１ に示す。この測定における同時再現性は、２５０ｐｍｏ
１．５０ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、５ｐｍｏ　１　／　
５０　μ（ｌにおいて、夫々１．０％、２．３％、１．
８％、及び９．４％であった。また、検出限界（シグナ
ル／ノイズ＝２）は５００ｆｍｏｌ／試験であり、用手
法に比べて約２００倍、またマチダ等の測定法に比較し
て約２０００倍高感度に測定できる。

操作５：核酸（有機リン）の測定 種々の濃度の仔つシ胸！ＩｇＤ　Ｎ　Ａ水溶液０．５ｍ
℃に硝酸マグネシウム（２，５％）エタノール溶液０．
２ｍ℃を加え、直火で乾固する。この乾固物を１Ｎ塩酸
で溶解し、中和して最終液量２ｍβとして検体とし、操
作３により発光強度を測定した。その時のＤＮＡ量と発
光強度との関係を第５図に示す。また未知量のＤＮＡを
含む仔つシ胸線よりフェノール抽出、エタノール沈殿に
より得られたＤＮＡを上記測定法に従って測定したとこ
ろ、従来のＤＮＡ測定法（チェノ等、アナリティカル　
ケミストリー　２８巻、１７５６２ １７５８ページ、１９５６年）に比べて約１６０倍高感
度にＤＮＡを測定することができた。

前記操作４及び操作５において、無機リンがこのように
高感度に測定することができる理由は、固定化酵素を使
用することによって、酵素等が酵素等に含まれる微量の
リン化合物が、測定系から除かれブランク値が低くなり
、測定限界を下げることができるためと思われる。

〈発明の効果〉 本出願に係る発明は以上のように構成したから、次のよ
うな効果を有する。

（１）従来の無機リンの測定方法に比較して非常に高感
度（１０〜２００倍）に測定できる。

（２）固定化酵素を用いることにより、酵素の繰り返し
使用が可能となり、測定コストを小さくすることができ
る。

（３）固定化酵素を用いるフローインジェクション法を
採用することができ、分析操作を自動化することができ
る。

（４）無機リンの測定に限らず有機リンの測定も可能と
なる。

【図面の簡単な説明】

第１図は無機リンを測定した時の検量線、第２図はフロ
ーインジェクションシステムを示すフローダイヤグラム
、第３図は各濃度での発光パターン、第４図は各濃度と
発光強度の関係、第５図はＤＮＡ量と発光強度との関係
を示す。 ■

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）連続して起こる次の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）
   の反応により生ずる過酸化水素量を測定して、（Ａ）中
   の無機リンの量に対応させる酵素的無機リンの測定方法
   において、生じた過酸化水素を、酸化触媒の存在下でル
   ミノールと反応させ、発生する化学発光の強さを測定し
   て過酸化水素（無機リン）量に対応させることを特徴と
   する化学発光を用いる酵素的無機リンの測定方法。 （Ａ）： ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｂ）： ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｃ）： ▲数式、化学式、表等があります▼
2. （２）酸化触媒として、ミクロペルオキシダーゼを使用
   する特許請求の範囲第１項記載の化学発光を用いる酵素
   的無機リンの測定方法。
3. （３）無機リンの試料として、有機リン化合物を灰化し
   て使用する特許請求の範囲第１項記載の化学発光を用い
   る酵素的無機リンの測定方法。
4. （４）連続して起こる次の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）
   の反応により生ずる過酸化水素量を測定して、（Ａ）中
   の無機リンの量に対応させる酵素的無機リンの測定方法
   において、（Ａ）中のプリンヌクレオサイドフォスフォ
   リラーゼ、（Ｂ）中のキサンチンオキシダーゼ、及び（
   Ｃ）中のウリカーゼを担体に固定化させて使用すると共
   に、生じた過酸化水素を、酸化触媒の存在下でルミノー
   ルと反応させ、発生する化学発光の強さを測定して過酸
   化水素（無機リン）量に対応させることを特徴とする化
   学発光を用いる酵素的無機リンの測定方法。 （Ａ）： ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｂ）： ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｃ）： ▲数式、化学式、表等があります▼
5. （５）酸化触媒として、ミクロペルオキシダーゼを使用
   する特許請求の範囲第４項記載の化学発光を用いる酵素
   的無機リンの測定方法。