JPH05163291A - Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、これを有効成分とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規化合物を基質として用いることにより、
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧａ
ｓｅ）活性を効率よく、正確に測定する。 【構成】 基質として用いる化合物は、一般式 【化１】 （式中のＲ¹は有機アミン若しくは含窒素複素環又はそ
の第四アンモニウム塩を有する炭素数１〜４の置換アル
キル基、Ｒ²〜Ｒ⁴はそれぞれ独立して、水素原子、ハロ
ゲン原子、又はニトロ基を意味する）で表わされるＮ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体である。該化合
物をＮＡＧａｓｅ含有試料に加え、酵素反応により生成
するアグリコン（フルオレセイン・モノエーテル）を定
量してＮＡＧａｓｅ活性を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なＮ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミン誘導体、該誘導体を有効成分とす
るＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定
用試薬及び該誘導体を用いてＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニダーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定する
方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ（以下、ＮＡＧａｓｅという）は、腎尿細管上皮に
多く含まれるリソソーム（Ｌｙｓｏｓｏｍｅ）中の酵素
の１つであり、糖蛋白やムコ多糖類の分解に関与してい
る。尿中ＮＡＧａｓｅは急性腎不全や糸球体腎炎などの
各種腎臓疾患や腎臓の術後においては上昇し、また糖尿
病においては、尿中ばかりでなく血清中ＮＡＧａｓｅも
上昇することが認められている。こういった各種腎臓疾
患の診断及び経過観察の一助として、また薬物の腎毒性
検討の指標としても、臨床及び動物実験面でＮＡＧａｓ
ｅの測定が注目されている。

【０００３】そして従来、ＮＡＧａｓｅ活性の測定用基
質としては、例えばｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．，
２７，１１８０（１９８１）］及び４−メチルウンベリ
フェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃ
ｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ，２４，１８９（１９
６９）］、 ｍ−クレゾールスルホンフタレイニル−Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃｌｉｎ． Ｃｈ
ｅｍ．，２９，１７１３（１９８３）］が知られてい
る。

【０００４】しかしながら、これらの化合物をＮＡＧａ
ｓｅ活性の測定用基質として用いた場合は、酵素作用に
よって生成したアグリコンを定量する際、反応液のｐＨ
を１０〜１１程度という高アルカリ性とする必要がある
ために、一旦酵素反応を停止させて酵素活性を測定する
いわゆるエンドポイント法しか適用できず、酵素活性測
定法として最適のレイトアッセイ法を採用することがで
きないなどの欠点を有している。

【０００５】最近、酵素反応進行中に直接吸光度変化を
計測して酵素活性を測定する前記レイトアッセイ法が適
用可能な基質として、２−クロロ−４−ニトロフェニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．，３４，２１４０（１９８８）］やソジオ−
３，３′−ジクロロフェノールスルホンフタレイニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（特開昭６３−
３０９１９９号）が提案されている。

【０００６】しかしながら、これらはいずれもＮＡＧａ
ｓｅの至適ｐＨである４．５〜５．０においては十分な
感度を示すことができず、また２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドはＮ
ＡＧａｓｅ活性測定に必要十分な量を溶解させることが
困難であるなどの欠点を有している。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬及びそれを用いる
測定方法が有する欠点を克服し、ＮＡＧａｓｅ活性を効
率よく、かつ正確に測定し得る溶解性の優れた試薬とし
て好適な新規化合物を提供するとともに、これを試薬と
した新規なＮＡＧａｓｅ活性の測定方法を提供すること
を目的としてなされたものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ＮＡＧａｓｅ
活性測定用試薬として、特定の新規なＮ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミン誘導体が極めて好適であり、これを
用いてＮＡＧａｓｅ活性を測定することにより、その目
的を達成し得ることを見出し、この知見に基づいて本発
明を完成するに至った。

【０００９】すなわち、本発明は、一般式

【化２】 （式中のＲ¹は有機アミン若しくは含窒素複素環又はそ
の第四アンモニウム塩を有する炭素数１〜４の置換アル
キル基、Ｒ²〜Ｒ⁴はそれぞれ独立して、水素原子、ハロ
ゲン原子、又はニトロ基を意味する）で表わされるＮ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、該一般式
（Ｉ）の化合物を有効成分とするＮＡＧａｓｅ活性測定
用試薬、及びＮＡＧａｓｅ含有試料に、該一般式（Ｉ）
の化合物を加え、酵素反応によって生成するアグリコン
（フルオレセイン・モノエーテル）を定量することを特
徴とするＮＡＧａｓｅ活性の測定方法を提供するもので
ある。

【００１０】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明の前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミン誘導体において、Ｒ¹は有機アミン
若しくは含窒素複素環又はその第四アンモニウム塩を有
する炭素数１〜４の置換アルキル基であるが、該有機ア
ミンとしては第三アミンが好ましく 、また該含窒素複
素環の化合物としてはピリジンが好ましい。

【００１１】そして、このようなＲ¹の有機アミン又は
その第四アンモニウム塩を有する炭素数１〜４の置換ア
ルキル基としては、例えばアミノメチル、ジメチルアミ
ノメチル、アミノエチル、メチルアミノエチル、ジメチ
ルアミノエチル、ジエチルアミノエチル、ジイソプロピ
ルアミノエチル、ジベンジルアミノエチル、エチルフェ
ニルアミノエチル、アミノプロピル、ジメチルアミノプ
ロピル、アミノブチル、ジメチルアミノブチル、ピペリ
ジノエチル、ピロリジノエチル、モルホリノエチル、メ
チルピロリジニルエチル、ピペラジノプロピル、トリメ
チルアンモニウムエチル、ジメチルベンジルアンモニウ
ムエチルなどの基が挙げられる。また、Ｒ¹の含窒素複
素環又はその第四アンモニウム塩を有する炭素数１〜４
の置換アルキル基としては、例えばピリジルメチル、ピ
リジルエチル、キノリルメチル、メチルピリジニウムメ
チル、ベンジルキノリニウムメチルなどの基が挙げられ
る。そして、前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体が置換基Ｒ¹を有する
ことにより、その弱酸性水性溶媒に対する溶解性が向上
することとなる。

【００１２】さらに、Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴はそれぞれ独立
して、水素原子、ハロゲン原子（塩素、ヨウ素、フッ素
若しくは臭素原子）、又はニトロ基である。そして、前
記一般式（Ｉ）で表わされる化合物とＮＡＧａｓｅとの
酵素反応によって生成するアグリコン（フルオレセイン
・モノエーテル）の発色性の観点から、Ｒ²、Ｒ³の少な
くとも一つがハロゲン原子であることが好ましい。ま
た、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物には、フルオ
レセイン部位の１位（スピロ）炭素における２種類の立
体異性体が存在するが、そのいずれでも、あるいはそれ
らの両者が存在してもＮＡＧａｓｅ活性の測定用基質と
して有効に用いられる。

【００１３】このような前記一般式（Ｉ）で表わされる
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体としては、
例えば６′−Ｏ−アミノメチル−フルオレセイニル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、６′−Ｏ−ジメ
チルアミノエチル−２′，７′−ジクロロフルオレセイ
ニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、６′−
Ｏ−トリメチルアンモニウムエチル−２′，７′−ジク
ロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニド、６′−Ｏ−モルホリノエチル−２′，７′−
ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニド、６′−Ｏ−ピリジルメチル−２′，７′
−ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド、６′−Ｏ−ジベンジルアミノエチル−
４′，５′−ジブロモフルオレセイニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド、６′−Ｏ−ジメチルアミノ
ブチル−４′，５′−ジヨードフルオレセイニル−Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、６′−Ｏ−ピペリ
ジノエチル−２′，４′，５′，７′−テトラブロモフ
ルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド、６′−Ｏ−ジメチルベンジルアンモニウムエチル−
２′，４′，５′，７′−テトラヨード−４，５，６，
７−テトラクロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニド、６′−Ｏ−メチルピリジニウム
メチル−４′，５′−ジブロモ−２′，７′−ジニトロ
フルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニドなどが挙げられる。

【００１４】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体は文献未載の
新規な化合物であって、その製造方法については特に制
限はなく、任意の方法を用いることができるが、例えば
次の方法によって製造することができる。

【００１５】すなわち、一般式

【化３】 （式中のＲ²〜Ｒ⁴は前記と同じ意味をもち、Ｘはアシル
基を意味する）で表わされるフルオレセイニルグルコサ
ミン誘導体に、一般式 Ｒ¹−Ｙ （ＩＩＩ） （式中のＲ¹は前記と同じ意味をもち、Ｙはハロゲン原
子を意味する）で表わされる置換アルキルハライドを作
用させたのち、Ｏ−アシル基を脱離させることにより製
造することができる。

【００１６】前記一般式（ＩＩ）で表わされるフルオレ
セイニルグルコサミン誘導体において、Ｘのアシル基と
しては炭素数２〜７のものが好ましく、中でもアセチル
基が特に好ましい。そして、前記一般式（ＩＩ）で表わ
される化合物は、例えば、市販のＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンから容易に製造することができる、１−クロ
ロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラアセチル−
α−Ｄ−グルコサミン、１−ブロモ−１−デオキシ−
２，３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサミ
ンなど［その製法は、例えばＭｅｔｈ． Ｃａｒｂｏｈ
ｙｄｒ． Ｃｈｅｍ．，６，２８２（１９７２）などを
参照］の１モル当量に、市販のフルオレセイン類、例え
ばフルオレセイン、２′，７′−ジクロロフルオレセイ
ン、４′，５′−ジブロモフルオレセイン、４′，５′
−ジヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テトラク
ロロフルオレセイン、２′，４′，５′，７′−テトラ
ヨードフルオレセイン、４′，５′−ジブロモ−２′，
７′−ジニトロフルオレセイン、２′，４′，５′，
７′−テトラブロモ−４，５，６，７−テトラクロロフ
ルオレセインなど、さらにはこれらのナトリウム塩、カ
リウム塩などの１モル当量を作用させて製造することが
できる。具体的には、例えば、溶媒としてアセトニトリ
ル、クロロホルム、アセトンなどを用い、Ａｇ₂Ｏ、Ｋ₂
ＣＯ₃、トリエチルアミンなどの触媒の存在下、２０〜
８０℃で１〜６０時間連続して反応させ、次いで、例え
ば常法により精製操作をおこなって、前記一般式（Ｉ
Ｉ）で表わされる化合物を製造することができる。

【００１７】このような前記一般式（ＩＩ）で表わされ
る化合物としては、例えばフルオレセイニル−２，３，
４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、
２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−２，３，４，
６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、４′
５′−ジブロモフルオレセイニル−２，３，４，６−テ
トラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、４′５′−ジ
ヨードフルオレセイニル−２，３，４，６−テトラアセ
チル−β−Ｄ−グルコサミニド、４，５，６，７−テト
ラクロロフルオレセイニル−２，３，４，６−テトラア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニド、２′，４′，５′，
７′−テトラヨードフルオレセイニル−２，３，４，６
−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、４′，
５′−ジブロモ−２′，７′−ジニトロフルオレセイニ
ル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニド、２′，４′，５′，７′−テトラブロモ−
４，５，６，７−テトラクロロフルオレセイニル−２，
３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
などが挙げられる。

【００１８】また、前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる
置換アルキルハライドとしては、市販品を用いてもよ
く、あるいは適宜の方法で製造して得たものを用いても
よい。このような前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる化
合物としては、例えば、いずれも市販品であるが、アミ
ノメチルクロライド、アミノエチルブロマイド、ジメチ
ルアミノエチルクロライド、ジエチルアミノエチルブロ
マイド、ジベンジルアミノエチルクロライド、ジメチル
アミノブチルブロマイド、ピペリジノエチルクロライ
ド、ピロリジノエチルクロライド、モルホリノエチルク
ロライド、ピペラジノプロピルブロマイド、トリメチル
アンモニウムエチルブロマイド、ジメチルベンジルアン
モニウムエチルクロライド、ピリジルメチルクロライ
ド、キノリルメチルクロライド、メチルピリジニウムメ
チルブロマイドなど、さらにはこれらの塩酸塩、臭素酸
塩などが挙げられる。

【００１９】次に、前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体の製造法につき
例示する。先ず、前記一般式（ＩＩ）で表わされるフル
オレセイニルグルコサミン誘導体に、溶媒及び触媒の存
在下で、前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる置換アルキ
ルハライドを作用させるのであるが、このときの該一般
式（ＩＩ）で表わされる化合物に対する該一般式（ＩＩ
Ｉ）で表わされる化合物の添加量は、通常１〜１００倍
モル当量、好ましくは５〜２０倍モル当量である。

【００２０】溶媒としては、ケトン類、例えばアセト
ン、メチルエチルケトンなど、ニトリル類、例えばアセ
トニトリルなど、ハロゲン化炭化水素類、例えばジクロ
ロメタン、クロロホルム、ジクロロエタンなど、ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（Ｄ
ＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメ
チルホスホラミド（ＨＭＰＡ）などが挙げられ、中でも
アセトニトリル、ＤＭＦが特に好ましい。また、これら
は単独又は組み合わせて用いられる。その量は、通常、
前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる化合物の重量の５〜
１０００倍量、好ましくは５０〜５００倍量である。

【００２１】触媒としては、銀塩、例えば Ａｇ₂Ｏ、Ａ
ｇＣｌＯ₄、ＡｇＮＯ₃、Ａｇ₂ＣＯ₃など、水銀塩、例え
ばＨｇＯ、Ｈｇ（ＣＮ）₂ など、アルカリ金属塩、例え
ばＮａＯＨ、Ｎａ₂ＣＯ₃、ＫＯＨ、Ｋ₂ＣＯ₃など、第三
アミン類、例えばトリエチルアミン、トリブチルアミン
などが挙げられ、中でも銀塩、アルカリ金属塩が好まし
い。また、これらは単独又は組み合わせて用いられる。
その量は、通常、前記一般式（ＩＩＩ）で表わされる化
合物の１〜１００倍モル当量、好ましくは１〜１０倍モ
ル当量である。

【００２２】反応温度及び反応時間は前記一般式（Ｉ
Ｉ）で表わされる化合物、前記一般式（ＩＩＩ）で表わ
される化合物、溶媒及び触媒の種類によって異なるが、
通常は２０〜１００℃で１〜６０時間連続して反応させ
る。

【００２３】こうして得られたものに塩基を作用させて
Ｏ−アシル基を脱離させることにより、前記一般式
（Ｉ）で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ン誘導体が得られる。塩基としては、例えばＫＯＨ、Ｋ
₂ＣＯ₃、ＮａＯＨ、Ｎａ₂ＣＯ₃などのアルカリ金属塩、
例えばナトリウムメチラート、ナトリウムフェノラート
などのアルカリ金属のアルコラート、アンモニアなどが
挙げられ、ナトリウムメチラートが特に好ましい。

【００２４】次いで、このようにして得られたものを常
法により精製して前記一般式（Ｉ）で表わされる目的化
合物を得ることができる。精製法としては、例えば適宜
の有機溶媒などを用いる析出法、シリカゲル、ＯＤＳ
（オクタデシルシリルシリカゲル）などを用いるカラム
クロマトグラフィなどが挙げられる。なお、前記一般式
（Ｉ）で表わされる化合物の２種類の立体異性体を必要
により分離するには、常法、例えば高速液体クロマトグ
ラフィなどを用いればよい。

【００２５】以上のようにして得られた前記一般式
（Ｉ）で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ン誘導体は、ＮＡＧａｓｅ活性の測定に極めて有用であ
り、この化合物を用いてＮＡＧａｓｅ活性をレイトアッ
セイ法により高感度、高精度で測定することができる。

【００２６】ＮＡＧａｓｅを測定するための有利な系と
しては、例えば前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体を１〜２０ｍＭ及び
緩衝剤を２〜２００ｍＭ含有する系（ｐＨ４．０〜６．
０）などが挙げられる。この系に用いられる緩衝剤とし
ては、例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸
塩、フタル酸塩などが挙げられる。また必要に応じて溶
解補助剤、安定化剤として、例えばグリセリン、トリト
ンＸ−１００などの界面活性剤、クラウンエーテル類、
シクロデキストリン類、グライコール類などを加えても
よい。

【００２７】本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した
形で用いてもよく、薄膜状の担体、例えばシート、含浸
性の紙などに含浸させて用いてもよい。このような本発
明の試薬を用いることにより、各種の試料に含有される
ＮＡＧａｓｅの活性を簡単な操作で正確に、かつ高感度
で測定することができる。

【００２８】次に、本発明のＮＡＧａｓｅ活性の測定法
の好適な１例について説明する。先ず、ＮＡＧａｓｅを
含む試料に、前記一般式（Ｉ）で表わされるＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体を１〜２０ｍＭ、好ま
しくは２〜５ｍＭ及び緩衝剤を添加した後、２０〜６０
℃、ｐＨ４．０〜６．０の条件にて１分以上、好ましく
は３〜１０分間酵素反応させ、生成するアグリコン（フ
ルオレセイン・モノエーテル）の吸光度を直接分光光度
計を用いて測定し、単位時間当りの吸光度の変化量を求
める。そして予め同様にして測定したＮＡＧａｓｅ標品
の吸光度変化量と対比させて試料中のＮＡＧａｓｅ活性
を算出する。

【００２９】本発明に用いられるＮＡＧａｓｅ含有試料
については、ＮＡＧａｓｅを含有するものであればよ
く、特に制限はないが、具体的には微生物の培養液、植
物の抽出液、あるいは動物の体液や尿や組織及びそれら
の抽出液などを用いることができる。また緩衝剤として
は、例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸
塩、フタル酸塩などが挙げられる。その他、必要に応じ
て還元物質の影響を少なくするために、前処理や酸化剤
の添加を行なってもよい。

【００３０】

【発明の効果】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体は、新規な
化合物であって、ＮＡＧａｓｅ活性測定用試薬として極
めて有用であり、このものを用いることにより、試料中
に含まれるグルコース、ビリルビン、ヘモグロビンなど
の影響を受けることなく、ＮＡＧａｓｅ活性を自動分析
法などにより精度よく、容易に測定することができる。

【００３１】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に
説明する。 実施例１ ６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル−２′，
７′−ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニド［Ｒ¹＝ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｎ（Ｃ
Ｈ₃）₂、Ｒ²＝Ｃｌ、Ｒ³＝Ｒ⁴＝Ｈ）の製造 １−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラア
セチル−α−Ｄ−グルコサミン１５．０ｇ（４１．０ｍ
ｍｏｌ）をアセトニトリル２．５ｌに溶解し、これに
２′，７′−ジクロロフルオレセイン１６．５ｇ（４
１．０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン５７ｍｌ（４１
０ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で１６時間攪拌しながら反
応させた。次いで、溶媒を留去したのち、シリカゲルク
ロマトグラフィにより精製し、クロロホルム−メタノー
ル混液（容量比４：１）で溶出した区分より、２′，
７′−ジクロロフルオレセイニル−２，３，４，６−テ
トラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド１５．２ｇ（２
０．８ｍｍｏｌ、収率５０．７％）を得た。

【００３２】融点： １６５−１６７℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝４８６，４５７，３７３，２８３，２
２７ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＣＤＣ
ｌ₃）：δ（ｐｐｍ） ８．００−８．０５（１Ｈ，ｍ），７．６０−７．８０
（２Ｈ，ｍ），６．６５−７．２０（５Ｈ，ｍ），６．
１８ａｎｄ６．２８（１Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝８．５
Ｈｚ，ＮＨ），５．００−５．６５（３Ｈ，ｍ），４．
１５−４．３０（３Ｈ，ｍ），３．６０−４．００（１
Ｈ，ｍ），２．１８（３Ｈ，ｓ），２．０７（３Ｈ，
ｓ），２．０６（３Ｈ，ｓ），１．９３ａｎｄ１．９６
（３Ｈ，ｅａｃｈ ｓ）

【００３３】なお、該２′，７′−ジクロロフルオレセ
イニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニドは、フルオレセイン部位の１位炭素におけ
る２種類の立体異性体が存在し、核磁気共鳴スペクトル
よりその存在比は約１：１であった。

【００３４】次に、この２′，７′−ジクロロフルオレ
セイニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド２．０ｇ（２．７４ｍｍｏｌ）をジメチ
ルホルムアミドに溶解し、これに、塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノエチルクロリド３．９５ｇ（２７．４ｍｍｏ
ｌ）及び炭酸カリウム７．５８ｇ（５４．８ｍｍｏｌ）
を加え、６０℃で２０時間かきまぜながら反応させた。
続いて、不溶物を濾去し、濾液のジメチルホルムアミド
を留去したのち、シリカゲルクロマトグラフィにより精
製し、クロロホルム−メタノール混液（容量比２５：
１）で溶出した区分より、６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノ）エチル−２′，７′−ジクロロフルオレセイ
ニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グル
コサミニド１．０９ｇ（１．３６ｍｍｏｌ、収率：４
９．７％）を得た。

【００３５】融点：１５２−１５４℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝２８２，２２８ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＣＤＣ
ｌ₃）：δ（ｐｐｍ） ８．００−８．０５（１Ｈ，ｍ），７．６０−７．８０
（２Ｈ，ｍ），７．１０−７．２０（２Ｈ，ｍ），６．
７０−６．８０（３Ｈ，ｍ），５．９３ａｎｄ５．９９
（１Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ＮＨ），５．
０５−５．６５（３Ｈ，ｍ），４．２５−４．３５（３
Ｈ，ｍ），４．１８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），
３．８５−４．０５（１Ｈ，ｍ），２．８５（２Ｈ，
ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．３９（６Ｈ，ｓ），２．１
５（３Ｈ，ｓ），２．０６（６Ｈ，ｓ），１．９２ａｎ
ｄ１．９４（３Ｈ，ｅａｃｈ ｓ）

【００３６】このようにして得た６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−
ジメチルアミノ）エチル−２′，７′−ジクロロフルオ
レセイニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ
−グルコサミニド０．５０ｇ（０．６２ｍｍｏｌ）を脱
水メタノール（２０ｍｌ）−アセトニトリル（１０ｍ
ｌ）混液に溶解し、これに２８％ナトリウムメチラート
−メタノール溶液０．０６ｍｌ（０．３１ｍｍｏｌ）を
加え、氷冷下、２時間かきまぜながら反応させた。次い
で、溶媒を減圧留去したのち、ＯＤＳ（ＹＭＣ・ＧＥＬ
ＯＤＳ−ＡＱ １２０−Ｓ５０）カラムクロマトグラ
フィにより精製し、４０％エタノール−水溶液で溶出し
た区分を凍結乾燥すると、６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノ）エチル−２′，７′−ジクロロフルオレセイ
ニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド２７０ｍ
ｇ（０．４０ｍｍｏｌ、収率：６４．１％）を得た。

【００３７】融点：１６０−１６２℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝２８２，２２８ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） ８．００−８．０５（１Ｈ，ｍ），７．６５−７．９０
（３Ｈ，ｍ），７．２０−７．３５（３Ｈ，ｍ），６．
７８（１Ｈ，ｓ），６．７６（１Ｈ，ｓ），５．１４ａ
ｎｄ５．１５（１Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝８．６Ｈ
ｚ），５．０８（１Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，Ｏ
Ｈ），５．０１（１Ｈ，ｂｒ ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｏ
Ｈ），４．６０−４．７０（１Ｈ，ｍ，ＯＨ），４．２
３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．７０−３．８５
（２Ｈ，ｍ），３．３０−３．６０（４Ｈ，ｍ），２．
７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．２５（６Ｈ，
ｓ），１．７８ａｎｄ１．７９（３Ｈ，ｅａｃｈ ｓ）

【００３８】実施例２ ６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）エ
チル−２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｒ¹＝ＣＨ₂ＣＨ₂−
Ｎ（ＣＨ₃）₃、Ｒ²＝Ｃｌ、Ｒ³＝Ｒ⁴＝Ｈ］の製造 ２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−２，３，４，
６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド２．０ｇ
（２．７４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミドに溶解
し、これにブロモコリンブロマイド６．７７ｇ（２７．
４ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム７．５８ｇ（５４．８ｍ
ｍｏｌ）を加え、室温で２０時間かきまぜながら反応さ
せた。次いで、不溶物を濾去し、濾液のジメチルホルム
アミドを留去したのち、ＯＤＳカラムクロマトグラフィ
により精製し、２５％エタノール−水溶液で溶出した区
分より、 ６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモ
ニウム）エチル−２′，７′−ジクロロフルオレセイニ
ル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニド１．２５ｇ（１．５３ｍｍｏｌ、収率：５５．
９％）を得た。

【００３９】融点：１９１−１９３℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝２８２，２２８ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＣＤＣ
ｌ₃）：δ（ｐｐｍ） ８．００−８．１０（１Ｈ，ｍ），７．６０−７．８５
（２Ｈ，ｍ），７．１０−７．２５（２Ｈ，ｍ），６．
９０−７．００（１Ｈ，ｍ），６．６５−６．８０（２
Ｈ，ｍ），６．０６ａｎｄ６．１７（１Ｈ，ｅａｃｈ
ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＮＨ），５．００−５．７５（３
Ｈ，ｍ），４．７２（２Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．４Ｈ
ｚ），４．２９（２Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），
４．０５−４．２５（３Ｈ，ｍ），３．８０−３．９５
（１Ｈ，ｍ），３．５１ａｎｄ３．５４（９Ｈ，ｅａｃ
ｈ ｓ），２．１３（３Ｈ，ｓ），２．０５（６Ｈ，
ｓ），１．９０ａｎｄ１．９２（３Ｈ，ｅａｃｈ ｓ）

【００４０】このようにして得た６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ，
Ｎ−トリメチルアンモニウム）エチル−２′，７′−ジ
クロロフルオレセイニル−２，３，４，６−テトラアセ
チル−β−Ｄ−グルコサミニド０．５０ｇ（０．６１ｍ
ｍｏｌ）を脱水メタノール（２０ｍｌ）−アセトニトリ
ル（１０ｍｌ）混液に溶解し、これに２８％ナトリウム
メチラート−メタノール溶液０．０６ｍｌ（０．３１ｍ
ｍｏｌ）を加え、氷冷下、２時間かきまぜながら反応さ
せた。次いで、溶媒を減圧留去したのち、ＯＤＳ（ＹＭ
Ｃ・ＧＥＬ ＯＤＳ−ＡＱ １２０−Ｓ５０）カラムク
ロマトグラフィにより精製し、２０％エタノール−水溶
液で溶出した区分を凍結乾燥すると、６′−Ｏ−（Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）エチル−２′，７′
−ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド２８４ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ、収率：
６７．１％）を得た。

【００４１】融点：１７９−１８２℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝２８２，２２８ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） ８．００−８．０５（１Ｈ，ｍ），７．６５−７．９０
（３Ｈ，ｍ），７．２０−７．３５（３Ｈ，ｍ），６．
８０−６．８５（２Ｈ，ｍ），５．１６ａｎｄ５．１７
（１Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，），４．９５
−５．０１（２Ｈ，ｍ，ＯＨ），４．６０−４．７５
（１Ｈ，ｍ，ＯＨ），４．６８（２Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝
５．６Ｈｚ），３．８９（２Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．６
Ｈｚ），３．７０−３．８５（２Ｈ，ｍ），３．３０−
３．６０（４Ｈ，ｍ），３．２２（９Ｈ，ｓ），１．７
８ａｎｄ１．８０（３Ｈ，ｅａｃｈ ｓ）

【００４２】実施例３ ６′−Ｏ−（Ｎ−モルホリノ）エチル−２′，７′−ジ
クロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニド［Ｒ¹＝ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂）₂Ｏ
、Ｒ²＝Ｃｌ、Ｒ³＝Ｒ⁴＝Ｈ］の製造 ２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−２，３，４，
６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド２．０ｇ
（２．７４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミドに溶解
し、これに塩酸Ｎ−（２−クロロエチル）モルホリン
５．１０ｇ（２７．４ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム７．
５８ｇ（５４．８ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で７時間か
きまぜながら反応させた。次いで、不溶物を濾去し、濾
液のジメチルホルムアミドを留去したのち、シリカゲル
クロマトグラフィにより精製し、クロロホルム−メタノ
ール混液（容量比２５：１）で溶出した区分より、
６′−Ｏ−（Ｎ−モルホリノ）エチル−２′，７′−ジ
クロロフルオレセイニル−２，３，４，６−テトラアセ
チル−β−Ｄ−グルコサミニド１．４４ｇ（１．７１ｍ
ｍｏｌ、収率：６２．３％）を得た。

【００４３】融点：１５６−１５８℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝２８２，２２８ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＣＤＣ
ｌ₃）：δ（ｐｐｍ） ８．００−８．０５（１Ｈ，ｍ），７．６０−７．８０
（２Ｈ，ｍ），７．１０−７．２０（２Ｈ，ｍ），６．
７０−６．８０（３Ｈ，ｍ），５．９０ａｎｄ５．９３
（１Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＮＨ），５．
０５−５．７０（３Ｈ，ｍ），４．２５−４．３５（２
Ｈ，ｍ），４．２１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），
３．８５−４．０５（２Ｈ，ｍ），３．７２（４Ｈ，ｂ
ｒ ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），２．８８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝
５．６Ｈｚ），２．６３（４Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝４．６Ｈ
ｚ），２．１５（３Ｈ，ｓ），２．０７（６Ｈ，ｓ），
１．９２ａｎｄ１．９４（３Ｈ，ｅａｃｈ ｓ）

【００４４】このようにして得た６′−Ｏ−（Ｎ−モル
ホリノ）エチル−２′，７′−ジクロロフルオレセイニ
ル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニド０．５０ｇ（０．５９ｍｍｏｌ）を脱水メタノ
ール（２０ｍｌ）−アセトニトリル（１０ｍｌ）混液に
溶解し、これに２８％ナトリウムメチラート−メタノー
ル溶液０．０６ｍｌ（０．３１ｍｍｏｌ）を加え、氷冷
下、２時間かきまぜながら反応させた。次いで、溶媒を
減圧留去したのち、ＯＤＳ（ＹＭＣ・ＧＥＬＯＤＳ−Ａ
Ｑ １２０−Ｓ５０）カラムクロマトグラフィにより精
製し、４０％エタノール−水溶液で溶出した区分を凍結
乾燥すると、６′−Ｏ−（Ｎ−モルホリノ）エチル−
２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド２９４ｍｇ（０．４１ｍｍｏ
ｌ、収率：６９．１％）を得た。

【００４５】融点：１４７−１４８℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝２８２，２２８ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） ８．００−８．０５（１Ｈ，ｍ），７．７０−７．９０
（３Ｈ，ｍ），７．２０−７．３５（３Ｈ，ｍ），６．
７８（１Ｈ，ｓ），６．７６（１Ｈ，ｓ），５．１４ａ
ｎｄ５．１５（１Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝８．５Ｈ
ｚ，），４．９５−５．１０（２Ｈ，ｍ，ＯＨ），４．
６８（１Ｈ，ｂｒ ｓ，ＯＨ），４．３０（２Ｈ，ｔ，
Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．６５−３．８５（２Ｈ，ｍ），
３．５７（４Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），３．２
０−３．５０（４Ｈ，ｍ），２．７７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝
５．６Ｈｚ），２．５２（４Ｈ，ｂｒ ｔ，Ｊ＝４．６
Ｈｚ），１．７８ａｎｄ１．８０（３Ｈ，ｅａｃｈ
ｓ）

【００４６】実施例４ ６′−Ｏ−（２−ピリジル）メチル−２′，７′−ジク
ロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニド［Ｒ¹＝ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｃ₅Ｈ₅Ｎ 、Ｒ²＝Ｃｌ、
Ｒ³＝Ｒ⁴＝Ｈ］の製造 ２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−２，３，４，
６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサミニド３．０ｇ
（４．１１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミドに溶解
し、これに塩酸２−（クロロメチル）ピリジン６．７４
ｇ（４１．１ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム１１．３６ｇ
（８２．２ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で５時間かきまぜ
ながら反応させた。次いで、不溶物を濾去し、濾液のジ
メチルホルムアミドを留去したのち、シリカゲルクロマ
トグラフィにより精製し、クロロホルム−メタノール混
液（容量比５０：１）で溶出した区分より、 ６′−Ｏ
−（２−ピリジル）メチル−２′，７′−ジクロロフル
オレセイニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−
Ｄ−グルコサミニド２．４３ｇ（２．９６ｍｍｏｌ、収
率：７２．０％）を得た。

【００４７】融点：１４６−１４８℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝２８２，２２８ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＣＤＣ
ｌ₃）：δ（ｐｐｍ） ８．５５−８．６５（１Ｈ，ｍ），８．００−８．１０
（ＩＨ，ｍ），７．６５−７．８０（３Ｈ，ｍ），７．
５５−７．６０（１Ｈ，ｍ），７．２３−７．３０（１
Ｈ，ｍ），７．１０−７．１７（２Ｈ，ｍ），６．７０
−６．９０（３Ｈ，ｍ），５．９６ａｎｄ６．０４（１
Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ＮＨ），５．０５
−５．７０（３Ｈ，ｍ），５．３１（２Ｈ，ｂｒ
ｓ），４．１５−４．３５（２Ｈ，ｍ），３．８５−
４．０５（２Ｈ，ｍ），２．１４（３Ｈ，ｓ），２．０
７（３Ｈ，ｓ），２．０５（３Ｈ，ｓ），１．９０ａｎ
ｄ１．９３（３Ｈ，ｅａｃｈ ｓ）

【００４８】このようにして得た６′−Ｏ−（２−ピリ
ジル）メチル−２′，７′−ジクロロフルオレセイニル
−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニド０．５０ｇ（０．６１ｍｍｏｌ）を脱水メタノー
ル（２０ｍｌ）−アセトニトリル（１０ｍｌ）混液に溶
解し、これに２８％ナトリウムメチラート−メタノール
溶液０．０６ｍｌ（０．３１ｍｍｏｌ）を加え、氷冷
下、２時間かきまぜながら反応させた。次いで、溶媒を
減圧留去したのち、ＯＤＳ（ＹＭＣ・ＧＥＬ ＯＤＳ−
ＡＱ １２０−Ｓ５０）カラムクロマトグラフィにより
精製し、５０％エタノール−水溶液で溶出した区分を凍
結乾燥すると、６′−Ｏ−（２−ピリジル）メチル−
２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド３３４ｍｇ（０．４８ｍｍｏ
ｌ、収率：７８．８％）を得た。

【００４９】融点：１７２−１７３℃ 紫外部・可視部吸収スペクトル（ＥｔＯＨ）：吸収極大
波長［λmax］＝２８２，２２８ｎｍ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）（ＤＭＳＯ−ｄ
₆）：δ（ｐｐｍ） ８．５５−８．６５（１Ｈ，ｍ），８．００−８．０５
（１Ｈ，ｍ），７．６５−７．９５（４Ｈ，ｍ），７．
５０−７．６０（１Ｈ，ｍ），７．２５−７．４０（４
Ｈ，ｍ），６．７５−６．８５（２Ｈ，ｍ），５．４１
（２Ｈ，ｓ），５．１４ａｎｄ５．１５（１Ｈ，ｅａｃ
ｈ ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，），５．００−５．１０（２
Ｈ，ｍ，ＯＨ），４．６０−４．７０（１Ｈ，ｍ，Ｏ
Ｈ），３．７０−３．８５（２Ｈ，ｍ），３．４０−
３．６０（３Ｈ，ｍ），３．１５−３．３０（１Ｈ，
ｍ）１．７８ａｎｄ１．７９（３Ｈ，ｅａｃｈ ｓ）

【００５０】実施例５ ＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬 （１）試薬の組成 含有物 濃度 基質試薬：６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ） エチル−２′，７′−ジクロロフルオレ セイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル コサミニド ２．０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０） ５０．０ｍＭ 精製水

【００５１】（２）測定法 基質試薬１ｍｌを３７℃で５分間加温したのち、試料液
５０μｌを加え、３７℃で５分間加温後からの５分間の
４９０ｎｍにおける吸光度の変化量を測定する。この吸
光度変化量と予め作成した検量線から算出して、試料液
中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を行なうことができる。な
お、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲を超えた
場合は、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を用
いて相当する倍数の希釈を行なったのち、再測定を行な
う。

【００５２】実施例６ ＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬 （１）試薬の組成 含有物 濃度 基質試薬：６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルア ンモニウム）エチル−２′，７′−ジク ロロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル− β−Ｄ−グルコサミニド ２．０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０） ５０．０ｍＭ 精製水 （２）測定法 実施例５に記載したと同様にして、ＮＡＧａｓｅ活性を
測定することができる。

【００５３】実施例７ ＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬 （１）試薬の組成 含有物 濃度 基質試薬：６′−Ｏ−（Ｎ−モルホリノ）エチル− ２′，７′−ジクロロフルオレセイニル −Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ ド ２．０ｍＭ β−シクロデキストリン ０．５％（Ｗ／Ｖ） クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０） ５０．０ｍＭ 精製水 （２）測定法 実施例５に記載したと同様にして、ＮＡＧａｓｅ活性を
測定することができる。

【００５４】実施例８ ＮＡＧａｓｅ活性の測定用試薬 （１）試薬の組成 含有物 濃度 基質試薬：６′−Ｏ−（２−ピリジル）メチル− ２′，７′−ジクロロフルオレセイニ ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ ミニド ２．０ｍＭ １８−クラウン−６ ０．２％（Ｗ／Ｖ） クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０） ５０．０ｍＭ 精製水 （２）測定法 実施例５に記載したと同様にして、ＮＡＧａｓｅ活性を
測定することができる。

【００５５】実施例９ ＮＡＧａｓｅ活性の測定方法 （１）基質液の調製 実施例１で得た６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）
エチル−２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド６７．５ｍｇ（０．
１ｍｍｏｌ）を取り、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝
５．０）を加えて全量を５０ｍｌとして基質液とする。 （２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調製 市販品の酵素活性既知のＮＡＧａｓｅを５０ｍＭクエン
酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を用いて数種類の濃度に希釈
して標品ＮＡＧａｓｅ液とする。

【００５６】（３）検量線の作成 基質液１ｍｌに、各濃度の標品ＮＡＧａｓｅ液５０μｌ
を加え、３７℃で５分間加温後からの５分間の４９０ｎ
ｍにおける吸光度の変化量の関係により検量線を作成す
る。シグマ社製ＮＡＧａｓｅ（２５ｕ／０．５ｍｌ）を
使用した場合、検量線の式は Ｕ＝１．８４×（△Ａ）×１０³ （Ｕ：酵素活性ｕ／ｌ、△Ａ：吸光度変化量／分）とな
る。そのグラフを図１に示す。 （４）試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定 基質液１ｍｌに試料液５０μｌを加え、３７℃で５分間
加温後からの５分間の４９０ｎｍにおける吸光度の変化
量を測定する。この吸光度変化量と（３）で作成した検
量線から算出して試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を
行なうことができる。なお、試料液の酵素活性の値が検
量線の測定範囲（０−２５０ｕ／ｌ）を超えた場合は、
５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を用いて相当
する倍数の希釈を行なったのち、再測定を行なう。

【００５７】実施例１０ ＮＡＧａｓｅ活性の測定方法 （１）基質液の調製 基質として、実施例２で得た６′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−
トリメチルアンモニウム）エチル−２′，７′−ジクロ
ロフルオレセイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニド６９．０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を用いる以外
は、実施例９に記載したと同様にして基質液を調製す
る。 （２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調製、検量線の作成及び試
料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定は、実施例９に記載し
たと同様にして行なう。なお、シグマ社製ＮＡＧａｓｅ
（２５ｕ／０．５ｍｌ）を使用した場合、検量線の式は Ｕ＝２．８５×（△Ａ）×１０³ （Ｕ：酵素活性ｕ／ｌ、△Ａ：吸光度変化量／分）とな
る。そのグラフを図２に示す。

【００５８】実施例１１ ＮＡＧａｓｅ活性の測定方法 （１）基質液の調製 基質として実施例３で得た６′−Ｏ−（Ｎ−モルホリ
ノ）エチル−２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド７１．７ｍｇ
（０．１ｍｍｏｌ）を用い、β−シクロデキストリン
０．２５ｇを加える以外は、実施例９に記載したと同様
にして基質液を調製する。 （２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調製、検量線の作成及び試
料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定は、実施例９に記載し
たと同様にして行なう。なお、シグマ社製ＮＡＧａｓｅ
（２５ｕ／０．５ｍｌ）を使用した場合、検量線の式は Ｕ＝２．１４×（△Ａ）×１０³ （Ｕ：酵素活性ｕ／ｌ、△Ａ：吸光度変化量／分）とな
る。そのグラフを図３に示す。

【００５９】実施例１２ ＮＡＧａｓｅ活性の測定方法 （１）基質液の調製 基質として実施例４で得た６′−Ｏ−（２−ピリジル）
メチル−２′，７′−ジクロロフルオレセイニル−Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド６９．５ｍｇ（０．
１ｍｍｏｌ）を用い、１８−クラウン−６を０．１０ｇ
加える以外は、実施例９に記載したと同様にして基質液
を調製する。 （２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調製、検量線の作成及び試
料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定は、実施例９に記載し
たと同様にして行なう。なお、シグマ社製ＮＡＧａｓｅ
（２５ｕ／０．５ｍｌ）を使用した場合、検量線の式は Ｕ＝３．２０×（△Ａ）×１０³ （Ｕ：酵素活性ｕ／ｌ、△Ａ：吸光度変化量／分）とな
る。そのグラフを図４に示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例９におけるＮＡＧａｓｅ活性の測定に
用いる検量線のグラフ

【図２】 実施例１０におけるＮＡＧａｓｅ活性の測定
に用いる検量線のグラフ

【図３】 実施例１１におけるＮＡＧａｓｅ活性の測定
に用いる検量線のグラフ

【図４】 実施例１２におけるＮＡＧａｓｅ活性の測定
に用いる検量線のグラフ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (54)【発明の名称】 Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、これを有効成分とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グ ルコサミニダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ 活性の測定方法

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中のＲ¹は有機アミン若しくは含窒素複素環又はそ
   の第四アンモニウム塩を有する炭素数１〜４の置換アル
   キル基、Ｒ²〜Ｒ⁴はそれぞれ独立して、水素原子、ハロ
   ゲン原子、又はニトロ基を意味する）で表わされるＮ−
   アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＮ−アセチル−β−Ｄ−
   グルコサミン誘導体を有効成分とするＮ−アセチル−β
   −Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬。
3. 【請求項３】 Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
   ーゼ含有試料に、請求項１記載のＮ−アセチル−β−Ｄ
   −グルコサミン誘導体を加え、酵素反応によって生成す
   るアグリコン（フルオレセイン・モノエーテル）を定量
   することを特徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
   ニダーゼ活性の測定方法。