DE2147466B2 - 2- BenzothiazoIyl-(2)-3-phenyI-5- (4-N-trimethyl-ammonium-pheyl) tetrazoliumsalze - Google Patents
2- BenzothiazoIyl-(2)-3-phenyI-5- (4-N-trimethyl-ammonium-pheyl) tetrazoliumsalzeInfo
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Description
Tetrazoliumsalze sind wertvolle Reagenzien zur Sichtbarmachung biologischer Reduktionsvorgänge.
Sie stellen im allgemeinen farblose Verbindungen dar, die durch Reduktion, z. B. mit einem reduzierenden ω
Zucker, in starkfarbige, wenig lösliche Körper übergehen, die man als Formazane bezeichnet (L. F. Fieser +
M. Fieser, Org. Chemie, Verl. Chemie, 1965, S. 1437). Es ist seit langem bekannt, daß reduzierte Pyridinnucleotide
unter der Katalyse von N-Methylphenazinium-sal- b5
zen (PMS) oder dem Enzym Diaphorase mit Tetrazoliumsalzen in der oben beschriebenen Weise reagieren.
Auf dieser Reaktion beruhen eine Reihe von Bestimmungsmethoden für reduzierte Pyridinnucleotide
und damit von Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Enzymen; so läßt sich beispielsweise die Aktivität
von Lactat-Dehydrogenase (LDH) dadurch bestimmen, daß Lactat unter Katalyse von Lactat-Dehydrogenase
mit Nicotinamidadenin-dinucleotid (NAD) zu Pyruvat und reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid
(NADH) umgesetzt wird. Das gebildete NADH reagiert nun beispielsweise in Gegenwart des Enzyms Diaphorase
mit Tetrazoliumsalzen unter Bildung von NAD und farbigen Formazanen, deren Konzentration photometrisch
bestimmt werden kann.
Für den Nachweis von NADH stehen bis jetzt nur wenige Tetrazoliumsalze zur Verfügung [z.B. Triphenyl-tetrazoliumchlorid,
(TTC), Jodphenylnitrophenyl-tetrazoliumsalze
(INT), 2,5-Dipheiiyl-3[4,5-dimethyIthiazolyl-(2)]-tetrazoliumbroimd
(MTT), die sich jedoch für quantitative Bestimmungen im Photometer
nicht gut eignen, da sie folgende hierfür notwendige Bedingungen nicht hinreichend erfüllen:
1. Sowohl das Tetrazoliumsalz als auch das bei der Reduktion gebildete Formazan muß in wäßriger
Lösung auch ohne Zusatz von organischen Lösungsmitteln oder Lösungsvermittlern leicht lösbar
sein.
2. Das Tetrazoliumsalz muß unter den Reaktionsbedingungen der enzymatischen Bestimmung leicht
und schnell reduziert werden.
3. Das gebildete Formazan muß ein Absorptionsmaximum in einem günstigen Meßbereich, möglichst
um 550 nm besitzen.
4. Der molare Extinktionskoeffizient und damit die Empfindlichkeit muß sehr hoch sein.
Zweck der Erfindung war es, Tetrazoliumsalze zu entwickeln, welche sich für eine enzymatische NADH-Bestimmung
im Photometer eignen und die obigen Bedingungen in möglichst idealer Weise erfüllen.
Es wurde gefunden, daß die bisher nicht bekannten 2-Benzothiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammonium-phenyl)-tetrazoliumsalze
der allgemeinen Formel I
(III)
mit einem geeigneten Oxidationsmittel umsetzt und gewünschtenfalls das Anion X mit entsprechenden
Alkalisalzen oder entsprechend beladenen Ionenaustauschern modifiziert.
3. Verwendung von 2-Benzothiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammonium-phenyl)-tetrazo-
liunisalzen gemäß Anspruch 1 zum Nachweis von biologischen Reduktionsvorgängen.
liunisalzen gemäß Anspruch 1 zum Nachweis von biologischen Reduktionsvorgängen.
CH3
CH3
(X) 2° (D
in welcher X ein zweiwertiges oder zwei einwertige Anionen organischer oder anorganischer Säuren
bedeutet,
leicht löslich sind, schnell und empfindlich reagieren und überraschenderweise Formazane ergeben, die ein
günstiges Absorptionsmaximum bei 525 nm besitzen und sich außerdem durch außergewöhnliche Löslichkeit
und einen hohen molaren Extinktionskoeffizienten auszeichnen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind
somit zum fotometrischen Nachweis von NADH und anderen reduzierenden Stoffen hervorragend geeignet.
Als Anionen kommen zum Beispiel Chlorid, Bromid, Iodid, Nitrat, Fluoroborat, Perchlorat, Sulfat, Oxalat
und Tartrat infrage. Da jedoch die Wahl des Anions für die Reaktionsfähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen
nicht von wesentlicher Bedeutung ist, lassen sich auch andere Anionen und Anionen-Kombinationen
mit dem Tetrazoliumkation zu reaktionsfähigen Salzen vereinigen. Es versteht sich von selbst, daß Anionen,
welche die erstrebten Eigenschaften des Nachweisreagens, beispielsweise die Leichtlöslichkeit wieder aufheben
oder den Nachweis z. B. durch Inhibitorwirkung (Fluoride) stören, nicht geeignet sind.
Die Herstellung der erfmdungsgemäßen Substanzen erfolgt in an sich bekannter Weise durch Umsetzung
eines Hydrazone der allgemeinen Formel II
CH3
C-NH-N=C
χβ
(N)
mit einem reaktiven Benzoldiazoniumsalz, vorzugsweise
mit Benzoldiazoniumchlorid, und anschließende Oxidation
des erhaltenen Formazans der allgemeinen Formel III
zu Verbindungen der allgemeinen Formel I mit einem geeigneten Oxidationsmittel, wobei das Anion bzw. die
Anionen erfindungsgemäß durch Umsetzung mit entsprechenden Alkalisalzen oder entsprechend beladenen
Anionenaustauschern modifiziert werden können.
Für die Umsetzung zu den Verbindungen III kommen als Hydrazonsalze II insbesondere die Halogenide, vorzugsweise
Chloride infrage.
Als Oxidationsmittel für die Verbindungen III kommen Quecksilber-(II)-oxid, Isoamylnitrit, Blcitetraazetat,
N-Bromsuccinimid oder N-Chlorphthalimid infrage.
Die als Ausgangsprodukte verwendeten Verbindungen der allgemeinen Formel II, werden in bekannter
Weise z.B. durch Umsetzung von p-N-Trimethylammonium-benzaldehyd-chlorid
mit 2-Hydrazinobenzothiazol in Eisessig und gegebenenfalls anschließende Modifikation des Restes X hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Tetrazoliumsalze eignen sich ganz allgemein für die Bestimmung reduzierender Substanzen
z. B. von reduzierenden Zuckern, Ascorbinsäure oder Ketosteroiden. Hierbei müssen lediglich die
Reaktiongsbedingungen der gesteigerten Reaktivität angepaßt werden. Hauptaufgabe der Erfindung war jedoch,
ein Reagenz zum Nachweis biologischer Reduktionsvorgänge bereitzustellen, das insbesondere zur
Bestimmung von Enzymen oder deren Substraten dient, bei deren Reaktionen reduzierte Pyridinnucleotide gebildet
oder verbraucht werden.
Als reduzierte Pyridinnucleotide kommen vor allem Nicotinadenin-dinucleotid (NADH), Nicotin-adenindinucleotid-phosphat
(NADPH) und Acetylpyridindinucleotid (APADH) infrage. Erfindungsgemäß können beispielsweise die Enzyme Lactat-Dehydrogenase
(LDH), Malat-Dehydrogenase (MDH) und Glutamat-Dehydrogenase (Gl.DH) bestimmt werden.
Es lassen sich enzymatisch auch beispielsweise folgende Substrate bestimmen: Äthanol mit Alkohol-Dehydrogenase,
Glucose mit Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase,
Galaktose mit Galaktose-Dehydrogenase sowie Glycerin mit Giycerokinase und
Glycerophosphat-Dehydrogenase. Als Reduktionskatalysatoren eignen sich Diaphorase
und N-Methylphenazinium-methosulfat (PMS^ wobei
prinzipiell hinsichtlich der Versuchs- und Reaktionsbedingungen kein Unterschied zu den bekannten Tetrazoliumsalzen
besteht
ίο Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung
der Erfindung.
2-Benzothiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammoniumphenyl)-tetrazolium-dichlorid
a) p-Trimethylammonium-benzaldehyd-chlorid
29,8 g (0,2 Mol) p-Dimethylaminobenzaldehyd werden
mit 56 g (0,4 Mol) Methyljodid in 100 ml Acetonitril 8 Stunden unter Rühren am Rückfluß gekocht Nach
weiterem zweistündigem Rühren bei Zimmertemperatur werden die gebildeten farblosen Kristalle von p-Trimethylammonium-benzaldehyd-iodid
abgesaugt und mit wenig eiskaltem Acetonitril gewaschen. Fp. 158° Ausbeute: 48,6 g (80,7 dTh.).
30 g p-Trimethylammonium-benzaldehyd-iodid werden in 100 rrl Wasser gelöst und über einen mit Chloridionen
beladenen Anionenaustauscher (z.B. erhältlich unter dem Handelsnamen Amberlite IRA 400) gegeben.
Aus dem Eluat erhält man beim Einengen farblose etwas hygroskopische Kristalle von p-Trimethylammonium-benzaldehyd-chlorid
Fp. 203 bis 204°; Ausbeute: 19,8 g( = 963% d.Th.).
b) p-N-Trimethylammonium-benzaldehyd-benzothiazolyl-(2)-hydrazonchlorid
25 g (0,125 Mol) p-N-Trimethylammonium-benzaldehyd-chlorid
werden mit 20,8 g (0,125 Mol) 2-Hydrazino-
benzothiazol in 300 ml Eisessig 6 Stunden bei 80 bis 900C gerührt Nach Einenger im Vakuum und Zugabe
von wenig Alkohol kristallisiert die Substanz in leicht gelblichen Kristallen, die aus Methanol umkristallisiert
werden. Man erhält 39,4 g (=90,5% d.Th.) p-N-Trimethylammonium-benzaldehyd-benzothiazolyl-(2)-hy-
drazon-chlorid, Fp. 215° C.
c) 1 -Phenyl-3-(4-N-trimethylammoniumphenyl)-chlorid-5-benzothiazolyl-(2)-formazan
20,7 g (0,06 Mol) p-N-Trimethylammonium-benzaldehyd-benzothiazol-(2)-hydrazon-chlorid
werden in 600 ml Wasser und 150 ml Pyridin gelöst und auf O0C
abgekühlt. Danach wird aus 6,5 g Salzsäure, 6 ml Wasser und 2,8 ml Anilin bei 00C unter Zugabe von
2,1 g Natriumnitrit in 5 ml Wasser eine Benzol-diazoniumsalzlösung
hergestellt. Diese wird bei O0C unter Rühren und weiterem Kühlen innerhalb einer halben
Stunde in die vorgelegte Hydrazonlösung eingetropft, dabei fällt das Formazan in grünen Kristallen an. Nach 1
Stunde Weiterrühren wird der voluminöse Niederschlag abgesaugt und mit ca. 150 ml Wasser in kleinen
Portionen gewaschen. Nach dem Abfiltrieren wird der trockene Rückstand mit 200 ml trockenem Dioxan angerührt
und abgesaugt. Man erhält 24 g (89,4% d. Th.)
l-Phenyl-S-^-N-trirnethylarnmoniumphenylJ-chlorid-5-benzothiazolyl-(2)-formazan;
Fp. 152° C (Zers.).
d) 2-Benzothiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammonium-phenyl)-tetrazolium-dichlorid
18 g{0,04 MoI) l-Phenyl-3-(4-N-trimethylammoniumphenyl)-chlorid-5-benzthiazolyl-(2)-fonnazan
werden in 450 ml Methanol gelöst Die dunkdrote Lösung wird
mit 13,5 g N-Chlorphthalimid versetzt, langsam
erwärmt und solange unter Rückfluß gekocht, bis eine hellgelbe Lösung entstanden ist Nach Abkühlen auf 5
bis 100C wird das überschüssige N-Chlorphthalimid
(ca. 6 g) abgesaugt und mit wenig kaltem Methanol gewaschen. Das Filtrat wird dann mit 2,5 Liter Äther
versetzt Das abgeschiedene voluminöse Tetrazoliumsalz wird abgesaugt und mit ca. 250 ml Essigester angerührt
Die so erhaltenen gelben Kristalle werden zur weiteren Reinigung aus 160 ml n-Propanol umkristallisiert,
wobei durch Zugabe von etwas Aktivkohle die dunkelbraune Lösung geklärt wird. Man erhält 15 g
(71,3% dTh.) 2-Benzothiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethyl-ammoniumphenyl)-tetrazolium-dichlorid.
Fp. 156° C (Zers.).
Darstellung wetterer 2-Benzothiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammoniumphenyl)-tetrazoliumsalze
1 g des in Beispiel 1 beschriebenen 2-Benzothiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trirnethyIammoruum-phenyl)-tetrazolium-dichlorids
werden in 5 bis 10 ml Wasser gelöst und unter gutem Rühren langsam mit
dem festen Natriumsalz des gewünschten Anioru versetzt Die mehr oder weniger schnell ausfallenden
Tetrazoliumsalze werden abgesaugt und umkristallisiert.
Auf diese Weise werden hergestellt:
Dibromid: gelbe Kristalle aus Äthanol, Fp. 174 bis 176° C (Zers.).
Dibromid: gelbe Kristalle aus Äthanol, Fp. 174 bis 176° C (Zers.).
Dijodid: rote Nadeln aus Methanol, Fp. 160 bis 16^°C
(Zers.).
Difluoborat: gelbe Nadeln aus Methanol, Fp. 213 bis 215° C (Zers.).
Dipercnlorat: gelbe Kristalle aus Methanol, Fp. 207 bis
2100C (Zers.).
Dinitrat: gelbe Kristalle aus Propanol-Äther, Fp. 213 bis
215°C (Zers.).
Ditosylat: hellgelbes Pulver aus Äthanol-Äther, Fp. 222 bis 224" C (Zers.).
Anwendungsbeispiele
1. Bestimmung der Aktivität von Lactat-Dehydrogenase im Serum
2,5 ml eines Natriumpyrophosphatpuffers (pH 8,6), der 48 mMol L-Lactat enthält werden mit 0,2 n:l einer
Lösung gemischt, die 0,6 bis 1,2 mg NAD' pro ml einer verdünnten Pufferlösung (Kaliumphosphat, pH 7,4) und
mindestens 0,2 mg Diaphorase pro ml enthält. Zu diesem Gemisch gibt man 0,2 ml einer wäßrigen
Lösung, welche mindestens 1 mg/ml 2-Benzothiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammoniumphenyl)-tetrazolium-dichlorid
enthält. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml Serum in Gang gesetzt. Die Änderung der Extinktion pro Minute {Δ E/min) in den
ersten 5 Minuten nach Start wird bei 25° C gegen einen Blindwert gemessen (546 mm) und die Volumenaktivität
nach folgender Formel ermittelt:
... ,-,,,,., I E/min · V- 1000
Volumenaktivität [UjL] - - '
-T74 ( cr"2 ^
' V .«Mol,/
d = Schichtdicke, cm
r = Probenvolumen,
r = Probenvolumen,
V = Testvolumen;
1000 = Umrechnungsfaktor von mL auf L.
1000 = Umrechnungsfaktor von mL auf L.
In analoger Weise lassen sich die Aktivitäten folgender
Enzyme bestimmen:
a) Λ-Hydroxybuttersäure-Dehydrogenase, mit
«-Hydroxybuttersäure.
«-Hydroxybuttersäure.
b) Malat-Dehydrogenase, mit Malat.
c) Sorbit-Dehydrogenase, mit D-Sorbit.
d) Alkohol-Dehydrogenase, mit Äthanol.
,. 2. Bestimmung von Glycerin irr» Serum
2,3 ml Puffer (0,2 molarer Glycin/Natriumcarbonatpuffer. pH = 8,0-9,0) werden mit 0,2 ml einer Lösung
gemischt, die 25 mg ATP, 0,5 mg Glycerokinase und 1,0 mg Λ-Glycero-phosphat-Dehydrogenase enthält.
Zu diesem Gemisch gibt man 0,2 ml einer Lösung, welche 0,6 bis 1,2mg NAD" pro ml einer verdünnten
Pufferlösung (Kaliumphosphat, pH 7,4) und mindestens 0,2 mg Diaphorase pro ml enthält. Anschließend gibt
man 0,2 ml einer wäßrigen Lösung zu, welche mindestens 1 mg/ml 2-Benzothiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammoniumphenyl)-tetrazolium-dichlorid
enthält. Die Reaktion wird udrch Zugabe von 0,1 ml Serum in Gang gesetzt.
Sofort nach Serumzugabe wird die Anfangsextinktion E\ bei 546 nm abgelesen; nach 25 Minuten die Endextinktion Ei und aus der Differenz Δ Ε ( = E2 — E\) der Gehalt nach folgender Formel berechnet:
Sofort nach Serumzugabe wird die Anfangsextinktion E\ bei 546 nm abgelesen; nach 25 Minuten die Endextinktion Ei und aus der Differenz Δ Ε ( = E2 — E\) der Gehalt nach folgender Formel berechnet:
IE·
MW
Konzentration
V = Testvolumen,
ν = Probenvolumen,
MW = Molekulargewicht
ε = 27,4 [cmVMol],
d = Schichtdicke [cm].
ν = Probenvolumen,
MW = Molekulargewicht
ε = 27,4 [cmVMol],
d = Schichtdicke [cm].
In analoger Weise lassen sich folgende klinisch chemisch wichtige Substrate bestimmen:
Glucose mit ATP, Hexokinase und NADP, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase,
«-Hydroxybuttersäure mit «-Hydroxybuttersäure-Dehydrogenase,
Apfelsäure mit Malat-Dehydrogenase,
Neutralfette (nach Verseifung mit äthanolischer KOH bo und Bestimmung des Glyceringehalts),
Äthylalkohol mit Alkohol-Dehydrogenase,
D-Sorbit mit Sorbit-Dehydrogenase.
Claims (2)
1.2-Benzothiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammonium-pheny])-tetr^oliumsalze
der allgemeinen Formel I
CH3
N-CH3
CH3
(D
10
15
in welcher X ein zweiwertiges oder zwei einwertige Anionen organischer oder anorganischer Säuren bedeutet
2. Verfahren zur Herstellung von Tetrazoliumsalzen gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet,
daß man in an sich bekannter Weise ein Hydrazon der allgemeinen Formel II
25
mit einem reaktiven Benzoldiazoniumsalz umsetzt und das erhaltene Formazan der allgemeinen Formel
III
J5
40
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19712147466 DE2147466C3 (de) | 1971-09-23 | 1971-09-23 | 5- (4-N-trimethyl-ammonium-phenyl) tetrazoliumsalze |
Publications (3)
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|---|---|
| DE2147466A1 DE2147466A1 (de) | 1973-03-29 |
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| DE2147466C3 DE2147466C3 (de) | 1980-06-26 |
Family
ID=5820341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19712147466 Expired DE2147466C3 (de) | 1971-09-23 | 1971-09-23 | 5- (4-N-trimethyl-ammonium-phenyl) tetrazoliumsalze |
Country Status (1)
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| US5300637A (en) * | 1990-09-19 | 1994-04-05 | Miles Inc. | 2-benzothiazolyl tetrazolium salt indicators |
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| DE4311460A1 (de) * | 1993-04-08 | 1994-10-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels Benzylalkoholdehydrogenase und einem chromogenen Redoxindikator |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2147466A1 (de) | 1973-03-29 |
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