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Tetrazoliumsalze Tetrazoliumsalze sind wertvolle Reagenzien zur Sichtbarmachung
biologischer Reduktionsvorgänge. Sie stellen im allgemeinen farblose Verbindungen
dar, die durch Reduktion, z.B. mit einem reduzierenden Zucker, in starkfarbige,
wenig lösliche Körper übergehen, die man als Formazane bezeichnet (L. F. Fieser
+ M. Fieser, Org. Chemie, Verl. Chemie, 1965 S. 1437). Es ist seit langem bekannt,
daß reduzierte Pyridinnucleotide unter der Katalyse von N-Methylphenazinium-salzen
(PMS> oder dem Enzym Diaphorase mit Tetrazoliumsalzen in der oben beschriebenen
Weise reagieren. Auf dieser Reaktion beruhen eine Reihe von Bestimmungsmethoden
für reduzierte Pyridinnucleotide und damit von Methoden zur Aktivitätsbestimmung
von Enzymen. so läßt sich beispielsweise die Aktivität von Lactat-Dehydrogenase
(LDH) dadurch bestimmen, daß Lactat unter Katalyse von Lactat-Dehydrogenase mit
Nicotinamidadenin-dinucleotid (NAD) zu Pyruvat und reduziertem Nicotinamidadenin-dinucleotid
(NADH) umgesetzt wird. Das gebildete NADH reagiert nun beispielsweise in Gegenwart
des Enzyms Diaphorase mit Tetrazoliumsalzen unter Bildung von NAD und farbigen Formazanen,
deren Konzentration photometrisch bestimmt werden kann.
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Für den Nachweis von NADH stehen bis jetzt nur wenige Tetrazoliumsalze
zur Verfügung [z.B. Triphenyl-tetrazoliumchlorid, (TTC), Jodphenylnitrophenyl-tetrazoliumsalze
(INT), 2,5-Diphenyl-3[4,5-dimethylthiazolyl-(2)]-tetrazoliumbromid (mit), die sich
jedoch für quantitative Bestimmungen im Photometer nicht gut eignen, da sie folgende
hierfür notwendige Bedingungen nicht hinreichend erfüllen:
1.) Sowohl
das Tetrazoliumsalz als auch das bei der Reduktion gebildete Formazan muß in wässriger
Lösung auch ohne Zusatz von organischen Lösungsmitteln oder Lösungsvermittlern leicht
löslich sein.
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2.) Das Tetrazoliumsalz muß unter den Reaktionsbedingungen der enzymatischen
Bestimmung leicht und schnell reduziert werden.
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3.) Das gebildete Formazan muß ein Absorptionsmaximum in einem günstigen
Meßbereich, möglichst um 550 nm besitzen.
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4.) Der molare Extinktionskoeffizient und damit die Empfindlichkeit
muß sehr hoch sein.
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Zweck der vorliegenden Erfindung war es, Tetrazoliumsalze zu entwickeln,
welche sich für eine enzymatische NADH-Bestimmung im Photometer eignen und die obigen
Bedingungen in möglichst idealer Weise erfüllen.
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Es wurde gefunden, daß die bisher nicht bekannten 2-Benzthiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammonium-phenyl)-tetrazoliumsalze
der Formell
in welcher X ein oder mehrere Anionen organischer oder anorganischer
Säuren bedeutet, leicht löslich sind, schnell und empfindlich reagieren und überraschenderweise
Formazane ergeben, die ein günstiges Absorptionsmaximum bei 525 n m besitzen und
sich außerdem durch außergewöhnliche Löslichkeit und einen hohen molaren Extinktionskoeffizienten
auszeichnen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind somit zum fotometrischen Nachweis
von NADH und anderen reduzierenden Stoffen hervorragend geeignet.
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Als Anionen kommen zum Beispiel Chlorid, Bromid, Jodid, Nitrat, Fluoroborat,
Perchlorat, Sulfat, Oxalat und Tartrat infrage. Da jedoch die Wahl des Anions für
die Reaktionsfähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen nicht von wesentlicher
Bedeutung ist, lassen sich auch andere Anionen und Anionen-Kombinationen mit dem
Tetrazoliumkation zu reaktionsfähigen Salzen vereinigen. Es versteht sich von selbst,
daß Anionen, welche die erstrebten Eigenschaften des Nachweisreagens, beispielsweise
die Leichtlöslichkeit wieder aufheben oder den Nachweis z.B. durch Inhibitorwirkung
(Fluoride) stören, nicht geeignet sind.
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Die Herstellung der erfindungsgemäßen Substanzen erfolgt in an sich
bekannter Weise durch Umsetzung eines Hydrazons der Formel II
in welcher xe die obengeijannte Eedeu ung hat, mit einem reaktiven
Benzoldiazoniumsalz, vorzugsweise mit Benzoldiazoniumchlorid, und anschließende
Oxidation des erhaltenen Formazans der Formel III
in welcher xe die obengenannte Bedeutung hat, zu Verbindungen der Formel I mit einem
geeigneten Oxidationsmittel, wobei das Anion bzw. die Anionen erfindungsgemäß durch
Umsetzung mit entsprechenden Alkalisalzen oder entsprechend beladenen Anionenaustauschern
modifiziert werden können.
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Für die Umsetzung mit den Verbindungen III kommen als Hydrazonsalze
II insbesondere die Halogenide, vorzugsweise Chloride infrage.
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Als Oxidationsmittel für die Verbindungen III kommen Quecksilber-(II)-oxid,
Isoamylnitrit, Bleitetraazetat, N-Bromsuccinimid oder N-Chlorphthalimid infrage.
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Die als Ausgangsprodukte verwendeten Verbindungen der Formel II, werden
in bekannter Weise z.B. durch Umsetzung von p-N-Trimethylammonium-benzaldehyd-chlorid
mit 2-Hydrazinobenzthiazol in Eisessig und gegebenenfalls anschließende Modifikation
des Restes X hergestellt.
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Die erfindungsgemäßen Tetrazoliumsalze eignen sich ganz allgemein
für die Bestimmung reduzierender Substanzen z.B. von reduzierenden Zuckern, Ascorbinsäure
oder Ketosteroiden. Hierbei müssen lediglich die Reaktionsbedingungen der gesteigerten
Reaktivität angepaßt werden. Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung war jedoch,
ein Reagenz zum Nachweis biologischer Reduktionsvorgänge bereitzustellen, das insbesondere
zur Bestimmung von Enzymen oder deren Substraten dient, bei deren Reaktionen reduzierte
Pyridinnucleotide gebildet oder verbraucht werden.
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Als reduzierte Pyridinnucleotide kommen vor allem Nicotinadenin-dinucleotid
(NADH), Nicotin-adenin-dinucleotidphosphat (NADPH) und Acetylpyridin-dinucleotid
(APADH) infrage.
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Erfindungsgemäß können beispielsweise die Enzyme Lactat-Dehydrogenase
(LDII), Malat-Dehydrogenase (MDH) und Glutamat-Dehydrogenase (G1.DH) bestimmt werden.
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Es lassen sich enzymatisch auch beispielsweise folgende Substrate
bestimmen: Äthanol mit Alkohol-Dehydrogenase, Glucose mit Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase,
Galaktose mit Galaktose-Dehydrogenase sowie Glycerin mit Glycerokinase und Glycerophosphat-Dehydrogenase.
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Als Reduktionskatalysatoren eignen sich Diaphorase und N-Methylphenazinium-methosulfat
(PMS), wobei prinzipiell hinsichtlich der Versuchs- und Reaktionsbedingungen kein
Unterschied zu den bekannten Tetrazoliumsalzen besteht.
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Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.
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Beispiel 1 Herstellung von 2-Benzthiazolyl- (2) -3-phenyl-5- (4-N-trimethylammoniumphenyl)
-tetrazolium-dichlorid a) p-Trimethylammonium-benzaldehyd-chlorid 29,8 g (0,2 Mol)
p-Dimethylaminobenzaldehyd werden mit 56 g (0,4 Mol) Methyljodid in 100 ml Acetonitril
8 Stunden'unter Rühren am Rückfluß gekocht. Nach weiterem zweistündigem Rühren bei
Zimmertemperatur werden die gebildeten farblosen Kristalle von p-Trimethylammonium-benzaldehyd-iodid
abgesaugt und mit wenig eiskaltem Acetonitril gewaschen.
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0 Fp. 158 Ausbeute: 48,6 g (80,7 d.Th.) 30 g p-Trimethylammonium-benzaldehyd-iodid
werden in 100 ml Wasser gelöst und über einen mit Chloridionen beladenen Anionenaustauscher
(Amberlite IRA 400) gegeben. Aus dem Eluat erhält man beim Einengen farblose etwas
hygroskopische Kristalle von p-Trimethylammonium-benzaldehyd-chlorid Fp.
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203 - 204°. Ausbeute: 19,8 g (= 96,3 % d.Th.) b) p-N-Trimethylammonium=benzaldehyd=benzthiazolyl=(2)-hydrazonchlorid
25 g (0,125 Mol) p-N-Trimethylammonium-benzaldehyd-chlorid werden mit 20,8 g (0,125
Mol) 2-Hydrazinobenzthiazol in 300 ml Eisessig 6 Stunden bei 80 - 900 C gerührt.
Nach Einengen im Vakuum und Zugabe von wenig Alkohol kristallisiert die Substanz
in leicht gelblichen Kristallen, die aus Methanol umkristallisiert werden. Man erhält
39,4 g (= 90,5 % d.Th.) p-N-Trimethylammonium-benzaldehyd-benzthiazolyl-(2)-hydrazon-chlorid
Fp.
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2150 C.
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c) l-Phenyl-3-(4-N-trimethylammoniumEhenyl)-chlorid-5-benzthiazolyl-(2)-formazan
20,7 g (0,06 Mol) p-N-Trimethylammonium-benzaldehyd-benzthiazol-(2)-hydrazon-chlorid
werden in 600 ml Wasser und 150 ml Pyridin gelöst und auf O C abgekühlt. Danach
wird aus 6,5 g Salzsäure, 6 ml Wasser und 2,8 ml Anilin bei 0o C unter Zugabe von
2,1 g Natriumnitrit in 5 ml Wasser eine Benzol-diazoniumsalzlösung hergestellt.
Diese wird bei 0° C unter Rühren und weiterem Kühlen innerhalb einer halben Stunde
in die vorgelegte Hydrazonlösung eingetropft, dabei fällt das Formazan in grünen
Kristallen an.
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Nach 1 Stunde Weiterrühren wird der voluminöse Niederschlag abgesaugt
und mit ca. 150 ml Wasser in kleinen Portionen gewaschen.
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Nach dem Abfiltrieren wird der trockene Rückstand mit 200 ml trockenem
Dioxan angerührt und abgesaugt. Man erhält 24 g (89,4 % d.Th.) l-Phenyl-3- (4-N-trimethylammoniumphenyl)
-chlorid-5-benzthiazolyl- (2) -formazan; Fp. 1520 C (Zers.).
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d) 2-Benzthiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammonium-phenyl) tetrazolium-dichlorid
18 g (0,04 Mol) l-Phenyl-3- (4-N-trimethylammoniumphenyl) -chlorid-5-benzthiazolyl-(2)-formazan
werden in 450 ml Methanol gelöst.
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Die dunkelrote Lösung wird mit 13,5 g N-Chlorphtalimid versetzt,
langsam erwärmt und solange unter Rückfluß gekocht, bis eine hellgelbe Lösung entstanden
ist. Nach Abkühlen auf 5 - 10 C wird das überschüssige N-Chlorphtalimid (ca. 6 g)
abgesaugt und mit wenig kaltem Methanol gewaschen. Das Filtrat wird dann mit 2,5
Liter Aether versetzt. Das abgeschiedene voluminöse Tetrazoliumsalz wird abgesaugt
und mit ca. 250 ml Essigester angerührt. Die so erhaltenen gelben Kristalle werden
zur weiteren Reinigung aus 160 ml n-Propanol umkristallisiert, wobei durch Zugabe
von etwas Aktivkohle die dunkelbraune Lösung geklärt wird. Man erhält 15 g (71,3
% d.Th.) 2-Benzthiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethyl-ammoniumphenyl)-tetrazolium-dichlorid.
Fp. 1560 C (Zers.)
Beispiel 2 Darstellung weiterer 2-Benzthiazolyl-(2)
-3-phenyl-5- (4-N-trimethylammoniumphenyl)-tetrazoliumsalze 1 g des in Beispiel
1 beschriebenen 2-Benzthiazolyl-(2)-3-phenvl-5 - (4-N-trimethvlammonium-phenyl)
-tetrazolium-dichlorids werden in 5 - 10 ml Wasser gelöst und unter gutem Rühren
langsam mit dem festen Natriumsalz des gewünschten Anions versetzt. Die mehr oder
weniger schnell ausfallenden Tetrazoliumsalze werden abgesaugt und umkristallisiert.
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Auf diese Weise werden hergestellt: Dibromid: gelbe Kristalle aus
Äthanol, Fp. 174 - 1760 C (Zers.) Dijodid: rote Nadeln aus Methanol, Fp. 160 - 163
C (Zers.) Difluoborat: gelbe Nadeln aus Methanol, Fp. 213 - 2150 C (Zers.) Diperchlorat:
gelbe Kristalle aus Methanol, Fp. 207 - 2100 C (Zers.) Dinitrat: gelbe Kristalle
aus Propanol-Äther, Fp. 213 - 2150 C (Zers.) Ditosylat: hellgelbes Pulver aus Äthanol-Äther,
Fp. 222 - 2240 C (Zers.)
Beispiel 3 Bestimmung der Aktivität von
Lactat-Dehydrogenase im Serum 2,5 ml eines Natriumpyrophosphatpuffers (pH 8,6),
der 48 mMol L-Lactat enthält, werden mit 0,2 ml einer Lösung gemischt, die 0,6 -
1,2 mg NADg CH2 pro ml einer verdünnten Pufferlösung (Kaliumphosphat, pH 7,4) und
mindestens 0,2 mg Diaphorase pro ml enthält. Zu diesem Gemisch gibt man 0,2 ml einer
wässrigen Lösung, welche mindestens 1 mg/ml 2-Benzthiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammoniumphenyl)-tetrazolium-dichlorid
enthält.
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Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml Serum in Gang gesetzt.
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Die Änderung der Extinktion pro Minute (E/min) in den ersten 5 Minuten
nach Start wird bei 25°C gegen einen Blindwert gemessen (546 nm) und die Volumenaktivität
nach folgender Formel ermittelt: Volumenaktivität [U/L]
# = 27,4 (cm2 ),d = Schichtdicke # = Probenvolumen V = µ Mol (cm) Testvolumen; 1000
= Umrechnungsfaktor von mL auf L.
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In analoger Weise lassen sich die Aktivitäten folgender Enzyme bestimmen:
a) α-Hydroxybuttersäure-Dehydrogenase, mit'-Hydroxybuttersäure b.)Malat-Dehydrogenase,
mit Malat c.)Sorbit-Dehydrogenase, mit D-Sorbit d. ) Alkohol-Dehydrogenase, mit
Äthanol
Beispiel 4 Bestimmung von Glycerin im Serum 2,3 ml Puffer
(0,2 molarer Glycin/Natriumcarbonatpuffer pH =8,0 -9,0) werden mit 0,2 ml einer
Lösung gemischt, die 25 mg ATP, 0,5 mg Glycerokinase und 1,0 mg a-Glycero-phosphat-Dehydrogenase
enthält. Zu diesem Gemisch gibt man 0,2 ml einer Lösung, welche 0,6 - 1,2 mg NAD
8 pro ml einer verdünnten Pufferlösung (Kaliumphosphat, pH 7,4) und mindestens 0,2
mg Diaphorase pro ml enthält. Anschließend gibt man 0,2 ml einer wäßrigen Lösung
zu, welche mindestens 1 mg/ml 2-Benzthiazolyl-(2)-3-phenyl-5-(4-N-trimethylammoniumphenyl)
-tetrazolium-dichlorid enthält.
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Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml Serum in Gang gesetzt.
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Sofort nach Serumzugabe wird die Anfangs extinktion E1 bei 546 nm
abgelesen. nach 25 Minuten die Endextinktion E2 und aus der Differenz E (= E2-E1)
der Gehalt nach folgender Formel berechnet Konzentration [/ug/ml]
V = Testvolumen # = Probenvolumen MW = Molekulargewicht # = 27,4 [cm2/Mol] d = Schichtdicke
[cm] In analoger Weise lassen sich folgende klinisch chemisch wichtige Substrate
bestimmen: Glucose mit ATP, Hexokinase und NADP, Glucose-6-phosphdt-De hydrogenase
a-Hydroxybuttersäure mit α-Hydroxybuttersäure-Dehydrogenase Äpfelsäure mit
Malat-Dehydrogenase Neutralfette (nach Verseifung mit athanolischer #OH und Bestimmung
des Glyceringehalts) Äthylalkohol mit Alkohol -Dehydr ogenas e D-Sorbit mit Sorbit-Dehydrogenase