JP4614885B2 - 水溶性テトラゾリウム化合物 - Google Patents
水溶性テトラゾリウム化合物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4614885B2 JP4614885B2 JP2005513603A JP2005513603A JP4614885B2 JP 4614885 B2 JP4614885 B2 JP 4614885B2 JP 2005513603 A JP2005513603 A JP 2005513603A JP 2005513603 A JP2005513603 A JP 2005513603A JP 4614885 B2 JP4614885 B2 JP 4614885B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- aromatic
- water
- group
- formazan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- -1 tetrazolium compound Chemical class 0.000 title claims description 42
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 12
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 9
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- 125000004964 sulfoalkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 54
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 42
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 33
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 32
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 8
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 7
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 7
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- MASUWVVNWALEEM-UHFFFAOYSA-M 1-methoxy-5-methylphenazin-5-ium;methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2N=C3C(OC)=CC=CC3=[N+](C)C2=C1 MASUWVVNWALEEM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 150000001989 diazonium salts Chemical class 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KMVPXBDOWDXXEN-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 KMVPXBDOWDXXEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JQJPBYFTQAANLE-UHFFFAOYSA-N Butyl nitrite Chemical compound CCCCON=O JQJPBYFTQAANLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000007357 dehydrogenase reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical group C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1C(N=[N+]1C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AXQTUUPVMIBBKV-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]benzenediazonium Chemical class COC1=CC([N+]#N)=C(OC)C=C1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 AXQTUUPVMIBBKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BXRFQSNOROATLV-UHFFFAOYSA-N 4-nitrobenzaldehyde Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(C=O)C=C1 BXRFQSNOROATLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010002065 Anaemia megaloblastic Diseases 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010022822 Intravascular haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 208000000682 Megaloblastic Anemia Diseases 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002610 basifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- YKJQVLWZGODFIH-UHFFFAOYSA-L disodium;4-formylbenzene-1,3-disulfonate;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC=C(C=O)C(S([O-])(=O)=O)=C1 YKJQVLWZGODFIH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 231100001016 megaloblastic anemia Toxicity 0.000 description 1
- JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M methyl sulfate(1-) Chemical compound COS([O-])(=O)=O JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
- C07D257/04—Five-membered rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、テトラゾリウム化合物に関し、特に脱水素酵素または酵素基質を定量分析するのに好適な新規の水溶性テトラゾリウム化合物に関する。
乳酸脱水素酵素（以下ＬＤＨと略称する）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素などの各種脱水素酵素の定量分析には、従来よりテトラゾリウム化合物（テトラゾリウム塩）が用いられてきた。これは、テトラゾリウム化合物は、これら各種の脱水素酵素の作用により遊離した水素を中間電子運搬体を介して受容してホルマザンとなるので、そのホルマザンの吸光度を測定することにより脱水素酵素またはそれらの酵素基質を定量することができるからである。
特に、これらの脱水素酵素の内、ＬＤＨは全ての体細胞に分布し、特に心筋、肝臓、骨格筋、肝臓に多く、心筋梗塞、悪性腫瘍、肝疾患、進行性筋萎縮、血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には、血清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている。従って血中のＬＤＨ活性を測定することにより、臨床上、診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる。血中の尿酸や胆汁酸の測定においても、より生体成分の妨害を受けにくい脱水素酵素を用いる方法が望まれている。
また、近年、培養細胞内および細胞から漏出した脱水素酵素活性を指標とすることで、細胞増殖能および細胞毒性度合いを測定することが可能となり、化学物質の毒性や新規治療薬の効果等を簡便に知る目的に汎用されている。
このような目的の水素受容体としては、従来より、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−２Ｈテトラゾリウム塩化物］（以下ニトロＴＢと略称する）、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］（以下ＭＴＴと略称する）などが一般的に用いられている。
しかしながら、ニトロＴＢおよびＭＴＴが水素を受容して生じるホルマザンは水に溶解せず、使用上不便であった。特に自動分析およびマイクロプレート分析においては、生成したホルマザンがセル、チューブおよびマイクロプレートなどの計測系に付着する難点があり、これらの欠点を除去するために、水溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩を使用することが必要となっていた。特に生体試料を測定する場合、試料中に含有される生体成分の色による干渉を回避するため、長波長の吸収を持つ紫から青色のホルマザンが所望されている。
本出願人の研究グループは、先に、これらの要求を満たす幾つかのテトラゾリウム化合物を案出している〔特許第２５９２４３６号公報（特許文献１）、特許第２８１９２５８号公報（特許文献２）、および特許第２９９５８８０号公報（特許文献３）〕。これらの特許に開示されているテトラゾリウム化合物は、脱水素酵素やその酵素基質を自動分析またはマイクロプレート分析により分析にするに際して実用に供することのできる試薬を構成するものであるが、更なる品質向上も求められている。特に、これまで提案された長波長のホルマザンを生成する水溶性テトラゾリウム化合物は、水溶液中で不安定であるため試薬として長期保存するのに難点を有していた。
特許第２５９２４３６号公報 特許第２８１９２５８号公報 特許第２９９５８８０号公報
本発明の目的は、水溶性で長波長の光吸収を呈するホルマザンを生成するとともに、水溶液中で長期間安定であり脱水素酵素または酵素基質の定量に好適な水溶性テトラゾリウム化合物を提供することにある。
本発明者らは、溶解性の良好なホルマザンを生じさせ、かつ安定性の高い化合物についてさらに研究を重ねた結果、新規の水溶性テトラゾリウム化合物の合成に成功し、この化合物が優れた水素受容体で、且つこのものから生じるホルマザンが水溶性で、安定であり、分析装置への付着や沈殿を起こさず脱水素酵素やその酵素基質の測定が可能であることを見出した。
かくして、本発明は下記の一般式（１）で表されるテトラゾリウム化合物を提供するものである。
式中、Ｒ１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に、水素原子、ニトロ基、スルホン酸基、または炭素数１から４のアルキル基、アルコキシ基、スルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、但し、Ｒ１〜Ｒ１９のうち少なくとも２つは、それぞれ独立に、スルホン酸基または炭素数１〜４のスルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムである。
さらに、本発明に従えば、上記のテトラゾリウム化合物を用いることを特徴とする脱水素酵素または酵素基質の定量方法が提供され、本発明の脱水素酵素または酵素基質の定量方法には、培養細胞内または培養細胞から漏出した脱水素酵素活性を測定することも含まれる。
さらに、本発明に従えば、上記のテトラゾリウム化合物を用いることを特徴とする脱水素酵素または酵素基質の定量方法が提供され、本発明の脱水素酵素または酵素基質の定量方法には、培養細胞内または培養細胞から漏出した脱水素酵素活性を測定することも含まれる。
本発明の水溶性テトラゾリウム化合物を用いることにより、得られるホルマザンの水溶性がさらに向上し、測定機器への付着が無く、自動分析やマイクロプレート分析装置による脱水素酵素または酵素基質の高感度の定量測定が可能である。さらに、本発明のテトラゾリウムは水溶液中で長期間安定であり、試薬としての保存性においても優れている。
本発明の前記一般式（１）の化合物は、各種の反応を工夫し常法によって製造することができる。例えば、次の一般式（２）
で示されるフェニルヒドラジン類にアルデヒド化合物をアルコール溶媒中で反応させて、一般式（３）
で示されるヒドラゾンを得、次いで対応するジアゾニウム塩を水溶媒中塩基性条件下で反応させて一般式（４）
で示されるホルマザンを得る。ここで塩基性化剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。
次いで得られた一般式（４）のホルマザンを亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を用いアルコール溶媒中で酸化し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物を得ることができる。
次いで得られた一般式（４）のホルマザンを亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を用いアルコール溶媒中で酸化し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物を得ることができる。
図１には、以上のようにして合成される本発明のテトラゾリウム化合物の具体例として後記の実施例において用いられているものの化学構造式を示しているが、本発明のテトラゾリウム化合物はこれらに限定されるものではない。図１から明らかなようにそれらの化合物は、一般式（１）においてＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８がスルホン酸基、Ｒ１１、Ｒ１８がメトキシ基（化合物ａ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｂ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｃ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３、Ｒ８がニトロ基、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｄ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｅ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８がスルホアルキルオキシ基、Ｒ１１、Ｒ１８がメトキシ基（化合物ｆ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｇ）に相当するものである。
本発明の水溶性テトラゾリウム化合物から生じるホルマザンは、長波長領域において光吸収し且つそれぞれのテトラゾリウム化合物に特有の極大吸収波長を有している。例えば、既述の化合物ａ〜ｇから生じるホルマザンは、それぞれ、表１に示す極大吸収波長を有する。そして、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物は水溶液中できわめて安定であり、経時的に分解することはない。
以下に本発明の特徴をさらに明らかにするため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１は、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物の合成例を示すものである。実施例２は、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が安定であり経時的な分解を生じないことを示すものである。実施例３は、脱水素酵素反応のモデルとして１−メトキシＰＭＳ／ＮＡＤＨ系において、本発明の水溶性テトラゾリウムから生成するホルマザンの吸光度がＮＡＤＮの濃度に相関し、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が脱水素酵素またはその酵素基質の定量分析に利用できることを示すものである。実施例４は、本発明のテトラゾリウム化合物に由来するホルマザンの吸光度が１−メトキシＰＭＳ／培養細胞系における細胞数に相関しており、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が実際の培養細胞中での脱水素酵素や酵素基質の定量に用いることができることを示すものである。
実施例１は、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物の合成例を示すものである。実施例２は、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が安定であり経時的な分解を生じないことを示すものである。実施例３は、脱水素酵素反応のモデルとして１−メトキシＰＭＳ／ＮＡＤＨ系において、本発明の水溶性テトラゾリウムから生成するホルマザンの吸光度がＮＡＤＮの濃度に相関し、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が脱水素酵素またはその酵素基質の定量分析に利用できることを示すものである。実施例４は、本発明のテトラゾリウム化合物に由来するホルマザンの吸光度が１−メトキシＰＭＳ／培養細胞系における細胞数に相関しており、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が実際の培養細胞中での脱水素酵素や酵素基質の定量に用いることができることを示すものである。
（化合物ａの合成）
ｐ−ニトロフェニルヒドラジン１０ｇ（６５．３ｍｍｏｌ）及び４−フォルミル−１，３−ベンゼン−ジスルホン酸２ナトリウム塩一水和物２０．２６ｇ（６５．３ｍｍｏｌ）をメタノール３００ｍｌに懸濁させ、２時間加熱還流した。次いで反応懸濁液を冷却後、反応懸濁液の沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物２５．３ｇを収率８６．９％で得た。
得られたヒドラゾン化合物７．６１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２００ｍｌと水２００ｍｌの混合溶媒に溶解し、３℃に冷却した。そのヒドラゾン水溶液に２，５−ジメトキシ−４−（４−ニトロフェニルアゾ）ベンゼンジアゾニウム塩１／２塩化亜鉛を加えた。この反応溶液を０〜３℃に保持しながら、水酸化ナトリウム２．０８ｇを水４０ｍｌに溶解した水溶液を滴下し、滴下終了後６時間撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、弱酸性にした。次いで溶媒のテトラヒドロフランと水を減圧留去した。得られた粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、ホルマザン１．５ｇを収率１１％で得た。
次いで得られたホルマザン０．４６ｇ（０．６１ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍｌに溶解した。そのホルマザン溶液に塩酸０．５ｍｌ（４．９ｍｍｏｌ）を加えた後、亜硝酸ブチル１ｇ（９．１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。次いで溶媒のメタノールを減圧留去した後、粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物である化合物ａを３０ｍｇ、収率６．７％で得た。
プロトン核磁気共鳴分光法（以下１Ｈ−ＮＭＲと略称する）（重水、３００ＭＨｚ）δ３．６４（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．１８（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、７．８９−８．０５（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１７−８．２７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７−８．３７（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５８−８．６８（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
赤外分光法（以下ＩＲと略称する）（臭化カリウム錠剤法、以下ＫＢｒと略称する）３４６０、３１００、１６１０、１５２５、１５００、１３４５、１２３０、１１１８ｃｍ−１。
質量分析法（質量スペクトル、以下ＭＳと略称する）ｍ／ｅ＝７３５（Ｍ＋１）。
ｐ−ニトロフェニルヒドラジン１０ｇ（６５．３ｍｍｏｌ）及び４−フォルミル−１，３−ベンゼン−ジスルホン酸２ナトリウム塩一水和物２０．２６ｇ（６５．３ｍｍｏｌ）をメタノール３００ｍｌに懸濁させ、２時間加熱還流した。次いで反応懸濁液を冷却後、反応懸濁液の沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物２５．３ｇを収率８６．９％で得た。
得られたヒドラゾン化合物７．６１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２００ｍｌと水２００ｍｌの混合溶媒に溶解し、３℃に冷却した。そのヒドラゾン水溶液に２，５−ジメトキシ−４−（４−ニトロフェニルアゾ）ベンゼンジアゾニウム塩１／２塩化亜鉛を加えた。この反応溶液を０〜３℃に保持しながら、水酸化ナトリウム２．０８ｇを水４０ｍｌに溶解した水溶液を滴下し、滴下終了後６時間撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、弱酸性にした。次いで溶媒のテトラヒドロフランと水を減圧留去した。得られた粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、ホルマザン１．５ｇを収率１１％で得た。
次いで得られたホルマザン０．４６ｇ（０．６１ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍｌに溶解した。そのホルマザン溶液に塩酸０．５ｍｌ（４．９ｍｍｏｌ）を加えた後、亜硝酸ブチル１ｇ（９．１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。次いで溶媒のメタノールを減圧留去した後、粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物である化合物ａを３０ｍｇ、収率６．７％で得た。
プロトン核磁気共鳴分光法（以下１Ｈ−ＮＭＲと略称する）（重水、３００ＭＨｚ）δ３．６４（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．１８（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、７．８９−８．０５（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１７−８．２７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７−８．３７（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５８−８．６８（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
赤外分光法（以下ＩＲと略称する）（臭化カリウム錠剤法、以下ＫＢｒと略称する）３４６０、３１００、１６１０、１５２５、１５００、１３４５、１２３０、１１１８ｃｍ−１。
質量分析法（質量スペクトル、以下ＭＳと略称する）ｍ／ｅ＝７３５（Ｍ＋１）。
（化合物ｂの合成）
上記化合物ａと同様な方法で合成し、同定した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、３００ＭＨｚ）δ７．６３−７．７８（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０１−８．０８（４Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１８−８．２８（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３２−８．３８（２Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４４−８．５４（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３１００、１６２０、１５２０、１４５５、１３５０、１２２０、１０３０、８５０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝６３０（Ｍ＋１）。
上記化合物ａと同様な方法で合成し、同定した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、３００ＭＨｚ）δ７．６３−７．７８（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０１−８．０８（４Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１８−８．２８（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３２−８．３８（２Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４４−８．５４（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３１００、１６２０、１５２０、１４５５、１３５０、１２２０、１０３０、８５０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝６３０（Ｍ＋１）。
（化合物ｃの合成）
上記化合物ａと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、３００ＭＨｚ）δ７．９８−８．１２（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１４−８．２１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２３−８．３７（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４１−８．５７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７１−８．７５（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４８０、３１００、１６３８、１５４０、１３５５、１２３０、１１４０、８５５、６１０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝８３４（Ｍ＋１）。
上記化合物ａと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、３００ＭＨｚ）δ７．９８−８．１２（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１４−８．２１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２３−８．３７（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４１−８．５７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７１−８．７５（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４８０、３１００、１６３８、１５４０、１３５５、１２３０、１１４０、８５５、６１０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝８３４（Ｍ＋１）。
（化合物ｄの合成）
ｐ−ニトロフェニルヒドラジン１４ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）及びｐ−ニトロベンズアルデヒド１３．８ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）をメタノール４００ｍｌに懸濁させ、２時間加熱還流した。次いで反応懸濁液を冷却後、反応懸濁液の沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物２３．６ｇを収率９０．１％で得た。
４−アミノ−１，１’−アゾベンゼン−３，４−ジスルフォン酸ナトリウム塩３１．２ｇを水２００ｍｌに懸濁し、５℃以下に冷却した。その懸濁液に濃塩酸２５．７ｍｌを、次いで水５０ｍｌに溶解した亜硝酸ナトリウム５．６７ｇを加えた後、０〜５℃で１時間撹拌し、ジアゾニウム化合物水溶液を得た。
ヒドラゾン化合物７．６１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３００ｍｌと水５０ｍｌの混合溶媒に溶解し、３℃に冷却した。そのヒドラゾン水溶液に合成したジアゾニウム化合物水溶液を加えた。この反応溶液を０〜３℃に保持しながら、水１６０ｍｌに溶解した水酸化ナトリウム１３．２ｇを滴下し、滴下終了後３時間撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、弱酸性にした。次いで溶媒のテトラヒドロフランと水を減圧留去した。濃縮物をジメチルフォルムアミドとエーテルで再沈殿精製し、ジアゾニウム塩５２ｇを収率９０．６％で得た。
次いで得られたホルマザン３ｇ（４．３ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍｌとジメチルフォルムアミド５０ｍｌの混合溶液に溶解した。そのホルマザン溶液に塩酸９ｍｌ（０．１１ｍｏｌ）を加えた後、次亜塩素酸ナトリウム水溶液２０ｍｌを添加し室温で１時間撹拌した。反応後、その反応溶液の溶媒であるメタノールとジメチルフォルムアミドを減圧留去した後、粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物である化合物ｄを０．８ｇ、収率２７．６％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ８．１２−８．１９（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２０−８．２３（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２３−８．２６（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３５−８．４０（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．６０−８．６８（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７１（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７４（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３５００、３１１０、１６３０、１５５０、１４７５、１３６５、１２４０、１０５０、８７０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝６７５（Ｍ＋１）。
ｐ−ニトロフェニルヒドラジン１４ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）及びｐ−ニトロベンズアルデヒド１３．８ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）をメタノール４００ｍｌに懸濁させ、２時間加熱還流した。次いで反応懸濁液を冷却後、反応懸濁液の沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物２３．６ｇを収率９０．１％で得た。
４−アミノ−１，１’−アゾベンゼン−３，４−ジスルフォン酸ナトリウム塩３１．２ｇを水２００ｍｌに懸濁し、５℃以下に冷却した。その懸濁液に濃塩酸２５．７ｍｌを、次いで水５０ｍｌに溶解した亜硝酸ナトリウム５．６７ｇを加えた後、０〜５℃で１時間撹拌し、ジアゾニウム化合物水溶液を得た。
ヒドラゾン化合物７．６１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３００ｍｌと水５０ｍｌの混合溶媒に溶解し、３℃に冷却した。そのヒドラゾン水溶液に合成したジアゾニウム化合物水溶液を加えた。この反応溶液を０〜３℃に保持しながら、水１６０ｍｌに溶解した水酸化ナトリウム１３．２ｇを滴下し、滴下終了後３時間撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、弱酸性にした。次いで溶媒のテトラヒドロフランと水を減圧留去した。濃縮物をジメチルフォルムアミドとエーテルで再沈殿精製し、ジアゾニウム塩５２ｇを収率９０．６％で得た。
次いで得られたホルマザン３ｇ（４．３ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍｌとジメチルフォルムアミド５０ｍｌの混合溶液に溶解した。そのホルマザン溶液に塩酸９ｍｌ（０．１１ｍｏｌ）を加えた後、次亜塩素酸ナトリウム水溶液２０ｍｌを添加し室温で１時間撹拌した。反応後、その反応溶液の溶媒であるメタノールとジメチルフォルムアミドを減圧留去した後、粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物である化合物ｄを０．８ｇ、収率２７．６％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ８．１２−８．１９（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２０−８．２３（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２３−８．２６（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３５−８．４０（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．６０−８．６８（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７１（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７４（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３５００、３１１０、１６３０、１５５０、１４７５、１３６５、１２４０、１０５０、８７０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝６７５（Ｍ＋１）。
（化合物ｅの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ７．８３−７．９７（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９７−８．０９（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０９−８．１８（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２０−８．２６（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７−８．３３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３３−８．４１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４３−８．５３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３０８０、１６３０、１５３０、１４１０、１３４０、１２２０、１０３０、８５０、７４５、６１０、５６０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝７３１（Ｍ＋１）。
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ７．８３−７．９７（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９７−８．０９（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０９−８．１８（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２０−８．２６（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７−８．３３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３３−８．４１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４３−８．５３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３０８０、１６３０、１５３０、１４１０、１３４０、１２２０、１０３０、８５０、７４５、６１０、５６０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝７３１（Ｍ＋１）。
（化合物ｆの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ２．２２−２．４８（４Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、３．１０−３．２８（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、３．６６（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．１３（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．２１−４．３０（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、６．６６−６．６８（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、６．８９−６．９３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．４１（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．７０−７．７５（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９１（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１２−８．２２（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４２−８．４８（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５２−８．５８（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４７５、２９５０、１６２０、１５１０、１３５０、１２１０、１０５０、８６０、６１０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝８５１（Ｍ＋１）。
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ２．２２−２．４８（４Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、３．１０−３．２８（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、３．６６（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．１３（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．２１−４．３０（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、６．６６−６．６８（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、６．８９−６．９３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．４１（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．７０−７．７５（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９１（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１２−８．２２（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４２−８．４８（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５２−８．５８（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４７５、２９５０、１６２０、１５１０、１３５０、１２１０、１０５０、８６０、６１０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝８５１（Ｍ＋１）。
（化合物ｇの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ７．５３−７．６３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９６−８．０１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０９−８．２６（６Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２８−８．４２（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５２−８．６４（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３１００、１６００、１５３０、１３５０、１２３０、１２００、１０４０、８５０、６１０、５５０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝７０５（Ｍ＋１）。
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ７．５３−７．６３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９６−８．０１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０９−８．２６（６Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２８−８．４２（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５２−８．６４（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３１００、１６００、１５３０、１３５０、１２３０、１２００、１０４０、８５０、６１０、５５０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝７０５（Ｍ＋１）。
化合物ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇを１ｍＭ濃度になるよう、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）で調製した。溶液は４℃または２５℃で保存し、各化合物について、既述の表１に示すホルマザンの極大吸収波長における吸光度を測定した。図２および図３に化合物ｄの測定結果を示す。他の化合物についても同様の結果が得られ、全ての化合物において３０日間吸光度の変化は見られず、本発明の化合物は水溶液中でホルマザンに分解することがなく安定であることが確認された。
なお、図４には比較のために特許第２９９５８８０号公報（特許文献３）に開示している水溶性テトラゾリウム化合物の緩衝液中の吸光度変化を示しており、経時的な安定性において幾分難点があることが理解される。
なお、図４には比較のために特許第２９９５８８０号公報（特許文献３）に開示している水溶性テトラゾリウム化合物の緩衝液中の吸光度変化を示しており、経時的な安定性において幾分難点があることが理解される。
１ｍＭの化合物ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅまたはｆと、５μＭの１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルスルフェート（以下１−メトキシＰＭＳと略称する）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌに、５ｍＭの還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨと略称する）をそれぞれ０、１０、２０、３０、４０及び５０μｌ加え（それぞれのＮＡＤＨ最終濃度は、０、１０、２０、３０、４０及び５０μｍｏｌ／ｌである。）、５分間室温で反応させた後、吸光度を測定した。得られた吸収スペクトルを化合物ごとに図５（化合物ａ）、図６（化合物ｂ）、図７（化合物ｃ）、図８（化合物ｄ）、図９（化合物ｅ）、図１０（化合物ｆ）、図１１（化合物ｇ）に示す。ＮＡＤＨ濃度変化に伴い、化合物ａでは５２７ｎｍ、化合物ｂでは４９３ｎｍ、化合物ｃでは４７２ｎｍ、化合物ｄでは５３０ｎｍ、化合物ｅでは４７４ｎｍ、化合物ｆでは５３０ｎｍ、化合物ｇでは４７３ｎｍの吸光度が上昇し、ホルマザンの生成が確認された。またホルマザンの測定セルへの吸着も認められなかった。
また、図１２に示されるようにＮＡＤＨと吸光度との間には良好な直線性の検量線が得られ、本発明の化合物が脱水素酵素反応の定量分析に使用できることが確認された。
また、図１２に示されるようにＮＡＤＨと吸光度との間には良好な直線性の検量線が得られ、本発明の化合物が脱水素酵素反応の定量分析に使用できることが確認された。
化合物ｄおよび１−メトキシＰＭＳを１５０ｍＭ食塩水に各々５ｍＭおよび０．２ｍＭ溶解し、試薬溶液を調製した。ヒト子宮頚癌細胞を９６穴マイクロプレートに２５０００細胞／ウェルから倍希釈法により１００ｕｌずつ播種し、細胞培養用インキュベーター中、３７℃、３時間インキュベーションした。試薬溶液１０ｕｌずつ各ウエルに添加し、インキュベーター中、３７℃、１．５時間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで５３０ｎｍの吸光度を測定した。マイクロプレートへのホルマザンの吸着は観測されず、細胞数（酵素または基質の濃度に対応する）と吸光度との間には良好な検量線が得られた（図１３）。
本発明は、長期間使用できる安定な試薬を用いる高感度の臨床検査法として、ＬＤＨをはじめとする生体中の各種の脱水素酵素を定量分析することにより疾病の診断や治療にきわめて有意義な知見を得るのに利用され、さらに、培養細胞内または培養細胞から漏出する脱水素酵素を測定することにより、新しい化学物質や薬剤の開発に際してそれらの毒性や効能等を知る手段としても有用である。
Claims (4)
- 下記の一般式（１）で表されることを特徴とする水溶性テトラゾリウム化合物。
- 請求項１のテトラゾリウム化合物を用いることを特徴とする脱水素酵素または酵素基質の定量方法。
- 培養細胞内の脱水素酵素活性を測定することを特徴とする請求項２の方法。
- 培養細胞から漏出した脱水酵素活性を測定することを特徴とする請求項２の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003273982 | 2003-07-14 | ||
| JP2003273982 | 2003-07-14 | ||
| PCT/JP2004/009953 WO2005023786A1 (ja) | 2003-07-14 | 2004-07-13 | 水溶性テトラゾリウム化合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2005023786A1 JPWO2005023786A1 (ja) | 2007-04-19 |
| JP4614885B2 true JP4614885B2 (ja) | 2011-01-19 |
Family
ID=34263987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005513603A Expired - Lifetime JP4614885B2 (ja) | 2003-07-14 | 2004-07-13 | 水溶性テトラゾリウム化合物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7485705B2 (ja) |
| EP (1) | EP1650197A4 (ja) |
| JP (1) | JP4614885B2 (ja) |
| CN (1) | CN100396671C (ja) |
| CA (1) | CA2532211A1 (ja) |
| WO (1) | WO2005023786A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019502655A (ja) * | 2015-11-09 | 2019-01-31 | ハンジョウ ジェニファー バイオーテック カンパニー リミテッドＨａｎｇｚｈｏｕ Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． | モノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物及び用途 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2008272818A1 (en) * | 2007-07-02 | 2009-01-08 | Yu, Ming Dr | Methods, composition, targets for combinational cancer treatments |
| US20140248655A1 (en) * | 2011-10-03 | 2014-09-04 | Nippon Medical & Chemical Instruments Co., Ltd. | Quantitative soft agar colony formation assay using tetrazolium that generates water-soluble formazan |
| WO2017090631A1 (ja) * | 2015-11-24 | 2017-06-01 | 国立大学法人 東京大学 | 細胞外代謝物を検出するための蛍光プローブ及び当該蛍光プローブを用いるスクリーニング方法 |
| EP3239709B1 (en) * | 2016-04-25 | 2019-06-05 | ARKRAY, Inc. | Method of analyzing glycated protein; use of analysis reagent, analysis kit, and test piece for analysis |
| EP3514156A4 (en) * | 2016-09-14 | 2020-02-19 | Terumo Kabushiki Kaisha | 2-SUBSTITUTED BENZOTHIAZOLYL-3-SUBSTITUTED PHENYL-5-SUBSTITUTED SULFONATED PHENYL-2H-TETRAZOLIUM SALTS, REAGENT FOR MEASURING THE CONCENTRATION OF BIOLOGICAL COMPONENTS WITH THE SALT AND METHOD FOR THE MEASURING METHOD |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB738585A (en) * | 1952-07-17 | 1955-10-19 | May & Baker Ltd | Improvements in or relating to tetrazolium compounds |
| JPH09286784A (ja) * | 1996-04-18 | 1997-11-04 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 |
| JP2995380B2 (ja) * | 1994-08-11 | 1999-12-27 | 株式会社同仁化学研究所 | 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0578410A (ja) * | 1991-09-19 | 1993-03-30 | Okamoto Kagaku Kogyo Kk | 光重合性組成物 |
| JP2592436B2 (ja) * | 1993-09-01 | 1997-03-19 | 株式会社同仁化学研究所 | 新規水溶性テトラゾリウム化合物 |
| US6913878B2 (en) * | 2003-01-06 | 2005-07-05 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Method of detecting DNA single strand breaks |
-
2004
- 2004-07-13 EP EP04747419A patent/EP1650197A4/en not_active Withdrawn
- 2004-07-13 WO PCT/JP2004/009953 patent/WO2005023786A1/ja active Application Filing
- 2004-07-13 CN CNB200480020013XA patent/CN100396671C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-07-13 US US10/563,702 patent/US7485705B2/en active Active
- 2004-07-13 JP JP2005513603A patent/JP4614885B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-07-13 CA CA002532211A patent/CA2532211A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB738585A (en) * | 1952-07-17 | 1955-10-19 | May & Baker Ltd | Improvements in or relating to tetrazolium compounds |
| JP2995380B2 (ja) * | 1994-08-11 | 1999-12-27 | 株式会社同仁化学研究所 | 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 |
| JPH09286784A (ja) * | 1996-04-18 | 1997-11-04 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019502655A (ja) * | 2015-11-09 | 2019-01-31 | ハンジョウ ジェニファー バイオーテック カンパニー リミテッドＨａｎｇｚｈｏｕ Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． | モノスルホン酸フェニルテトラゾール化合物及び用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1650197A4 (en) | 2008-11-05 |
| US20070111274A1 (en) | 2007-05-17 |
| CN100396671C (zh) | 2008-06-25 |
| WO2005023786A1 (ja) | 2005-03-17 |
| JPWO2005023786A1 (ja) | 2007-04-19 |
| CA2532211A1 (en) | 2005-03-17 |
| EP1650197A1 (en) | 2006-04-26 |
| US7485705B2 (en) | 2009-02-03 |
| CN1823049A (zh) | 2006-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2757348B2 (ja) | 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 | |
| JP5228190B2 (ja) | パーオキシナイトライト蛍光プローブ | |
| CN111303102A (zh) | 一种硝基还原酶响应的乏氧探针化合物及其制备与应用 | |
| CN109232626B (zh) | 一种基于二氟硼氧基香豆素的so2比率型荧光探针 | |
| JP4373608B2 (ja) | 一重項酸素測定用試薬 | |
| CN109836394B (zh) | 一种用于识别硫化氢的近红外荧光探针及其制备方法和应用 | |
| US8394850B2 (en) | Fluorescent probe specific to hydrogen peroxide | |
| JPH10332591A (ja) | アルカリイオンの定量方法およびジアザ−クリプタンド | |
| CN111019644B (zh) | 辅因子-底物探针平台用于肿瘤缺氧相关酶的快速定量检测 | |
| JP4614885B2 (ja) | 水溶性テトラゾリウム化合物 | |
| JPH0859686A (ja) | ウミホタルルシフェリン誘導体および糖加水分解酵素の定量方法 | |
| CN112079823A (zh) | 近红外频率上转换荧光分子探针、制备方法及用途 | |
| JP2592436B2 (ja) | 新規水溶性テトラゾリウム化合物 | |
| EP0498196B1 (en) | A colorimetric method and reagent for the assay of lithium in a test sample | |
| JPS60180600A (ja) | 還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドの定量方法 | |
| CN113637048A (zh) | 一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针及其制备方法和应用 | |
| JP2995380B2 (ja) | 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 | |
| JP2819258B2 (ja) | 新規水溶性テトラゾリウム塩化合物 | |
| US6046312A (en) | Water soluble azo dyes and their synthesis and use | |
| JPS58124771A (ja) | ４−アミノ−２，３−ジ置換−１−（モノまたはトリクロロフエニル）−３−ピラゾリン−５−オン | |
| CA2251850C (en) | Water-soluble tetrazolium salt compounds | |
| US20240132777A1 (en) | Dyes for nucleic acid detection | |
| JP2889476B2 (ja) | スチルベンジボロン酸化合物 | |
| CN116751209A (zh) | 一种近红外比率型荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN114621172A (zh) | 一种高尔基体靶向亚铁离子荧光探针及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070530 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101005 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101019 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4614885 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131029 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |