JP4614885B2 - Water-soluble tetrazolium compound - Google Patents
Water-soluble tetrazolium compound Download PDFInfo
- Publication number
- JP4614885B2 JP4614885B2 JP2005513603A JP2005513603A JP4614885B2 JP 4614885 B2 JP4614885 B2 JP 4614885B2 JP 2005513603 A JP2005513603 A JP 2005513603A JP 2005513603 A JP2005513603 A JP 2005513603A JP 4614885 B2 JP4614885 B2 JP 4614885B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- aromatic
- water
- group
- formazan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
- C07D257/04—Five-membered rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
Description
本発明は、テトラゾリウム化合物に関し、特に脱水素酵素または酵素基質を定量分析するのに好適な新規の水溶性テトラゾリウム化合物に関する。 The present invention relates to a tetrazolium compound, and more particularly to a novel water-soluble tetrazolium compound suitable for quantitative analysis of a dehydrogenase or an enzyme substrate.
乳酸脱水素酵素（以下ＬＤＨと略称する）、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素などの各種脱水素酵素の定量分析には、従来よりテトラゾリウム化合物（テトラゾリウム塩）が用いられてきた。これは、テトラゾリウム化合物は、これら各種の脱水素酵素の作用により遊離した水素を中間電子運搬体を介して受容してホルマザンとなるので、そのホルマザンの吸光度を測定することにより脱水素酵素またはそれらの酵素基質を定量することができるからである。 Tetrazolium compounds (tetrazolium salts) have been conventionally used for quantitative analysis of various dehydrogenases such as lactate dehydrogenase (hereinafter abbreviated as LDH), alcohol dehydrogenase, and glutamate dehydrogenase. This is because tetrazolium compounds receive hydrogen released by the action of these various dehydrogenases through an intermediate electron carrier to form formazan. This is because the enzyme substrate can be quantified.
特に、これらの脱水素酵素の内、ＬＤＨは全ての体細胞に分布し、特に心筋、肝臓、骨格筋、肝臓に多く、心筋梗塞、悪性腫瘍、肝疾患、進行性筋萎縮、血管内溶血、巨赤芽球性貧血などの疾患の場合には、血清ＬＤＨ活性が著しく上昇することが知られている。従って血中のＬＤＨ活性を測定することにより、臨床上、診断に対する極めて有意義な知見を得ることができる。血中の尿酸や胆汁酸の測定においても、より生体成分の妨害を受けにくい脱水素酵素を用いる方法が望まれている。 In particular, among these dehydrogenases, LDH is distributed in all somatic cells, especially in the myocardium, liver, skeletal muscle, liver, myocardial infarction, malignant tumor, liver disease, progressive muscle atrophy, intravascular hemolysis, In the case of diseases such as megaloblastic anemia, it is known that serum LDH activity is significantly increased. Therefore, by measuring the LDH activity in blood, it is possible to obtain clinically very useful knowledge for diagnosis. In the measurement of uric acid and bile acid in blood, a method using a dehydrogenase that is less susceptible to interference with biological components is desired.
また、近年、培養細胞内および細胞から漏出した脱水素酵素活性を指標とすることで、細胞増殖能および細胞毒性度合いを測定することが可能となり、化学物質の毒性や新規治療薬の効果等を簡便に知る目的に汎用されている。 In recent years, by using the dehydrogenase activity leaked from cultured cells and cells as an index, it has become possible to measure cell proliferation ability and the degree of cytotoxicity. It is widely used for the purpose of knowing easily.
このような目的の水素受容体としては、従来より、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−２Ｈテトラゾリウム塩化物］（以下ニトロＴＢと略称する）、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］（以下ＭＴＴと略称する）などが一般的に用いられている。 As a hydrogen acceptor for such purpose, conventionally, 3,3 ′-[3,3′-dimethoxy- (1,1′-biphenyl) -4,4′-diyl] -bis [2- (4 -Nitrophenyl) -5-2H tetrazolium chloride] (hereinafter abbreviated as nitro TB), [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] (hereinafter abbreviated as MTT) Etc.) is generally used.
しかしながら、ニトロＴＢおよびＭＴＴが水素を受容して生じるホルマザンは水に溶解せず、使用上不便であった。特に自動分析およびマイクロプレート分析においては、生成したホルマザンがセル、チューブおよびマイクロプレートなどの計測系に付着する難点があり、これらの欠点を除去するために、水溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩を使用することが必要となっていた。特に生体試料を測定する場合、試料中に含有される生体成分の色による干渉を回避するため、長波長の吸収を持つ紫から青色のホルマザンが所望されている。 However, formazan produced by nitro TB and MTT accepting hydrogen did not dissolve in water and was inconvenient to use. Especially in automatic analysis and microplate analysis, the produced formazan has a difficulty in adhering to measurement systems such as cells, tubes and microplates. To eliminate these disadvantages, a tetrazolium salt that produces water-soluble formazan is used. It was necessary to use it. In particular, when measuring a biological sample, purple to blue formazan having long wavelength absorption is desired in order to avoid interference due to the color of the biological component contained in the sample.
本出願人の研究グループは、先に、これらの要求を満たす幾つかのテトラゾリウム化合物を案出している〔特許第２５９２４３６号公報（特許文献１）、特許第２８１９２５８号公報（特許文献２）、および特許第２９９５８８０号公報（特許文献３）〕。これらの特許に開示されているテトラゾリウム化合物は、脱水素酵素やその酵素基質を自動分析またはマイクロプレート分析により分析にするに際して実用に供することのできる試薬を構成するものであるが、更なる品質向上も求められている。特に、これまで提案された長波長のホルマザンを生成する水溶性テトラゾリウム化合物は、水溶液中で不安定であるため試薬として長期保存するのに難点を有していた。
本発明の目的は、水溶性で長波長の光吸収を呈するホルマザンを生成するとともに、水溶液中で長期間安定であり脱水素酵素または酵素基質の定量に好適な水溶性テトラゾリウム化合物を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a water-soluble tetrazolium compound that produces water-soluble formazan exhibiting long-wavelength light absorption and is stable in an aqueous solution for a long period of time and is suitable for quantification of dehydrogenase or enzyme substrate. is there.
本発明者らは、溶解性の良好なホルマザンを生じさせ、かつ安定性の高い化合物についてさらに研究を重ねた結果、新規の水溶性テトラゾリウム化合物の合成に成功し、この化合物が優れた水素受容体で、且つこのものから生じるホルマザンが水溶性で、安定であり、分析装置への付着や沈殿を起こさず脱水素酵素やその酵素基質の測定が可能であることを見出した。 As a result of further research on a compound having high solubility and high stability, the present inventors have succeeded in synthesizing a novel water-soluble tetrazolium compound, and this compound has an excellent hydrogen acceptor. In addition, it has been found that formazan produced from this product is water-soluble and stable, and it is possible to measure dehydrogenase and its enzyme substrate without causing attachment or precipitation to the analyzer.
かくして、本発明は下記の一般式（１）で表されるテトラゾリウム化合物を提供するものである。 Thus, the present invention provides a tetrazolium compound represented by the following general formula (1).
式中、Ｒ１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に、水素原子、ニトロ基、スルホン酸基、または炭素数１から４のアルキル基、アルコキシ基、スルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、但し、Ｒ１〜Ｒ１９のうち少なくとも２つは、それぞれ独立に、スルホン酸基または炭素数１〜４のスルホアルキル基もしくはスルホアルキルオキシ基であり、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムである。
さらに、本発明に従えば、上記のテトラゾリウム化合物を用いることを特徴とする脱水素酵素または酵素基質の定量方法が提供され、本発明の脱水素酵素または酵素基質の定量方法には、培養細胞内または培養細胞から漏出した脱水素酵素活性を測定することも含まれる。In the formula, R 1 to R 19 are each independently a hydrogen atom, a nitro group, a sulfonic acid group, or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkoxy group, a sulfoalkyl group, or a sulfoalkyloxy group, provided that At least two of R 1 to R 19 are each independently a sulfonic acid group, a sulfoalkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a sulfoalkyloxy group, and M is an alkali metal or ammonium.
Furthermore, according to the present invention, there is provided a dehydrogenase or enzyme substrate quantification method characterized by using the above-mentioned tetrazolium compound, and the dehydrogenase or enzyme substrate quantification method of the present invention includes cultured intracellular cells. It also includes measuring the dehydrogenase activity leaked from the cultured cells.
本発明の水溶性テトラゾリウム化合物を用いることにより、得られるホルマザンの水溶性がさらに向上し、測定機器への付着が無く、自動分析やマイクロプレート分析装置による脱水素酵素または酵素基質の高感度の定量測定が可能である。さらに、本発明のテトラゾリウムは水溶液中で長期間安定であり、試薬としての保存性においても優れている。 By using the water-soluble tetrazolium compound of the present invention, the water solubility of the obtained formazan is further improved, there is no adhesion to the measuring instrument, and high-sensitivity quantification of dehydrogenase or enzyme substrate by automatic analysis or microplate analyzer Measurement is possible. Furthermore, the tetrazolium of the present invention is stable in an aqueous solution for a long period of time and is excellent in storability as a reagent.
本発明の前記一般式（１）の化合物は、各種の反応を工夫し常法によって製造することができる。例えば、次の一般式（２） The compound of the general formula (1) of the present invention can be produced by a conventional method by devising various reactions. For example, the following general formula (2)
で示されるフェニルヒドラジン類にアルデヒド化合物をアルコール溶媒中で反応させて、一般式（３）Is reacted with an aldehyde compound in an alcohol solvent to give a general formula (3)
で示されるヒドラゾンを得、次いで対応するジアゾニウム塩を水溶媒中塩基性条件下で反応させて一般式（４）And then reacting the corresponding diazonium salt in an aqueous solvent under basic conditions to give a general formula (4)
で示されるホルマザンを得る。ここで塩基性化剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが用いられる。
次いで得られた一般式（４）のホルマザンを亜硝酸ブチル又は次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤を用いアルコール溶媒中で酸化し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物を得ることができる。The formazan indicated by is obtained. Here, sodium hydroxide, potassium hydroxide, or the like is used as the basifying agent.
Subsequently, the obtained formazan of the general formula (4) is oxidized in an alcohol solvent using an oxidizing agent such as butyl nitrite or sodium hypochlorite to obtain the tetrazolium compound of the general formula (1).
図１には、以上のようにして合成される本発明のテトラゾリウム化合物の具体例として後記の実施例において用いられているものの化学構造式を示しているが、本発明のテトラゾリウム化合物はこれらに限定されるものではない。図１から明らかなようにそれらの化合物は、一般式（１）においてＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８がスルホン酸基、Ｒ１１、Ｒ１８がメトキシ基（化合物ａ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｂ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｃ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３、Ｒ８がニトロ基、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｄ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｅ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８がスルホアルキルオキシ基、Ｒ１１、Ｒ１８がメトキシ基（化合物ｆ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９が水素原子、Ｒ３がニトロ基、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１１、Ｒ１５がスルホン酸基（化合物ｇ）に相当するものである。FIG. 1 shows chemical structural formulas of those used in the examples described later as specific examples of the tetrazolium compound of the present invention synthesized as described above, but the tetrazolium compound of the present invention is not limited to these. Is not to be done. As apparent from FIG. 1, these compounds are represented by the following formula (1): R 1 , R 2 , R 4 , R 5 , R 7 , R 9 , R 10 , R 12 , R 13 , R 14 , R 16. , R 17 and R 19 are hydrogen atoms, R 3 is a nitro group, R 6 and R 8 are sulfonic acid groups, R 11 and R 18 are methoxy groups (compound a); R 1 , R 2 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 12 , R 13 , R 14 , R 16 , R 17 , R 18 , R 19 are hydrogen atoms, R 3 is a nitro group, R 11 , R 15 is a sulfonic acid group (compound b); R 1 , R 2 , R 4 , R 5 , R 7 , R 9 , R 10 , R 12 , R 13 , R 14 , R 16 , R 17 , R 18 , R 19 is a hydrogen atom, R 3 is a
本発明の水溶性テトラゾリウム化合物から生じるホルマザンは、長波長領域において光吸収し且つそれぞれのテトラゾリウム化合物に特有の極大吸収波長を有している。例えば、既述の化合物ａ〜ｇから生じるホルマザンは、それぞれ、表１に示す極大吸収波長を有する。そして、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物は水溶液中できわめて安定であり、経時的に分解することはない。 Formazan produced from the water-soluble tetrazolium compound of the present invention absorbs light in the long wavelength region and has a maximum absorption wavelength specific to each tetrazolium compound. For example, formazan produced from the above-mentioned compounds a to g each have a maximum absorption wavelength shown in Table 1. The water-soluble tetrazolium compound of the present invention is extremely stable in an aqueous solution and does not decompose over time.
以下に本発明の特徴をさらに明らかにするため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１は、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物の合成例を示すものである。実施例２は、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が安定であり経時的な分解を生じないことを示すものである。実施例３は、脱水素酵素反応のモデルとして１−メトキシＰＭＳ／ＮＡＤＨ系において、本発明の水溶性テトラゾリウムから生成するホルマザンの吸光度がＮＡＤＮの濃度に相関し、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が脱水素酵素またはその酵素基質の定量分析に利用できることを示すものである。実施例４は、本発明のテトラゾリウム化合物に由来するホルマザンの吸光度が１−メトキシＰＭＳ／培養細胞系における細胞数に相関しており、本発明の水溶性テトラゾリウム化合物が実際の培養細胞中での脱水素酵素や酵素基質の定量に用いることができることを示すものである。Examples are given below to further clarify the features of the present invention, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1 shows a synthesis example of the water-soluble tetrazolium compound of the present invention. Example 2 shows that the water-soluble tetrazolium compound of the present invention is stable and does not decompose over time. In Example 3, in the 1-methoxy PMS / NADH system as a model for the dehydrogenase reaction, the absorbance of formazan produced from the water-soluble tetrazolium of the present invention is correlated with the concentration of NADN, and the water-soluble tetrazolium compound of the present invention is dehydrated. It shows that it can be used for quantitative analysis of elementary enzyme or its enzyme substrate. In Example 4, the absorbance of formazan derived from the tetrazolium compound of the present invention correlates with the number of cells in the 1-methoxy PMS / cultured cell line, and the water-soluble tetrazolium compound of the present invention was dehydrated in actual cultured cells. It shows that it can be used for quantification of elementary enzymes and enzyme substrates.
（化合物ａの合成）
ｐ−ニトロフェニルヒドラジン１０ｇ（６５．３ｍｍｏｌ）及び４−フォルミル−１，３−ベンゼン−ジスルホン酸２ナトリウム塩一水和物２０．２６ｇ（６５．３ｍｍｏｌ）をメタノール３００ｍｌに懸濁させ、２時間加熱還流した。次いで反応懸濁液を冷却後、反応懸濁液の沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物２５．３ｇを収率８６．９％で得た。
得られたヒドラゾン化合物７．６１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２００ｍｌと水２００ｍｌの混合溶媒に溶解し、３℃に冷却した。そのヒドラゾン水溶液に２，５−ジメトキシ−４−（４−ニトロフェニルアゾ）ベンゼンジアゾニウム塩１／２塩化亜鉛を加えた。この反応溶液を０〜３℃に保持しながら、水酸化ナトリウム２．０８ｇを水４０ｍｌに溶解した水溶液を滴下し、滴下終了後６時間撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、弱酸性にした。次いで溶媒のテトラヒドロフランと水を減圧留去した。得られた粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、ホルマザン１．５ｇを収率１１％で得た。
次いで得られたホルマザン０．４６ｇ（０．６１ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍｌに溶解した。そのホルマザン溶液に塩酸０．５ｍｌ（４．９ｍｍｏｌ）を加えた後、亜硝酸ブチル１ｇ（９．１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。次いで溶媒のメタノールを減圧留去した後、粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物である化合物ａを３０ｍｇ、収率６．７％で得た。
プロトン核磁気共鳴分光法（以下１Ｈ−ＮＭＲと略称する）（重水、３００ＭＨｚ）δ３．６４（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．１８（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、７．８９−８．０５（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１７−８．２７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７−８．３７（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５８−８．６８（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
赤外分光法（以下ＩＲと略称する）（臭化カリウム錠剤法、以下ＫＢｒと略称する）３４６０、３１００、１６１０、１５２５、１５００、１３４５、１２３０、１１１８ｃｍ−１。
質量分析法（質量スペクトル、以下ＭＳと略称する）ｍ／ｅ＝７３５（Ｍ＋１）。(Synthesis of Compound a)
10 g (65.3 mmol) of p-nitrophenylhydrazine and 20.26 g (65.3 mmol) of 4-formyl-1,3-benzene-disulfonic acid disodium salt monohydrate are suspended in 300 ml of methanol and heated for 2 hours. Refluxed. Next, the reaction suspension was cooled, and the precipitate of the reaction suspension was collected by filtration to obtain 25.3 g of a hydrazone compound in a yield of 86.9%.
The obtained hydrazone compound (7.61 g, 17.1 mmol) was dissolved in a mixed solvent of 200 ml of tetrahydrofuran and 200 ml of water and cooled to 3 ° C. 2,5-Dimethoxy-4- (4-nitrophenylazo) benzenediazonium
Next, 0.46 g (0.61 mmol) of the obtained formazan was dissolved in 20 ml of methanol. After adding 0.5 ml (4.9 mmol) of hydrochloric acid to the formazan solution, 1 g (9.1 mmol) of butyl nitrite was added and stirred at room temperature for 1 hour. Subsequently, after methanol of the solvent was distilled off under reduced pressure, the crude product was purified by a reprecipitation method with water / alcohol to obtain 30 mg of compound a which is the tetrazolium compound of the general formula (1) in a yield of 6.7%. It was.
Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (hereinafter abbreviated as 1 H-NMR) (heavy water, 300 MHz) δ 3.64 (3H, s, —OCH 3 ), 4.18 (3H, s, —OCH 3 ), 7.89 -8.05 (4H, m, aromatic CH), 8.17-8.27 (4H, m, aromatic CH), 8.27-8.37 (2H, m, aromatic CH), 8.58-8 .68 (3H, m, aromatic CH).
Infrared spectroscopy (hereinafter abbreviated as IR) (potassium bromide tablet method, hereinafter abbreviated as KBr) 3460, 3100, 1610, 1525, 1500, 1345, 1230, 1118 cm −1 .
Mass spectrometry (mass spectrum, hereinafter abbreviated as MS) m / e = 735 (M + 1).
（化合物ｂの合成）
上記化合物ａと同様な方法で合成し、同定した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、３００ＭＨｚ）δ７．６３−７．７８（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０１−８．０８（４Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１８−８．２８（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３２−８．３８（２Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４４−８．５４（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３１００、１６２０、１５２０、１４５５、１３５０、１２２０、１０３０、８５０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝６３０（Ｍ＋１）。(Synthesis of Compound b)
The compound was synthesized and identified in the same manner as the compound a.
1 H-NMR (deuterated methanol, 300 MHz) δ 7.63-7.78 (3H, m, aromatic CH), 8.01-8.08 (4H, s, aromatic CH), 8.18-8.28 ( 4H, m, aromatic CH), 8.32-8.38 (2H, d, aromatic CH), 8.44-8.54 (3H, m, aromatic CH).
IR (KBr) 3450, 3100, 1620, 1520, 1455, 1350, 1220, 1030, 850 cm −1 .
MS m / e = 630 (M + l).
（化合物ｃの合成）
上記化合物ａと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重メタノール、３００ＭＨｚ）δ７．９８−８．１２（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１４−８．２１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２３−８．３７（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４１−８．５７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７１−８．７５（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４８０、３１００、１６３８、１５４０、１３５５、１２３０、１１４０、８５５、６１０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝８３４（Ｍ＋１）。(Synthesis of Compound c)
The compound was synthesized in the same manner as the compound a.
1 H-NMR (deuterated methanol, 300 MHz) δ 7.98-8.12 (5H, m, aromatic CH), 8.14-8.21 (1H, m, aromatic CH), 8.23-8.37 ( 3H, m, aromatic CH), 8.41-8.57 (4H, m, aromatic CH), 8.71-8.75 (1H, d, aromatic CH).
IR (KBr) 3480, 3100, 1638, 1540, 1355, 1230, 1140, 855, 610 cm −1 .
MS m / e = 834 (M + l).
（化合物ｄの合成）
ｐ−ニトロフェニルヒドラジン１４ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）及びｐ−ニトロベンズアルデヒド１３．８ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）をメタノール４００ｍｌに懸濁させ、２時間加熱還流した。次いで反応懸濁液を冷却後、反応懸濁液の沈殿物を濾取してヒドラゾン化合物２３．６ｇを収率９０．１％で得た。
４−アミノ−１，１’−アゾベンゼン−３，４−ジスルフォン酸ナトリウム塩３１．２ｇを水２００ｍｌに懸濁し、５℃以下に冷却した。その懸濁液に濃塩酸２５．７ｍｌを、次いで水５０ｍｌに溶解した亜硝酸ナトリウム５．６７ｇを加えた後、０〜５℃で１時間撹拌し、ジアゾニウム化合物水溶液を得た。
ヒドラゾン化合物７．６１ｇ（１７．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３００ｍｌと水５０ｍｌの混合溶媒に溶解し、３℃に冷却した。そのヒドラゾン水溶液に合成したジアゾニウム化合物水溶液を加えた。この反応溶液を０〜３℃に保持しながら、水１６０ｍｌに溶解した水酸化ナトリウム１３．２ｇを滴下し、滴下終了後３時間撹拌した。反応混合液に塩酸を加え、弱酸性にした。次いで溶媒のテトラヒドロフランと水を減圧留去した。濃縮物をジメチルフォルムアミドとエーテルで再沈殿精製し、ジアゾニウム塩５２ｇを収率９０．６％で得た。
次いで得られたホルマザン３ｇ（４．３ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍｌとジメチルフォルムアミド５０ｍｌの混合溶液に溶解した。そのホルマザン溶液に塩酸９ｍｌ（０．１１ｍｏｌ）を加えた後、次亜塩素酸ナトリウム水溶液２０ｍｌを添加し室温で１時間撹拌した。反応後、その反応溶液の溶媒であるメタノールとジメチルフォルムアミドを減圧留去した後、粗成生物は水／アルコールによる再沈殿法により精製し、前記一般式（１）のテトラゾリウム化合物である化合物ｄを０．８ｇ、収率２７．６％で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ８．１２−８．１９（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２０−８．２３（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２３−８．２６（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３５−８．４０（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．６０−８．６８（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７１（１Ｈ，ｄ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．７４（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３５００、３１１０、１６３０、１５５０、１４７５、１３６５、１２４０、１０５０、８７０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝６７５（Ｍ＋１）。(Synthesis of Compound d)
14 g (91.4 mmol) of p-nitrophenylhydrazine and 13.8 g (91.4 mmol) of p-nitrobenzaldehyde were suspended in 400 ml of methanol and heated to reflux for 2 hours. Next, after cooling the reaction suspension, the precipitate of the reaction suspension was collected by filtration to obtain 23.6 g of a hydrazone compound in a yield of 90.1%.
31.2 g of 4-amino-1,1′-azobenzene-3,4-disulfonic acid sodium salt was suspended in 200 ml of water and cooled to 5 ° C. or lower. To the suspension, 25.7 ml of concentrated hydrochloric acid and 5.67 g of sodium nitrite dissolved in 50 ml of water were added, followed by stirring at 0 to 5 ° C. for 1 hour to obtain a diazonium compound aqueous solution.
7.61 g (17.1 mmol) of the hydrazone compound was dissolved in a mixed solvent of 300 ml of tetrahydrofuran and 50 ml of water and cooled to 3 ° C. The synthesized diazonium compound aqueous solution was added to the hydrazone aqueous solution. While maintaining this reaction solution at 0 to 3 ° C., 13.2 g of sodium hydroxide dissolved in 160 ml of water was added dropwise, and the mixture was stirred for 3 hours after completion of the dropwise addition. Hydrochloric acid was added to the reaction mixture to make it weakly acidic. Next, the solvent tetrahydrofuran and water were distilled off under reduced pressure. The concentrate was purified by reprecipitation with dimethylformamide and ether to obtain 52 g of diazonium salt in a yield of 90.6%.
Next, 3 g (4.3 mmol) of the obtained formazan was dissolved in a mixed solution of 200 ml of methanol and 50 ml of dimethylformamide. After adding 9 ml (0.11 mol) of hydrochloric acid to the formazan solution, 20 ml of aqueous sodium hypochlorite solution was added and stirred at room temperature for 1 hour. After the reaction, methanol and dimethylformamide as solvents of the reaction solution are distilled off under reduced pressure, and then the crude product is purified by a reprecipitation method with water / alcohol to obtain a compound d which is a tetrazolium compound of the general formula (1). Was obtained in a yield of 27.6%.
1 H-NMR (heavy water, 300 MHz) δ 8.12-8.19 (3H, m, aromatic CH), 8.20-8.23 (1H, d, aromatic CH), 8.23-8.26 (1H , D, aromatic CH), 8.27 (1H, s, aromatic CH), 8.35-8.40 (2H, m, aromatic CH), 8.60-8.68 (5H, m, aromatic CH) , 8.71 (1H, d, aromatic CH), 8.74 (1H, s, aromatic CH).
IR (KBr) 3500, 3110, 1630, 1550, 1475, 1365, 1240, 1050, 870 cm −1 .
MS m / e = 675 (M + l).
（化合物ｅの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ７．８３−７．９７（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９７−８．０９（５Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０９−８．１８（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２０−８．２６（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２７−８．３３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．３３−８．４１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４３−８．５３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３０８０、１６３０、１５３０、１４１０、１３４０、１２２０、１０３０、８５０、７４５、６１０、５６０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝７３１（Ｍ＋１）。(Synthesis of Compound e)
The compound was synthesized in the same manner as the above compounds a and d.
1 H-NMR (heavy water, 300 MHz) δ 7.83-7.97 (2H, m, aromatic CH), 7.97-8.09 (5H, m, aromatic CH), 8.09-8.18 (1H , M, aromatic CH), 8.20-8.26 (1H, m, aromatic CH), 8.27-8.33 (1H, m, aromatic CH), 8.33-8.41 (1H, m , Aromatic CH), 8.43-8.53 (1H, m, aromatic CH).
IR (KBr) 3450, 3080, 1630, 1530, 1410, 1340, 1220, 1030, 850, 745, 610, 560 cm −1 .
MS m / e = 731 (M + 1).
（化合物ｆの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ２．２２−２．４８（４Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、３．１０−３．２８（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、３．６６（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．１３（３Ｈ，ｓ，−ＯＣＨ３）、４．２１−４．３０（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２−）、６．６６−６．６８（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、６．８９−６．９３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．４１（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．７０−７．７５（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９１（１Ｈ，ｓ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．１２−８．２２（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．４２−８．４８（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５２−８．５８（２Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４７５、２９５０、１６２０、１５１０、１３５０、１２１０、１０５０、８６０、６１０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝８５１（Ｍ＋１）。(Synthesis of Compound f)
The compound was synthesized in the same manner as the above compounds a and d.
1 H-NMR (heavy water, 300 MHz) δ 2.22-2.48 (4H, m, —CH 2 —), 3.10-3.28 (2H, m, —CH 2 —), 3.66 (3H , S, —OCH 3 ), 4.13 (3H, s, —OCH 3 ), 4.21-4.30 (2H, m, —CH 2 —), 6.66-6.68 (1H, m , Aromatic CH), 6.89-6.93 (1H, m, aromatic CH), 7.41 (1H, s, aromatic CH), 7.70-7.75 (1H, m, aromatic CH), 7 .91 (1H, s, aromatic CH), 8.12-8.22 (4H, m, aromatic CH), 8.42-8.48 (2H, m, aromatic CH), 8.52-8.58 (2H, m, aromatic CH).
IR (KBr) 3475, 2950, 1620, 1510, 1350, 1210, 1050, 860, 610 cm −1 .
MS m / e = 851 (M + 1).
（化合物ｇの合成）
上記化合物ａ、ｄと同様な方法で合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（重水、３００ＭＨｚ）δ７．５３−７．６３（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、７．９６−８．０１（１Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．０９−８．２６（６Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．２８−８．４２（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）、８．５２−８．６４（３Ｈ，ｍ，ａｒｏｍａｔｉｃ ＣＨ）。
ＩＲ（ＫＢｒ）３４５０、３１００、１６００、１５３０、１３５０、１２３０、１２００、１０４０、８５０、６１０、５５０ｃｍ−１。
ＭＳ ｍ／ｅ＝７０５（Ｍ＋１）。(Synthesis of Compound g)
The compound was synthesized in the same manner as the above compounds a and d.
1 H-NMR (heavy water, 300 MHz) δ 7.53-7.63 (1H, m, aromatic CH), 7.96-8.01 (1 H, m, aromatic CH), 8.09-8.26 (6H) , M, aromatic CH), 8.28-8.42 (3H, m, aromatic CH), 8.52-8.64 (3H, m, aromatic CH).
IR (KBr) 3450, 3100, 1600, 1530, 1350, 1230, 1200, 1040, 850, 610, 550 cm −1 .
MS m / e = 705 (M + l).
化合物ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇを１ｍＭ濃度になるよう、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）で調製した。溶液は４℃または２５℃で保存し、各化合物について、既述の表１に示すホルマザンの極大吸収波長における吸光度を測定した。図２および図３に化合物ｄの測定結果を示す。他の化合物についても同様の結果が得られ、全ての化合物において３０日間吸光度の変化は見られず、本発明の化合物は水溶液中でホルマザンに分解することがなく安定であることが確認された。
なお、図４には比較のために特許第２９９５８８０号公報（特許文献３）に開示している水溶性テトラゾリウム化合物の緩衝液中の吸光度変化を示しており、経時的な安定性において幾分難点があることが理解される。Compounds a, b, c, d, e, f, and g were prepared with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4, pH 8.0, pH 9.0) so as to have a concentration of 1 mM. The solution was stored at 4 ° C. or 25 ° C., and the absorbance at the maximum absorption wavelength of formazan shown in Table 1 was measured for each compound. 2 and 3 show the measurement results of Compound d. Similar results were obtained for other compounds, and no change in absorbance was observed for 30 days for all compounds, confirming that the compound of the present invention was stable without being decomposed into formazan in an aqueous solution.
For comparison, FIG. 4 shows the change in absorbance in the buffer solution of the water-soluble tetrazolium compound disclosed in Japanese Patent No. 2994880 (Patent Document 3), which is somewhat difficult in terms of stability over time. It is understood that there is.
１ｍＭの化合物ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅまたはｆと、５μＭの１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルスルフェート（以下１−メトキシＰＭＳと略称する）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌに、５ｍＭの還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨと略称する）をそれぞれ０、１０、２０、３０、４０及び５０μｌ加え（それぞれのＮＡＤＨ最終濃度は、０、１０、２０、３０、４０及び５０μｍｏｌ／ｌである。）、５分間室温で反応させた後、吸光度を測定した。得られた吸収スペクトルを化合物ごとに図５（化合物ａ）、図６（化合物ｂ）、図７（化合物ｃ）、図８（化合物ｄ）、図９（化合物ｅ）、図１０（化合物ｆ）、図１１（化合物ｇ）に示す。ＮＡＤＨ濃度変化に伴い、化合物ａでは５２７ｎｍ、化合物ｂでは４９３ｎｍ、化合物ｃでは４７２ｎｍ、化合物ｄでは５３０ｎｍ、化合物ｅでは４７４ｎｍ、化合物ｆでは５３０ｎｍ、化合物ｇでは４７３ｎｍの吸光度が上昇し、ホルマザンの生成が確認された。またホルマザンの測定セルへの吸着も認められなかった。
また、図１２に示されるようにＮＡＤＨと吸光度との間には良好な直線性の検量線が得られ、本発明の化合物が脱水素酵素反応の定量分析に使用できることが確認された。50 mM Tris-HCl buffer (pH 8) containing 1 mM of compound a, b, c, d, e or f and 5 μM of 1-methoxy-5-methylphenadium methyl sulfate (hereinafter abbreviated as 1-methoxy PMS) 0.0) 0, 10, 20, 30, 40 and 50 μl of 5 mM reduced nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter abbreviated as NADH) are added to 5 ml (each NADH final concentration is 0, 10, 20). , 30, 40 and 50 μmol / l.) After reacting at room temperature for 5 minutes, the absorbance was measured. The obtained absorption spectra for each compound are shown in FIG. 5 (Compound a), FIG. 6 (Compound b), FIG. 7 (Compound c), FIG. 8 (Compound d), FIG. 9 (Compound e), and FIG. This is shown in FIG. 11 (Compound g). With the change in NADH concentration, the absorbance at 527 nm for compound a, 493 nm for compound b, 472 nm for compound c, 530 nm for compound d, 474 nm for compound e, 530 nm for compound f, and 473 nm for compound g increases the formation of formazan. confirmed. Also, no adsorption of formazan to the measuring cell was observed.
Further, as shown in FIG. 12, a calibration curve with good linearity was obtained between NADH and absorbance, and it was confirmed that the compound of the present invention can be used for quantitative analysis of dehydrogenase reaction.
化合物ｄおよび１−メトキシＰＭＳを１５０ｍＭ食塩水に各々５ｍＭおよび０．２ｍＭ溶解し、試薬溶液を調製した。ヒト子宮頚癌細胞を９６穴マイクロプレートに２５０００細胞／ウェルから倍希釈法により１００ｕｌずつ播種し、細胞培養用インキュベーター中、３７℃、３時間インキュベーションした。試薬溶液１０ｕｌずつ各ウエルに添加し、インキュベーター中、３７℃、１．５時間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで５３０ｎｍの吸光度を測定した。マイクロプレートへのホルマザンの吸着は観測されず、細胞数（酵素または基質の濃度に対応する）と吸光度との間には良好な検量線が得られた（図１３）。 Compound d and 1-methoxy PMS were dissolved in 150 mM saline at 5 mM and 0.2 mM, respectively, to prepare a reagent solution. Human cervical cancer cells were seeded in a 96-well microplate from 25000 cells / well by a 100-fold dilution method and incubated at 37 ° C. for 3 hours in a cell culture incubator. 10 ul of the reagent solution was added to each well, incubated at 37 ° C. for 1.5 hours in an incubator, and the absorbance at 530 nm was measured with a microplate reader. Adsorption of formazan to the microplate was not observed, and a good calibration curve was obtained between the number of cells (corresponding to the concentration of enzyme or substrate) and absorbance (FIG. 13).
本発明は、長期間使用できる安定な試薬を用いる高感度の臨床検査法として、ＬＤＨをはじめとする生体中の各種の脱水素酵素を定量分析することにより疾病の診断や治療にきわめて有意義な知見を得るのに利用され、さらに、培養細胞内または培養細胞から漏出する脱水素酵素を測定することにより、新しい化学物質や薬剤の開発に際してそれらの毒性や効能等を知る手段としても有用である。 The present invention is a highly sensitive clinical test method that uses a stable reagent that can be used for a long period of time, and is a highly significant finding for diagnosis and treatment of diseases by quantitatively analyzing various dehydrogenases in living bodies including LDH. Furthermore, it is useful as a means of knowing their toxicity and efficacy in the development of new chemical substances and drugs by measuring dehydrogenase leaking in or from cultured cells.
Claims (4)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003273982 | 2003-07-14 | ||
| JP2003273982 | 2003-07-14 | ||
| PCT/JP2004/009953 WO2005023786A1 (en) | 2003-07-14 | 2004-07-13 | Water-soluble tetrazolium compounds |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2005023786A1 JPWO2005023786A1 (en) | 2007-04-19 |
| JP4614885B2 true JP4614885B2 (en) | 2011-01-19 |
Family
ID=34263987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005513603A Active JP4614885B2 (en) | 2003-07-14 | 2004-07-13 | Water-soluble tetrazolium compound |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7485705B2 (en) |
| EP (1) | EP1650197A4 (en) |
| JP (1) | JP4614885B2 (en) |
| CN (1) | CN100396671C (en) |
| CA (1) | CA2532211A1 (en) |
| WO (1) | WO2005023786A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019502655A (en) * | 2015-11-09 | 2019-01-31 | ハンジョウ ジェニファー バイオーテック カンパニー リミテッドＨａｎｇｚｈｏｕ Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． | Monosulfonic acid phenyltetrazole compounds and applications |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2008272818A1 (en) | 2007-07-02 | 2009-01-08 | Yu, Ming Dr | Methods, composition, targets for combinational cancer treatments |
| WO2013051590A1 (en) * | 2011-10-03 | 2013-04-11 | 国立大学法人鹿児島大学 | Quantitative soft agar colony formation assay using tetrazolium that generates water-soluble formazan |
| WO2017090631A1 (en) * | 2015-11-24 | 2017-06-01 | 国立大学法人 東京大学 | Fluorescent probe for detecting extracellular metabolite and screening method employing said fluorescent probe |
| EP3239709B1 (en) * | 2016-04-25 | 2019-06-05 | ARKRAY, Inc. | Method of analyzing glycated protein; use of analysis reagent, analysis kit, and test piece for analysis |
| WO2018051822A1 (en) * | 2016-09-14 | 2018-03-22 | テルモ株式会社 | 2-substituted benzothiazolyl-3-substituted phenyl-5-substituted sulfonated phenyl-2h-tetrazolium salt, biological component concentration measurement reagent containing said salt, and biological component concentration measurement method using said salt |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB738585A (en) * | 1952-07-17 | 1955-10-19 | May & Baker Ltd | Improvements in or relating to tetrazolium compounds |
| JPH09286784A (en) * | 1996-04-18 | 1997-11-04 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | Novel water-soluble tetrazolium salt |
| JP2995380B2 (en) * | 1994-08-11 | 1999-12-27 | 株式会社同仁化学研究所 | New water-soluble tetrazolium salt compound |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0578410A (en) * | 1991-09-19 | 1993-03-30 | Okamoto Kagaku Kogyo Kk | Photopolymerizable composition |
| JP2592436B2 (en) * | 1993-09-01 | 1997-03-19 | 株式会社同仁化学研究所 | New water-soluble tetrazolium compounds |
| US6913878B2 (en) * | 2003-01-06 | 2005-07-05 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Method of detecting DNA single strand breaks |
-
2004
- 2004-07-13 CN CNB200480020013XA patent/CN100396671C/en active Active
- 2004-07-13 CA CA002532211A patent/CA2532211A1/en not_active Abandoned
- 2004-07-13 JP JP2005513603A patent/JP4614885B2/en active Active
- 2004-07-13 US US10/563,702 patent/US7485705B2/en active Active
- 2004-07-13 EP EP04747419A patent/EP1650197A4/en not_active Withdrawn
- 2004-07-13 WO PCT/JP2004/009953 patent/WO2005023786A1/en active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB738585A (en) * | 1952-07-17 | 1955-10-19 | May & Baker Ltd | Improvements in or relating to tetrazolium compounds |
| JP2995380B2 (en) * | 1994-08-11 | 1999-12-27 | 株式会社同仁化学研究所 | New water-soluble tetrazolium salt compound |
| JPH09286784A (en) * | 1996-04-18 | 1997-11-04 | Doujin Kagaku Kenkyusho:Kk | Novel water-soluble tetrazolium salt |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019502655A (en) * | 2015-11-09 | 2019-01-31 | ハンジョウ ジェニファー バイオーテック カンパニー リミテッドＨａｎｇｚｈｏｕ Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． | Monosulfonic acid phenyltetrazole compounds and applications |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2532211A1 (en) | 2005-03-17 |
| CN1823049A (en) | 2006-08-23 |
| CN100396671C (en) | 2008-06-25 |
| JPWO2005023786A1 (en) | 2007-04-19 |
| US7485705B2 (en) | 2009-02-03 |
| US20070111274A1 (en) | 2007-05-17 |
| EP1650197A4 (en) | 2008-11-05 |
| WO2005023786A1 (en) | 2005-03-17 |
| EP1650197A1 (en) | 2006-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2757348B2 (en) | New water-soluble tetrazolium salt compound | |
| US8178669B2 (en) | Fluorescent probe for peroxynitrite | |
| CN109232626B (en) | SO based on difluoro boro coumarin2Ratiometric fluorescent probes | |
| JP4373608B2 (en) | Reagent for singlet oxygen measurement | |
| CN111303102A (en) | Nitroreductase responsive hypoxic probe compound and preparation and application thereof | |
| CN109836394B (en) | Near-infrared fluorescent probe for identifying hydrogen sulfide and preparation method and application thereof | |
| US8394850B2 (en) | Fluorescent probe specific to hydrogen peroxide | |
| JPH10332591A (en) | Method for quantitative determination of alkali ion and diaza-cryptand | |
| JP4614885B2 (en) | Water-soluble tetrazolium compound | |
| CN111019644B (en) | Rapid quantitative detection of tumor hypoxia related enzyme by using cofactor-substrate probe platform | |
| JPH0859686A (en) | Cypridinacea luciferin derivative and determination of saccharide hydrolase | |
| CN112079823A (en) | Near-infrared frequency up-conversion fluorescence molecular probe, preparation method and application | |
| EP0498196B1 (en) | A colorimetric method and reagent for the assay of lithium in a test sample | |
| JPS60180600A (en) | Determination of reduced-type nicotinamide adenine dinucleotide | |
| JP2592436B2 (en) | New water-soluble tetrazolium compounds | |
| CN113637048A (en) | Two-photon fluorescent probe of gamma-glutamyl transpeptidase, and preparation method and application thereof | |
| JP2995380B2 (en) | New water-soluble tetrazolium salt compound | |
| JP2819258B2 (en) | New water-soluble tetrazolium salt compound | |
| US6046312A (en) | Water soluble azo dyes and their synthesis and use | |
| JPS58124771A (en) | 4-amino-2,3-disubstituted-1-(mono or trichlorophenyl)-3- pyrazolin-5-one | |
| CA2251850C (en) | Water-soluble tetrazolium salt compounds | |
| JP2889476B2 (en) | Stilbene diboronic acid compound | |
| CN116751209A (en) | Near infrared ratio type fluorescent probe and preparation method and application thereof | |
| JPH04221393A (en) | N-acetyl-beta-d-glucosamine derivative, reagent for determination of n-acetyl-beta-d-glucosaminidase activity containing the derivative as active component and determination of n-acetyl-beta-d-glucosaminidase activity using the same | |
| JP2003321486A (en) | Method for assaying alkaline phosphatase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070530 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101005 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101019 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4614885 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131029 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |