JPS62195559A - 還元性物質の定量方法及びその定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は還元性物質の定量方法ならびにその定量用試薬
に関する。

〔従来の技術およびその問題点〕

生体試料中の還元性物質、例えばアスコルビン酸などの
測定は診断学上重要でちる。

また酸化還元酵素が関与する多数の反応によって生成さ
れる還元性物質、例えばニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤＨ）またはニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド燐酸（ＮＡＤＰＨ）あるいはスーパーオキ
サイド（０；）等を測定することにより酵素活性や基質
となる物質のｉを知ることは、疾病の診断や治療効果あ
るいは疾病の機序を知る上で非常に重要である。

従来、血清又は尿などの生体試料中におけるこれらの還
元性物質の定量法としては簡便な比色定量法が一般に用
いられている。即ちその一つの方法としては、試料中の
還元性物質によりテトラゾリウム塩を還元し、ホルマザ
ンに変換して、これを比色定量する方法が広く用いられ
ている。しかし、この方法は感度が低く、ホルマザンの
吸着性があるなどの問題を有している。

また池の方法として、還元性物質（ＮＡＤ）１　）によ
り３価の鉄イオンを２価の鉄イオンに還元し、これに特
異的な金属指示薬（フェロジン）を作用させて、有色の
キレート化合物を形成させ、これを測定することにより
、還元性物質（ＮＡＤＩ（）の量を測定する方法も知ら
れている（クリニカルケミストリイ、１８巻６９５頁、
　１９７２年）。しかしこの方法もかならずしも感度の
高いものではなく、微量成分の定量法としては満足のい
くものでＪｉなかった。

また鉄以外の金属イオンは水溶液中で酸化型として安定
に存在することが難しいことから、還元性物質の定量に
使用された報告は全くなかった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは斯かる問題点を克服すべく種々検討を行っ
た結果、コバルト錯体が水溶液中で安定に存在し、かつ
金属指示薬と組み合せて用いることにより、滝めて高感
度に還元性物質を定量できることを見い出し、本発明を
完成した。

すなわち、本発明は酸化型コバルト錯体を還元性物質と
反応させて還元型コバルト錯体に変換せしめ、次いで該
還元型コバルト錯体と金属指示薬とを作用せしめ生成し
た有色性錯体を測定することを特徴とする還元性物質の
定量方法を提供するものである。

さらに本発明は酸化型コバルト錯体及び金属指水薬を含
有する還元性物質定量用試薬を提供するものである。

本発明定量方法は、次の反応式（Ｈによって示される。

すなわち、被検物質である還元性物質と酸化型コバルト
錯体を反応せしめ、生成した還元性コバルト錯体に金属
指示薬を反応させて生成する有色性錯体の量を測定する
ことにより行なわれる。

被検物質である還元性物質としては、その物質自身還元
能力を有すれば特に制限されないが、例えばアスコルビ
ン酸、ＮＡＤＨ、ＮＡ’ＤＰＨ、スーパーオキサイド、
チオール化合物等が挙げられる。

酸化型コバルト錯体としては、トリス（アセチルアセト
ナト）コバルト（１）　、ヘキサアンミンコバルト（１
）壜化物、ヘキサシアノコバルト（１）酸カリウム、ヘ
キサニトロコバルト（Ｉ）酸カリウム等が挙げられるが
、これと同様の反応性を有するものであれば、これに限
定されるものではない。

金属指示薬としては、還元型コバルト錯体との反応によ
って有色性錯体を生成する能力を有するものであれば特
に限定されないが、例えば４−（２−ピリジルアゾ）−
１，３−ジアミノベンゼン、５−（２−ピリジルアゾ）
−２，４−ジアミノトルエン、２−（２−ピリジルアゾ
）−５−ジメチルアミンフェノール、２−（２−ピリジ
ルアゾ）−５−ジエチルアミノフェノール、２−（５−
ブロモー２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ
−スルホプロピルアミノ）フェノール・ナトリウム塩（
以下５−Ｂｒ−ＰＡＰＳと略す）、２−（５−ブロモピ
リジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピ
ルアミノ）アニリン・ナトリウム塩（以下５−Ｂｒ−Ｐ
ＳＡＡと略す）、１−（２−ピリジルアゾ）−２−ナフ
トール、４−（２−ピリジルアゾ）レゾルシノール、４
−（２−チアゾリルアゾ）−レゾルシノール、２−（２
−チアゾリルアゾ）−ｐ−クレゾール等のアリルアゾ誘
導体；１−ニトロン−２−ナフトール、２−ニトロン−
１−ナフトール、２−ニトロン−１−ナフトール−４−
スルホン酸、１−二トロン−２−ナフトール−３，６−
ジスルホン酸ナトリウム塩等のニトロン−ナフトール誘
導体；２−ニトロン−４−ジメチルアミノフェノール等
のニトロソフェノール誘導体；フェニルフルオロン誘導
体；ピロカテコールバイオレット誘導体；ピロガロール
レッド誘導体；クロマメロールＳ１タイロン、１−フェ
ニル−３−メチル−４−ベンゾイル−５−ピラゾロン等
のβ−ジケトン誘導体；Ｎ−ベンゾイル−Ｎ−フェニル
ヒドロキシルアミンｄ導体；　３　、３’−ビス［Ｎ、
Ｎ−ジ（カルボキシメチルアミンメチル））−０−クレ
ゾールスルホフタレイン等のフェノール−スルホフタレ
イン誘導体；アリザリンコンブレクソン等のアントラキ
ノン誘導体；８−キノリツール等のキノリン誘導体；グ
リオキサル・ビス（２−ヒドロキシアニル＞ｎ導体；ジ
フェニルカルバジッド誘導体；ジフェニルカルバゾン誘
導体；ジンコン誘導体；５，５−二トリロジバルビツー
ル酸誘導体、２．４．６−）リス（２−ピリジル）−８
−）リアジン、３−（２−ピリジル）−５，６−ジフェ
ニル−１，２，４−トリアジン、３−（２−ピリジル）
−５、６−ジフェニル−１，２，４−トリアジン・ジス
ルホン酸ナトリウム塩等のトリアジン誘導体；ジオキシ
ム誘導体；ジチゾン誘導体：チオキシン誘導体などが挙
げられる。

本発明定量法を実施するには、一定温度（例えば室温〜
４０℃の任意の温度）下に保持したｐＨ５〜１０の緩衝
液中に被検体、金属指示薬および酸化型コバルト錯体を
加えて反応を行ない、該反応液中に生成した有色性錯体
を光学的手段により測定することにより行なわれる。

酸化型コバルト錯体は、反応液中の濃度が０．０１〜１
０　ｍｍｏ−ｇ／Ａ　、好ましくは０．０５〜１　ｍｍ
ｏ４／Ａとなるように添加される。また、金属指示薬は
０、０１〜２００　ｍｍｏＡ／ｅ、好ましくは５０〜５
００μｍＯβ／ｐの濃度範囲で使用される。

緩衝液としては、前記のｐＨ範囲を保持できれば特に制
限されないが、例えば酢酸緩衝液、トリス緩衝液、リン
酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液等が用いられ
る。

反応液中に生成した有色性錯体を測定して被検体中の還
元性物Ｊｌ定量するには、まず、生成した錯体に適した
波長で吸光度変化ｔを測定するか、あ、るいは一定時間
後に酸もしくはアルカリ溶′ｒＬまたは界面活性剤を加
え反応を停止させ、適した波長で吸光度を求める。次い
で得られた吸光度から盲検の吸光度を差引いた値をあら
かじめ求めておいた標準液の吸光度と比較し、被検体中
の還元性＊質量を求める。

本発明定量方法は、被検体中で還元性物質が生成する灰
石、例えば脱水素酵素、酸化酵素等とそれらの恭賀を組
み合せることによυ、これらの酵素及び基質の定量も可
能となる。この例を示せば以下の通りである。

本発明定量方法の実施にあたって、予め酸化型コバルト
錯体及び金属指示薬を含有する試薬を調製しておくこと
が便利である。該試薬としては、０、０１〜１０　ｍｍ
ｏ［／、ｇ、好ましくは０．０５〜１ｍｍｏｐ／（３の
酸化型コバルト錯体と０．０１〜２００ｍｍ０沙句、好
ましくは５０〜５００μｍＯ勝句の金属指示薬をＰＨ５
〜１０の緩衝液に加えたものが好ましい。

〔作用及び発明の効果〕

本発明によれば還元性物質を極めて高感度で定量するこ
とができる。更に種々の物質（４質）に作用して還元性
物質を生成するような酵素の活性あるいはそのような酵
素反応と連結し得る自体公知の酵素反応に関与する物質
（基質）、酵素、補酵素の量若しくは活性などを容易に
、しかも高感度に定量することができる。

〔実施例〕 次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１　アスコルビン酸の定量 ５００μＭのトリス（アセチルアセトナト）コバルト（
１）、１２５　ｐｈｉの５−Ｂｒ−ＰＳＡＡ　を含む’
ｌ　Ｑ　ｍＭの酢酸緩衝液（ＰＨ５，０）　１ｍｌにア
スコルビン酸を含む被検体５０μ！ｔ−加えて３７°Ｃ
で３０分間７１１１温後、盲検を対照として波長５ＱＱ
ｎｍの吸光度を測定する。結果を表１に示す。

表１ 検量線は直線を示した。

実施例２　アスコルビン酸の定量 ５０μＭのヘキサアンミンコバル）　（１）塩化物、４
００μＭの２−（５−ブロモ−２−ビリジルア７’）　
−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フ
ェノールナトリウム塩（以下５−Ｂｒ　−ＰＡＰ　Ｓと
略す）を含む２０　ｍＭのグリシン緩衝液（ｐＨ１１，
０）２ｍｌにアスコルビン酸を含む被検体１０μＡｔ加
えて３７℃で１０分間加温後、盲検を対照として波長５
８５　ｎｍの吸光度を測定する。結果を表２に示す。

表２ 実流側３　　ＮＡＤＨの定量 ３００μＭのトリス（アセチルアセトナト）９バルト（
１）、１０μＭの１−メトキシーフエナジ７Ｊ　トｆｋ
’７ｆ−−ト、２００　μＭ　ノ５−Ｂｒ−ＰＡＰＳｔ
　含ｔｒ　１０　ｍｍｏ４／４モノエタノールアミン−
塩酸緩衝液（ｐａｔ　９．５　）　ＬＯｍｌにＮＡＤＨ
を含む被検液１０μ召を加えて３７°Ｃで１５分間加温
後、盲検を対照として波長５８５　ｎｍで吸光度を測定
する。

結果を表３に示す。

表３ 慣量線は直線となり、良好な定量性を示している。

実施例４　胆汁酸の定量 ３００μＭのトリス（アセチルアセトナト）コバルト（
１）、１０μＭの１−メトキシフェナジンメトサルフェ
ート、１ｍＭのニコチンアミドアテニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）、４５ｍＭのオキサミド酸ナトリウム、１０
０Ｕ／６の３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼ、２００μＭの５−Ｂｒ−ＰＡＰＳ　ｆ含む０．０２
　Ｍのモノエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９，５
）　２．０１Ｌｌに胆汁酸を含む被検体１０μｐを加え
て３７°Ｃで１５分間加温後、盲検を対照として波長５
８５　ｎｍで吸光度を測定する。なお被検体としてはグ
リココール酸（以下ＧＣと略す）を添カロした血清を無
添／ＪＤ血清で種々の濃度に希釈して使用し、検量線を
求めた。結果を表４に示す。

表４ 検量線は直線を示し、良好な定量性を示しだ。

実施例５ 胆汁酸を本発明方法（実施例４）、ニトロテトラゾリウ
ムプルーヲ１史用した方法（１）及び峡イオンを使用し
た方法（１１）によりそｎぞれ定数した。各感度の相ｉ
Ｊ比？衆５に示す。

（１）　　ニトロテトラゾリウムブルーを使用した方法
６００μＭのニトロテトラゾリウムブルー、５００　Ｕ
／６のジアホラーゼ、２ｍＭのＮＡＤ。

３０　ｍＭのオキサミド酸ナトリウム、１００Ｕ／での
３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲｆ−−ｔ’（３
（１−Ｈ’；３Ｄ　）を含む６５　ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐｉ−１７，０）　０．５０ｒｌに胆汁酸を含む被検
体２００μ！を加えて３７°Ｃで１０分間加温後、反応
停止液（０，１Ｎ塩＠　）　０．５　ｍｔを８口える。

５分間、放置後、波長５４０　ｎｍで吸光度を測定する
。また同一試料について３α−Ｈ８Ｄを除いた測定試液
で同様な操１８：を行ない検体ブランク（盲検）とする
。

（１１）鉄イオンを使用した方法 ２００μＭの塩化第二鉄、５０μＭの１−メトキシＰＭ
Ｓ、４００μＭのニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡｉ））、３０１７１Ｍオキサミド酸ナトリウム
、１００Ｕ／ｅの３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ（３α−）ＩＳＤ）を含む０．１　Ｍ　トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）１．Ｏｒ！Ｌｌに胆汁Ｍ’
ｊｃ含む被検体１００μ石を加えて３７℃で１５分間加
温後、波長５６２ｎｍで吸光度を測定する。また同一試
料について３α−Ｈ８Ｉ）を除いた測定試液で同様な操
作を行ない、検体ブランク（盲検）とする。

表５ 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酸化型コバルト錯体を還元性物質と反応させて還元
   型コバルト錯体に変換せしめ、次いで該還元型コバルト
   錯体と金属指示薬とを作用せしめ生成した有色性錯体を
   測定することを特徴とする還元性物質の定量方法。 ２、酸化型コバルト錯体及び金属指示薬を含有する還元
   性物質定量用試薬。