PT96029B - Processo para a determinacao de um analito por meio de um sal fracamente soluvel de um heteropoltacido - Google Patents

Processo para a determinacao de um analito por meio de um sal fracamente soluvel de um heteropoltacido Download PDF

Info

Publication number
PT96029B
PT96029B PT96029A PT9602990A PT96029B PT 96029 B PT96029 B PT 96029B PT 96029 A PT96029 A PT 96029A PT 9602990 A PT9602990 A PT 9602990A PT 96029 B PT96029 B PT 96029B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
heteropoly
acid
soluble salt
formation
aromatic amine
Prior art date
Application number
PT96029A
Other languages
English (en)
Other versions
PT96029A (pt
Inventor
Joachim Hoenes
Hans Wielinger
Volker Unkrig
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of PT96029A publication Critical patent/PT96029A/pt
Publication of PT96029B publication Critical patent/PT96029B/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/525—Multi-layer analytical elements
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/17—Nitrogen containing
    • Y10T436/173845—Amine and quaternary ammonium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/17—Nitrogen containing
    • Y10T436/173845—Amine and quaternary ammonium
    • Y10T436/174614—Tertiary amine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/17—Nitrogen containing
    • Y10T436/173845—Amine and quaternary ammonium
    • Y10T436/175383—Ammonia

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Description

Descrição referente à patente de invenção de BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, alemã, industrial e comercial, com sede em 6800 Mannheim 31, República Federal Alemã (inventores: Dr.Joachim Hones, Dr.Phil. Hans Wielinger e Dr.rer.nat. Volker Unkrig, residentes na República
Federal Alemã) para PROCESSO PARA A DETERMINAÇÃO DE UM ANALITO POR MEIO DE UM SAL FRACAMENTE SOLÚVEL DE UM HETEROPOLIÁCIDO
A invenção refere-se a um processo para a determinação de um analito por meio de formação de heteropoliasul bem como a um agente adequado para esse efeito. Finalmente, a invenção também se refere à utilização de um sal pouco solúvel de um heteropoliácido para a preparação de um agente para a determinação de um analito por meio da formação de heteropoliazul.
Os heteropoliácidos são poliácidos inorgânicos que têm pelo menos dois átomos centrais diferentes. Eles são obtidos a partir de oxo ácidos polibásicos de um metal como por exemplo molibdénio, tugnsténio, vanádio e um não metal como por exemplo fósforo, silício, arsénio, iodo, ferro, manganês, cobalto como anidridos parcialmente mistos.
Exemplos são o ácido fosfomolíbdico e o ácido fosfotúngstico. Os heteropoliácidos são solúveis em água. Eles são contudo, apenas estáveis em solução ácida.
Os heteropoliácidos de molibdénio e tungsténio são reagentes que já são conhecidos há muito tempo. Eles são utilizados analiticamente para determinar fosfatos e também para detectar arsénio ou silicatos por formação dos heteropoliácidos correspondentes com molibdato ou tungstato e redução posterior do heteropoliácido para um corante azul, que é designado por heteropoliazul. A cor é baseada na absorvência da luz pelos electroes das camadas de transição entre molibdénio e tungsténio pentavalentes e hexavalentes. 0 heteropoliazul dos heteropoliácidos é em cada caso um corante com uma elevada absorvência que tem um máximo de absorção muito largo que depende do comprimento de onda. Este facto é típico de bandas de absorção de transferência de cargas.
Os heteropoliácidos que podem ser utilizados para a detecção de compostos redutores por meio da formação do heteropoliazul são conhecidos. Em Spot Tests in Organic Analysis de F. Feigl, Elsevier Publishing Company, 5ã Edição, 1956, páginas 128 e 129 é afirmado que o ácido 12-molibdofosfórico é reduzido para azul de molibdénio por muitas substâncias redutoras. Dado que esta reacção de ensaio não ê específica, é recomendado que a amostra a analisar seja tornada alcalina e depois sofra extracção com éter de modo a obter-se uma certa selectividade. 0 extracto etéreo contém então principalmente bases azotadas aromáticas e substâncias neutras solúveis em éter. As substâncias ácidas permanecem dissolvidas na fase aquosa.
Sabe-se a partir de P. B. Issopoulos, Pharm. Acta Helv. 6.4. 82 (1989) que certos medicamentos que contêm uma estrutura de o-hidroquinona como por exemplo metil-dopa actuam de forma redutora no ácido molibdofosfórico
em solução de ácido sulfúrico e conduzem à formação de azul de molibdénio.
A utilização de ácido fosfotúngstico para a detecção do ácido úrico é descrita em M. L. Matheke e col., Clin. Chem. 33. 2109 - 2110 (1987). A formação com redução do azul de tungsténio serve como indicador para a presença de ácido úrico. A presença de medicamentos que actuam de forma redutora interfere com a reacção do ensaio.
Em B. Klein e col., Clin. Chem. 1.2, 816 823 (1966) refere-se á determinação de glicose no soro ou plasma que se baseia nas seguintes sequências de reacções:
A glicose é oxidada pelo hexacianoferrato de potássio (III) e em que o hexacianoferrato de potássio (II) formado actua de forma redutora no ácido fosfomolibdico e conduz à formação de azul de molibdénio. Dado que o soro e o plasma podem conter quantidades diferentes de ácido úrico, é certo que os medicamentos ou outras substâncias que actuam de forma redutora tais como, por exemplo, bilirrubina ou glutationa interferem com este método.
A principal desvantagem de todos os métodos analíticos anteriormente conhecidos que se baseiam na formação com redução do heteropoliazul a partir de heteropoliácidos é acima de tudo a não especificidade da reacção do ensaio respectivo. Muitas substâncias redutoras podem interferir dado que elas também conduzem à formação de heteropoos heteropoliácidos são apenas estáveis Este facto limita muito a sua gama de liazul. Além disso, em condições ácidas aplicações. Em particular, o acoplamento de formação de heteropoliazul para fases de reacção enzimáticas de modo a detectar-se especificaraente e determinar-se especificamente substâncias é até agora desconhecida. Os métodos enzimáticos de determinação são, contudo, frequentemente necessários, especialmente para a detecção de constituintes de fluídos do corpo como por exemplo sangue, soro, plasma e urina.
anexas que actuam neste processo e a objecto da presente invenção consiste em utilizar a formação de heteropoliazul como reacção de ensaio de determinação de algumas substâncias, em particular para substâncias nos fluídos do corpo e em particular em combinação com fases de reacção enzimáticas. As substâncias de forma redutora não devem interferir reacção de ensaio e a reacção de determinação devem dar-se a um valor de pH necessário para as reacções enzimáticas. Além disso, deve ser possível efectuar rapidamente a reacção de ensaio e a reacção de determinação.
Este objectivo é conseguido por medidas que são caracterizadas nas reivindicações.
Verificou-se que um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido pode ser utilizado com vantagem para a determinação de um analito especialmente se o analito for uma amina aromática rica em electrões ou se, juntamente com outra substância, ela conduzir a essa amina aromática.
processo de acordo com a presente invenção para a determinação de um analito por meio de formação de heteropoliazul é caracterizado por o analito ser feito reagir com uma substância que conduz à formação de uma amina aromática rica em electrões que é posta em contacto com um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido. 0 método de acordo com a presente invenção pode obviamente ser utilizado também para determinar uma amina aromática rica em electrões pondo em contacto uma solução desta amina com um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido, objectivo subjacente da invenção é também conseguido utilizando um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido para a produção de ura agente para a formação de um agente para a determinação de um analito por meio da formação de heteropoliazul.
De acordo com a presente invenção, é proporcionado um agente para a determinação de um analito por meio da formação de heteropoliazul que é caracterizado por conter uma substância que juntamente com o analito conduz à formação de uma amina aromática rica em electrões e em adição de um ácido fracamente solúvel de um heteropoliácido ou de substâncias que produzem esse sal após contacto. Se o agente de acordo com a presente invenção servir directamente para determinar uma amina aromática rica em electrões, é suficiente que ele contenha um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido ou de substâncias que produzem esse sal após contacto num meio líquido ou uma forma ligada a um veículo.
De acordo com a presente invenção pode ser utilizado um sal fracaraente solúvel de um heteropoliácido para a determinação de uma substância a analisar. No sentido da presente invenção um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido é considerado essencialmente como um sal de um heteropoliácido que não é solúvel ou que é fracamente solúvel em água, quer num meio aquoso como por exemplo um fluído tampão ou um fluído do corpo tal como, por exemplo, sangue, plasma, soro, urina ou saliva e que também permanece assim nas condições de ensaio e formação de cor. Em particular um sal de um heteropoliácido é tão fracamente solúvel que a quantidade máxima que pode ser dissolvida numa amostra líquida não será unicamente suficiente para a determinação do analito nela contido.
Foi verificado, com surpresa, que esse sal fracamente solúvel de um heteropoliácido não é apenas estável na gama de valores de pH ácido, mas também na gama neutra e básica, em particular até pH 10. Ele pode ser assim utilizado em gamas de pH em que a maior parte das enzimas são activas e portanto ele pode ser utilizado para a formação de heteropoliazul em combinação com reacções enzimáticas. Um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido é também estável a temperaturas elevadas, especialmente no estado não dissolvido. Foi demonstrado, que apesar de pouca solubili5
dade, pode ser detectada um analito e ele pode ser determinado muito rapidamente pela formação de heteropoliazul com um sal de um heteropoliácido de acordo com a presente invenção, isto é, entre um período de alguns segundos até alguns minutos. Uma determinação selectiva sem a interferência de outras substâncias que actuam de forma redutora ê possível por este meio. Isto permite utilizar um método sensível de medida que não requere especificações especiais para o instrumento de medição e pode ser facilmente seguido visualmente o que também é, em particular, devido ao máximo de absorção largo de heteropoliazul que se forma e que varia de cerca de 550 a mais de 1100 nm.
Os sais de heteropoliácidos que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção são os sais de heteropoliácido de molibdénio, molibdénio e tungsténio, vanádio e molibdénio ou vanádio e molibdénio e tungsténio sem fósforo, arsénio, silicio ou germânio como heteroátomos. Os heteropoliácidos de molibdénio com fósforo ou arsénio são os particularmente preferidos. O fósforo é especialmente preferido como átomo não metálico. 0 molibdénio é especialmente preferido como átomo metálico. Eminentemente adequados são os sais solúveis de ácido 12-molibdofosfórico, ácido 18molibdodifosfórico, o ãcido 12-molibdoarsénico, o ácido 18molibdoarsénico, o ácido 11-molibdo-1-vanadofosfórico, o ácido 10-molibdo-2-vanadofosfórico e o ácido 9-molibdo-3vanadofosfórico, em que o ácido 18-molibdodifosfórico é o particularmente preferido devido ao seu alto rendimento de coloração na redução para azul molibdénio.
Os sais fracamente solúveis de heteropoliácidos são os que contêm catiões maiores que o-ião de amónio, NH4+. Os catiões preferidos podem ser representados pela fórmula geral I 1
R1R2R3R4X+ (I)
1
em que Rl, r2, £3, R4 são iguais ou diferentes e designam um radical alquilo, arilo ou aralquilo ou hidrogénio, se os radicais não forem os mesmos ou nos dois radicais formam em conjunto um radical alquileno e X representa um átomo de fósforo ou de azoto.
Nos radicais alquilo e aralquilo designam um radical de cadeia ramificada ou de cadeia linear contendo
1-22 átomos de carbono, preferivelmente 1-6 átomos de carbono. Arilo em radicais arilo ou aralquilo designam um radical aromático com 6a 10 átomos de carbono. Fenilo ou naftilo são os particularmente preferidos .
grupo benzilo é o particularmente preferido como radical aralquilo.
Um radical alquileno é uma cadeia saturado ou insaturado de átomos de carbono composto de 4-6, preferivelmente 4 ou 5 átomos de carbono que são ligados a X em ambas as extremidades. Os catiões com a fórmula geral I podem conter como por exemplo dois radicais alquileno. Contudo, apenas está presente um radical alquileno.
X designa preferivelmente um átomo de hidrogénio na fórmula geral I. Os catióes preferidos nos sais fracamente soláveis dos heteropoliácidos podem ser também os do grupo dos compostos heterocíclicos aromáticos contendo um átomo de azoto quaternário. Exemplos são a piridina ou quinolina que contêm um radical alquilo, arilo ou aralquilo no seu átomo de azoto em que a definição desses radicais são indicadas acima para os radicais RÍ, R2, R^, r4 qUe se aplica também na fórmula I.
Um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido de acordo com a presente invenção pode ser obtido por exemplo fazendo reagir um heteropoliãcido com uma substância . básica correspondente. Para este procedimento, utiliza-se * habitualmente uma substância em solução, preferivelmente em
- 7 5
solução aquosa. Contudo, ambos os sais componentes podem ser adicionados numa forma sólida a um líquido, particularmente um líquido aquoso ou vice versa.
Um analito designa uma substância a determinar. Verificou-se que a invenção era especialmente adequada para substâncias que estão presentes dissolvidas num líquido, particularmente num líquido aquoso. Um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido pode ser utilizado particularmente para a determinação de substâncias era fluídos do corpo tal como, por exemplo, sangue, plasma, soro, urina ou saliva. Analitos possíveis neste sentido são por exemplo a glicose, colesterol, lactato, NADH ou etanol. Em princípio, todas as substâncias podem ser determinadas de acordo com a presente invenção desde que em conjunto com um ou mais compostos possam ser convertidas nessas substâncias ou que sejam elas próprias substâncias que, em relação ao seu potencial redox e em relação à sua cinética, são susceptíveis de reduzir um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido para heteropoliazul em alguns segundos até alguns minutos, preferivelmente em menos de três minutos. Verificou-se, com surpresa, que as aminas aromáticas ricas em electrões são susceptíveis de sofrerem esta reacção. Acima de tudo, verificouse com surpresa que é possível uma determinação selectiva sem a interferência de outros compostos que actuam de forma redutora.
Uma amina aromática rica em electrões deve ser entendida como um composto que é mais rico em electrões que a anilina e constitui assim um agente redutor mais forte que a anilina. As aminas aromáticas que são ricas em electrões têm um potencial redox de menos de 0,6 V, preferivelmente menos de 0,45 V em relação a um eléctrodo normal de hidrogénio. A grandeza do redox potencial isoladamente não é, contudo, decisiva. Além disso, é importante que a substância respectiva seja susceptível de reduzir rapidamente um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido para um heteropoliazul, isto é, em menos de cerca de três
minutos. Por exemplo, todos os derivados considerados como portadores de um ou mais ou/e +M tais como radicais hidroxi, alquilo, alquiltio, ariltio, amino, monoalquilamino e de anilina são substituintes +1 alcoxi, ariloxi, dialquilamino.
Os radicais alquilo, alcoxi, alquitio, monoalquilamino e dialquilamino são radicais em que o alquilo representa um radical hidrocarboneto com la 6 átomos de carbono, que podem ser ele próprio substituído por um grupo hidroxi, um grupo amino substituído, e se deseiado, uma ou várias vezes por alquilo com 1-6 átomos de carbono, POgHg, SO3H ou CO2H. Os radicais ácidos PO3H2, SO3H e CO2H podem estar presentes tal e qual ou na forma de um sal tal como um sal de amónio, de metal alcalino ou alcalino-terroso.
Os radicais ariloxi e ariltio são radicais com 1-6 átomos de carbono era que os radicais fenoxi e feniltio são os particularmente preferidos.
Os compostos devem também ser entendidos como derivados da anilina que contêm um grupo amino não substituído ou um grupo amino substituído uma ou várias veaes por um alquilo num sistema de anel aromático que é anelado com um ou mais anéis aromáticos e/ou alicíclicos. Δ este respeito, os sistemas carbono-aromático bem como os heteroaromáticos são considerados anéis aromáticos, exemplo são os anéis bensol ou naftalino anelados ou um anel de piridina anelado.
Deve entender-se que os anéis alicíclicos são cicloalifáticos saturados ou insaturados com 5-7 átomos de carbono, preferivelmente 5 ou 6 átomos de carbono.
Possíveis substituintes de alquilo do grupo amino podem ser redicais hidrocarboneto com 1-6 átomos de carbono que por sua vez podem ser substituídos por um grupo hidroxi, um grupo amino substituído, e se desejado, uma ou várias vezes por um grupo alquilo com 1-6 átomos de
carbono, PO3H2, SO3H e COgH. Os radicais ácidos PO3H2, SO3H e CO2H podem estar presentes quer na forma de um sal tal como por exemplo, sais amónio, de metais alcalinos ou alcalinoterrosos .
As aminas aromáticas particularmente adequadas ricas em electrões são compostos com a fórmula geral II,
Κξ_ (II) P5_Z \-N/RÍ R Λ_Λ Ί?7 em que:
R5 designa hidroxi ou grupo amino é substituído, se desejado, uma um radical alquilo, e o radical alquilo é amino, em que o ou duas vezes por ele próprio substituído, se desejado, por grupo hidroxi, um grupo amino substituído, e se desejado, uma ou várias vezes por alquilo, PO3H2, SO3H ou O2H;
R6 e R7 são iguais ou diferentes e representam hidrogénio ou alquilo, em que o radical alquilo é substituído, se desejado, por um grupo hidroxi, um grupo amino substituído, e se desejado, uma ou várias vezes por alquilo, PO3H2, SO3H e CO2H e
R8, Rl° e Rn são iguais ou diferente e designam hidrogénio, alquilo, alcoxi, alquiltio, ariloxi, ariltio, halogéneo, carboxi, carboxialquilo ou alcoxicarbonilo.
Os radicais alquilo e alquilo em radicais alquitio, carboxialquilo, e alcoxicarbonilo são radicais
hidrocarboneto com 1-6 átomos de carbono. Os radicais com 1-3 átomos de carbono são os particularmente preferidos.
Os radicais alcoxi são também radicais hidrocarboneto com 1-6 átomos de carbono. Os radicais com 1-3 átomos de carbono são os particularmente preferidos. Os radicais ariloxi e ariltio são radicais com 1-10 átomos de carbono, em que os radicais fenoxi e feniltio são os particularmente preferidos. Halogéneo designa flúor, cloro, bromo ou iodo. 0 cloro e o bromo são os substituintes de halogéneo preferidos.
Os radicais ácidos PO3H2, SO3H ou CO2H podem estar presentes tal e qual ou sob a forma de um sal como por exemplo de amónio, de metal alcalino ou de metal alcalino-terroso .
Os sais de amónio são aqueles que contêm o ião amónio, NHzf*·, ou os que contém um catião de amónio substítuido uma ou várias vezes por radicais alquilo, arilo ou aralquilo. Os radicais alquilo em alquilo e aralquilo representam um radical hidrocarboneto com 1-6 átomos de carbono. Os radicais arilo em arilo e aralquilo são um sistema em anel aromático consistindo em 6-10 átomos de carbono, em que o fenilo é o preferido. Um radical aralquilo preferido é o radical benzilo.
Os sais alcalinos são preferivelmente os sais de lítio, sódio ou potássio. Os sais alcalino-terrosos sao preferivelmente os sais de magnésio ou de cálcio.
As aminas aromáticas ricas em electrões podem ser determinadas directamente com um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido pela formação de heteropoliazul. As substâncias podem também ser determinadas por meio de uma reacção química ou ensimática que converte uma substância adicional numa amina aromática rica em electrões de forma estequiométrica. Essas substâncias podem ser utilizadas
por exemplo como reagente que já contém o esqueleto de uma amina aromática rica em electrões e que podem ser libertadas delas por uma reacção química ou enzimática com o analito a determinar. Esses compostos devem ser preferivelmente entendidos como aqueles que por hidrólise conduzem a uma amina aromática rica em electrões. As amidas, ésteres ou glicósidos de aminas aromáticas ricas em electrões podem mencionadas como exemplos. Os analitos que podem ser determinados desta forma são preferivelmente enzimas que catalisam a conversão de substratos adequados em aminas aromáticas ricas em electrões, em particular hidrolases tais como enzimas que clivam as ligações de amida e/ou ligações de péptido, enzimas que clivam as ligações de éster, quer sejam ligações de ácido carboxílico, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, e enzimas que clivam ligações glicosídicas, e em adição transferases que catalisam a transferência de grupos, tais como, por exemplo Γ-glutamiltransferase.
Além disso, as substâncias podem por exemplo ser determinadas por oxidação enzimática, e esses compostos são utilizados como aceitantes de electrões que produzem aminas aromáticas ricas em electrões. Conhecem-se várias oxidorredutases, especialmente para substâncias em fluídos do corpo, como por exemplo sangue, plasma, soro, urina ou saliva, em que cada uma reconhece especificamente certas substâncias e que oxidam essas substâncias na presença de um aceitante de electrões activo.
As oxidases dependentes de flavina tais como por exemplo L- e D-aminoácido oxidase, colesterol oxidase, glicose oxidase, glicerol-3-fosfato oxidase, lactato oxidase ou piruvato oxidase e desidrogenases não dependentes de NAD(P) como por exemplo desidrogenases de glicose dependente de pirroloquinolina-quinona ou também diaforase (NADH : corante oxidorredutase) podem ser mencionados como exemplos.
No caso de oxidorredutases, em particular oxidases e desidrogenases não dependentes de NAD(P), podem ser utilizados aceitantes de electrões para oxidações enzimáticas para reduzir uma amina aromática rica em electrões pela oxidação enzimática de substrato de enzima. Desta forma, estas substâncias que são oxidadas enzimaticamente, podem ser detectadas e determinadas por formação de heteropoliazul levando a amina aromática rica em electrões em contacto com o sal fracaraente solúvel de um heteropoliácido.
A este respeito, os compostos aceitantes de electrões que são vantajosos no âmbito da presente invenção são, em particular, compostos de nitroso aromático, oximas e hidroxilaminas. Os compostos nitroso aromáticos e as oximas são os particularmente preferidos. Estes compostos nitroso e oximas são descritos no Pedido de Patente Europeia EP-A-0354 441 e são os particularmente preferidos.
Para efectuar a determinação de um analito pela formação de heteropoliazul de acordo com a presente invenção é suficiente fazer reagir o analito com uma substância de entre aquelas que foram acima descritas, para converter numa amina aromática rica em electrões e levá-la ao contacto com um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido. Se a amina aromática rica em electrões for ela própria a substância a analisar que se pretende determinar directamente, ela é levada ao contacto com um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido sem as reacções químicas ou enzimáticas anteriores.
Como regra, pelo menos uma amina aromática rica em electrões que actua no sal do heteropoliácido está presente numa forma solúvel, preferivelmente em solução aquosa, como por exemplo, água, tampão ou fluído do corpo. Se o analito que se pretende determinar fôr ele próprio uma amina aromática rica em electrões, então o composto que juntamente com o analito é necessário para produzir uma amina aromática rica em electrões é preferivelmente também solúvel
numa solução aquosa de um líquido. Ele pode ser adicionado à amostra antes do contacto com o sal fracamente solúvel de um heteropoliácido. Ele pode também, contudo, ser levado em primeiro lugar ao contacto com a amostra a ser examinada em conjunto com o sal fracamente solúvel de um heteropoliácido ou ele pode ser mesmo levado ao contacto numa fase final. A ordem escolhida depende do caso individual e pode ser decidida pelo especialista com base nos seus conhecimentos técnicos e por algumas experiências de optimização. A substância necessária para produzir uma amina aromática rica em electrões pode ser adicionada a uma amostra aquosa numa forma sólida ou na forma dissolvida.
A substância que juntamente com o analito produz uma amina aromática rica em electrões deve ser levada ao contacto com a amostra numa quantidade que seja suficientemente grande para que todo o analito possa reagir. É preferivelmente utilizado um excesso de 2 a 10 vezes.
O sal fracamente solúvel de um heteropoliácido pode ser levado ao contacto como substância sólida com a amostra a examinar. Ele pode, contudo, estar também presente sob a forma de uma suspensão num fluído, preferivelmente num fluído aquoso, em que a suspensão é em seguida misturada com a amostra a examinar de modo a efectuar a determinação . Quando o analito a determinar está presente forma-se o heteropoliazul que é fracamente solúvel em água e que pode ser detectado por meio da sua côr intensa. Para efectuar uma determinação quantitativa é possível separar o heteropoliazul, que é fracamente solúvel em água, e o sal de heteropoliácido não reagido do líquido, por exemplo por centrifugação, e pósteriormente dissolvido num solvente adequado, como por exemplo sulfóxido de dimetileno, e medir a concentração de heteropoliazul por meios fotométricôs com a ajuda de soluções padrão ou curvas de calibração, e se desejado determinar assim finalmente a concentração da substância a analisar.
ss^^feR« - —
sal fracamente solúvel de um heteropoliácido deve estar presente numa quantidade suficientemente grande para que a amina aromática rica em electrões presente na amostra, ou que é formada, conduza à formação de um heteropoliazul que possa ser quantitativamente relacionado com a quantidade de substância a analisar ou amina aromática rica em electrões. Em princípio, a quantidade de um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido utilizado deve ser tal que com o aumento da quantidade de amina conduza a um aumento da quantidade de heteropoliazul até à concentração mais elevada relevante da amina aromática rica em electrões.
Um agente de acordo com a presente invenção para a determinação de um analito por formação de heteropoliazul contém uma substância que juntamente com o analito conduz a uma amina aromática rica em electrões e contém também um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido. Esse agente pode ser utilizado por exemplo como suspensão ou na forma de um liofiliaado, mistura de pós ou pode ser prensado para se obter um comprimido. Os contituintes podem estar presentes próximos uns dos outros ou separados, e cada um dos constituintes pode ser processado na sua forma mais adequada. É também possível que um agente de acordo com a presente invenção não contenha um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido que seja fácil de utilizar mas que contenha era vez disso separadamente os componentes necessários para preparar esse sal, isto é, por exemplo um heteropoliácido e um composto catiónico ou básico, em que ambos são em primeiro lugar levados ao contacto imediatamente antes da reacção de determinação de acordo com a presente invenção e em seguida se obtém o sal correspondente. É particularmente vantajoso que o agente de acordo com a presente invenção contenha um sal fracamente solúvel de um heteropoliácido numa forma finamente dispersa de modo a ter uma grande superfície reactiva. Se desejado, o agente de acordo com a presente invenção pode também conter outros reagentes como por exemplo, tampões e outros agentes auxiliares como, por exemplo agentes molhantes, estabilizantes, cargas, etc. Se a substância a analisar
já for uma amina aromática rica em electrões não é necessário obviamente uma substância para o agente de acordo com a presente invenção que juntamente com a substância a analisar, conduz em primeiro lugar à formação de uma amina aromática rica em electrões.
A determinação de um analito de acordo com a presente invenção pode ser efectuada de modo vantajosamente particular num denominado ensaio a seco. Os dispositivos que são adequados para efectuar o ensaio a seco são conhecidos por exemplo de EP-A-0 016 387, DE-A-32 47 608, EP-A-0 262 445 ou EP-A-0 256 806. Eles podem ser designados como veículos de ensaio. Neste caso os reagentes necessários para efectuar o ensaio estão presentes numa forma seca, isto é, não dissolvidos num líquido, como por exemplo num material absorvente tal como por exemplo, papel, uma película aberta de acordo com EP-A-0 016 387, uma rede de fibra de vidro ou uma membrana plástica porosa para mencionar apenas alguns materiais possíveis, ou um material susceptível de sofrer expansão, como por exemplo, uma película de plástico, gelatinas ou celuloses correspondentes.
Quando a amostra de fluído é aplicada ao veículo de ensaio ou o veículo de ensaio é deitado no fluído da amostra forma-se uma solução líquida no veículo de ensaio no qual decorrerá a reacção. A formação de cor provocada pela reacção pode ser avaliada visualmente ou fotometricamente por exemplo, por meio de fotometria de reflexão.
Para produzir o agente de acordo com a presente invenção numa forma ligada a um veículo adequado como por exemplo papel de filtro, celulose ou rede de fibra plástica é impregnado com soluções e/ou suspensões dos reagentes necessários para a produção de veículos de ensaio em solventes muito voláteis, como por exemplo, água, metanol, etanol, e acetona. Isto pode ser efectuado numa fase de impregnação. Ê muitas vezes aconselhável efectuar a impregnação em várias fases em que as soluções ou suspensões •FWWSÍSÍWSSÍ
são utilizadas contendo parte dos constituintes do agente final. Assim, por exemplo, o sal fracamente solúvel de um heteropoliácido pode ser aplicado ao material veículo a partir de uma suspensão numa primeira fase e numa segunda fase a substância que juntamente com o analito conduz a uma amina aromática rica em electroes é aplicada a partir de uma solução que, se desejada, contêm tampão e outros aditivos. 0 material do veículo tratado desta forma pode ser utilizado tal e qual ou pode ser colado a suportes ou em folhas de plástico rígidas de forma conhecida de modo a facilitar o manuseamento.
Em vez de uma impregnação múltipla da mesma substância veiculo, os reagentes do agente de acordo com a presente invenção podem também ser distribuídos em diferentes substâncias veículo que, quando efectuam a determinação de um analito, são levados a um contacto que permite uma permuta de fluídos.
Como alternativa à impregnação para a produção de agentes de ensaio ligados a veículos, podem ser preparadas soluções a partir de formadores de película, isto é, a partir de polímeros ou de dispersões de polímeros que são tão viscosos que as películas podem ser produzidas a partir deles de acordo com processos conhecidos tais como revestimento com a navalha, revestimento com o rolo, etc. Os reagente e, se desejado, substâncias tampão e agentes auxiliares são integrados nestas soluções. As massas de revestimento são aplicadas a folhas veículo, secas e as películas finais são, por exemplo, processadas para se obterem tiras de ensaio.
Exemplos de veículos de ensaio preferidos são os apresentados nas figuras 1 e 6. As outras figuras 25 e 7 mostram diagramas da dependência da reflexão em percentagem no tempo, comprimento de onda, ou concentração de analito que foram obtidas utilizando os veículos de ensaio de acordo com a Figura 1 ou Figura 6.
Pormenores das figuras:
Fig. 1: mostra uma secção através de um veículo de ensaio preferido.
Fig. 2: é um diagrama que mostra a dependência da reflexão em percentagem do tempo em segundos após a aplicação da amostra a um veículo de ensaio de acordo com a Fig. 1 para as amostras a) - f) possuindo cada uma, uma concentração diferente de glicose.
Fig. 3: é uma Figura que mostra a dependência da reflexão em percentagem do comprimento de onda em nanometros para as amostras a) - f) que possuem concentrações diferentes de glicose quando se utiliza um veículo de ensaio de acordo com a Figura 1.
Fig. 4: é um diagrama que mostra a dependência da reflexão em percentagem da concentração de glicose quando medida com um veículo de ensaio de acordo com a Figura 1.
Fig. 5: é um diagrama que mostra a dependência da reflexão em percentagem da concentração de NADH quando medida com um veículo de ensaio de acordo com a Figura 1.
Fig. 6: é uma secção através do veículo de ensaio preferido adicional.
Fig. 7: é um diagrama que mostra a dependência da reflexão em percentagem da concentração de etanol quando medida com um veículo de ensaio de acordo com a Figura 6.
Os seguintes exemplos mostram algumas das variantes possíveis do processo para a determinação de um analito por formação de heteropoliazul. Eles não pretendem representar uma limitação da invenção a estas realizações. As figuras são ainda melhor compreendidas nos exemplos seguintes .
Exemplo 1
Prepara-se um veículo de ensaio de acordo com a Figura 1. Ele consiste numa película de poliéster com a espessura de 350 μιη (Melinex, ICI, Francoforte, República Federal da Alemanha) como película de veículo (1) e com as medidas de 2 x 3 cm. Existe um furo com o diâmetro de 6 mm no centro da folha de veículo. O veículo reagente (6) consistindo numa folha transparente de policarbonato cora a espessura de 200 Mm (5) (Pokalon, Lonza, Rheinfelden, República Federal da Alemanha), uma primeira camada de reagente (4) e uma segunda camada de reagente (3) que se montam sobre o furo na película veículo utilizando um adesivo de transferência (2) de forma a que uma amostra líquida aplicada através deste furo entre em primeiro lugar em contacto com a segunda camada reagente. 0 veículo reagente mede 2 x 1 cm.
veículo reagente (6) é produzido da forma seguinte:
Primeira camada reagente:
113 g de água re-destilada,
36,3 g de 2% em peso de xantano (Keltrol F, Kelco, Oklahoma, Estados Unidos da América) em tampão de citrato 0,2 M, pH de 7,0 g de Propiofan 70 D (BASF, Ludwigshafen, República Federal da Alemanha) ml de 15% em peso de nonilsulfato de sódio em água g de polivinilpirrolidona (Kollidon 25, BASF, Ludwigshafen, República Federal da Alemanha)
3,9 g de cloreto de tetrabutilamónio g de ácido 18-molibdodifosfórico (preparado de acordo com G. Brauer, Handbuch der praparativen anorganischen Chemie, Publisher Enke, Estugarda, 1954) em 15 g de água g de Celatom MW 25 (Eagle Picher, Cincinnati, Ohio, Estados Unidos da América) que são agitados para se obter uma massa homogénea e que é revestida com navalha até uma espessura de 150 um na folha transparente (5). Ela é seca durante uma hora a 60 °C.
Segunda camada reagente:
g de água re-destilada, g de dióxido de titânio RN 56 (Kronos-Titan GmbH, Leverkusen, República Federal da Alemanha)
36,3 g de 2% em peso de Keltrol F (Kelco, Oklahoma, Estados Unidos da América) era tampão de citrato 0,2 M, pH de 6,0 g de Propiofan 70 D (BASF, Ludwigshafen, República Federal da Alemanha) ml de 15% em peso de nonilsulfato de sódio em água g de Kollidon 25 (BASF, Ludwigshafen, República Federal da Alemanha)
188 g de àgua g de Celatom MW 25 (Eagle-Picher, Cincinnati, Ohio, Estados Unidos da América)
400 mg de Ν,Ν-bis-(2-hidroxietilk)-p-nitrosoanilina x HC1 em 20 g de água •r
(200 U/rol) em 12 g de água g de glicose oxidase que são agitados para se obter uma massa homogénea que é revestida com navalha até uma espessura de 400 um sobre a primeira camada reagente. São removidas as bolhas de ar por sopragem moderada e o revestimento é seco durante uma hora a 60°C.
Na altura t=0, aplica-se plasma humano com a) 0 mg de glicose/dl, b) 47,5 mg de glicose/dl, c) 108,7 mg de glicose/dl, d) 200,8 mg de glicose/dl, e) 392,3 mg de glicose/dl e f) 766 mg de glicose/dl a um veiculo de ensaio acima referida. A remissão A primeira medida é feita medidas adicionais em inseparado que é produzido da forma em percentagem é medida a 950 nm passados 8 segundos e são feitas tervalos de 4 segundos. Obtem-se um diagrama de acordo com a Figura 2 apresentando a remissão (R) em percentagem em função do tempo (t). A formação de cor e a diminuição da remissão é já quase completa na altura da primeira medida. Obtem-se assim um ponto final estável que pode ser medido a qualquer altura após o início.
A Figura 3 é obtida quando as amostras com uma concentração de glicose de a) 0 mg/dl, b) 100 mg/dl,
c) 240 mg/dl e d) 800 mg/dl, são medidas com um veículo de ensaio de acordo com a Figura 1, produzido da forma acima descrita, para diferentes comprimentos de onda e a remissão (R) era percentagem é representada graficamente em função do comprimento de onda (λ ) em nm num diagrama. Os espectros neste diagrama mostram claramente que qualquer comprimento de onda entre 550 nm ou mais do que 1100 nm pode ser utilizado para medir a concentração de glicose. Como resultado do espectro relativamente plano, a tolerância para as variações do comprimento de onda é muito elevada,
Exemplo......2
As substâncias de interferência referidas na Tabela 1 são adicionadas nas concentrações apresentadas ao plasma humano com a) 0 mg de glicose/dl (Cqiuc=0) e b) 110 mg de glicose/dl (Cq]_uc=110 mg/dl). Se esse plasma humano for examinado com um veículo de ensaio de acordo com a Figura 1, que é fabricado como descrito no Exemplo 1, então os valores de remissão em percentagem (% R) para 660 nm são os referidos na Tabela 1.
Substância Interferente Concentração Final CGluc^0 % R cGluc=110 mg/dl % R
Nenhuma 0 60.3 43.0
(referência)
NaOH 1 mM 59.9 42.5
Acido úrico 10 mg/dl 59.5 42.4
20 mg/dl 60.1 42.4
Lactato 100 mg/dl 59.7 43.2
300 mg/dl 60.2 42.8
Bilirrubina 10 mg/dl 60 .0 42.7
20 mg/dl 61.5 43.0
Glutationa 1 mM 59.3 43.0
5 mM 59.4 43.8
Metildopa 10 mg/dl 59.5 43.1
100 mg/dl 59.0 42.1
Dobesilato 20 mg/dl 59.4 41.8
Ácido gentisico 50 mg/dl 59.6 43.0
Aspirina 5 mg/dl 59.9 42.1
60 mg/dl 60 .0 42.0
te
^-^ucaKcnsuwKUS ‘J
Não se encontram interferências significativas no plasma humano (0 e 110 mg/dl) independentes da concentração de glicose.
Os resultados obtidos utilizando veículos de ensaio de acordo com a Figura 1, que é produzido de acordo com o Exemplo 1 e é idêntico ao veículo de ensaio descrito nesse exemplo com a excepção da utilização de cloreto de tetrabutilamónio que é omitido no veículo de referência, mostra uma grande dispersão e uma fraca reprodutibilidade dado que o ácido 18-molibdodifosfórico utilizado se decompõe para valores de pH superiores a 5,5. Além disso, as„substâncias redutoras interferem aqui com uma formação adicional de côr.
Exemp.LQ„.j
2si<2JAla_j&SL_j^ ___çiai!Lhâjsem.em_12r„ ms2it!d..Q£Q..s£â±.õ.
Se o ácido 18-molibdodifosfórico na formulação do Exemplo 1 for substituído pela mesma quantidade do ácido 12-molibdofosfórico (Fluka, Buchs, Suíça) obtem-se um veículo de ensaio que apresenta uma formação mais moderada de côr na presença de glicose e que é particularmente bem adquado para concentrações de glicose superiores. A curva de acordo com a Figura 4 é obtida utilizando amostras de concentrações diferentes mas conhecidas de glicose (C) e medindo a remissão respectiva (E) em percentagem a 850 nm. É obtida uma curva idêntica se for medida a 950 nm.
São obtidos resultados semelhantes com 12-molibdoarsenato (V), 18-molibdodiarsenato (V), 11-molibdo1-vanadofosfato, 10-molibdo-2-vanadofosfato e 9-molibdo-3vanadofosfato que podem ser todos preparados de acordo com G. Brauer, Handbuch der praparativen anorganischen Chemie, Publisher Enke, Estugarda (1954). Os nomes e fórmulas dos heteropoliácidos bem como os máximos de absorvência do hete23 -
ropoliasul corespondente são apresentados na Tabela 2 seguinte .
Tahala......2.
Heteropoliazul de heteropoliácidos diferentes
Substância de partida Fórmula Máximo de absorção do heteropoliazul
ácido 12-molibdofosf órico Η3(ΡΜοΐ2θ40) x n H2O 725 nra
18-molibdodifosfato de sódio Nag(P2M018θ62) χ42Η2θ 693 nm
12-molibdoarsenato de potássio (V) K3(AsMo]_2°40 x n ^20 840a ou 652nmb
18-molibdodiarsenato de sódio (V) Na θ (As 2M0 2.8θ 6 2 3H2O 672 nm
ácido 11-molibdo-1-vanadofosfórico H4(PMonVO40) x n H20 665 nm
ácido 10-molibdo-2-vanadofosfórico H5(PMoιο^2θ4Ο) x ηΗ2θ 620 nm
ácido 9-molibdo-3-vanadofosfórico Η6<ΡΜθ9ν3θ20) χ n 780 nm
a : pequena quantidade de agente redutor (glicose) b : grande quantidade de agente redutor (glicose)
E.x.emp.l..Q.—4
Sê.ÍQ.U.ls.......dâ......SJTSãÃQ......^^ formulação do de diaforase, de NAD(P)H. A concentrações percentagem a
Se a glicose oxidase na Exemplo 1 for substituída pela mesma quantidade
é obtido um veículo de ensaio para a detecção
curva da F igura 5 1* e obtida com amostras de
conhecidas de NADH e a medida da reacção em
880nm. Esta curva pode servir como curva de calibraçao para a determinação de concentrações desconhecidas de NADH.
Os processos para a formação de NAD(P)H a partir de desidrogenase dependente de NAD(P), um substrato correspondente e NAD(P) são conhecidos. Assim, após uma reacção preliminar adequada, o veiculo de ensaio de NADH pode ser utilizado para detectar os substratos de desidrogenase ou pode efectuar as próprias desidrogenases.
Ε.χβ.ιπρ.ΧΩ..______5.
_____......ds._________
a) Preparação do veículo de ensaio ê
Preparação de um veículo de ensaio de acordo com a Figura 6. Este veículo de ensaio é produzido de modo a que o sistema indicador seja feito de uma suspensão homogénea consistindo de ml 0.2 M de tampão de citrato, pH 6.0 ml de 10% em peso de nonilsulfato de sódio em água 60 mg de tartarazina
0.1 g de N, N-bis-(2-hiároxietil)-p-nitrosoanilina x HCL
6.8 ml de 20% em peso de ácido 18-molibdodifosfórico em água 1 g de 25% em peso de cloreto de tetraetilamónio em água g de 5% em peso de Kollidon 25 (BASF, Ludwigshafen, República Federal da Alemanha) em tampão citrato 50mM, pH 6.0 que é impregnado num papel de absorção (Langfaser, Schoeller, Germsbach, Republica Federal da Alemanha) e pósteriormente seco a 40°G durante 30 minutos.
As enzimas são incorporadas num papel separado (Langfaser, Schoeller, Germsbach, República Federal da Alemanha). 0 papel é impregnado com uma solução de g de Ό.2 M tampão fosfato, pH 7.0 g de água ml de 10% em peso de nonisulfato de sódio em água g de diaforase (15 U/ml liofilisado) g álcool desidrogenase (250 U/m liofilisado), e pósteriormente seco a 40 °C durante 20 minutos. O papel indicador (13) e o papel de enzima (12) produzido deste modo é cortado em tiras de dimensão de 14 x 6 mm.
Uma rede de fibra de vidro com 16 mm de comprimento, 6 mm de largura e 0,25 mm de espessura com ura peso superficial de 25 g/m^ que serve como rede de transporte (14), uma rede de fibra de vidro com 6 mm de largura, 6mm de comprimento e 700 um de espessura com um peso superficial de 60 g/m^ que serve como rede para separar os eritrócitos (15), bem como uma trama protectora (16) feita em Scrynel PE280HC red^ (Zuricher Beuteltuchfabrik AB, Ruschlikon, Suíça), medindo 6x8 mm e tendo um tamanho de partícula de 280 um são fixados a uma folha de poliéster com uma espessura de 350 um, comprimento de 9,8 cm e uma largura de 0,6 cm (Melinex, ICI, Francoforte, República Federal da Alemanha) por meio de uma tira adesiva de fixação a quente (18) como é indicado na Figura 6. 0 papel de enzima (12) e o papel indicador (13) são fixados à folha de veículo (17) juntamente com uma folha de policarbonato transparente com a espessura de 200 um, 15 mm de comprimento e 6 mm de largura (Pokalon, Lonza, Rheínfelden, República Federal da Alemanha) (11) por meio de uma gota de adesivo de curva quente (19) de forma a que (11), ((12) e (13) não entrem em contacto com o outro, mas sejam levados a contacto por pressão bem como um contacto líquido com um líquido situado na rede de transporte (14).
b) Determinação do etanol
Aplicam-se 32 jul de sangue à rede protectora (16) do veículo de ensaio preparado segundo a) de acordo com a Figura 6. Passados 60 segundos, o papel de enzima (12) e o papel indicador (13) são prensados na rede de transporte (14) utilizando a sente. Passados 120 segundos centagem a 642 nm através pressão, e no soro nele preé medida a remissão em perda folha transparente (11).
Utilizando concentrações conhecidas, mas diferentes, de etanol no sangue é obtida uma curva de acordo com a Figura 7. Esta curva pode servir como curva de calibração para a determinação de concentrações desconhecidas de etanol numa amostra.
(EC 3.2.1.23)
São preparadas as seguintes soluções:
Tampão : 0,1 M Hepes, 20 mM de cloreto de magnésio, pH 6,8
Substrato : 50 nM de p-aminofenil-8-galactósido (preparado a partir de p-nitrofenil-B-D-galactósido por hidratação com hidrogénio em Pd-carbono de acordo com Organikum, VEB Deutscher Verlag der Wissenschften, 15ã edição, Berlim 1976) em água.
Neutralizador: solução 1 N de hidróxido de sódio
Indicador: 100 mg/ml de ácido 18-molibdodifosfórico e 50 mg/ml de cloreto de fenil-trimetilamónio em água
Enzima: 180 U/ml em tampão (a actividade da enzima referida esta relacionada com a utilização de o—nitrofenol galactosido como substrato)
São misturadas as seguintes substâncias num vaso da reacção para o ensaio:
tampão 780 μΐ indicador 100 μ.1 neutralizador 20 μΐ substrato 100 μΐ enzima........a) 0, b) 1 μΐ, c) 2 μΐ, d) 3μ1,
e) 4 μΐ, f) 5 μΐ
Passados 4,5 minutos de incubação centrifuga-se durante 0,5 minutos, despeja-se o sobrenadante, o sedimento é dissolvido em 1 ml de sulfóxido de dimetilo e a absorvência (A) é medida imediatamente. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 3.
T..a±LÇ_l.a_.a
μΐ de enzima U/ml de enzima A (800 nm)
0 0 0 .065
1 0.18 0.571
2 0.36 1.245
3 0.54 1.697
4 0.72 2.350
5 0.90 2.907
A curva de calibração derivada destes valores pode ser utilizada para determinar o teor de Bgalactósido em amostras desconhecidas.
-E..X.e.IRP_lQ—..7
Na formulação do Exemplo 6 utiliza-se o fosfato de p-aminofenilo 50 mM (preperado de acordo com L. H. De Riemer, C. F. Meares, Biochemistry 20, 1606 (1981) como substrato e dietanolamina 1M, cloreto de magnésio 1 M, cloreto de zinco 0,1 mM, pH 9,8 como tampão, e em seguida a enzima de fosfatase alcalina pode ser determinada com estes reagentes. Utilizando concentrações conhecidas de enzimas, deterraina-se uma relação linear entre a concentração de enzimas e a absorvância a 800 nm da forma indicada no Exemplo 6.
(ec 2.3.2.2)
Foi preparado um veículo de ensaio da forma análoga à referida no Exemplo 1, que, contudo, tem as seguintes alterações:
Na segunda camada de reagente o tampão (2% em peso de Keltrol F em tampão de citrato 0,2 M, pH 6,0) é substituído por 2% em peso de Keltrol F em água, N,N-bis(2-hidroxietil)-p-nitrosoanilina x HC1 e omite-se a glicose oxidase. Em seguida impregna-se um papel com substrato que é produzido da forma a seguir descrita entre o adesivo de transferência (2) e a segunda camada reagente (3):
É impregnado um papel de saco para chá (12 g/m2) com uma solução de 250 mM de glicilglicina e 20 mM de ^-L-glutamil-3-carboxil-l, 4-fenilenodiamina (preparada de acordo com EP-A-0 103 823) em tampão Tris 250 mM, pH 7,6 e seca-se durante 20 minutos a 50°C.
transferase em tampão Tris 0,1 M contendo 10 mg/ml de albumina de soro de bovino, pH 7,5. Aplicam-se 10 μΐ desta solução a um veículo de ensaio preparado da forma acima descrita. Passado 1 minuto medem-se os valores de remissão em percentagem a 37°C e 950 nm referidos na Tabela 4.
Concentração de enzimas Remissão a 950 nm U/ml em %
0 59.0
0.245 57.0
0.471 55.5
1.31 52.7
2.77 49.7
4.93 45.8
7.39 42.2
9.85 39.0
A curva obtida desta forma pode ser utilizada para determinar a concentração desconhecida de glutamiltransferase em líquidos .
E.X.SJ5BP..Lq_..9.
(EC 3...1.3.2)
Em analogia com o Exemplo 8 é obtido um veículo de ensaio para a detecção de fosfatase ácida a partir de papel de embalagem para chá impregnado com 10 mM de pamino-fenilfosfato (preparado de acordo com L.H. De Riemer,
C.F. Meares, Biochemistry .2..0., 1606 (1981) em 0,1 M de tampão de citrato, pH 5,0.

Claims (1)

  1. - lã Processo para a determinação de uma substância a analizar por formação de heteropoliazul caracterizado por se fazer reagir a substância a analisar com uma substância que conduz à formação de uma amina aromática rica em electrões que se faz reagir com um sal pouco solúvel de um heteropoliácido.
    -2ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar um sal pouco solúvel de um heteropoliácido de molibdénio e tungsténio, vanádio e molibdénio ou vanádio e molibdénio e tungsténio com fósforo, arsénio, silício ou germânio como heteroátomo.
    - 3ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 2, caracterizado por se utilizar um sal pouco solúvel de um heteropoliácido cujo catião ê maior que ião de amónio.
    - 4ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se utilizar um sal pouco solúvel de um heteropoliácido com um catião com a fórmula geral (I) na qual RÍ, R^, R^, r45 sâo iguais ou diferentes e representam um radical alquilo, arilo ou aral31 quilo ou hidrogénio, os radicais forem todos iguais, ou em dois radicais formam em conjunto um radical alquileno e X representa um átomo de fósforo ou de azoto .
    - 5ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado por se utilizar um sal com um catião do grupo de heteroaromáticos como sal pouco solúvel de um heteropoliácido.
    - 6ã Processo para a determinação de uma amina aromática rica em electrões por formação de heteropoliazul, caracterizado por se fazer reagir uma solução de amina aromática rica em electrões que se pretende determinar com um sal pouco solúvel de um heteropoliácido.
    A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 2 de Dezembro de 1989, sob o n2 P 39 40 010.7.
    Lisboa, 29 de Novembro de 1990
PT96029A 1989-12-02 1990-11-29 Processo para a determinacao de um analito por meio de um sal fracamente soluvel de um heteropoltacido PT96029B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3940010A DE3940010A1 (de) 1989-12-02 1989-12-02 Verwendung eines schwer loeslichen salzes einer heteropolysaeure zur bestimmung eines analyts, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignetes mittel

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT96029A PT96029A (pt) 1991-09-13
PT96029B true PT96029B (pt) 1998-02-27

Family

ID=6394747

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT96029A PT96029B (pt) 1989-12-02 1990-11-29 Processo para a determinacao de um analito por meio de um sal fracamente soluvel de um heteropoltacido

Country Status (26)

Country Link
US (3) US5240860A (pt)
EP (1) EP0431456B1 (pt)
JP (1) JPH0687790B2 (pt)
KR (1) KR950001124B1 (pt)
CN (1) CN1030735C (pt)
AT (1) ATE118552T1 (pt)
AU (1) AU628688B2 (pt)
CA (1) CA2031238C (pt)
CZ (1) CZ284677B6 (pt)
DE (2) DE3940010A1 (pt)
DK (1) DK0431456T3 (pt)
ES (1) ES2069661T3 (pt)
FI (1) FI98569C (pt)
GR (1) GR3015363T3 (pt)
HU (1) HU212120B (pt)
IE (1) IE65537B1 (pt)
IL (1) IL96473A (pt)
MX (1) MX23524A (pt)
NO (1) NO300244B1 (pt)
NZ (1) NZ236249A (pt)
PL (1) PL166907B1 (pt)
PT (1) PT96029B (pt)
RU (1) RU2052819C1 (pt)
SK (1) SK280136B6 (pt)
YU (1) YU227790A (pt)
ZA (1) ZA909625B (pt)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3940010A1 (de) * 1989-12-02 1991-06-06 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung eines schwer loeslichen salzes einer heteropolysaeure zur bestimmung eines analyts, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignetes mittel
DE4311460A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels Benzylalkoholdehydrogenase und einem chromogenen Redoxindikator
DE4311464A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mit einer PQQ-abhängigen Dehydrogenase
DE4338811A1 (de) * 1993-11-15 1995-05-18 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung von Teststreifen zur Bestimmung der UV-Intensität oder zur Vorbestimmung der sonnenbrandfreien Aufenthaltsdauer in der Sonne sowie hierfür geeignetes Testsystem und Teststreifenpackung
US5696193A (en) * 1994-04-25 1997-12-09 Clinical Diagnostic Systems, Inc. Immunoassay elements comprising polymers containing vandium IV (V+4) ions
US5601997A (en) 1995-02-03 1997-02-11 Tchao; Ruy Chemotaxis assay procedure
US6719988B2 (en) 1997-02-21 2004-04-13 The Regents Of The University Of California Antiseptic compositions for inactivating prions
US6720355B2 (en) * 1997-02-21 2004-04-13 The Regents Of The University Of California Sodium dodecyl sulfate compositions for inactivating prions
US20060008494A1 (en) * 1997-02-21 2006-01-12 The Regents Of The University Of California Complete inactivation of infectious proteins
US6620629B1 (en) 1997-02-21 2003-09-16 The Regents Of The University Of California Method for detecting prions
US6617119B2 (en) 1997-02-21 2003-09-09 The Regents Of The University Of California Assay for specific strains of multiple disease related conformations of a protein
US6221614B1 (en) * 1997-02-21 2001-04-24 The Regents Of The University Of California Removal of prions from blood, plasma and other liquids
US6121050A (en) * 1997-08-29 2000-09-19 Han; Chi-Neng Arthur Analyte detection systems
KR20010031258A (ko) * 1998-08-21 2001-04-16 요시다 쇼지 콘택트 렌즈용 제제
KR100311854B1 (ko) * 1998-10-29 2001-12-28 신한길 지하수자동관측시스템
DE19945828B4 (de) 1999-09-24 2011-06-01 Roche Diagnostics Gmbh Analysenelement und Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Flüssigkeit
US6645359B1 (en) * 2000-10-06 2003-11-11 Roche Diagnostics Corporation Biosensor
ATE335435T1 (de) 2001-06-08 2006-09-15 Hoffmann La Roche Entnahmevorrichtung für körperflüssigkeiten und testmedienskassette
US6659966B2 (en) 2001-11-15 2003-12-09 Roche Diagnostics Corporation Fluid sampling apparatus
DE10163775A1 (de) 2001-12-22 2003-07-03 Roche Diagnostics Gmbh Analysensystem zur Bestimmung einer Analytkonzentration unter Berücksichtigung von proben- und analytunabhängigen Lichtintensitätsänderungen
US6759190B2 (en) * 2002-06-15 2004-07-06 Acon Laboratories, Inc. Test strip for detection of analyte and methods of use
US7572237B2 (en) * 2002-11-06 2009-08-11 Abbott Diabetes Care Inc. Automatic biological analyte testing meter with integrated lancing device and methods of use
DE10303265A1 (de) 2003-01-28 2004-07-29 Roche Diagnostics Gmbh Fluorimetrische Bestimmung von Analyten durch ein intramolekulares Quencher-Fluorophor-Konjugat
DE10304448A1 (de) 2003-02-04 2004-08-12 Roche Diagnostics Gmbh Fluorimetrische Bestimmung von Analyten durch Amin-N-Oxide als Redoxindikatoren
DE10346863A1 (de) * 2003-10-09 2005-05-04 Roche Diagnostics Gmbh On-Board-Kontrolle für Analyseelemente
ATE553213T1 (de) 2004-12-13 2012-04-15 Bayer Healthcare Llc Zusammensetzungen mit eigener grössenbegrenzung sowie testvorrichtungen zur messung von analyten in biologischen flüssigkeiten
EP1853598B1 (en) 2005-03-01 2012-11-21 Life Technologies Corporation Chemical probe compounds that become fluorescent upon reduction, and methods for their use
WO2006107914A2 (en) * 2005-04-04 2006-10-12 Facet Technologies, Llc Narrow-profile lancing device
US7955484B2 (en) * 2005-12-14 2011-06-07 Nova Biomedical Corporation Glucose biosensor and method
US8008068B2 (en) * 2008-02-29 2011-08-30 Light Pointe Medical, Inc. Nonhemolytic optical sensor with enhanced reflectance
US20090219509A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-03 Hiroshi Nomura Optical sensor with enhanced reflectance
PL2936124T3 (pl) 2012-12-20 2017-08-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Sposoby oceniania medycznych krzywych pomiarowych
CA2884919C (en) 2012-12-20 2021-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for analyzing a sample of a body fluid
EP2781919A1 (en) 2013-03-19 2014-09-24 Roche Diagniostics GmbH Method / device for generating a corrected value of an analyte concentration in a sample of a body fluid
WO2016003683A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 3M Innovative Properties Company Photochromic articles containing polyoxometalate derivatives and methods of making same
EP3161103A1 (en) 2014-06-30 2017-05-03 3M Innovative Properties Company Photochromic articles containing a polyoxometalate and methods of making same
CN106573910B (zh) 2014-08-22 2020-08-28 豪夫迈·罗氏有限公司 氧化还原指示剂
JP2019529935A (ja) 2016-10-05 2019-10-17 エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト 多検体診断用試験エレメントのための検出試薬および電極配置、ならびにそれらを使用する方法
EP3339431A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 Roche Diabetes Care GmbH Glucose dehydrogenase variants with improved properties
CN111801425B (zh) 2018-02-28 2024-02-23 豪夫迈·罗氏有限公司 用于连续分析物测量的生物相容性涂层
CN108508064B (zh) * 2018-03-22 2020-08-14 中国科学院上海硅酸盐研究所 文物表面可溶盐含量的检测设备
CN109394782B (zh) * 2018-12-03 2020-10-20 中北大学 胆固醇衍生物改性多钼氧簇杂化物及其制备和应用
CN110813339A (zh) * 2019-11-29 2020-02-21 吉林师范大学 一种缺陷杂多蓝/TiO2复合可见光合成氨催化剂的制备方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT630626A (pt) * 1959-05-15
JPS5637050A (en) * 1979-09-04 1981-04-10 Ube Ind Ltd Preparation of catalyst for preparing unsaturated acid
JPS5963198A (ja) * 1982-10-01 1984-04-10 Toyo Jozo Co Ltd 酵素を用いる定量法
US4935346A (en) * 1986-08-13 1990-06-19 Lifescan, Inc. Minimum procedure system for the determination of analytes
DE3630999A1 (de) * 1986-09-12 1988-03-17 Boehringer Mannheim Gmbh Mehrschichtiger testtraeger
US4952495A (en) * 1987-06-08 1990-08-28 Eastman Kodak Company Hydrolyzable compounds which release electron transfer agents and analytical use of same
DE3826922A1 (de) * 1988-08-09 1990-02-22 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur kolorimetrischen bestimmung eines analyten mittels enzymatischer oxidation
DE3940010A1 (de) * 1989-12-02 1991-06-06 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung eines schwer loeslichen salzes einer heteropolysaeure zur bestimmung eines analyts, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignetes mittel

Also Published As

Publication number Publication date
IL96473A0 (en) 1991-08-16
NZ236249A (en) 1993-02-25
CN1030735C (zh) 1996-01-17
HU908021D0 (en) 1991-06-28
KR910012717A (ko) 1991-08-08
NO905202D0 (no) 1990-11-30
FI905925A0 (fi) 1990-11-30
DE59008475D1 (de) 1995-03-23
ES2069661T3 (es) 1995-05-16
IL96473A (en) 1995-03-15
AU628688B2 (en) 1992-09-17
HUT56631A (en) 1991-09-30
FI98569C (fi) 1997-07-10
PL166907B1 (pl) 1995-07-31
NO300244B1 (no) 1997-04-28
IE904317A1 (en) 1991-06-05
CS593690A3 (en) 1992-03-18
US5240860A (en) 1993-08-31
GR3015363T3 (en) 1995-06-30
EP0431456B1 (de) 1995-02-15
RU2052819C1 (ru) 1996-01-20
US5382523A (en) 1995-01-17
CN1052376A (zh) 1991-06-19
HU212120B (en) 1996-02-28
EP0431456A1 (de) 1991-06-12
DE3940010A1 (de) 1991-06-06
MX23524A (es) 1993-10-01
US5521060A (en) 1996-05-28
NO905202L (no) 1991-06-03
CA2031238A1 (en) 1991-06-03
FI905925A (fi) 1991-06-03
SK280136B6 (sk) 1999-08-06
DK0431456T3 (da) 1995-07-17
KR950001124B1 (ko) 1995-02-11
IE65537B1 (en) 1995-11-01
ATE118552T1 (de) 1995-03-15
FI98569B (fi) 1997-03-27
AU6694990A (en) 1991-06-06
ZA909625B (en) 1991-10-30
CZ284677B6 (cs) 1999-01-13
JPH03191799A (ja) 1991-08-21
CA2031238C (en) 1995-10-24
PT96029A (pt) 1991-09-13
YU227790A (sh) 1992-12-21
JPH0687790B2 (ja) 1994-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT96029B (pt) Processo para a determinacao de um analito por meio de um sal fracamente soluvel de um heteropoltacido
KR920001449B1 (ko) 효소적산화에 의한 검체의 비색적 측정방법 및 시약
ES2357664T3 (es) Quinonas como mediadores de ensayos fotométricos.
US5126247A (en) Method, system and devices for the assay and detection of biochemical molecules
EP1312922B1 (en) Stabilized tetrazolium reagent compositions with nitrite and methods for using the same
KR20030041809A (ko) 안정화된 테트라졸륨-페나진 시약 조성물 및 이의 사용방법
US4940660A (en) Color developing method in clinical examinations
JPH0734757B2 (ja) グルコースの定量のための分析法、分析用試薬組成物及びその使用
Moore et al. Enzymically amplified voltammetric sensor for microliter sample volumes of salicylate
JPH0334920B2 (pt)
JPS6249040B2 (pt)
JPH0550275B2 (pt)
EP0317070A2 (en) Digital colorimetric quantitative assay system
AU754237B2 (en) Uric acid assay device with stabilized uricase reagent composition
JP2005118014A (ja) 分析方法およびそれに用いる試薬
JP3889834B2 (ja) 還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬およびそれを用いた測定方法並びに測定用試験片
Ivison et al. Development of a redox mediated amperometric detection system for immunoassay. Application to urinary amphetamine screening
KR20160138085A (ko) 가교연결에 의한 고 하중 효소 고정화
EP3531120A1 (en) Oxidizing agent for electron mediator
CA1206077A (en) Sensitive enzymatic creatinine assay
JPS62285799A (ja) 体液に含有される成分の測定方法およびそれに用いる試薬
JPH08160049A (ja) カリウムイオン測定用試薬組成物および試験片

Legal Events

Date Code Title Description
BB1A Laying open of patent application

Effective date: 19910410

FG3A Patent granted, date of granting

Effective date: 19971106

MM4A Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent

Free format text: MAXIMUM VALIDITY LIMIT REACHED

Effective date: 20121106