KR20160138085A - 가교연결에 의한 고 하중 효소 고정화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가교-연결 반응이 일어나기에 적합한 조건 하에서 용액 중에 가교-연결제 및 폴리펩티드 분자를 조합하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법 및 상기 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 폴리펩티드 분자가 적어도 40 개의 인접 원자를 포함하는 본질적으로 비분지형 가교-연결기에 의해 가교-연결된, 가교-연결된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 산화환원 조인자, 산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제, 및 지시 시약을 포함하는 시험 화학 매트릭스로서, 상기 화학 매트릭스가 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자, 뿐 아니라 상기 시험 화학 매트릭스를 포함하는 진단 시험 요소를 추가로 포함하는 시험 화학 매트릭스에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 질환 진단에 사용하기 위한 및 당뇨병 진단에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자 뿐 아니라, 시험 화학 매트릭스의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

가교연결에 의한 고 하중 효소 고정화 {HIGH LOAD ENZYME IMMOBILISATION BY CROSSLINKING}
본 발명은 가교-연결 반응이 일어나기에 적합한 조건 하에서 용액 중에 가교-연결제 및 폴리펩티드 분자를 조합하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법 및 상기 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 폴리펩티드 분자가 적어도 40 개의 인접 원자를 포함하는 본질적으로 비분지형 가교-연결기에 의해 가교-연결된, 가교-연결된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 산화환원 조인자, 산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제, 및 지시 시약을 포함하는 시험 화학 매트릭스로서, 상기 화학 매트릭스가 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자, 뿐 아니라 상기 시험 화학 매트릭스를 포함하는 진단 시험 요소를 추가로 포함하는 시험 화학 매트릭스에 관한 것이다. 본 발명은 질환 진단에 사용하기 위한 및 당뇨병 진단에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자 뿐 아니라, 시험 화학 매트릭스의 제조 방법에 관한 것이다.
효소 고정화는 화학 합성에 사용되는 효소의 재활용, 취급의 편리성 (예를 들어, 생성물로부터의 분리), 및 고정화된 효소 제제의 향상된 안정성 (Sheldon (2007), Adv Synth Catal 349:1289 에서 리뷰됨) 을 가능하게 한다는 양상 하에서 당업계에서 조사되어 왔다. 따라서, 효소를 고체 입자에 커플링하는 것, 효소를 가교연결하는 것, 효소 캡시드화 (encapsidation), 또는 고체 매트릭스 내의 효소의 고정화 (Meth Biotechnol Nr. 22: Immobilization of Enzymes and Cells, 2nd ed., J.M. Guisan (ed), Humana press) 를 포함하여, 효소를 고정하는 여러 방법이 종래 기술에 기재되어 있다. 가교-연결을 위해서는, 효소를 결정화시킨 다음 가교-연결하여, 가교-연결된 효소 결정 (CLEC) 을 생성하거나; 또는 효소를 침전시키고 침전물을 처리하여, 가교-연결된 효소 응집물 (CLEAs®) (Sheldon (2007), op. cit.) 을 제공한다. 가교연결제로서, 글루타르알데히드는 일반적으로 선택 작용제이다. 그러나, 글루타르알데히드는 많은 효소가 가교-연결 동안 비활성화된다는 단점이 있고, 이것은 글루타르알데히드 분자의 작은 크기로 인한 것이고, 이것은 단백질 분자 내로 관통하여 효소의 활성에 중요한 아미노산을 비활성화시킨다고 생각된다 (Sheldon (2007) op. cit.). 따라서, 덱스트란 폴리알데히드가 예를 들어, 니트릴라아제 및 페니실린 G (Penicillin G) 아실라아제에 대해 제시된 글루타르알데히드와 비교하여 개선된, 대안적인 가교-연결제 (Mateo et al. (2004), Biotech Bioeng 86(3):273) 로서 제안되었다.
진단 시험 요소는 통상 환자-근처 적용에서 사용하도기 위해 제조된다. 따라서, 요소는 최급 및 저장에 대해 강해야만 한다. 이것은, 특히, 시험 요소의 시험 화학을 위해 적용한다. (참고, Hones 2008, Diabetes Technology & Therapeutics 10: S10). 그러나, 많은 진단 시험 요소는 시험 요소 상에 존재하는 다소 복잡한 효소 시험 화학에 기반한다. 특히, 시험 요소는 운반체 및 검출 층을 포함하고, 상기 검출 층은 통상 효소를 함유한다. 이것은 상기 효소가 저장 동안 그리고 처리 시 생물학적 활성으로 남아있는 시험 요소의 적합한 기능을 위해 결정적이다. 개별 측정에 대한 보정이 통상 가능하지 않으므로, 시험 요소는 보통 보정된 배치-방식이다. 시험 요소의 배치에 대한 보정 정보가 저장되고, 처리 및 저장에서의 개별 차이와 관계없이 배치의 각 요소에 대해 사용된다.
그러나, 시험 요소 및 저장 조건의 전처리는 효소의 활성에 심각하게 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 시험 요소의 제조 동안 또는 저장 동안의 열 처리가, 시험 요소 상에 존재하는 전반적인 효소 활성이 상당히 감소되고, 이것이 그러한 시험 요소가 사용될 때 잘못된 시험 결과를 산출할 방식으로 효소를 변성시킬 수 있다. 유사하게, 검출 층, 효소 및 검출 층의 다른 성분 중의 물 함량을 증가시키면 확산되는 경향이 있을 것이고, 이것이 시험 화학의 1 개 초과의 층을 포함하는 시험 요소에서 특정한 문제이다. 상기 문제는 시험 스트립이 연장된 시간 동안 환경 조건에 노출되는 적용, 예를 들어, "개방 바이알" 적용에서 또는 시험 스트립이 카트리지 내에 제공되는 적용에서 특히 두드러진다. 따라서, 이러한 시험 스트립에 포함되는 효소는 하전된 입자, 예를 들어, Transpafil 에 흡수되었다. 그러나, 이러한 고정화 방법은 질량 기준으로 계산된 바와 같은, 고정된 효소의 특이적 활성을 심각하게 희석한다는 단점을 가지고, 이것은 차례로, 면적 당 필요한 효소 활성을 제공하도록 층 두께의 증가를 필요하게 만든다. 층 두께에서의 이러한 증가는 차례로, 통상 층 내로의 분석물의 느린 확산으로 인해 증가된 반응 시간을 야기하고, 증가된 시험 시간이 필요하다는 것을 의미한다.
따라서, 폴리펩티드의 고정화 개선을 위한 수단 및 방법에 대해 당업계의 필요성이 있다. 특히, 질량 당 특이적 활성의 강한 희석을 피하는 효소의 고정화 방법 및/또는 미세하게 분산가능한 응집체의 형태로의 효소의 고정화 방법이 필요하다.
상기 기재된 과제는 독립항의 특징을 가진 수단 및 방법에 의해 해결된다. 고립된 방식으로 또는 임의의 무작위 조합으로 실현될 것인 바람직한 구현예가 종속항에 열거된다.
따라서, 본 발명은 가교-연결 반응이 일어나기에 적합한 조건 하에서 용액 중에 가교-연결제 및 폴리펩티드 분자를 조합하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법에 관한 것이다.
하기에서 사용되는 바와 같은, 용어 "~ 를 갖는다", "~ 를 포함한다" 또는 "~ 가 포함된다" 또는 이의 임의의 무작위적 문법적 변형은 비-배제적 방식으로 사용된다. 그러므로, 이들 용어는 상기 용어에 의해 도입된 특징 외에, 추가의 특징이 본 문맥에 기재된 전체에 존재하지 않는 상황 및 하나 이상의 추가의 특징이 존재하는 상황 둘 다를 말할 수 있다. 예로서, 표현 "A 가 B 를 갖는다", "A 가 B 를 포함한다" 및 "A 에 B 가 포함된다" 는 B 외에, 다른 요소가 A 에 존재하지 않는 상황 (즉, A 가 단독으로 또는 오로지 B 로 이루어지는 상황) 및 B 외에, 하나 이상의 추가의 요소가 부분 A 내에, 예컨대 요소 C, 요소 C 및 D 또는 심지어 추가의 요소가 존재하는 상황 둘 다를 말할 수 있다.
추가로, 하기에서 사용되는 바와 같은, 용어 "바람직하게는", "더욱 바람직하게는", "더욱 바람직하게는", "특히", "더욱 특히", "구체적으로", "더욱 구체적으로" 또는 유사한 용어는 대안적인 가능성을 제한하지 않으면서, 임의의 특징과 함께 사용된다. 그러므로, 상기 용어에 의해 도입되는 특징은 임의의 특징이고, 청구 범위를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은, 당업자가 인지할 것 같이, 대안적인 특징을 사용함으로써 수행될 수 있다. 유사하게는, "본 발명의 구현예에서" 또는 유사한 표현에 의해 도입되는 특징은 본 발명의 대안적인 구현예와 관련하여 임의의 제한 없이, 본 발명의 범주와 관련하여 임의의 제한 없이 그리고 본 발명의 기타 임의의 또는 비-임의의 특징과 함께 그러한 식으로 도입되는 특징의 조합 가능성과 관련하여 임의의 제한 없이, 임의의 특징인 것으로 의도된다.
본 발명의 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법은 시험관 내 방법이다. 게다가, 이것은 상기 명시적으로 언급된 것 외의 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 단계는 가교-연결 및/또는 가교-연결 단계 후 과잉 시약 및/또는 원치 않는 부산물의 제거 전에, 예를 들어, 폴리펩티드를 정제하는 것과 관련될 수 있다. 게다가, 하나 이상의 상기 단계는 자동화 장비에 의해 수행될 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 는 당업자에게 공지되어 있고, 다수의 펩티드 결합을 포함하는 화학적 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 펩티드 결합은 아미노산 사이에서 형성된다. 아미노산은 바람직하게는, 알파-아미노산이고, 더욱 바람직하게는 L-알파-아미노산이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 상호연결된 적어도 5 개의 아미노산을 포함하고; 더욱 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 상호연결된 적어도 25 개의 아미노산을 포함하고; 가장 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 상호연결된 적어도 100 개의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 시험관 내 펩티드 합성, 즉, 당업자에게 공지된 방법 중 하나에 따른 화학 합성에 의해 합성된 폴리펩티드이다. 더욱 바람직하게는, 폴리펩티드는 시험관 내 단백질 생합성에 의해 합성된 폴리펩티드이다. 가장 바람직하게는, 폴리펩티드는 생체 내 단백질 생합성에 의해, 즉, 살아있는 세포에서 합성된 폴리펩티드이다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 그 자체의 촉매 활성이 없는 폴리펩티드, 예를 들어, 세포 수용체, 면역글로불린, 또는 이의 일부이다. 더욱 바람직하게는, 폴리펩티드는 촉매 활성을 갖는 폴리펩티드이다, 즉, 폴리펩티드는 효소이다. 당업자는 폴리펩티드 제제의 순도가 일반적으로 100% 미만이라는 것으로 이해한다. 따라서, 폴리펩티드 분자의 적어도 일부가 각각의 효소 활성을 갖는 분자; 더욱 바람직하게는, 폴리펩티드 분자의 적어도 80% 가 각각의 효소 활성을 갖는 분자; 가장 바람직하게는, 폴리펩티드 분자의 적어도 90% 가 각각의 효소 활성을 갖는 분자인 것이 바람직하다.
바람직하게는, 효소는 데히드로게나아제이거나 또는 데히드로게나아제 또는 옥시도리덕타아제를 포함한다. 용어 "데히드로게나아제" 는 본원에서 사용되는 바와 같이, 히드라이드 (H-) 를 1-단계-기작을 또는 H+ / e- 를 2-단계-기작으로 산화환원 등가물로서, 본원의 그 밖에 언급되는 바와 같은 이의 산화환원 조인자에 대해 또는 이로부터 이동시킴으로써 기질의 산화 또는 환원을 촉매화할 수 있는 효소를 말한다. 바람직하게는, 데히드로게나아제는 히드라이드 (H-) 를 산화환원 등가물로서 수용기 분자, 바람직하게는, 본원의 그 밖에 언급되는 바와 같은 산화환원 조인자에 대해 이동시킴으로써 기질의 산화를 촉매화할 수 있는 폴리펩티드이다. 본 발명에 의해 구상되는 데히드로게나아제는 바람직하게는, 산화환원 조인자 (또는 종종 조-효소로서 언급됨) 에 의존하는 것들, 예컨대 피롤로 퀴놀린 퀴논 (PQQ), 티코틴아미드-아데닌-디뉴클레오티드 (NAD) 또는 이의 유도체, 또는 플라빈 조인자, 예컨대 플라빈-아데닌-디뉴클레오티드 (FAD) 또는 플라빈 모노뉴클레오티드 (FMN) 이다. 바람직한 데히드로게나아제는 특히, 락테이트 데히드로게나아제 (EC number 1.1.1.27 또는 1.1.1.28), 글루코오스 데히드로게나아제 (하기 참고), 알코올 데히드로게나아제 (EC number EC number 1.1.1.1 또는 1.1.1.2), L-아미노산 데히드로게나아제 (EC number 1.4.1.5), 글리세린 데히드로게나아제 (EC number 1.1.1.6), 말레에이트 데히드로게나아제 (EC number 1.1.1.37), 3-히드록시부티레이트 데히드로게나아제 (EC number 1.1.1.30), 소르비톨 데히드로게나아제 (EC number 1.1.1.14), 또는 콜레스테롤 데히드로게나아제이다.
더욱 바람직하게는, 데히드로게나아제는 글루코오스 데히드로게나아제이다. 가장 바람직하게는, 상기 글루코오스 데히드로게나아제는: 글루코오스 데히드로게나아제 (EC number 1.1.1.47), 퀴노단백질 글루코오스 데히드로게나아제 (EC number 1.1.5.2), 특히, 피롤로 퀴놀린 퀴논 (PQQ)-의존성 글루코오스 데히드로게나아제 (EC number 1.1.5.2), 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제 (EC number 1.1.1.49), 티코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD)-의존성 글루코오스 데히드로게나아제 (EC number 1.1.1.119) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD)-의존성 글루코오스 데히드로게나아제 (EC number 1.1.99.10) 또는 이의 효소적으로 활성인 돌연변이체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
상기 언급된 효소의 효소적으로 활성인 돌연변이체는 이전에 언급된 바와 같은 종래 기술에서 상기 언급된 야생형 효소에 대해 보고된 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산을 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 수득될 수 있다. 바람직한 돌연변이체는 US 7,132,270 또는 US 7,547,535 에 기재된 바와 같은 이들의 야생형 대응부와 비교하여, 개선된 기질 특이성을 갖는 PQQ-의존성 글루코오스 데히드로게나아제의 돌연변이체이다. 추가의 돌연변이체는 Baik et al (Baik 2005, Appl Environ Microbiol 71: 3285), Vasquez-Figuera et al. (Vasquez-Figuera 2007, Chem BioChem 8: 2295), 및 WO 2005/045016 에 기재된 것들이다. 본 발명에 따라 바람직한 것은 본원에 참고로서 인용된, 적어도 아미노산 위치 96, 170 및/또는 252 에서 돌연변이를 갖는 WO2009/103540A1 (p.21) 또는 EP1660648 에 기재된, 글루코오스 데히드로게나아제 (E.C. 1.1.1.47) 돌연변이체이다. 상기 아미노산 위치에서 구상되는 바람직한 돌연변이는 Glu96Gly, Glu170Arg 또는 Lys 및/또는 Lys252Leu 의 치환이며, 조합 Glu170Lys / Lys252Leu 이 더욱 바람직하다. 가장 바람직하게는, 상기 돌연변이는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 로부터의 글루코오스 데히드로게나아제 중의 돌연변이 Glu170Arg 및 Gln252Leu ("GlucDH E170K/Q252L", 또한 실시예에서 "GlucDH2" 로서 언급됨) 이다.
용어 "가교-연결" 은 본원에서 사용되는 바와 같이, 중개 가교-연결기를 통해 2 개의 폴리펩티드 분자를 공유적으로 상호연결하는 것에 관한 것이다. 원칙적으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법으로, 비-동일한 유형의 폴리펩티드 분자 (혼합된 가교-연결) 를 가교-연결하는 것, 예를 들어, 화학적 반응 순서의 상이한 단계를 촉매화하는 효소 분자를 가교-연결하는 것이 가능하다. 비-제한적인 예로서, 글루코오스 데히드로게나아제 및 디아포라아제가 본원에 기재된 가교-연결 반응에서 조합될 수 있다. 당업자에게는 혼합된 가교-연결은 원칙적으로 폴리펩티드 분자의 2 개의 비-동일한 유형에 제한되지 않으나, 폴리펩티드 분자의 2 개 초과의 유형을 함유할 수 있다는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 그러나, 동일한 분자 종류의 폴리펩티드 분자가 가교-연결된다.
용어 "가교-연결제" 는 적합한 조건 하에서 가교-연결되어지는 폴리펩티드 분자와 공유 결합을 형성하는 반응성 화학기를 포함하는 화학 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 가교-연결제는 적어도 40 개의 원자, 더욱 바람직하게는 적어도 50 개의 원자, 가장 바람직하게는 적어도 65 개의 원자의 인접 사슬을 포함한다. 바람직하게는, 가교-연결제는 적어도 2 개의 반응성 화학기를 포함하고; 더욱 바람직하게는, 가교-연결제는 정확하게 2 개의 반응성 화학기를 포함한다. 당업자는 반응성 화학기 중 적어도 2 개가 상기 2 개의 반응성 화학기가 가교-연결되어지는 2 개의 상이한 폴리펩티드 분자를 연결하도록 하는 그러한 식으로 공간적으로 배열되는 것으로 이해한다. 바람직하게는, 가교-연결제 및/또는 가교-연결기는 본질적으로 비분지형 분자이다, 즉, 가교-연결제 및/또는 가교-연결기는 10% 미만의 분지점을 구성하는 원자를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 가교-연결제는 비분지형 분자이다. 더 더욱 바람직하게는, 가교-연결제는 각 말단에 하기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 반응성 화학기를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (비스-활성화된 PEG) 이다. 가장 바람직하게는, 가교-연결제는 비스-N-히드록시-숙신이미드 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (O,O'-비스[2-(N-숙신이미딜-숙시닐아미노)에틸] 폴리에틸렌 글리콜) 이다. 상기로부터 가교-연결기가 반응성 화학기 중 적어도 2 개가 가교-연결 반응을 겪은 후 남아있는 가교-연결제의 백본이라는 것이 명백하다.
바람직하게는, 가교-연결제는 0.6 kDa 내지 20 kDa, 더욱 바람직하게는 0.9 kDa 내지 10 kDa, 더 더욱 바람직하게는 1 kDa 내지 5 kDa, 가장 바람직하게는 3 kDa 의 분자 질량을 갖는다.
용어 "반응성 화학기" 는 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드에 존재하는 원자의 기, 바람직하게는 아미노산 측쇄와 반응하여 적합한 조건 하에서 공유 결합을 형성하는 화학기에 관한 것이다. 바람직하게는, 반응성 화학기는 상기 폴리펩티드의 변성을 일으키지 않는 조건 하에서 폴리펩티드에 존재하는 원자의 기와 반응하는 화학기이다. 바람직하게는, 변성을 일으키지 않는 상기 조건은 생리학적 조건, 더욱 바람직하게는 적합한 용매 중의 25℃, 100 kPa 이다. 적합한 반응성 화학기는 당업계에 공지되고, 바람직하게는, 시아네이트 에스테르, 에폭시드, 이소시아네이트, 이미데이트, 티오이미데이트 및, 더욱 바람직하게는, N-히드록시-숙신이미드 기를 포함한다.
용어 "용액 중의" 는 본원에서 사용되는 바와 같이, 화학적 화합물이 균질 혼합물로 액체 중에 존재하는, 화학적 화합물 (용질) 이 용매 중에 용해되는 상태에 관한 것이다. 따라서, 바람직한 용매는 본 발명의 폴리펩티드가 변성 및/또는 침전을 일으키지 않도록 하는 용매이다. 당업자는 제공된 폴리펩티드에 대해 적합한 용매를 선택하는 방법을 알고 있다; 예를 들어 짧은 폴리펩티드는 극성 유기 용매, 예를 들어, DMSO 에 용해될 수 있다. 바람직하게는 50 개 초과의 아미노산을 포함하는 더 긴 폴리펩티드는, 전형적으로 수용액에 가장 잘 용해된다. 따라서, 바람직하게는, 용액은 수용액이다. 바람직하게는, 용액은 7 내지 9, 바람직하게는 7.5 내지 8.8, 더욱 바람직하게는 8.3 ± 1, 가장 바람직하게는 8.3 의 pH 를 갖는 완충용액이다. 바람직한 완충제는 가교-연결제의 반응성 화학기와 반응하지 않는 완충제이다. 더욱 바람직하게는, 완충제는 Na- 및/또는 K-포스페이트 완충제, 가장 바람직하게는 0.1 M K-포스페이트-완충제이다. 당업자는 특정 폴리펩티드가 용액으로 유지되기 위해서는 용매 내에 부가적인 성분, 예를 들어, 1원자가 및/또는 2원자가 양이온, 조인자, 기질 또는 기질들, 및/또는 세제를 필요로 할 수 있다는 것을 이해한다.
당업자는 "가교-연결 반응이 일어나기에 적합한 조건" 의 선택이 가교-연결제 및 특히 그곳에 포함되는 화학적으로 반응성인 기 뿐 아니라, 특정 유형의 폴리펩티드에 따라 다르다는 것을 이해하고, 그에 따라서 조건을 선택하는 것을 알고 있다. 바람직한 조건은 본원의 다른 곳에 기재된다. 바람직하게는, 폴리펩티드 분자는 0.1 mM 내지 5 mM, 바람직하게는 0.3 mM 내지 4 mM, 더욱 바람직하게는 2.5 ± 1 mM 의 초기 농도로 용액 중에 존재한다. 또한 바람직하게는, 가교연결제 / 폴리펩티드 분자의 몰 비는 0.2 내지 5, 바람직하게는 0.5 내지 4, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 3, 가장 바람직하게는 1 내지 2 이다. 바람직하게는, 용액 중에서 가교-연결제 및 폴리펩티드 분자를 조합하는 것은 가교-연결제의 폴리펩티드 분자를 포함하는 용액에의 적가를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 조합은 추가로 폴리펩티드 분자를 포함하는 상기 용액의 진탕을 포함한다. 바람직하게는, 가교-연결제는 폴리펩티드 용액에 첨가하기 전에, 유기 용매, 더욱 바람직하게는 양립성 유기 용매에 용해된다. 당업자는 양립성 유기 용매가 바람직하게는 가교-연결제와 반응하지 않도록, 반응 혼합물에 존재하는 최종 농도에서 폴리펩티드를 비활성화시키거나 변성시키지 않도록, 그리고 가교-연결제를 용해하도록 선택된다는 것을 이해한다. 바람직하게는, 유기 용매는 무수 (water-free) 이다. 더욱 바람직하게는, 유기 용매는 디메틸술폭시드 (DMSO) 이다. 가장 바람직하게는, 유기 용매는 무수 DMSO 이다.
유리하게는, 및 예상치 않게, 폴리펩티드 분자가 용액 중에서 효과적으로, 즉, 폴리펩티드를 침전시킬 필요 없이 가교-연결될 수 있다는 것을 본 발명의 근본적인 연구에서 발견하였다. 상기 방법은 특히 침전에 의해 비활성되는 효소 및 침전 후 재-용해되기 어려운 폴리펩티드에 대해 유리하다. 게다가, 본 발명의 방법에 따라 수득된 가교-연결된 폴리펩티드가 시험 화학 매트릭스의 제조에 특별히 매우 적합한데, 이것은 가교-연결된 폴리펩티드가 한편으로는 매트릭스 층 또는 층들을 통한 확산을 현저하게 감소시키기에 충분히 크고, 다른 한편으로는 화학 매트릭스에 대한 폴리펩티드의 양호한 분산을 위해서는 충분히 작기 때문이라는 것이 발견되었다. 추가로, 본 발명에 따른 효소의 가교-연결에 의해, 고-분자량 중합체와의 가교-연결의 결과인 특이적 활성의 희석이 현저하게 감소될 수 있다는 것이 발견되었다.
상기 정의는 하기에 준용된다. 추가로 하기에 있는 부가적인 정의 및 설명은 또한 본 명세서에서 기재되는 모든 구현예에 대해 준용된다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법에 의해 수득가능한, 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법에 의해 수득가능한 제제에 포함되는 가교-연결된 폴리펩티드 분자는 평균 5 - 50 개의 폴리펩티드 분자, 더욱 바람직하게는 10 내지 40 개의 폴리펩티드 분자, 및 가장 바람직하게는 15 내지 25 개의 폴리펩티드 분자를 포함하는 공유 응집체에 포함된다. 따라서, 예를 들어, 1 x 102 kDa 의 분자 질량을 가진 폴리펩티드의 경우에, 가교-연결된 폴리펩티드 분자는, 바람직하게는, 5 x 102 kDa 내지 5 x 103 kDa, 더욱 바람직하게는 1 x 103 kDa 내지 4 x 103 kDa, 또는, 가장 바람직하게는, 1.5 x 103 kDa 내지 2.5 x 103 kDa 의 겉보기 분자 질량을 가진 공유 응집체 내에 포함된다.
바람직하게는, 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제의 질량 당 특이적 활성은 가교-연결 전 폴리펩티드의 특이적 활성의 적어도 50% 이다. 더욱 바람직하게는, 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제의 질량 당 특이적 활성은 가교-연결 전 폴리펩티드의 특이적 활성의 적어도 60% 이다. 가장 바람직하게는, 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제의 질량 당 특이적 활성은 가교-연결 전 폴리펩티드의 특이적 활성의 적어도 70% 이다.
게다가, 본 발명은 폴리펩티드 분자가 적어도 40 개의 인접 원자를 포함하는 본질적으로 비분지된 가교-연결기에 의해 가교-연결된 가교-연결된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다.
바람직하게는, 가교-연결된 폴리펩티드 분자는 상기 본원에 명시된 바와 같이 가교-연결기에 의해 가교-연결된다. 또한 바람직하게는, 가교-연결된 폴리펩티드 분자는 상기 본원에 또한 명시된 바와 같이 응집체에 포함된다.
추가로, 본 발명은 산화환원 조인자, 산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제, 및 지시 시약을 포함하는 시험 화학 매트릭스로서, 상기 화학 매트릭스가 본 발명의 폴리펩티드 분자 가교-연결 방법 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자에 의해 수득가능한 가교-연결된 효소를 추가로 포함하는 시험 화학 매트릭스에 관한 것이다.
용어 "매트릭스" 는 본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에 명시된 바와 같은 화합물을 포함하는 혼합물에 관한 것이다. 당업자는 조성물이 하기 본원에 명시된 바와 같은 성분을 포함하여, 부가적인 성분, 예를 들어, 바람직하게는, 완충제 성분 (예를 들어, 포스페이트 완충 식염수, Tris 완충제, 시트레이트 완충제, 글리세린 포스페이트 완충제, 또는 Good's 완충제) 또는 기타 염, 세제 등을 포함할 수 있다고 이해한다. 또한 당업자는 본 발명의 매트릭스가 비균질 혼합물, 예를 들어 분산액 또는 혼합물일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 매트릭스는 건조 조성물이다. 용어 "건조 조성물" 은 본원에서 사용되는 바와 같이, 조성물에 본질적으로 용매 또는 용매의 혼합물이 없다는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 본질적으로 없다는 것은 조성물의 용액 또는 분산액에 본래 존재하고 있던 용매 또는 용매 혼합물의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 가 조성물로부터 제거되었다는 것을 의미한다. 따라서, 바람직하게는, 용매 또는 용매 혼합물이 본 발명의 건조 조성물에 5% 이하, 바람직하게는 2% 이하, 더욱 바람직하게는 1% 이하, 또는 가장 바람직하게는, 1% 미만의 양으로 존재한다고 구상된다. 더욱 바람직하게는, 건조 조성물은 5% 이하, 바람직하게는 2% 이하, 더욱 바람직하게는 1% 이하, 또는, 가장 바람직하게는, 1% 미만의 양으로 물을 포함하는 조성물이다. 잔류 물의 측정 방법은 당업자에게 알려져 있다; 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물 내의 잔류 물은 WO 1993/012418 에 기재된 바와 같은 방법에 따라 오산화인 센서를 사용하여 측정된다. 양을 정의하기 위해 사용되는 본원에 언급되는 상기 언급된 백분율 값 및 기타 백분율 값은 다르게 명시되지 않는 경우, 중량% (w/w) 로 언급된다. 본 발명의 이러한 조성물은 바람직하게는, 정상 조건 하에서, 즉, 실온 및 정상 압력 하에서 고체 조성물이다.
용어 "시험 화학 매트릭스" 는 본원에서 사용되는 바와 같이, 적어도 산화환원 조인자, 산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제; 지시 시약 및 본 발명의 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법에 의해 수득가능한 적어도 하나의 가교-연결된 효소 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제를 포함하는 화합물의 매트릭스를 말한다. 시험 화학 매트릭스를 디자인하는 다양한 가능성이 당업계에 알려져 있다. 이와 관련하여, 상기 언급된 종래 문헌을 참조할 수 있다. 구체적으로, 문헌 J. Hoenes et al.: The Technology Behind Glucose Meters: Test Strips, Diabetes Technology & Therapeutics, Volume 10, Supplement 1, 2008, S-10 to S-26 를 참조할 수 있다. 그러나, 다른 유형의 시험 화학 매트릭스가 가능하다. 시험 화학 매트릭스의 바람직한 조성물은 본원의 그밖에 기재되고 실시예에서 본원에 제시된다. 바람직하게는, 시험 화학 매트릭스는 본 발명의 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 효소 중 1 개 초과의 유형 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 1 개 초과의 제제를 포함한다. 예를 들어, 바람직하게는, 시험 화학 매트릭스가 본 발명에 따라 가교 연결된 글루코오스 데히드로게나아제 및 본 발명에 따라 가교 연결된 디아포라아제를 포함하며, 2 개의 효소가 분리된 가교-연결 반응에서 가교연결되는 것이 본 발명에 의해 구상된다.
바람직하게는, 본 발명의 시험 화학 매트릭스는 분석물질의 존재 하에 적어도 하나의 측정가능한 특성을 변화시키기 위해 채택된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "측정가능한 특성" 은 분석물질의 존재 하에 변화하고 임의의 종류의 물리적 신호로 전달할 수 있는 시험 화학의 임의의 특성에 관한 것이다. 바람직하게는, 측정가능한 특성 및/또는 그로부터 생성가능한 신호의 변화는 샘플 중의 분석물질의 농도와 비례한다. 바람직하게는, 측정가능한 특성은 적어도 시험 화학 매트릭스, 바람직하게는 상기 본원에 기재된 바와 같은 산화환원 조인자 및/또는 산화환원 매개체의 성분의 산환환원 상태이다. 따라서, 바람직하게는, 검출 반응은 산화환원 반응이다. 더욱 바람직하게는, 검출 반응은 중간체 및/또는 생성물로서 산화환원 등가물 및/또는 전자를 생성한다. 가장 바람직하게는, 측정가능한 특성은 본원에 기재된 바와 같은 환원된 또는 산화된 산화환원 매개체의 농도이다, 즉, 바람직하게는, 측정가능한 특성은 시험 화학에 포함되는 상기 매개체의 산화환원 상태이다. 상기 정의된 바와 같은 측정가능한 특성을 측정 값으로서 판독될 수 있는 물리적 신호로 전환하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, EP 0 821 234, EP 0 974 303, 및 US 2005/0023152 에 기재되어 있다.
바람직하게는, 측정되는 시험 화학 매트릭스의 측정가능한 특성은 매개체 및/또는 지시 시약과 상이한 시험 화학 매트릭스의 화합물의 특성이다; 따라서, 바람직하게는, 이 경우 매개체 및/또는 지시 시약은 시험 화학 매트릭스로부터 생략될 수 있다. 예를 들어, 비-제한적인 예로서, NAD 의 효소적 환원 또는 이의 유도체는 UV-조사에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 산화환원 조인자, 매개체, 및 지시제는 바람직하게는, 동일한 화합물일 수 있다.
바람직하게는, 측정가능한 특성은 전기화학적 특성이다. 따라서, 시험 화학 매트릭스는, 바람직하게는, 적어도 2 개의 전극을 접촉시키는 전기화학적 시험 화학 매트릭스이다. 전기화학적 시험 화학 매트릭스의 적합한 전극, 전극 설정 (setup), 적합한 추가의 화합물 및 이의 작동 방식은 당업자에게 공지되며, 예를 들어, WO 2007/071562 A1, US 2009/0198117 A1, WO 2007/071562 A1, WO 2014/001382 A1, 및 그곳에 언급된 참조에 기재되어 있다. 바람직한 전극 배치는 예를 들어, WO2004/113910 및 WO2006/027222 에 기재되어 있다. 본 발명에 의해, 전기화학적 시험 화학 매트릭스가 분석물질과 반응하기 위해 하나 이상의 화학적 시약을 포함하여 샘플 유체 내의 분석물질의 존재를 나타내는 전기화학적 신호를 생성하는 것이 구상된다. 바람직하게는, 전기화학적 특성은 분석물질의 농도의 지표인 전류적정 또는 전기량 반응을 포함한다. 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,108,564, 4,919,770 및 6,054,039 를 참고한다.
더욱 바람직하게는, 측정가능한 특성은 광학적 특성이다. 따라서, 바람직하게는, 시험 화학 매트릭스는 분석물질의 존재 하에 적어도 하나의 광학적으로 검출가능한 검출 반응을 수행한다. 더 더욱 바람직하게는, 검출 반응에 의해 생성되는 광학적으로 검출가능한 신호는 샘플 중의 분석물질의 양 및/또는 농도에 비례한다. 바람직하게는, 측정가능한 특성은 시험 화학의 색상 및/또는 색상 강도 에서의 변화, 즉, 바람직하게는, 시험 화학의 흡수 및/또는 방출 스펙트럼에서의 변화이다. 그러므로, 측정가능한 특성의 변화에서 광학적 특성은 바람직하게는 반사 특성, 바람직하게는 반사율 및/또는 감면 (remission); 전송 특성, 바람직하게는 흡수; 색상; 발광, 바람직하게는 형광으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
용어 "검출하기" 는 체액 샘플에 존재하는 분석물질의 양의 정량화, 즉, 상기 분석물질이 양 또는 농도를, 바람직하게는 반-정량적으로 또는 정량적으로 측정하는 것에 관한 것이다. 분석물질의 양의 검출은 당업자에게 공지된 또는 하기 본원에 상세화된 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 본 발명에 따르면, 분석물질의 양의 검출은 샘플 중의 상기 분석물질의 양의 검출을 위한 모든 공지된 방식에 의해 달성딜 수 있고, 단 이들은 본 발명의 분석물질을 특이적으로 검출하기 위해 채택되고, 본 발명의 필요조건과 양립성이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "양" 은 본원에서 언급되는 분석물질의 절대 양, 본원에서 언급되는 분석물질의 상대 양 또는 농도 뿐 아니라, 이와 연관되는 임의의 값 또는 파라미터를 포함한다. 이러한 값 또는 파라미터는 측정에 의해 본원에 언급되는 분석물질로부터 수득되는 모든 특정 물리적 또는 화학적 특성으로부터의 강도 신호 값을 포함한다. 상기 언급된 양 또는 파라미터와 연관되는 값은 또한 모든 표준 수학적 조작에 의해 수득될 수 있다고 이해된다.
용어 "산화환원 조인자" 는 본원에서 사용되는 바와 같이, 효소적으로 이동된 산화환원 등가물 및, 특히, 히드라이드 (H-) 에 대한 수용기로서 담당할 수 있는 분자를 말한다. 바람직하게는, 산화환원 조인자는 PQQ, NAD 또는 FAD 이다. 본 발명의 시험 화학 매트릭스 내에 포함되어지는 산화환원 조인자가 구상되어지는 데히드로게나아제의 특성에 따라 다른 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, PQQ 는 본 발명에 따른 조성물에서 PQQ 의존성 글루코오스 데히드로게나아제와 조합되고, NAD 는 본 발명에 따른 조성물에서 NAD 의존성 글루코오스 데히드로게나아제와 조합되고, FAD 는 본 발명에 따른 조성물에서 FAD 의존성 글루코오스 데히드로게나아제와 조합된다. 본 발명에 따른 산화환원 조인자는 또한 바람직하게는 PQQ, NAD 또는 FAD 의 유도체일 수 있다. NAD 의 바람직한 유도체는 기재된 NAD/NADH 및/또는 NADP/NADPH 유도체에 관해 참조로서 본원에 인용되는 WO 2007/012494 에 기재된 것들이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 산화환원 조인자는 WO 2007/012494 에 기재된 바와 같은 carbaNAD 이다.
따라서, 용어 "산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제" 는 산화환원 등가물의 존재 하에서, 지시 시약 중에서 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 유도할 수 있는 분자를 말한다. 본 발명에 따라 상기 작용제가 또한 이어서 후속적으로 검출될 수 있는 지시 시약의 1 개 초과의 측정가능한 특성에서의 변화를 도출할 수 있다고 이해된다. 게다가, 상기 작용제는, 바람직하게는, 또한 이어서 후속적으로 검출될 수 있는 1 개 초과의 지시 시약의 측정가능한 특성에서의 변화를 도출할 수 있다.
상기 언급된 바와 같은 작용제는 바람직하게는, 직접적으로 또는 간접적으로, 즉, 추가의 매개체를 통해, 산화환원 등가물을 산화환원 조인자로부터 지시 시약으로 이동시킬 수 있다. 산화환원 등가물의 상기 이동의 결과로서, 지시 시약은 적어도 하나의 측정가능한 특성에서의 변화가 일어나는 식으로 개질될 것이다. 측정가능한 특성이 광학적 특성인 경우, 바람직하게는, 예를 들어, 산화된 상태로의 무색 또는 무형광 지시 시약은, 환원된 상태로의 작용제에 의해 매개된 산화환원 등가물의 이동에 의해 색상이 있는 또는 형광의 지시 시약으로 전환될 수 있다. 산화환원 등가물의 이동은 산화환원 등가물이 작용제에 의해 지시 시약으로 이동되는 식으로 직접적일 수 있거나 또는 간접적일 수 있다. 간접적인 경우, 산화환원 등가물은 작용제를, 산화환원 등가물을 지시 시약으로 후속하여 이동시키는 중간 매개체로 이동시킨다. 바람직하게는, 1 개 초과의 매개체가 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 작용제는 산화환원 등가물을, 산화환원 등가물을 두번째 매개체로 후속하여 이동시키는 첫번째 매개체로 이동시키고, 상기 두번째 매개체가 그 이후 산화환원 등가물을 지시 시약으로 이동시킬 수 있다. 이러한 매개체 케스케이드에서 2 개 초과의 매개체가 사용될 수 있을 것이라고 이해될 것이다. 산화환원 등가물을 지시 시약으로 이동시키기 위한 하나 이상의 매개체를 사용하는 장점은 측정가능한 특성의 검출 타이밍이 개선될 수 있다는 것이다.
본 발명의 문맥에서 적용될 수 있는 매개체는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 예를 들어, 칼륨 페리시아나아이드, 퀴논 유도체, Nile blue (CAS no.: 3625-57-8), Meldola's blue (CAS no.: 7057-57-0), EP 1 457 572 B1 에 기재된 오슘 복합체, 전이 금속 착물, 예컨대 루테늄 헥사민 클로라이드, 또는 니트로소-아닐린-유도체를 포함한다.
바람직하게 구상되는 본 발명에 따른 작용제는 페나진이다. 더욱 바람직하게는, 상기 페나진은 페나진토술페이트, 페나진메토술페이트, 1-(3-카르복시프로폭시)-5-에틸페나지늄트리플루오로메탄술포네이트 또는 1-메톡시페나진-메토술페이트이다. 이러한 페나진은 지시 시약의 적어도 하나의 광학적 특성에서의 변화를 도출하기 위해 적용될 수 있다. 검출을 위한 상세한 사항 및 이러한 페나진을 적용하고자 하는 방법은 EP 0 654 079 A1 에서 찾을 수 있다. 또한, 본 문맥에서 구상되는 작용제는 바람직하게는, 키논이다. 더욱 바람직하게는, 상기 키논은 페난트렌키논, 페난트롤린키논 또는 벤조[h]-키놀린키논이다. 본 문맥에서 구상되는 또다른 작용제는 니트로소아닐린이다. 더욱 바람직하게는, 상기 니트로소아닐린은 [(4-니트로소페닐)이미노]디메탄올-히드로클로라이드이다. 가장 바람직하게는, 상기 니트로소아닐린은 4-비스(히드록시에틸)-1-니트로소-아닐린 또는 4-비스(히드록시에틸)-3-메톡시-1-니트로소아닐린이다. 본 발명에 의해 또한 바람직하게 구상되는 것은 산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제이며, 상기 작용제는 산화환원 등가물을 산화환원 조인자로부터 지시 시약으로의 이동을 촉매화할 수 있는 효소이다.
용어 "지시 시약" 은 본원에서 사용되는 바와 같이, 바람직하게는, 본 발명의 효소의 활성에 의존적인, 바람직하게는 이에 비례하는 적어도 하나의 측정가능한, 바람직하게는 광학적, 특성을 변화시키는 화합물에 관한 것이다. 바람직하게는, 지시 시약은 광학 지시자 성분인데, 이것은 적어도 하나의 효소 또는 시험 화학 매트릭스에 포함된 효소가 분석물질과 반응할 때 적어도 하나의 광학적으로 검출가능한 특성 변화를 수행한다. 따라서, 적어도 하나의 지시 시약은 바람직하게는 적어도 하나의 효소 및 분석물질의 효소 반응의 지표인 광학적 특성에서의 변화를 수행하는 하나 이상의 염료를 포함한다. 본 발명에 따른 지시 시약의 광학적 특성은, 본 발명의 효소의 활성에 의존하여 변화한다. 따라서, 바람직하게는, 광학적 특성의 변화는 효소가 검출 반응을 촉매화하는 경우에만 발생한다. 더욱 바람직하게는, 광학적 특성의 변화는 시험 화학 매트릭스에 존재하는 효소에 의해 겪어지는 촉매 사이클 횟수에 비례한다. 따라서, 가장 바람직하게는, 광학적 특성의 변화는 효소에 의해 전환되는 분석물질 분자의 숫자에 비례한다.
바람직하게는, 지시 시약에서 변화하는 광학적 특성은 상기 지시 시약을 포함하는 시험 화학 매트릭스에서 측정가능하다. 따라서, 적어도 하나의 광학적 특성은 분석물질의 존재 하에 변화하고 임의의 종류의 광학 신호로 이동할 수 있는 시험 화학 매트릭스의 임의의 특성일 수 있다. 바람직하게는, 광학적 특성 및/또는 이로부터 생성될 수 있는 신호의 변화는 샘플 중의 분석물질의 농도에 비례한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 광학적 특성, 광학적 특성 및/또는 이로부터 생성될 수 있는 신호의 변화 및 샘플 중의 분석물질의 농도 사이의 미리 측정된 또는 측정가능한 관련성이 존재할 수 있어, 이것이 신호로부터 농도를 유도하기 위해 사용될 수 있다.
당업자는 측정된 시험 화학 매트릭스의 측정가능한 특성이 또한 매개체 및/또는 지시 시약과 상이한 시험 화학 매트릭스의 화합물의 특성일 수 있고, 이러한 경우에, 매개체 및/또는 지시 시약은 시험 화학 매트릭스로부터 생략될 수 있다는; 예를 들어, 바람직하게는, NAD 또는 이의 유도체의 효소적 환원이 UV-조사에 의해 검출될 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 산화환원 조인자, 매개체, 및 지시제는 바람직하게는, 동일한 화합물일 수 있다.
용어 "분석물질" 은 본원에서 사용되는 바와 같이, 체액에 존재하는 화학적 화합물에 관한 것이다. 바람직하게는, 분석물질은 소형 분자이다, 즉, 바람직하게는, 분석물질은 생물학적 거대분자가 아니다. 더욱 바람직하게는, 분석물질은 유기 분자, 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 시험 화학의 존재 하에 산화환원 반응을 겪을 수 있는 유기 분자이다. 바람직하게는, 분석물질은 대상의 대사작용의 분자이다. 또한 바람직하게는, 분석물질은 저 분자량 화학적 화합물, 더욱 바람직하게는 1000 u (1000 Da; 1.66×10-24 kg) 미만의 분자 질량을 갖는 화학적 화합물이다. 더욱 바람직하게는, 분석물질은 말레에이트, 에탄올, 아스코르브산, 콜레스테롤, 글리세롤, 우레아, 3-히드록시부티레이트, 락테이트, 피루베이트, 트리글리세라이드, 케톤, 간 파라미터, 크레아티닌, HDL, 등으로 이루어지는 목록으로부터 선태되고; 더욱 바람직하게는, 분석물질은 혈중 글루코오스이다. 바람직하게는, 분석물질은 혈중 글루코오스이고, 검출하고자 하는 실제 농도는 적어도 10 mg/dL, 적어도 50 mg/dL, 적어도 60 mg/dL, 적어도 70 mg/dL, 적어도 80 mg/dL, 적어도 90 mg/dL, 적어도 100 mg/dL, 적어도 110 mg/dL, 적어도 120 mg/dL, 적어도 130 mg/dL, 적어도 140 mg/dL, 또는 적어도 150 mg/dL 이다. 바람직하게는, 분석물질은 글루코오스이고, 검출하고자 하는 농도는 0 mg/dL 내지 800 mg/dL, 또는, 더욱 바람직하게는, 10 mg/dL 내지 600 mg/dL, 또는, 가장 바람직하게는, 50 mg/dL 내지 300 mg/dL 의 범위 내에 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "체액" 은 혈액, 혈장, 혈청, 눈물, 소변, 림프, 뇌척수액, 담즙, 대변, 땀, 및 타액을 포함하여, 본 발명의 분석물질을 포함하는 것으로 알려진 또는 포함하는 것으로 의심되는, 대상의 모든 신체의 유체를 말한다. 바람직하게는, 체액은 혈액이다. 용어 "샘플" 은 당업자에 의해 이해되고, 바람직하게는 상기 샘플을 시험 요소에 적용하기 전에 대상으로부터 제거되는, 체액의 임의의 부차부분에 관한 것이다. 샘플은 예를 들어, 정맥 또는 동맥 천자, 표피 천자 등을 포함하는 잘 공지된 기술에 의해 수득될 수 있다.
추가로, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 시험 화학 매트릭스의 제조 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명의 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법에 따른 가교-연결된 효소 분자의 제제 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 수득하는 단계, 및
b) 산화환원 조인자, 산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제, 지시 시약, 및 단계 a) 에서 수득된 가교-연결된 효소 분자의 제제를 혼화시키는 단계, 및, 이에 의한,
c) 시험 화학 매트릭스의 제조 단계.
게다가, 본 발명은 운반체 상에 본 발명의 시험 화학 매트릭스를 포함하는 체액 샘플로부터의 분석물질의 측정을 위한 진단 시험 요소에 관한 것이다.
용어 "운반체" 는, 본 발명이 문맥에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 시험 화학 매트릭스가 적용되는 고체 지지체를 말한다. 바람직하게는, 시험 화학 매트릭스는 운반체 상에 고정될 수 있다. 게다가, 또한 시험 화학 매트릭스가 운반체 상에 공간적으로 배열될 수 있다는 것이 구상된다. 운반체는 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성의 변화 검출을 가능하게 하는 방식으로 배열되어야만 한다, 즉, 이것은 바람직하게는 적어도 하나의 측정가능한 특성의 검출을 간섭할 성분 또는 공간적인 배열을 포함하지 않는다. 적합한 운반체는 본 발명의 조성물을 함유하는 바이알, 예를 들어, 웰-플레이트 형태에 배열된 바이알을 포함할 수 있다. 다른 어세이가 광학 도파관 또는 반도체 플레이트에 적용될 수 있다. 바람직한 운반체는, 그러나, 시험 스트립에 대해 사용되는 것들이다. 상기 시험 스트립은 통상 고체 운반체를 형성하는 하나 이상의 층을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 진단 시험 요소는 상기 시험 화학 매트릭스를 포함하는 시험 필드 (test field) 를 포함하는데, 시험 필드는 체액 샘플이 그 위에 적용되는 샘플 적용 면 및 분석물질이 시험 화학 매트릭스의 성분과 반응할 때 측정가능한 특성에서의 변화 검출을 가능하게 하는 검출 면을 갖는다. 샘플은 샘플 적용 면에 적용되게 되고, 이것은 바람직하게는, 세포, 예컨대 혈액 샘플에 존재하는 적혈구가 검출 면에 도달하지 않도록 구상된다. 이러한 진단 시험 요소 및 이의 제조에 대한 상세한 사항은 EP 0 821 234 B1 에서 찾을 수 있다. 본 발명에 따라 구상되는 추가의 시험 요소는 EP 1 035 919 B1 또는 EP 1 035 920 B1 에 기재된 것들이다.
본 발명의 진단 시험 요소의 시험 필드는 바람직하게는, 하나의, 더욱 바람직하게는 하나 초과의 필름 층이 적용되는 투명 호일을 포함한다. 진단 시험 요소의 필름 층은 중합체성 필름 형성제의 분산액 또는 유액으로부터 제조된다. 분산 필름 형성제는 운반체 액체 (통상 물) 에 불용성이고 운반체 액체에 미세하게 분산된 현미경적 중합체 입자를 함유한다. 액체가 필름 형성 동안 증발에 의해 제거되는 경우, 입자는 서로 가까워지고 미세하게 닿인다. 본 과정에서 발생하는 큰 힘 및 필름 형성을 동반하는 표면 에너지의 획득은 입자가 실질적으로 폐쇄된 필름 층 내에서 성장하는 결과를 낳는다. 대안적으로는, 또한 필름 형성제가 용매에 용해되는 필름 형성제의 유액을 사용하는 것이 가능하다. 용해된 중합체는 용매와 비혼화성인 운반체 액체 내에 유화된다. 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 아세테이트, 폴리아크릴 에스테르, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴아미드, 폴리아미드 및 폴리스티렌이 이러한 필름 형성제를 위한 중합체로서 특히 적합하다. 단독중합체 외에, 혼합된 중합물 예컨대 부타디엔, 스티렌 또는 말레산 에스테르와 같은 것이 또한 적합하다.
잘 팽창하는 팽창제 (즉, 물을 흡수했을 때 부피가 증가하는 성분) 를 첨가함으로써, 샘플 액체가 비교적 빠르게 투과될 수 있을 뿐 아니라 또한 팽창제의 상기 개방 효과에도 불구하고, 양호한 세포, 예를 들어, 적혈구 및 부가적으로 또한 혈액 안료, 분리 특성을 갖는 층을 수득한다. 팽창 특성이 매우 좋아서, 적어도 하나의 측정가능한 특성의 변화가 층을 통한 샘플 액체의 투과에 주로 의존적인 시험에 대해, 측정가능한 특성의 변화가 최대 1 분 후 측정가능해야만 한다. 특히 적합한 팽창제는 메틸 비닐 에테르 말레산 무수물 공중합체, 잔탄 검 및 메틸 비닐 에테르 말레산 공중합체인 것으로 입증되었다.
진단 시험 요소의 단일 층 레이아웃 (layout) 은 종래 기술로부터 공지되어 있으며, 예를 들어, EP 1 566 637 및 EP 1 780 288 을 참고한다. 더욱 바람직한 2 층 레이아웃은, 바람직하게는, 첫번째 및 두번째 순서로 서로 상단에 올려져 있는 첫번째 및 두번째 필름 층을 포함한다. 투명 호일상에 위치하는 첫번째 층이 위에 놓인 두번째 층보다 상당히 적게 빛을 산란시키는 것이 중요하다. 투명 호일의 비-코팅된 면은 검출 면으로서 불리고, 두번째 층이 첫번째 층 상에 놓인 면과 반대하는 두번째 층의 면은 샘플 적용 면으로서 불린다. 2 개의 소위 필름 층은 본 발명에 따른 진단 시험 운반체의 시험 필드 중의 투명 호일 상에 위치한다. 이를 위해, 이들 플라스틱 호일은 액체에 불침투성인 것이 고려된다. 폴리카보네이트 호일이 특히 적합한 것으로 입증되었다. 2 개의 필름 층은 동일한 중합체성 필름 형성제를 함유하는 코팅 화합물로부터 제조될 수 있고 또는 이들은 상이한 중합체성 필름 형성제를 함유하는 코팅 화합물로부터 제조될 수 있다. 첫번째 층이 팽창제 및 임의로 약한 광 산란 필러를 함유하는 반면, 두번째 층은 팽창제 및 임의의 경우에는 강하게 빛을 산란시키는 적어도 하나의 안료를 필요로 한다. 부가적으로 두번째 층은 또한 비-다공성 필러 뿐 아니라 다공성 필러를 함유할 수 있다.
바람직하게는, 전기화학적 검출에서 사용될 수 있는 단일-층 필름의 경우, 본 발명의 가교-연결된 폴리펩티드가 상기 단일 층에 포함된다. 다중층 (즉, 1 개 초과의 층) 레이아웃의 경우, 본 발명의 가교-연결된 폴리펩티드가 하나의 필름 층, 더욱 바람직하게는 첫번째 필름 층에 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 진단 시험 요소 중에 시험 필드를 최적화하기 위해서는, 모든 필름 층, 바람직하게는 2-층 레이아웃의 경우 두 모든 층이, 비-용혈성 (non-haemolyzing) 습윤제를 함유하는 경우에 특히 유리한 것으로 입증되었다. 중성, 즉, 비-하전된 습윤제가 이를 위해 특히 바람직하다. N-옥타노일-N-메틸 글루카미드가 가장 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 진단 시험 요소의 2-층 시험 필드를 제조하기 위해, 각각의 필름 층은 상기 성분의 균질 분산액으로부터 연속하여 각각 제조된다. 이를 위해, 투명 호일은 첫번째 필름 층에 대한 코팅 화합물을 형성하는 기재로서 사용된다. 첫번째 필름 층에 대한 코팅 화합물이 특정 층 두께로 적용된 후, 층이 건조된다. 결국 두번째 층에 대한 코팅 화합물이 상기 층에 또한 얇은 층 두께로 적용되고 건조된다. 상기 방식으로 제조된 시험 필드는 양호한 취급을 위해 지지 층에 고정될 수 있고, 시험하게 되는 액체를 흡수하지 않는 그러한 층에 대해 이러한 물질이 고려된다. 이들은 소위 비-흡수성 물질이고, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에스테르, 폴리카보네이트 또는 폴리아미드로 제조된 플라스틱 호일이 특히 바람직하다. 금속 호일 또는 유리가 추가의 지지 물질로서 적합하다.
본 발명에 따른 시험 요소의 바람직한 구현예에서, 지시 시약의 적어도 하나의 광학적 특성에서의 변화에 대해 관찰되고 측정되어지는 시험 필드의 검출 면은 신체 샘플에서 검출되어지는 분석물질을 측정하기 위해 지지 층을 통해 가시적이어야만 한다. 이것은 투명 지지 층에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 지지 층이 시험 필드의 검출 면에 의해 피복되는 천공을 갖는 것이 또한 가능하다. 이후 검출 면은 천공을 통해 가시적이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 진단 시험 요소에는 시험 필드의 검출 면 아래의 지지 층 중에 구멍이 있고, 이를 통해 시험 필드의 검출 면을 관찰할 수 있다. 구멍은 시험 필드의 가장 작은 선형 치수보다 다소 작은 직경을 가져서, 구멍 외부의 시험 필드가 지지 층 상에 위치하며 이에 부착될 수 있도록 한다.
본 발명에 따른 시험 요소의 또다른 바람직한 구현예에서, 시험 요소는 모세관을 포함한다. 이러한 레이아웃은 종래 기술, 예를 들어, EP 1 035 921 로부터 공지된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 시험 요소는 시험 요소 밴드로부터 제조되거나 (예를 들어, EP 1 593 434 참고) 또는 시험 스트립이다. 게다가, 추가의 바람직한 구현예에서, 진단 시험 요소가 카트리지에 포함되는데, 상기 카트리지는 바람직하게는 다수의 진단 시험 요소를 포함한다.
본 발명은 추가로, 질환 진단에 사용하기 위한 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 질환 진단에 사용하기 위한 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법에 따라 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제; 및 가교-연결된 폴리펩티드 분자에 관한 것으로서, 상기 폴리펩티드 분자는 질환 진단에 사용하기 위한 본 발명에 따른 적어도 40 개의 인접 원자를 포함하는 미분지형 측쇄에 의해 가교-연결된다.
용어 "진단" 은 본원에서 사용되는 바와 같이, 대상이 본 명세서에 언급되는 질환 또는 상태를 앓고 있는 또는 앓을 것인 것에 따른 가망성을 평가하는 것에 관한 것이다. 당업자에게 이해되듯이, 이러한 평가는 통상 진단되는 대상의 100% 에 대해서 올바를 것으로 의도되지 않는다. 그러나 상기 용어는, 대상의 통계적으로 유의한 부분이 질환 또는 상태를 앓는 것으로 올바르게 진단될 수 있는 것을 필요로 한다. 부분이 통계적으로 유의한 지는 다양한 잘 공지된 통계적 평가 도구, 예를 들어, 신뢰 구간 측정, p-값 측정, Student's t-검정, Mann-Whitney 검정 등을 사용하여 당업자에 의해 지체 없이 측정될 수 있다. 상세한 사항은 Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983 에서 찾을 수 있다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 이다. p-값은 바람직하게는, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 또는 0.0001 이다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 구상되는 확률은 진단이 제시된 코호트 또는 집단의 대상의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 에 대해 교정될 것이라는 것을 허용한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질환" 은 정상 대사작용으로부터의 임의의 임상적으로 관련된 편차에 관한 것이다. 따라서, "질환의 진단" 은 제한 없이, 말레에이트, 에탄올, 아스코르브산, 콜레스테롤, 글리세롤, 우레아, 3-히드록시부티레이트, 락테이트, 피루베이트, 트리글리세라이드, 케톤, 간 파라미터, 크레아티닌, HDL 등을 포함하는 적어도 하나의 임상적으로 관련된 파라미터 및/또는 응급 파라미터를 측정하고, 바람직하게는, 정상 대사작용으로부터의 임상적으로 관련된 편차가 존재하는지를 평가하는 것에 관한 것이다. 당업자에게는 진단은, 바람직하게는, 상기 임상적으로 관련된 편차의 부재를 측정하는 것, 즉, 바람직하게는, 배제에 의한 진단을 포함하는 것으로 이해된다.
게다가, 본 발명은 당뇨병의 진단에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 당뇨병의 진단에 사용하기 위한 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법에 따라 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제; 및 가교-연결된 폴리펩티드 분자에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드 분자는 당뇨병의 진단에 사용하기 위한 본 발명에 따른 적어도 40 개의 인접 원자를 포함하는 미분지형 측쇄에 의해 가교-연결된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자 및/또는 본 발명에 따른 시험 화학 매트릭스의 제조를 위한 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자 및/또는 본 발명에 따른 진단 시험 요소의 용도에 관한 것이다.
게다가, 본 발명은 진단 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자 및/또는 본 발명에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 용도에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 운반체 상에 본 발명의 시험 화학 매트릭스를 생성하는 단계를 포함하는 진단 시험 요소의 제조 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 참조문헌은 이들의 전체 기재 내용 및 본 명세서에서 구체적으로 언급된 내용을 참고로 하여 본원에 인용된다.
본 발명의 발견을 요약하면, 하기 구현예가 바람직하다:
구현예 1: 가교-연결 반응이 일어나기에 적합한 조건 하에서 용액 중에 가교-연결제 및 폴리펩티드 분자를 조합하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법.
구현예 2: 구현예 1 에 있어서, 폴리펩티드가 효소인 방법.
구현예 3: 구현예 1 또는 2 에 있어서, 가교-연결제가 적어도 40 개의 원자의 인접 사슬을 포함하는 방법.
구현예 4: 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 가교-연결제가 양 말단에서 화학적으로 활성화된 비분지형 분자인 방법.
구현예 5: 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 가교-연결제가 비스-활성화된 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
구현예 6: 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 가교-연결제가 비스-N-히드록시-숙신이미드 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (O,O'-비스[2-(N-숙신이미딜-숙시닐아미노)에틸] 폴리에틸렌 글리콜) 인 방법.
구현예 7: 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 가교-연결제가 0.6 kDa 내지 20 kDa, 바람직하게는 0.9 kDa 내지 10 kDa, 더욱 바람직하게는 1 kDa 내지 5 kDa, 가장 바람직하게는 3 kDa 의 분자 질량을 갖는 방법.
구현예 8: 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자가 0.1 mM 내지 5 mM, 바람직하게는 0.3 mM 내지 4 mM, 더욱 바람직하게는 2.5 ± 1 mM 의 초기 농도로 상기 용액 중에 존재하는 방법.
구현예 9: 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 가교연결제 / 폴리펩티드 분자의 몰 비가 0.2 내지 5, 바람직하게는 0.5 내지 4, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 3, 가장 바람직하게는 1 내지 2 인 방법.
구현예 10: 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 용액이 7 내지 9, 바람직하게는 7.5 내지 8.8, 더욱 바람직하게는 8.3 ± 1, 가장 바람직하게는 8.3 의 pH 를 갖는 방법.
구현예 11: 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 적어도 일부가 데히드로게나아제 분자이고, 바람직하게는 폴리펩티드 분자의 적어도 80% 가 데히드로게나아제 분자이고, 더욱 바람직하게는 폴리펩티드 분자의 적어도 90% 가 데히드로게나아제 분자인 방법.
구현예 12: 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 적어도 일부가 글루코오스 데히드로게나아제 분자이고, 바람직하게는 폴리펩티드 분자의 적어도 80% 가 글루코오스 데히드로게나아제 분자이고, 더욱 바람직하게는 폴리펩티드 분자의 적어도 90% 가 글루코오스 데히드로게나아제 분자인 방법.
구현예 13: 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드 분자의 적어도 일부가 GlucDH E170K/Q252L 분자이고, 바람직하게는 폴리펩티드 분자의 적어도 80% 가 GlucDH E170K/Q252L 분자이고, 더욱 바람직하게는 폴리펩티드 분자의 적어도 90% 가 GlucDH E170K/Q252L 분자인 방법.
구현예 14: 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 용액 중에 가교-연결제 및 폴리펩티드 분자를 조합하는 것이 가교-연결제를 바람직하게는 진탕 하에, 폴리펩티드 분자를 포함하는 용액에 적가하는 것을 포함하는 방법.
구현예 15: 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 용액 중에 가교-연결제 및 폴리펩티드 분자를 조합하는 것이 양립성 유기 용매에 용해된 가교-연결제를 폴리펩티드 분자를 포함하는 용액에 적가하는 것을 포함하는 방법.
구현예 16: 구현예 15 에서, 양립성 유기 용매가 디메틸술폭시드 (DMSO) 인 방법.
구현예 17: 구현예 1 내지 16 중 어느 하나의 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제.
구현예 18: 폴리펩티드 분자가 적어도 40 개의 인접 원자를 포함하는 본질적으로 비분지형 가교-연결기에 의해 가교-연결되는, 가교-연결된 폴리펩티드 분자.
구현예 19: 구현예 18 에 있어서, 폴리펩티드가 효소, 바람직하게는 데히드로게나아제인 가교-연결된 폴리펩티드 분자.
구현예 20: 구현예 18 또는 19 에 있어서, 폴리펩티드가 글루코오스 데히드로게나아제, 바람직하게는 GlucDH E170K/Q252L 인 가교-연결된 폴리펩티드 분자.
구현예 21: 구현예 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 가교-연결기가 폴리에틸렌 글리콜 사슬인 가교-연결된 폴리펩티드 분자.
구현예 22: 산화환원 조인자, 산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제, 및 지시 시약을 포함하는 시험 화학 매트릭스로서, 상기 화학 매트릭스가 구현예 1 내지 16 중 임의의 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 효소 및/또는 구현예 19 내지 21 중 임의의 하나에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 추가로 포함하는 시험 화학 매트릭스.
구현예 23: 구현예 22 에 있어서, 상기 산화환원 조인자, 상기 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제, 및/또는 상기 지시제가 동일한 화합물인 시험 화학 매트릭스.
구현예 24: 하기 단계를 포함하는, 시험 화학 매트릭스의 제조 방법:
a) 구현예 2 내지 16 중 어느 하나의 방법에 따른 가교-연결된 효소 분자의 제제 및/또는 구현예 19 내지 21 중 어느 하나에 따른 가교-연결된 효소 분자를 수득하는 단계, 및
b) 산화환원 조인자, 산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제, 지시 시약, 및 단계 a) 에서 수득된 가교-연결된 효소 분자의 제제를 혼화시키는 단계, 및, 이에 의한,
c) 시험 화학 매트릭스의 제조 단계.
구현예 25: 구현예 24 에 있어서, 상기 산화환원 조인자, 상기 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제, 및/또는 상기 지시제가 동일한 화합물인 방법.
구현예 26: 운반체 상에 구현예 22 또는 23 의 시험 화학 매트릭스를 포함하는 체액 샘플로부터의 분석물질의 측정을 위한 진단 시험 요소.
구현예 27: 구현예 26 에 있어서, 시험 화학 매트릭스의 적어도 일부가 시험 필드에 포함되는 진단 시험 요소.
구현예 28: 구현예 26 또는 27 에 있어서, 진단 시험 요소가 시험 스트립 또는 시험 밴드인 진단 시험 요소.
구현예 29: 구현예 26 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 카트리지 내에 포함되는 진단 시험 요소.
구현예 30: 질환의 진단에 사용하기 위한, 구현예 17 에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제 및/또는 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자.
구현예 31: 당뇨병의 진단에 사용하기 위한, 구현예 17 에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제 및/또는 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자.
구현예 32: 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 및/또는 구현예 22 또는 23 에 따른 시험 화학 매트릭스의 제조를 위한 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 따른 제제 및/또는 구현예 26 내지 29 중 어느 하나에 따른 진단 시험 요소의 용도.
구현예 33: 진단 조성물의 제조를 위한, 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 및/또는 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 따른 제제의 용도.
구현예 34: 운반체 상에 구현예 22 또는 23 에 따른 시험 화학 매트릭스를 생성하는 단계를 포함하는 진단 시험 요소의 제조 방법.
본 발명의 추가의 임의의 특징 및 구현예는 바람직한 구현예의 후속 설명에서, 바람직하게는 종속항과 함께 더욱 상세히 설명될 것이다. 그곳에서, 각각의 임의의 특징은 당업자가 실현할 것과 같이, 고립된 방식 뿐 아니라 임의의 무작위 실현가능한 조합으로 실현될 수 있다. 본 발명의 범주는 바람직한 구현예에 의해 제한되지 않는다. 구현예는 도에 도식적으로 명시된다.
도면에서:
도 1: 표 1 에 명시된 가교-연결 생성물의 SDS-젤-크로마토그래피 분석 (젤 내 아크릴아미드 농도 4 내지 12 %); GlucDH2 의 암피블루 (amphiblue) 염색. 실험 V1 에 상응하는 라인 V1, 유리 GlucDH2 는 발견되지 않음. M: 마커; C: 대조군; V1 - V6: 표 1 의 실험 V1 - V6 에 상응하는 라인. 화살표는 GlucDH2 단량체의 위치를 나타낸다. V1 및 V2 는 NHS PEG 와 가교-연결되었고; V3, V5 및 V6 은 에폭시-PEG 와 가교-연결되었다. 마커 화합물의 분자량은 kDa 로 표시된다.
도 2: 실험 2 의 반응 생성물의 젤 투과 크로마토그래피. 반응 생성물을 150 mM 칼륨 포스페이트 완충액/150 mM NaCl, pH 7.0 의 유동상이 있는 superose 6 10/300 컬럼 상에서, 0.5 ml/분의 유속으로 크로마토그래피하였고, 280 nm 에서 유동 셀에서 검출하였다. 샘플의 양은 각 경우 1.25 mg 의 단백질이었다. X-축: 용리 부피 (ml); Y-축: 280 nm 에서의 흡광도 (임의의 단위).
도 3: 확산 시험 단계의 대표 도식: 20 μl 의 완충액 122 를 파이펫 124 의 도움으로 글루코오스 시험 스트립 120 상에 파이펫팅한다. 1 분 후, 10 μl 의 완충액 122 를 파이펫 124 내로 뽑아내어 추가 분석에 사용하였다.
도 4: 층 생성 후 직접적으로 형광 표지된 효소를 포함하는 건조 시험 스트립의 형광-현미경 사진. A: 유리 GlucDH2 B: 가교-연결된 GlucDH2. 도 4A 에는, 표지된 효소가 본래 포함되는 첫번째 층 128, 및 표지된 효소가 확산되는 두번째 층 130 모두가 가시화된다. 도 4B 에는, 표지된 효소가 본래 도입되었던 첫번째 층 128 만이 가시화된다.
도 5: 다양한 조건 하에서 저장하는 동안 시험 스트립의 첫번째 및 두번째 층 사이의 형광 신호의 확산의 형광-현미경 평가의 정량적 평가. X-축: 인큐베이션 시간 (날짜); Y-축: 두번째 층에서 발견된 효소의 양 대 첫번째 층에서 발견된 효소의 양의 비. A: 유리 GlucDH2; B: 가교-연결된 GlucDH2.
도 6: 다양한 저장 조건 하에 GlucDH2 의 안정성 F: 유리 효소; X: 가교-연결된 효소; A: 건조 및 가온 조건; B: 습윤 및 가온 조건. X-축: 인큐베이션 시간 (날짜); Y-축: 시간 = 0 일 대비 잔류 활성 (Arel) (%).
도 7: 건조 및 가온 또는 습윤 및 가온 조건 하에 저장 후 GlucDH2 의 유동성. F: 유리 GlucDH2; X: 가교-연결된 GlucDH2. A: 건조 및 가온 조건 하에 저장; B: 습윤 및 가온 조건 하에 저장. X-축: 인큐베이션 시간 (날짜); Y-축: 백분율 유동성 (%).
도 8: 다양한 글루코오스 농도에서의 GlucDH2 의 성능. 각 경우에, 글루코오스 시험 스트립의 글루코오스 농도 의존적인 상대적 감면이 표시된다. X-축: 글루코오스 농도 (mg/dL); Y-축: 상대적 감면 (%). F: 유리 GlucDH2; X/U: 가교-연결된 GlucDH2, 미정제됨 (유리 효소 일부 포함), X/P: 가교-연결된 GlucDH2, 정제됨 (유리 효소가 없음).
실시예 1:
GlucDH2 를 가교-연결하기 위한 첫번째 시도에서, 하기 비율을 사용하여 단쇄 비스-에폭시- 및 비스-NHS-활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 사용하였다: 10 배 과량의 비스-NHS-활성화된 PEG 또는 50 배 과량의 비스-에폭시-활성화된 PEG 와의 반응 중의 0.3 mM GlucDH2 (10 mg/ml 단백질 용액 중). 반응을 0.1 molar 칼륨 포스페이트 완충액 (pH 7.5) 에서 수행하고, 실온에서 교반 하에 활성화된 PEG 를 적가하였다. 비스-에폭시-활성화된 PEG 와의 반응은 저 분자 질량 (380 및 520 g/mol) 에서 GlucDH2 의 활성의 완전한 상실을 초래하는 반면, 중간 분자 질량 (980 g/mol) 으로는 활성의 85% 가 보존될 수 있었다. 본 실험은 최저 분자 질량이 GlucDH2 중의 필수 라이신 잔기가 반응하는 것을 방지하기 위해 활성화된 링커를 필요로 하며, 이것이 효소의 완전한 불활성화를 초래할 것이라는 것을 보여준다. 그러나, 고-분자량 단백질 응집물은 에폭시-활성화된 PEG 와의 가교-연결에 의해 수득될 수 없었다 (도 1). 반대로, 3,000 및 10,000 g/mol 의 분자 질량을 갖는 NHS-활성화된 PEG 는 활성 뿐 아니라 가교-연결 보존을 보여주었다 (표 1, 도 1 및 2). 3,000 g/mol 비스-NHS-활성화된 PEG 와의 가교-연결 생성물을 superose 6-컬럼을 사용하는 겔 투과 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 상기 명시된 조건이 주로 가교-연결 대신에 PEGylation 를 초래한다는 것으로 밝혀졌다.
표 1
Figure pct00001
Figure pct00002
표 2
Figure pct00003
실시예 2:
가교-연결을 최적화하기 위해, 단백질의 양을 분자간 반응을 증가시키기 위해 현저하게 증가시켰다. NHS-기를 향해 효소에 포함되는 아미노 기의 반응성을 개선시키기 위해 pH 값을 또한 증가시켰다. 게다가, NHS 기의 미성숙 가수분해를 피하기 위해 NHS-활성화된 PEG 를 디메틸술폭시드 (DMSO) 에 용해시켰다. 따라서, 하기 개선된 반응 조건을 사용하였다: 2.85 mM GlucDH2 (80 mg/ml 단백질 용액) 와 0.5 내지 2 배 과량의 비스-NHS-활성화된 PEG (3,000 g/mol) 와 반응함. 반응 혼합물을 교반하면서, 실온에서 저속 적하에 의해 DMSO 에 용해된 NHS-활성화된 PEG 를 첨가하는 0.2 molar 나트륨-비카보네이트 완충액 (pH 8.3) 에서 가교-연결을 수행하였다. 산출되는, 점성의 용액을 0.05 molar 칼륨/나트륨 포스페이트 완충액 pH 7.0 에 대항하여 투석하였다. 활성을 활성 어세이에 의해 측정하고, 생성물의 크기를 겔 투과 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 도 2 에 제시되는 바와 같이, 1:1 의 효소 : PEG 의 몰 비로부터 출발하여, 유리 GlucDH2 가 관찰되지 않았고; 1:1.5 로의 몰 비 증가시, 큰 가교-연결 생성물의 비율이 증가하였다.
실시예 2 에서 생성된 가교-연결된 효소는 2-층 글루코오스 시험 스트립의 첫번째 층 내에 포함되었고, 효소의 안정성 및 유동성과 관련하여 평가하였다. 표 2 에 제시되는 바와 같이, 효소 : PEG 의 몰 비의 증가는 더 큰 가교-연결 생성물의 생성을 초래한다. 겔 투과 크로마토그래피에 의해 측정되는 바와 같은, 그렇게 생성되는 GlucDH2 의 분자량은 1:1.5 의 몰 비가 사용되는 경우 112 kDa (유리 효소) 에서 2,000 kDa 까지 증가한다. 상응하게, 시험 스트립 중의 효소의 유동성은 가교-연결 생성물의 크기가 증가하면서 강하게 감소한다. 시험 스트립 중의 안정성을 35℃ 및 85 % 상대 습도에서 시험하였고, 유리 GlucDH2 와 비교하여 상당한 차이가 없었다.
실시예 3:
추가 실험에서, 분자 질량 > 3,000 g/mol 의 NHS-활성화된 PEG 를 시험하였다; 그러나, 가교-연결이 실시예 2 에서보다 덜 효과적이라는 것이 밝혀졌다. 게다가, 10,000 및 20,000 g/mol 의 분자 질량을 가진 NHS-활성화된 PEG 로 수득되는 가교-연결 생성물이 매우 점성인 생성물을 산출했고, 이것이 추가 공정을 어렵게 만들었다. 따라서, > 3,000 g/mol 의 분자 질량을 가진 PEG 가 가교-연결 GlucDH2 에 대해 덜 바람직한 것으로 밝혀졌다.
실시예 4:
하기 실험을 위해, 하기 표준 반응 조건을 가교-연결 GlucDH2 에 대해 사용하였다: 0.2 molar 나트륨 비카보네이트 완충액 pH 8.3 중의 2.85 mM GlucDH2 (80 mg/ml 단백질 용액) 의 용액에, DMSO 중의 NHS-PEG 를 실온에서 교반하면서 저속 적하에 의해 4.2 mM 의 농도로 첨가하였다. 산출되는 점성 용액을 0.2 molar NaCL 를 포함하는 0.05 molar 나트륨/칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.0 에 대해 3 회 및 0.05 molar 칼륨/나트륨 포스페이트 완충액 pH 7.0 에 대해 1 회 투석하였다. 그렇게 생성된 가교-연결 생성물을 추가로 특징분석하였다.
a) 고정화 시험 (상청액 시험)
효소의 고정화에 대한 첫번째 시험으로서, 20 μl 완충액을 각각의 GlucDH2 제제를 포함하는 시험 화학 상에 파이펫팅하고, 1 분 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 10 μl 의 완충액을 뽑아내고, GlucDH2 활성에 대해 분석하였다. 완충액 내로 확산하는 활성을 적용되는 총 활성의 백분율로서 표 2 에 표현한다. 표 2 로부터 제시될 수 있듯이, 확산가능한 효소의 양은 가교-연결 생성물의 분자량이 증가하면서 현저하게 감소한다.
b) 확산 시험 (형광 현미경)
본 어세이를 위해, GlucDH2 를 650 nm 의 파장에서 여기하여, 668 nm 에서의 형광 방출을 초래할 수 있는 형광 염료 Alexa647 에 화학적으로 커플링시켰다. 형광 표지된 효소를 상기 기재된 바와 같은 가교-연결 반응에 사용하였고, 2-층 글루코오스 시험 스트립의 첫번째 층에 적용하였다. 스트립을 다양한 시간 기간 동안 다양한 조건 하에서 저장하였고, 이후 효소의 국부화를 형광 현미경에 의해 검사하였다 (도 4 및 5). 두번째 층 내로의 효소의 확산이 본질적으로 방해될 수 있었다는 것이 밝혀졌다.
실시예 5: 가교-연결된 GlucDH2 의 안정성
본 발명에 따라 제조되고 실시예 4 에 나타낸 조건 하에서 저장된 시험 스트립을 또한 수 일 후 잔여 활성에 대해 검사하였다 (도 6). 건조 및 가온 조건 (35 ℃ / 0% 상대 습도) 하에서, 유리 효소와 가교-연결된 효소 사이의 상당한 차이가 발견되지 않았다는 것이 밝혀졌다. 반대로, 가교-연결된 효소는 습윤 및 가온 조건 (35 ℃ / 85% 상대 습도) 하에서 55 일 후 20 % 높은 잔류 활성을 나타냈다.
상기 언급된 시험 스트립에 대해, 유동성을 위한 상청액 시험 (실시예 4a)) 을 또한 수행하였다. 유리 GlucDH2 가 3 내지 6% 의 평균 유동성을 갖는 반면, 가교-연결된 GlucDH2 는 모든 조건 하에서 1 % 미만의 유동성을 가져, 시험 스트립의 첫번째 층 중의 효소의 고정화 (도 7) 를 나타낸다고 밝혀졌다.
실시예 6:
유리 GlucDH2 및 가교-연결된 GlucDH2 의 동역학 및 신호 역학을 비교하기 위해, 상기 효소 제제를 포함하는 시험 스트립을 동역학 및 신호 역학 파라미터에 대해 시험하였다. 효소의 가교-연결이 상당한 차이를 산출하지 않는 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, cNAD 화학을 사용하는 비색 시험 스트립에서, cNADH 의 확산은 명백하게 매우 빨라서, 첫번째 층 중의 색상의 증가된 생성 (이것은 광도측정으로 검사된 층임) 이 관찰될 수 없었다. 반대로, 최종 색상 반응 생성물로서 헤테로폴리블루 (heteropolyblue) 를 생성하는 상이한 화학은 상이한 행동을 보여준다: 특히 200 mg/dl 미만의 글루코오스 농도에서, 산출 신호의 글루코오스 의존성은 유리 효소와 비교하여 가교-연결된 효소가 사용되는 경우 훨씬 더 강해서, 상당히 개선된 성능의 시스템을 도출한다.
120 글루코오스 시험 스트립
122 완충액
124 파이펫
128 글루코오스 시험 스트립의 첫번째 층
130 글루코오스 시험 스트립의 두번째 층

Claims (15)

  1. 가교-연결 반응이 일어나기에 적합한 조건 하에서 용액 중에 가교-연결제 및 폴리펩티드 분자를 조합하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 분자의 가교-연결 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드가 효소인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 가교-연결제가 양 말단에서 화학적으로 활성화된 비분지형 분자인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 가교-연결제가 비스-활성화된 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 가교-연결제가 0.6 kDa 내지 20 kDa, 바람직하게는 0.9 kDa 내지 10 kDa, 더욱 바람직하게는 1 kDa 내지 5 kDa, 가장 바람직하게는 3 kDa 의 분자 질량을 갖는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 가교연결제 / 폴리펩티드 분자의 몰 비가 0.2 내지 5, 바람직하게는 0.5 내지 4, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 3, 가장 바람직하게는 1 내지 2 인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 분자의 적어도 일부가 글루코오스 데히드로게나아제 분자이고, 바람직하게는 폴리펩티드 분자의 적어도 80% 가 글루코오스 데히드로게나아제 분자이고, 더욱 바람직하게는 폴리펩티드 분자의 적어도 90% 가 글루코오스 데히드로게나아제 분자인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한, 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 포함하는 제제.
  9. 폴리펩티드 분자가 적어도 40 개의 인접 원자를 포함하는 본질적으로 비분지형 가교-연결기에 의해 가교-연결되는 가교-연결된 폴리펩티드 분자.
  10. 제 9 항에 있어서, 폴리펩티드가 효소, 바람직하게는 데히드로게나아제인 가교-연결된 폴리펩티드 분자.
  11. 산화환원 조인자, 산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제, 및 지시 시약을 포함하는 시험 화학 매트릭스로서, 상기 화학 매트릭스가 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제 및/또는 제 9 항 또는 제 10 항에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자를 추가로 포함하는 시험 화학 매트릭스.
  12. 운반체 상에 제 11 항의 시험 화학 매트릭스를 포함하는 체액 샘플로부터의 분석물질의 측정을 위한 진단 시험 요소.
  13. 질환의 진단에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제 및/또는 제 9 항 또는 제 10 항에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자.
  14. 당뇨병의 진단에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교-연결된 폴리펩티드 분자의 제제 및/또는 제 9 항 또는 제 10 항에 따른 가교-연결된 폴리펩티드 분자.
  15. 하기 단계를 포함하는, 시험 화학 매트릭스의 제조 방법:
    a) 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 방법에 따른 가교-연결된 효소 분자의 제제 및/또는 제 10 항에 따른 가교-연결된 효소 분자를 수득하는 단계, 및
    b) 산화환원 조인자, 산화환원 등가물의 존재 하에 지시 시약의 적어도 하나의 측정가능한 특성에서 변화를 도출할 수 있는 작용제, 지시 시약, 및 단계 a) 에서 수득된 가교-연결된 효소 분자의 제제를 혼화시키는 단계, 및, 이에 의한,
    c) 시험 화학 매트릭스의 제조 단계.
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