CN106459950A - 通过交联的高负载酶固定化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及交联多肽分子的方法，其包括在适合发生交联反应的条件下在溶液中组合交联剂和多肽分子的步骤，并涉及包含可通过所述方法获得的交联多肽分子的配制品。本发明还涉及交联多肽分子，其中所述多肽分子通过包含至少40个邻接原子的基本无支链交联基团交联。此外，本发明涉及测试化学基质，其包含氧化还原辅因子、能在氧化还原等同物存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂和指示试剂，其中所述化学基质进一步包含可通过根据本发明的方法获得的交联多肽分子和/或根据本发明的交联多肽分子的配制品，以及涉及包含所述测试化学基质的诊断测试元件。本发明还涉及用于疾病诊断和用于糖尿病诊断的可通过根据本发明的方法获得的交联多肽分子和/或根据本发明的交联多肽分子的配制品，以及涉及生产测试化学基质的方法。

Description

通过交联的高负载酶固定化
发明领域
本发明涉及交联多肽分子的方法，其包括在适合发生交联反应的条件下在溶液中组合交联剂和多肽分子的步骤，并涉及包含可通过所述方法获得的交联多肽分子的配制品。本发明还涉及交联多肽分子，其中所述多肽分子通过包含至少40个邻接原子的基本无支链交联基团交联。此外，本发明涉及测试化学基质，其包含氧化还原辅因子、能在氧化还原等同物（equivalents）存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂和指示试剂，其中所述化学基质进一步包含可通过根据本发明的方法获得的交联多肽分子和/或根据本发明的交联多肽分子的配制品，以及涉及包含所述测试化学基质的诊断测试元件。本发明还涉及用于疾病诊断和用于糖尿病诊断的可通过根据本发明的方法获得的交联多肽分子和/或根据本发明的交联多肽分子的配制品，以及涉及生产测试化学基质的方法。
相关技术
在本领域中已在能使化学合成中所用的酶再循环、便于操作（例如与产物分离）和增强固定化酶配制品的稳定性的方面下研究了酶固定化（综述在Sheldon (2007), Adv SynthCatal 349:1289中）。相应地，在现有技术中已经描述了固定酶的几种方法，包括酶偶联到固体粒子上、酶交联、酶衣壳化（encapsidation）或将酶固定在固体基质中（MethBiotechnol Nr. 22: Immobilization of Enzymes and Cells, 第2版, J.M. Guisan(编辑), Humana出版社）。对于交联，使酶结晶，然后交联，以产生交联酶晶体（CLEC）；或使酶沉淀并处理沉淀物以产生交联酶聚集体（CLEA®）（Sheldon (2007), op. cit.）。作为交联剂，戊二醛通常是所选试剂。但是，戊二醛具有在交联过程中使许多酶失活的缺点，这归因于戊二醛分子的小尺寸，认为它们渗入蛋白质分子中并使对酶的活性而言至关重要的氨基酸失活（Sheldon (2007) op. cit.）。相应地，提出葡聚糖多醛（polyaldehyde）作为替代性的交联剂（Mateo等人(2004), Biotech Bioeng 86(3):273），其与戊二醛相比例如对腈水解酶和青霉素G酰基转移酶表现出改进。
通常制造诊断测试元件用于快速诊断（near-patient）应用。因此，该元件必须对操作和储存稳健。这特别适用于测试元件的测试化学（参见Hönes 2008, DiabetesTechnology & Therapeutics 10: S10）。但是，许多诊断测试元件基于存在于该测试元件上的相当复杂的酶测试化学。特别地，该测试元件包含载体和检测层，其中检测层通常含有酶。对该测试元件的适当功能而言决定性的是，这些酶在储存过程中和在处理时保持生物活性。由于通常不可能为各测量逐一校准，该测试元件通常分批校准。储存一批测试元件的校准信息并用于该批的各元件，而无论在处理和储存中的个体差异如何。
但是，测试元件的预处理和储存条件可严重影响酶的活性。例如，在测试元件的制造过程中或储存过程中的热处理可使酶变性，使得显著降低测试元件上存在的总体酶活性，这反过来将导致使用这样的测试元件时的错误测试结果。类似地，随着检测层中的水含量提高，检测层的酶和其它组分将倾向于扩散，这是包含多于一个测试化学层的测试元件中的特定问题。在测试条长时间暴露在环境条件下的应用中，例如在“开口瓶（open vial）”应用中或在盒（cartridges）中提供测试条时，这一问题特别显著。相应地，这样的测试条中包含的酶已吸收至带电粒子，例如Transpafil。但是，这种固定化方法具有严重稀释固定化的酶的比活性（在每质量基础上计算）的缺点，这反过来使得必须提高层厚度以提供所需的每面积酶活性。层厚度的这种提高反过来通常导致由于被分析物缓慢扩散到该层中而造成的增加的反应时间，意味着需要增加测试时间。
因此，本领域中需要改进多肽的固定化的装置和方法。特别需要固定酶以避免每质量的比活性的强稀释和/或以可细分散的聚集体形式固定酶的方法。
发明概述
通过具有独立权利要求的特征的装置和方法解决如上所述的问题。在从属权利要求中列出可以独立方式或以任何任意组合实现的优选实施方案。
相应地，本发明涉及交联多肽分子的方法，其包括在适合发生交联反应的条件下在溶液中组合交联剂和多肽分子的步骤。
下文所用的术语“具有”、“包含”或“包括”或它们的任何任意语法变体以非排他方式使用。因此，这些术语可能既涉及除通过这些术语提出的特征外在本文描述的实体中不存在其它特征的情况，还涉及存在一个或多个其它特征的情况。作为一个实例，表达“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”可以既涉及除B外在A中不存在其它要素的情况（即A仅仅并且完全由B构成的情况），又涉及除B外在实体A中还存在一个或多个其它特征，如要素C、要素C和D或甚至其它要素的情况。
此外，下文所用的术语“优选”、“更优选”、“特别地”、“更特别”、“具体地”、“更具体”或类似术语与任选特征联合使用，而不限制可供替代的可能性。因此，通过这些术语提出的特征是任选特征并且无意以任何方式限制权利要求书的范围。如技术人员将认识到的，可以通过使用替代性的特征实施本发明。类似地，通过“在本发明的一个实施方案中”或类似表达提出的特征意指任选特征，而并非对本发明的替代性实施方案的任何限制，并非对本发明的范围的任何限制和并非对将由此提出的特征与本发明的其它任选或非任选特征组合的可能性的任何限制。
本发明的交联多肽分子的方法是体外法。此外，其可包括除上文明确提到的步骤外的步骤。例如，其它步骤可涉及例如在交联之前纯化多肽和/或在交联步骤之后除去剩余试剂和/或不想要的副产物。此外，一个或多个所述步骤可以通过自动化设备进行。
术语“多肽”是技术人员已知的并涉及包含多个肽键的化学分子。优选在氨基酸之间形成肽键。氨基酸优选是α-氨基酸，更优选是L-α-氨基酸。该多肽优选包含至少5个经肽键相互连接的氨基酸；该多肽更优选包含至少25个经肽键相互连接的氨基酸；该多肽最优选包含至少100个经肽键相互连接的氨基酸。该多肽优选是通过体外肽合成，即根据技术人员已知的方法之一的化学合成法合成的多肽。该多肽更优选是通过体外蛋白质生物合成法合成的多肽。该多肽最优选是通过体内蛋白质生物合成法，即在活细胞中合成的多肽。
该多肽优选是其自身没有催化活性的多肽，例如细胞受体、免疫球蛋白或其一部分。该多肽更优选是具有催化活性的多肽，即该多肽是酶。技术人员会理解的是，多肽配制品的纯度通常小于100%。因此，优选地，至少一部分多肽分子是具有各自的酶活性的分子；更优选地，至少80%的多肽分子是具有各自的酶活性的分子；且最优选地，至少90%的多肽分子是具有各自的酶活性的分子。
该酶优选是脱氢酶或包含脱氢酶或氧化还原酶。本文所用的术语“脱氢酶”是指能够通过向或从如本文中其它地方提到的其氧化还原辅因子中在一步机理中转移作为氧化还原等同物的氢负离子（H-）或在两步机理中转移H+ / e-而催化底物的氧化或还原的酶。脱氢酶优选是能够通过向受体分子，优选向如本文中其它地方提到的氧化还原辅因子转移作为氧化还原等同物的氢负离子（H-）而催化底物的氧化的多肽。本发明设想的脱氢酶优选是依赖于氧化还原辅因子（或有时被称作辅酶），如吡咯并喹啉醌（PQQ）、烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸（NAD）或其衍生物或黄素辅因子，如黄素-腺嘌呤-二核苷酸（FAD）或黄素单核苷酸（FMN）的那些。优选的脱氢酶特别是乳酸脱氢酶（EC号1.1.1.27或1.1.1.28）、葡萄糖脱氢酶（见下文）、醇脱氢酶（EC号1.1.1.1或1.1.1.2）、L-氨基酸脱氢酶（EC号1.4.1.5）、甘油脱氢酶（EC号1.1.1.6）、苹果酸脱氢酶（EC号1.1.1.37）、3-羟丁酸脱氢酶（EC号1.1.1.30）、山梨醇脱氢酶（EC号1.1.1.14）或胆甾醇脱氢酶。
该脱氢酶更优选是葡萄糖脱氢酶。所述葡萄糖脱氢酶最优选选自：葡萄糖脱氢酶（EC号1.1.1.47）、醌蛋白葡萄糖脱氢酶（EC号1.1.5.2），特别是吡咯并喹啉醌（PQQ）依赖性葡萄糖脱氢酶（EC号1.1.5.2）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（EC号1.1.1.49）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性葡萄糖脱氢酶（EC号1.1.1.119）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖性葡萄糖脱氢酶（EC号1.1.99.10）或它们的酶活性突变体。
上述酶的酶活性突变体可通过从对如上文列举的现有技术中的上述野生型酶报道的氨基酸序列中取代、添加或删除一个或多个氨基酸获得。优选的突变体是与如US 7,132,270或US 7,547,535中公开的它们的野生型对应物相比具有改进的底物特异性的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶的突变体。另外的突变体是Baik等人（Baik 2005, Appl EnvironMicrobiol 71: 3285）、Vasquez-Figuera等人（Vasquez-Figuera 2007, Chem BioChem 8:2295）和WO 2005/045016中公开的那些。根据本发明优选的是WO2009/103540A1（第21页）或EP1660648中公开的具有至少在氨基酸位置96、170和/或252的突变的葡萄糖脱氢酶（E.C.1.1.1.47）突变体，其经此引用并入本文。在这些氨基酸位置考虑的优选突变是Glu96Gly、Glu170Arg或Lys和/或Lys252Leu的取代，更优选组合Glu170Lys / Lys252Leu。所述突变最优选是来自枯草杆菌（"GlucDH E170K/Q252L"，在实施例中也被称作"GlucDH2"）的葡萄糖脱氢酶中的突变Glu170Arg和Gln252Leu。
本文所用的术语“交联”涉及经介入（intervening）交联基团共价相互连接两个多肽分子。原则上，可以用根据本发明的多肽分子交联方法交联不同类型的多肽分子（混合交联），例如交联催化化学反应序列的不同步骤的酶分子。作为非限制性实例，在如本文所述的交联反应中可以组合葡萄糖脱氢酶和黄递酶。技术人员会理解，混合交联原则上不限于两种不同类型的多肽分子，而是可含有多于两种类型的多肽分子。但是，优选交联相同分子种类的多肽分子。
术语“交联剂”涉及包含在适当条件下与待交联的多肽分子形成共价键的反应性化学基团的化学分子。该交联剂优选包含至少40个原子，更优选至少50个原子，最优选至少65个原子的连续链。该交联剂优选包含至少两个反应性化学基团；该交联剂更优选包含正好两个反应性化学基团。技术人员会理解的是，至少两个反应性化学基团在空间上以能够使所述两个反应性化学基团接触两个不同的待交联多肽分子的方式排列。优选地，交联剂和/或交联基团是基本无支链分子，即该交联剂和/或交联基团包含少于10%的构成分支点的原子。该交联剂更优选是无支链分子。该交联剂甚至更优选是在各末端包含至少一个如下定义的反应性化学基团的聚乙二醇（PEG）（双活化PEG）。该交联剂最优选是双-N-羟基-琥珀酰亚胺活化的聚乙二醇（O,O'-双[2-(N-琥珀酰亚胺基-琥珀酰基氨基)乙基]聚乙二醇）。从上文清楚看出，该交联基团是在至少两个反应性化学基团已经历交联反应后留下的交联剂主链。
优选地，该交联剂具有0.6 kDa至20 kDa，更优选0.9 kDa至10 kDa，甚至更优选1kDa至5 kDa，最优选3 kDa的分子质量。
本文所用的术语“反应性化学基团”涉及在适当条件下与多肽中存在的原子团，优选氨基酸侧链反应并由此形成共价键的化学基团。优选地，该反应性化学基团是在不造成所述多肽变性的条件下与多肽中存在的原子团反应的化学基团。优选地，所述不造成变性的条件是生理条件，更优选25℃、100 kPa、在适当的溶剂中。合适的反应性化学基团是本领域中已知的并优选包括氰酸酯、环氧化物、异氰酸酯、亚氨酸酯（imidate）、硫代亚氨酸酯，且更优选N-羟基-琥珀酰亚胺基团。
本文所用的术语“在溶液中”涉及化合物以均质混合物的形式存在于液体中的状态，该化合物（溶质）溶解在溶剂中。相应地，优选溶剂是不造成本发明的多肽变性和/或沉淀的溶剂。技术人员知道如何为给定多肽选择适当的溶剂；例如短多肽可溶解在极性有机溶剂，例如DMSO中。优选包含多于50个氨基酸的较长多肽通常最好溶解在水溶液中。因此，该溶液优选是水溶液。该溶液优选是具有7至9，优选7.5至8.8，更优选8.3 ± 1，最优选8.3的pH的缓冲溶液。优选的缓冲剂是不与交联剂的反应性化学基团反应的缓冲剂。该缓冲剂更优选是Na-和/或K-磷酸盐缓冲剂，最优选0.1 M K-磷酸盐缓冲剂。技术人员会理解的是，特定多肽可能需要溶剂中的附加组分以保持在溶液中，例如一价和/或二价阳离子、辅因子、一种或多种底物和/或清洁剂（detergents）。
技术人员会理解，“适合发生交联反应的条件”的选择取决于交联剂，且特别取决于其中包含的化学反应性基团，以及取决于多肽的具体类型，并且知道相应地选择条件。在本文中其它地方描述了优选条件。优选地，多肽分子以0.1 mM至5 mM，优选0.3 mM至4 mM，更优选2.5 ± 1 mM的初始浓度存在于溶液中。同样优选地，交联剂 / 多肽分子的摩尔比为0.2至5，优选0.5至4，更优选0.8至3，最优选1至2。优选地，在溶液中组合交联剂和多肽分子包括将交联剂逐滴添加到包含多肽分子的溶液中。更优选地，所述组合进一步包括搅拌所述包含多肽分子的溶液。优选地，在添加到多肽溶液中之前将交联剂溶解在有机溶剂，更优选相容有机溶剂中。技术人员会理解的是，优选选择相容有机溶剂以不与交联剂反应，不在反应混合物中存在的最终浓度下使多肽失活或变性，并溶解交联剂。该有机溶剂优选无水。该有机溶剂更优选是二甲亚砜（DMSO）。该有机溶剂最优选是无水DMSO。
有利地和意外地，在本发明的基础工作中发现，多肽分子可以在溶液中有效交联，即不需要使多肽沉淀。这种方法特别有利于通过沉淀失活的酶和在沉淀后难以再溶解的多肽。此外发现，根据本发明的方法获得的交联多肽尤其充分适用于生产测试化学基质，因为该交联多肽一方面足够大以显著降低扩散通过一个或多个基质层，且另一方面足够小以使多肽精细分散在化学基质上。此外发现，通过根据本发明使酶交联，可以显著降低由与高分子量聚合物交联造成的比活性稀释。
上文作出的定义加以必要变通应用于下文。下面进一步作出的附加定义和解释也加以必要变通应用于本说明书中描述的所有实施方案。
本发明还涉及包含可通过本发明的多肽分子交联方法获得的交联多肽分子的配制品。
优选地，可通过本发明的多肽分子交联方法获得的配制品中所含的交联多肽分子包含在含有平均5 - 50个多肽分子，更优选10至40个多肽分子，且最优选15至25个多肽分子的共价聚集体中。相应地，例如，在具有1 x 102 kDa的分子质量的多肽的情况下，交联多肽分子优选包含在具有5 x 102 kDa至5 x 103 kDa，更优选1 x 103 kDa至4 x 103 kDa，或最优选1.5 x 103 kDa至2.5 x 103 kDa的表观分子质量的共价聚集体中。
优选地，包含交联多肽分子的配制品的每质量比活性为交联前的多肽的比活性的至少50%。更优选地，包含交联多肽分子的配制品的每质量比活性为交联前的多肽的比活性的至少60%。最优选地，包含交联多肽分子的配制品的每质量比活性为交联前的多肽的比活性的至少70%。
此外，本发明涉及交联多肽分子，其中所述多肽分子通过包含至少40个邻接原子的基本无支链交联基团交联。
该交联多肽分子优选通过如上文规定的交联基团交联。该交联多肽分子也优选包含在也如上文规定的聚集体中。
此外，本发明涉及测试化学基质，其包含氧化还原辅因子、能在氧化还原等同物存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂和指示试剂，其中所述化学基质进一步包含可通过本发明的多肽分子交联方法获得的交联酶和/或根据本发明的交联多肽分子。
本文所用的术语“基质”涉及包含如本文中规定的化合物的混合物。技术人员会理解的是，该组合物可包含附加组分，例如优选缓冲剂组分（例如磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、甘油磷酸盐缓冲剂或Good´s缓冲剂）或其它盐、清洁剂等，包括如下文中规定的组分。技术人员还会理解，本发明的基质可以是不均匀混合物，例如分散体或混合物。
优选地，本发明的基质是干燥组合物。本文所用的术语“干燥组合物”是指该组合物基本不含溶剂或溶剂混合物。本文所用的基本不含是指已从该组合物中除去最初存在于该组合物的溶液或分散体中的溶剂或溶剂混合物的至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少98%或至少99%。因此，优选考虑在本发明的干燥组合物中存在多至5%，优选多至2%，更优选多至1%或最优选少于1%的量的溶剂或溶剂混合物。干燥组合物更优选是包含多至5%，优选多至2%，更优选多至1%或最优选少于1%的量的水的组合物。测定残留水的方法是技术人员已知的；优选使用五氧化二磷传感器根据如WO 1993/012418中所述的方法测定根据本发明的组合物中的残留水。如果没有另行说明，用于限定量的上文提到的百分比值和本文中提到的其它百分比值是指重量百分比（w/w）。本发明的这样的组合物优选在正常条件下，即在室温和常压下是固体组合物。
本文所用的术语“测试化学基质”是指包含至少氧化还原辅因子、能在氧化还原等同物存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂；指示试剂和至少一种可通过本发明的多肽分子交联方法获得的交联酶和/或包含根据本发明的交联多肽分子的配制品的化合物基质。设计测试化学基质的各种可能性是本领域中已知的。在这方面，可以参考上文提到的现有技术文献。具体而言，可以参考J. Hoenes等人: The Technology BehindGlucose Meters: Test Strips, Diabetes Technology & Therapeutics, 第10卷, 增刊1, 2008, S-10至S-26。但是，其它类型的测试化学基质也有可能。在本文其它地方描述了并在本文的实施例中展示了该测试化学基质的优选组成。优选地，该测试化学基质包含多于一种类型的可通过本发明的多肽分子交联方法获得的交联酶和/或多于一种包含根据本发明的交联多肽分子的配制品。例如，优选地，本发明设想了该测试化学基质包含根据本发明交联的葡萄糖脱氢酶和根据本发明交联的黄递酶，其中这两种酶在单独的交联反应中交联。
优选地，本发明的测试化学基质适合在被分析物存在下改变至少一种可测性质。本文所用的术语“可测性质”涉及在被分析物存在下改变并可转化成任何种类的物理信号的测试化学的任何性质。优选地，可测性质的变化和/或可由其生成的信号与样品中的被分析物浓度成比例。优选地，该可测性质是测试化学基质的至少一种组分，优选如上所述的氧化还原辅因子和/或氧化还原介体的氧化还原状态。相应地，该检测反应优选是氧化还原反应。该检测反应更优选产生氧化还原等同物和/或电子作为中间体和/或产物。该可测性质最优选是如本文所述的还原或氧化的氧化还原介体的浓度，即该可测性质优选是该测试化学中包含的所述介体的氧化还原状态。将如上文定义的可测性质转化成可作为测量值读取的物理信号的方法是本领域中公知的并描述在例如EP 0 821 234、EP 0 974 303和US2005/0023152中。
优选地，测定的测试化学基质的可测性质是不同于介体和/或指示试剂的该测试化学基质的化合物的性质；相应地，优选地，在这种情况下，可以从测试化学基质中省去该介体和/或指示试剂。例如，作为非限制性实例，可以通过UV辐照检测NAD或其衍生物的酶促还原。相应地，氧化还原辅因子、介体和指示试剂可优选是相同化合物。
该可测性质优选是电化学性质。相应地，该测试化学基质优选是接触至少两个电极的电化学测试化学基质。合适的电极、电极设置、电化学测试化学基质的合适的其它化合物及其操作模式是技术人员已知的并描述在例如WO 2007/071562 A1、US 2009/0198117A1、WO 2007/071562 A1、WO 2014/001382 A1和其中引用的参考文献中。例如在WO2004/113910和WO2006/027222中公开了优选的电极配置。本发明设想了该电化学测试化学基质包含一种或多种用于与被分析物反应以产生代表被分析物在样品流体中的存在的电化学信号的化学试剂。优选地，电化学性质包括指示被分析物的浓度的安培或库仑响应。参见例如美国专利5,108,564、4,919,770和6,054,039。
该可测性质更优选是光学性质。相应地，该测试化学基质优选在被分析物存在下进行至少一个光学可检测的检测反应。通过该检测反应产生的光学可检测信号更优选与样品中的被分析物的量和/或浓度成比例。该可测性质优选是该测试化学的颜色和/或颜色强度的变化，即优选是该测试化学的吸收和/或发射光谱的变化。因此，在该可测性质的变化中，该光学性质优选选自：反射性质，优选反射比和/或缓解（remission）；透射性质，优选吸收；颜色；发光，优选荧光。
术语“检测”涉及体液样品中存在的被分析物的量的定量，即测量所述被分析物的量或浓度，优选半定量或定量。可以以技术人员已知的或下文中详述的各种方式实现被分析物的量的检测。根据本发明，可以通过所有已知的检测样品中所述被分析物的量的方式实现检测被分析物的量，只要它们适合特异性检测本发明的被分析物并与本发明的要求相容。本文所用的术语“量”包括本文中提到的被分析物的绝对量、本文中提到的被分析物的相对量或浓度以及与其相关的任何值或参数。这样的值或参数包括来自通过测量由本文中提到的被分析物获得的所有特定物理或化学性质的强度信号值。要理解的是，也可通过所有标准数学运算获得与上述量或参数有关的值。
本文所用的术语“氧化还原辅因子”是指可充当酶促转移的氧化还原等同物，且特别是氢负离子（H-）的受体的分子。该氧化还原辅因子优选是PQQ、NAD或FAD。要理解的是，要包括在本发明的测试化学基质中的氧化还原辅因子取决于所考虑的脱氢酶的性质。例如，PQQ与PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶组合在根据本发明的组合物中，NAD与NAD依赖性葡萄糖脱氢酶组合在根据本发明的组合物中，且FAD与FAD依赖性葡萄糖脱氢酶组合在根据本发明的组合物中。根据本发明的氧化还原辅因子还可优选是PQQ、NAD或FAD的衍生物。NAD的优选衍生物是WO 2007/012494中公开的那些，其在公开的NAD/NADH和/或NADP/NADPH衍生物方面通过引用并入本文。根据本发明的氧化还原辅因子更优选是如WO 2007/012494中公开的carbaNAD。
相应地，术语“能在氧化还原等同物存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂”是指在氧化还原等同物存在下能够引发指示试剂中的至少一种可测性质的变化的分子。根据本发明要理解的是，该试剂也可引发指示试剂的多于一种可测性质的变化，这随后可检测。此外，该试剂优选也可引发多于一种指示试剂的可测性质的变化，这随后可检测。
如上文提到的试剂优选能够直接或间接，即经由另一介体，将氧化还原等同物从氧化还原辅因子转移到指示试剂中。由于氧化还原等同物的所述转移，指示试剂被改性以致发生至少一种可测性质的变化。在该可测性质是光学性质的情况下，优选地，例如，可以通过由在还原状态下的试剂介导的氧化还原等同物的转移将在氧化状态下的无色或无荧光指示试剂转化成有色或荧光指示试剂。氧化还原等同物的转移可以是直接的，即通过该试剂将氧化还原等同物转移到指示试剂中，或可以是间接的。在后一情况下，将氧化还原等同物从该试剂转移到中间介体中，其随后将氧化还原等同物转移到指示试剂中。要理解的是，优选可使用多于一种介体。例如，该试剂可以将氧化还原等同物转移到第一介体中，其随后将氧化还原等同物转移到第二介体中，且所述第二介体随后将氧化还原等同物转移到指示试剂中。要理解的是，在这种介体级联中，可以使用多于两种介体。使用一种或多种介体将氧化还原等同物转移到指示试剂中的优点在于，可以改进可测性质的检测时机。
可用于本发明上下文中的介体是本领域中公知的并包括例如铁氰化钾、醌衍生物、尼罗蓝（CAS号: 3625-57-8）、Meldola蓝（CAS号: 7057-57-0）、如EP 1 457 572 B1中公开的锇络合物、过渡金属络合物，如六胺合氯化钌或亚硝基-苯胺-衍生物。
优选考虑的根据本发明的试剂是吩嗪。所述吩嗪更优选是硫代硫酸吩嗪、甲硫吩嗪、1-(3-羧基丙氧基)-5-乙基吩嗪三氟甲磺酸盐或1-甲氧基吩嗪-甲基硫酸盐。这样的吩嗪可用于引发指示试剂的至少一种光学性质的变化。关于检测和关于如何应用这样的吩嗪的细节可见于EP 0 654 079 A1。本文中考虑的试剂也优选是醌。所述醌更优选是菲醌、菲咯啉醌或苯并[h]-喹啉醌。本文中考虑的另一试剂是亚硝基苯胺。所述亚硝基苯胺更优选是[(4-亚硝基苯基)亚氨基]二甲醇-盐酸盐。所述亚硝基苯胺最优选是4-双(羟乙基)-1-亚硝基-苯胺或4-双(羟乙基)-3-甲氧基-1-亚硝基苯胺。本发明也优选考虑能在氧化还原等同物存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂，所述试剂是能够催化氧化还原等同物从氧化还原辅因子转移到指示试剂中的酶。
本文所用的术语“指示试剂”优选涉及根据本发明的酶的活性，优选与本发明的酶的活性成比例地改变至少一种可测（优选光学）性质的化合物。优选地，该指示试剂是当至少一种酶或当该测试化学基质中包含的酶与被分析物反应时表现出至少一种光学可检出的性质变化的光学指示剂物质。因此，所述至少一种指示试剂优选包含一种或多种表现出指示所述至少一种酶和被分析物的酶促反应的光学性质变化的染料。该指示试剂的光学性质根据本发明随本发明的酶的活性而变。因此，优选地，只有在酶催化该检测反应时才发生光学性质的变化。更优选地，光学性质的变化与测试化学基质中存在的酶经历的催化循环数成比例。因此，最优选地，光学性质的变化与被该酶转化的被分析物分子数成比例。
优选地，该指示试剂中的光学性质变化在包含所述指示试剂的测试化学基质中可测量。因此，所述至少一种光学性质可以是在被分析物存在下改变并可转化成任何种类的光学信号的测试化学基质的任何性质。优选地，光学性质的变化和/或可由其生成的信号与样品中的被分析物浓度成比例。另外或替代地，可能存在光学性质、光学性质变化和/或可由其生成的信号和样品中的被分析物浓度之间的预定或可测定的关系，其可用于由该信号获得该浓度。
技术人员会理解的是，测定的测试化学基质的可测性质也可以是不同于介体和/或指示试剂的该测试化学基质的化合物的性质，在这种情况下，可以从测试化学基质中省去该介体和/或指示试剂；例如，优选地，可以通过UV辐照检测NAD或其衍生物的酶促还原。相应地，氧化还原辅因子、介体和指示试剂可优选是相同化合物。
本文所用的术语“被分析物”涉及体液中存在的化合物。该被分析物优选是小分子，即该被分析物优选不是生物大分子。该被分析物更优选是有机分子，最优选是能在根据本发明的测试化学存在下经历氧化还原反应的有机分子。该被分析物优选是对象的代谢的分子。该被分析物也优选是低分子量化合物，更优选是分子质量小于1000 u（1000 Da；1.66×10−24 kg）的化合物。该被分析物更优选选自苹果酸盐、乙醇、抗坏血酸、胆甾醇、甘油、脲、3-羟基丁酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、甘油三酯、酮、肝参数、肌酸酐、HDL等；该被分析物更优选是血糖。优选地，该被分析物是血糖且待测定的实际浓度为至少10 mg/dL、至少50 mg/dL、至少60 mg/dL、至少70 mg/dL、至少80 mg/dL、至少90 mg/dL、至少100 mg/dL、至少110 mg/dL、至少120 mg/dL、至少130 mg/dL、至少140 mg/dL或至少150 mg/dL。优选地，该被分析物是葡萄糖且待测定的浓度为0 mg/dL至800 mg/dL，或更优选10 mg/dL至600 mg/dL，或最优选50 mg/dL至300 mg/dL。
本文所用的术语“体液”涉及已知包含或疑似包含本发明的被分析物的对象的所有体液，包括血液、血浆、血清、泪液、尿、淋巴液、脑脊液、胆汁、粪便、汗液和唾液。该体液优选是血液。术语“样品”是技术人员理解的并涉及体液的任何子部分，优选在将所述样品施加到测试元件上之前从对象移除。样品可通过公知技术获得，包括例如静脉或动脉穿刺、表皮穿刺等。
此外，本发明涉及制造测试化学基质的方法，其包括以下步骤：
a) 获得根据本发明的多肽分子交联方法的交联酶分子和/或根据本发明的交联多肽分子的配制品，和
b) 混合氧化还原辅因子、能在氧化还原等同物存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂、指示试剂和步骤a)中获得的交联酶分子配制品，并由此
c) 生产测试化学基质。
此外，本发明涉及用于测定来自体液样品的被分析物的诊断测试元件，其在载体上包含本发明的测试化学基质。
本发明的上下文中所用的术语“载体”是指在其上施加本发明的测试化学基质的固体载体。优选可以将测试化学基质固定化在载体上。此外，还考虑可以将测试化学基质在空间上布置在载体上。必须以能够检测指示试剂的所述至少一种可测性质的变化的方式布置该载体，即其优选不含会干扰所述至少一种可测性质的检测的组件或空间布置。合适的载体可包括含有本发明的组合物的管瓶，例如以孔板形式布置的管瓶。另一些测定可应用光波导管或半导体板。但是，优选载体是用于测试条的那些。所述测试条通常包含一个或多个形成固体载体的层。
优选地，本发明的诊断测试元件包含含有所述测试化学基质的测试场，其中该测试场具有样品施加侧（在其上施加体液样品）和检测侧（其能够检测在被分析物与测试化学基质的组分反应时可测性质的变化）。将样品施加到样品施加侧上，并优选考虑到，血液样品中存在的细胞，如红细胞不到达检测侧。关于这样的诊断测试元件及其制造的细节可见于EP 0 821 234 B1。根据本发明考虑的另一些测试元件是EP 1 035 919 B1或EP 1 035920 B1中公开的那些。
本发明的诊断测试元件的测试场优选包含透明箔，在其上施加一个，更优选多于一个膜层。该诊断测试元件的膜层由聚合物成膜剂的分散体或乳液生产。分散体成膜剂含有不溶于载体液体（通常是水）并细分散在载体液体中的微观聚合物粒子。如果在成膜过程中通过蒸发除去液体，那么粒子会互相靠近并精细地彼此接触。在这一过程中出现的大的力和伴随着成膜的表面能增加导致粒子生长成基本闭合的膜层。或者，也可以使用成膜剂的乳液，其中将其溶解在溶剂中。溶解的聚合物在与该溶剂不混溶的载体液体中乳化。聚乙烯酯、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚酰胺和聚苯乙烯特别适合作为这样的成膜剂的聚合物。除均聚物外，如丁二烯、苯乙烯或马来酸酯的混合聚合物也合适。
通过加入充分溶胀的溶胀剂（即在吸水时体积变大的物质），不仅获得可相对迅速地被样品液体渗透的层，而且尽管溶胀剂的这种打开效应（opening effect），该层还具有良好的细胞（例如红细胞以及另外血色素）分离性质。溶胀性质应该如此好以致对于所述至少一种可测性质的变化主要依赖于样品液体渗透通过该层的测试而言，在最多1分钟后可测量该可测性质的变化。尤其合适的溶胀剂经证实是甲基乙烯基醚马来酸酐共聚物、黄原胶和甲基乙烯基醚马来酸共聚物。
诊断测试元件的单层布置是现有技术中已知的，参见例如EP 1 566 637和EP 1780 288。更优选的双层布置优选包含以此顺序彼此叠加的第一和第二膜层。重要的是，位于透明箔上的第一层比上覆的第二层散射明显更少的光。透明箔的未涂布侧被称作检测侧，且与第二层位于第一层上的侧面相对的第二层的侧面被称作样品施加侧。这两个所谓膜层位于根据本发明的诊断测试载体的测试场中的透明箔上。为此考虑不透液体的那些塑料箔。聚碳酸酯箔经证实特别合适。这两个膜层可以由含有相同聚合物成膜剂的涂料化合物生产或它们可以由含有不同聚合物成膜剂的涂料化合物生产。第一层含有溶胀剂和任选弱光散射填料，而第二层需要溶胀剂和在任何情况下，至少一种强散射光的颜料。此外，第二层还可含有无孔填料以及多孔填料。
在可优选用于电化学检测的单层膜的情况下，本发明的交联多肽包含在所述单层中。在多层（即多于一个层）布置的情况下，本发明的交联多肽优选包含在一个膜层，更优选第一膜层中。
为了优化根据本发明的诊断测试元件中的测试场，当所有膜层，优选在双层布置的情况下两个层都含有非溶血润湿剂时经证实特别有利。中性，即不带电润湿剂特别优选用于此。最特别优选N-辛酰基-N-甲基葡糖酰胺。
为了生产根据本发明的诊断测试元件的双层测试场，各膜层各自相继由所述组分的均匀分散体生产。为此，使用透明箔作为基底以供第一膜层的涂料化合物成型。在已经以特定层厚度施加第一膜层的涂料化合物后，将该层干燥。此后也以薄层厚度在该层上施加第二层的涂料化合物并干燥。以该方式生产的测试场可安装在载体层上以便更好操作，为这样的层考虑不吸收待检查的液体的那些材料。这些是所谓的非吸收性材料，例如由聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚碳酸酯或聚酰胺制成的塑料箔特别优选。金属箔或玻璃适合作为其它载体材料。
在根据本发明的测试元件的一个优选实施方案中，待观察并测量指示试剂的至少一种光学性质的变化的测试场的检测侧应该透过载体层可见以测定要在体液样品中检测的被分析物。这可以通过透明载体层实现。但是，载体层也可具有被测试场的检测侧覆盖的穿孔。检测侧随后透过该穿孔可见。优选地，在根据本发明的诊断测试元件中，在测试场的检测侧下方的载体层中存在孔，可透过其观察测试场的检测侧。该孔的直径略小于测试场的最小线性尺寸以使该孔外的测试场位于载体层上并可附着在此。
在根据本发明的测试元件的另一优选实施方案中，该测试元件包含毛细管。这样的布置是现有技术中已知的，例如从EP 1 035 921已知。在另一优选实施方案中，根据本发明的测试元件由测试元件带生产，参见例如EP 1 593 434或是测试条。此外，在另一优选实施方案中，该诊断测试元件包含在盒中，所述盒优选包含多个诊断测试元件。
本发明还涉及用于疾病诊断的包含根据本发明的交联多肽分子的配制品和/或根据本发明的交联多肽分子。相应地，本发明涉及用于疾病诊断的可根据多肽分子交联方法获得的交联多肽分子的配制品；并涉及用于疾病诊断的交联多肽分子，其中所述多肽分子根据本发明通过包含至少40个邻接原子的无支链侧链交联。
本文所用的术语“诊断”是指评估对象患有或将患有本说明书中提到的疾病或病况的概率。本领域技术人员会理解，这样的评估通常无意对100%的待诊断对象正确。但是，该术语要求统计上显著部分的对象可被正确诊断为患有该疾病或病况。本领域技术人员可以使用各种公知的统计评价工具（例如置信区间的测定、p-值测定、Student´s t-测试、Mann-Whitney测试等）不费周折地确定该部分是否统计上显著。细节见于Dowdy和Wearden,Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。优选的置信区间是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。p-值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明考虑的概率能使该诊断对给定群体或人群的至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的对象正确。
本文所用的术语“疾病”涉及与正常代谢的任何临床相关偏差。相应地，“疾病诊断”涉及测定至少一个临床相关参数和/或紧急参数，包括但不限于苹果酸盐、乙醇、抗坏血酸、胆甾醇、甘油、脲、3-羟基丁酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、甘油三酯、酮、肝参数、肌酸酐、HDL等，并优选评估是否存在与正常代谢的临床相关偏差。技术人员会理解的是，诊断优选包括测定不存在所述临床相关偏差，即优选通过排除法诊断。
此外，本发明涉及用于糖尿病诊断的包含根据本发明的交联多肽分子的配制品和/或根据本发明的交联多肽分子。相应地，本发明涉及用于糖尿病诊断的可根据多肽分子交联方法获得的交联多肽分子的配制品；并涉及用于糖尿病诊断的交联多肽分子，其中所述多肽分子根据本发明通过包含至少40个邻接原子的无支链侧链交联。
本发明还涉及可通过根据本发明的方法获得的交联多肽分子和/或根据本发明的交联多肽分子用于制造根据本发明的测试化学基质和/或根据本发明的诊断测试元件的用途。
此外，本发明涉及可通过根据本发明的方法获得的交联多肽分子和/或根据本发明的交联多肽分子用于制造诊断组合物的用途。
此外，本发明涉及制造诊断测试元件的方法，其包括在载体上生成本发明的测试化学基质的步骤。
本说明书中引用的所有参考资料就它们的全部公开内容和本说明书中具体提到的公开内容通过引用并入本文。
总结本发明的发现，下列实施方案是优选的：
实施方案1：交联多肽分子的方法，其包括在适合发生交联反应的条件下在溶液中组合交联剂和多肽分子的步骤。
实施方案2：实施方案1的方法，其中所述多肽是酶。
实施方案3：实施方案1或2的方法，其中所述交联剂包含至少40个原子的连续链。
实施方案4：实施方案1至3任一项的方法，其中所述交联剂是在两端都化学活化的无支链分子。
实施方案5：实施方案1至4任一项的方法，其中所述交联剂是双活化的聚乙二醇。
实施方案6：实施方案1至5任一项的方法，其中所述交联剂是双-N-羟基-琥珀酰亚胺活化的聚乙二醇（O,O'-双[2-(N-琥珀酰亚胺基-琥珀酰基氨基)乙基]聚乙二醇）。
实施方案7：实施方案1至6任一项的方法，其中所述交联剂具有0.6 kDa至20 kDa，优选0.9 kDa至10 kDa，更优选1 kDa至5 kDa，最优选3 kDa的分子质量。
实施方案8：实施方案1至7任一项的方法，其中所述多肽分子以0.1 mM至5 mM，优选0.3 mM至4 mM，更优选2.5 ± 1 mM的初始浓度存在于所述溶液中。
实施方案9：实施方案1至8任一项的方法，其中交联剂 / 多肽分子的摩尔比为0.2至5，优选0.5至4，更优选0.8至3，最优选1至2。
实施方案10：实施方案1至9任一项的方法，其中所述溶液具有7至9，优选7.5至8.8，更优选8.3 ± 1，最优选8.3的pH。
实施方案11：实施方案1至10任一项的方法，其中至少一部分多肽分子是脱氢酶分子，优选其中至少80%的多肽分子是脱氢酶分子，更优选其中至少90%的多肽分子是脱氢酶分子。
实施方案12：实施方案1至11任一项的方法，其中至少一部分多肽分子是葡萄糖脱氢酶分子，优选其中至少80%的多肽分子是葡萄糖脱氢酶分子，更优选其中至少90%的多肽分子是葡萄糖脱氢酶分子。
实施方案13：实施方案1至12任一项的方法，其中至少一部分多肽分子是GlucDHE170K/Q252L分子，优选其中至少80%的多肽分子是GlucDH E170K/Q252L分子，更优选其中至少90%的多肽分子是GlucDH E170K/Q252L分子。
实施方案14：实施方案1至13任一项的方法，其中在溶液中组合交联剂和多肽分子包括优选在搅拌下将所述交联剂逐滴添加到包含所述多肽分子的溶液中。
实施方案15：实施方案1至14任一项的方法，其中在溶液中组合交联剂和多肽分子包括将溶解在相容有机溶剂中的所述交联剂逐滴添加到包含所述多肽分子的溶液中。
实施方案16：实施方案15的方法，其中所述相容有机溶剂是二甲亚砜（DMSO）。
实施方案17：配制品，其包含可通过实施方案1至16任一项的方法获得的交联多肽分子。
实施方案18：交联多肽分子，其中所述多肽分子通过包含至少40个邻接原子的基本无支链交联基团交联。
实施方案19：实施方案18的交联多肽分子，其中所述多肽是酶，优选脱氢酶。
实施方案20：实施方案18或19的交联多肽分子，其中所述多肽是葡萄糖脱氢酶，优选GlucDH E170K/Q252L。
实施方案21：实施方案18至20任一项的交联多肽分子，其中所述交联基团是聚乙二醇链。
实施方案22：测试化学基质，其包含氧化还原辅因子、能在氧化还原等同物存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂和指示试剂，其中所述化学基质进一步包含可通过根据实施方案1至16任一项的方法获得的交联酶和/或根据实施方案19至21任一项的交联多肽分子。
实施方案23：实施方案22的测试化学基质，其中所述氧化还原辅因子、所述能够引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂和/或所述指示试剂是相同化合物。
实施方案24：生产测试化学基质的方法，其包括以下步骤：
a) 获得根据实施方案2至16任一项的方法的交联酶分子和/或根据实施方案19至21任一项的交联酶分子的配制品，和
b) 混合氧化还原辅因子、能在氧化还原等同物存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂、指示试剂和步骤a)中获得的交联酶分子的配制品，并由此
c) 生产测试化学基质。
实施方案25：实施方案24的方法，其中所述氧化还原辅因子、所述能够引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂和/或所述指示试剂是相同化合物。
实施方案26：用于测定来自体液样品的被分析物的诊断测试元件，其在载体上包含实施方案22或23的测试化学基质。
实施方案27：实施方案26的诊断测试元件，其中至少一部分测试化学基质包含在测试场中。
实施方案28：实施方案26或27的诊断测试元件，其中所述诊断测试元件是测试条或测试带。
实施方案29：实施方案26至28任一项的诊断测试元件，其包含在盒中。
实施方案30：用于疾病诊断的根据实施方案17的包含交联多肽分子的配制品和/或根据实施方案18至21任一项的交联多肽分子。
实施方案31：用于糖尿病诊断的根据实施方案17的包含交联多肽分子的配制品和/或根据实施方案18至21任一项的交联多肽分子。
实施方案32：可通过根据实施方案1至16任一项的方法获得的交联多肽和/或根据实施方案18至21任一项的配制品用于制造根据实施方案22或23的测试化学基质和/或根据实施方案26至29任一项的诊断测试元件的用途。
实施方案33：可通过根据实施方案1至16任一项的方法获得的交联多肽和/或根据实施方案18至21任一项的配制品用于制造诊断组合物的用途。
实施方案34：制造诊断测试元件的方法，其包括在载体上生成根据实施方案22或23的测试化学基质的步骤。
附图简述
将优选连同从属权利要求，在随后的优选实施方案描述中更详细公开本发明的其它任选特征和实施方案。在此，如技术人员会认识到的，各个任选特征可以以独立方式以及以任何任意可行的组合实现。本发明的范围不受优选实施方案限制。这些实施方案示意性描绘在附图中。
在附图中：
图1: 如表1中规定的交联产物的SDS-凝胶色谱分析（该凝胶中的丙烯酰胺浓度为4至12%）；GlucDH2的amphiblue染色。在对应于实验V1的V1道中，没有发现游离GlucDH2。M: 标志物；C: 对照物；V1 - V6: 对应于表1的实验V1 – V6的道。箭头指示GlucDH2单体的位置。V1和V2用NHS PEG交联；V3、V5和V6用环氧-PEG交联。标志物化合物的分子量以kDa标示。
图2: 实验2的反应产物的凝胶渗透色谱法。反应产物在superpose 6 10/300柱上用150 mM磷酸钾缓冲剂/150 mM NaCl, pH 7.0的流动相以0.5 ml/min的流速色谱分离，并在流动池中在280纳米下检测。样品量在每种情况下为1.25毫克蛋白质。X轴: 洗脱体积(ml)；Y轴: 在280纳米下的吸光度（任意单位）。
图3: 扩散试验的步骤的示意图：借助移液管124将20微升缓冲剂122移液到葡萄糖测试条120上。在1分钟后，将10微升缓冲剂122抽取到移液管124中并用于进一步分析。
图4: 直接在产生层后包含荧光标记酶的干燥测试条的荧光显微照片。A: 游离GlucDH2 B: 交联GlucDH2。在图4A中，在其中原始包含标记酶的第一层128和标记酶扩散到其中的第二层130都可见。在图4B中，只有在其中原始并入标记酶的第一层128可见。
图5: 储存在各种条件下时测试条的第一和第二层之间的荧光信号扩散的荧光显微评估的定量评估。X轴: 培养时间（天）；Y轴: 存在于第二层中的酶量与存在于第一层中的酶量的比率。A: 游离GlucDH2；B: 交联GlucDH2。
图6: GlucDH2在各种储存条件下的稳定性F: 游离酶；X: 交联酶；A: 干燥温暖条件；B: 湿润温暖条件。X轴: 培养时间（天）；Y轴: 相对于时间 = 0天的残留活性(Arel)(%)。
图7: 在干燥温暖条件或湿润温暖条件下储存后的GlucDH2迁移率。F: 游离GlucDH2；X: 交联GlucDH2。A: 在干燥温暖条件下储存；B: 在湿润温暖条件下储存。X轴:培养时间（天）；Y轴: 迁移率百分比(%)。
图8: 在各种葡萄糖浓度下的GlucDH2性能。在每种情况下，标示依赖于葡萄糖测试条的葡萄糖浓度的相对缓解（relative remission）。X轴: 以mg/dL计的葡萄糖浓度；Y轴: 相对缓解(%)。F: 游离GlucDH2；X/U: 交联GlucDH2，未纯化（包含一部分游离酶），X/P:交联GlucDH2，纯化（不含游离酶）。
实施例
实施例1:
在交联GlucDH2的第一次尝试中，使用短链双-环氧-和双-NHS-活化的聚乙二醇（PEG），使用下列比率：0.3 mM GlucDH2（在10 mg/ml蛋白质溶液中）与10倍过量的双-NHS-活化的PEG或50倍过量的双-环氧活化的PEG反应。在pH 7.5的0.1摩尔磷酸钾缓冲剂中进行反应，在搅拌下在室温下逐滴加入活化PEG。与双-环氧活化的PEG在低分子质量（380和520 g/mol）下反应导致GlucDH2活性的完全损失，而在中等分子质量（980 g/mol）下可以保持85%的活性。这一实验显示为防止GlucDH2中的基本赖氨酸残基反应（这可导致该酶的完全失活）而需要的活化连接基（linker）最低分子质量。但是，通过与环氧活化的PEG交联不能获得高分子量蛋白质聚集体（图1）。相反，分子质量为3,000和10,000 g/mol的NHS活化的PEG表现出保持活性以及交联（表1，图1和2）。使用superose 6-柱通过凝胶渗透色谱法分析与3,000 g/mol双-NHS活化的PEG交联的产物。发现上述条件主要导致PEG化（PEGylation）而非交联。
表2:
摩尔比 1 : 0 1 : 0,5 1 : 1 1 : 1,5 1 : 2
对于2,85 mM GlucDH2的PEG浓度 0 1,42 mM 2,85 mM 4,2 mM 5,7 mM
经由GPC的mol. wt (kDa) 112 112-250 250-1000 1000-2000 无GPC
%迁移率(上清液试验) 100% 73% 14,5% 6,8% 1,4%
测试条中的稳定性(%残留活性, 1周, 35℃, 85%相对湿度) 72% 90% 81% 119% 111%
实施例2:
为了优化交联，显著增加蛋白质的量以提高分子间反应。也提高pH值以改进酶中包含的氨基对NHS基团的反应性。此外，将NHS活化的PEG溶解在二甲亚砜（DMSO）中以避免NHS基团的过早水解。相应地，使用下列改进的反应条件：2.85 mM GlucDH2（80 mg/ml蛋白质溶液）与0.5至2倍过量的双-NHS-活化的PEG（3,000 g/mol）反应。在pH 8.3的0.2摩尔碳酸氢钠缓冲剂中进行交联，在搅拌反应混合物的同时通过在室温下缓慢滴加加入溶解在DMSO中的NHS活化的PEG。将所得粘性溶液相对于pH 7.0的0.05摩尔磷酸钾/钠缓冲剂渗析。通过活性测定法测定活性并通过凝胶渗透色谱法测定产物的尺寸。如图2中所示，由1:1的酶 :PEG的摩尔比开始，没有观察到游离GlucDH2；将摩尔比提高到1:1.5，大交联产物的比例增加。
将实施例2中产生的交联酶包含到双层葡萄糖测试条的第一层中并评估酶的稳定性和迁移率。如表2中所示，酶 : PEG的摩尔比的提高导致产生更大的交联产物。当使用1:1.5的摩尔比时，如通过凝胶渗透色谱法测定的由此产生的GlucDH2的分子量从112 kDa（游离酶）提高到高达2,000 kDa。相应地，该酶在测试条中的迁移率随着交联产物的尺寸提高而强烈地降低。在35℃和85%相对湿度下测试测试条中的稳定性并与游离GlucDH2相比没有明显不同。
实施例3:
在进一步实验中，测试分子质量> 3,000 g/mol的NHS活化的PEG；但是，发现交联没有实施例2中有效。此外，用分子质量为10,000和20,000 g/mol的NHS活化的PEG获得的交联产物产生极粘产物，这使进一步加工困难。因此，发现分子质量> 3,000 g/mol的PEG较不优选用于交联GlucDH2。
实施例4:
对于下列实验，使用下列标准反应条件使GlucDH2交联：在室温下搅拌的同时，通过缓慢滴加，向2.85 mM GlucDH2（80 mg/ml蛋白质溶液）在pH 8.3的0.2摩尔碳酸氢钠缓冲剂中的溶液中加入DMSO中的NHS-PEG至4.2 mM的浓度。将所得粘性溶液相对于包含0.2摩尔NaCl的pH 7.0的0.05摩尔磷酸钾/钠缓冲剂渗析3次并相对于pH 7.0的0.05摩尔磷酸钾/钠缓冲剂渗析1次。进一步表征由此产生的交联产物。
a) 固定化试验（上清液试验）
作为用于酶固定化的第一试验，将20微升缓冲剂移液到包含各GlucDH2配制品的测试化学上并培养1分钟。在这一时间后，抽取10微升缓冲剂并分析GlucDH2活性。扩散到缓冲剂中的活性作为施加的总活性的百分比表示在表2中。从表2中可以看出，可扩散酶的量随着交联产物的分子量提高而显著降低。
b) 扩散试验（荧光显微法）
对于这一测定，将GlucDH2化学偶联到可在650纳米的波长下激发以产生在668纳米下的荧光发射的荧光染料Alexa647上。在如上所述的交联反应中使用荧光标记酶并将其施加到2层葡萄糖测试条的第一层上。将该条在各种条件下储存各种时间，此后通过荧光显微法检查酶的定位（图4和5）。发现基本可以防止酶扩散到第二层中。
实施例5: 交联GlucDH2的稳定性
也检查根据该方法生产并储存在实施例4中指出的条件下的测试条在几天后的剩余活性（图6）。发现在干燥温暖条件（35℃ / 0%相对湿度）下，没有发现游离酶和交联酶之间的显著差异。相反，在湿润温暖条件（35℃ / 85%相对湿度）下55天后，交联酶表现出高20%的残留活性。
对于上述测试条，也进行对迁移率的上清液试验（实施例4a））。发现游离GlucDH2具有3至6%的平均迁移率，而交联GlucDH2在所有条件下具有小于1%的迁移率，表明该酶在测试条的第一层中的固定化（图7）。
实施例6:
为了比较游离GlucDH2和交联GlucDH2的动力学和信号动态，测试包含所述酶配制品之一的测试条的动力学和信号动态参数。发现该酶的交联没有造成显著差异。令人惊讶地，在使用cNAD化学的比色测试条中，cNADH的扩散看起来如此快以致不能观察到第一层（这是光度检查的层）中提高的颜色生成。相反，产生杂多蓝作为最终有色反应产物的不同化学表现出不同的行为：特别在小于200 mg/dl的葡萄糖浓度下，与游离酶相比，如果使用交联酶，所得信号的葡萄糖依赖性强得多，导致该系统的性能显著改进。
附图标记列表
120 葡萄糖测试条
122 缓冲剂
124 移液管
128 葡萄糖测试条的第一层
130 葡萄糖测试条的第二层

Claims (15)

1.交联多肽分子的方法，其包括在适合发生交联反应的条件下在溶液中组合交联剂和多肽分子的步骤。
2.权利要求1的方法，其中所述多肽是酶。
3.权利要求1或2的方法，其中所述交联剂是在两端都化学活化的无支链分子。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述交联剂是双活化的聚乙二醇。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述交联剂具有0.6 kDa至20 kDa，优选0.9 kDa至10 kDa，更优选1 kDa至5 kDa，最优选3 kDa的分子质量。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中交联剂/多肽分子的摩尔比为0.2至5，优选0.5至4，更优选0.8至3，最优选1至2。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中至少一部分多肽分子是葡萄糖脱氢酶分子，优选其中至少80%的多肽分子是葡萄糖脱氢酶分子，更优选其中至少90%的多肽分子是葡萄糖脱氢酶分子。
8.配制品，其包含可通过权利要求1至7任一项的方法获得的交联多肽分子。
9.交联多肽分子，其中所述多肽分子通过包含至少40个邻接原子的基本无支链交联基团交联。
10.权利要求9的交联多肽分子，其中所述多肽是酶，优选脱氢酶。
11.测试化学基质，其包含氧化还原辅因子、能在氧化还原等同物存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂和指示试剂，其中所述化学基质进一步包含可通过根据权利要求1至7任一项的方法获得的交联多肽分子和/或根据权利要求9或10的交联多肽分子的配制品。
12.用于测定来自体液样品的被分析物的诊断测试元件，其在载体上包含权利要求11的测试化学基质。
13.用于疾病诊断的可通过根据权利要求1至7任一项的方法获得的交联多肽分子和/或根据权利要求9或10的交联多肽分子的配制品。
14.用于糖尿病诊断的可通过根据权利要求1至7任一项的方法获得的交联多肽分子和/或根据权利要求9或10的交联多肽分子的配制品。
15.用于生产测试化学基质的方法，其包括以下步骤：
a) 获得根据权利要求2至7任一项的方法的交联酶分子和/或根据权利要求10的交联酶分子的配制品，和
b) 混合氧化还原辅因子、能在氧化还原等同物存在下引发指示试剂的至少一种可测性质的变化的试剂、指示试剂和步骤a)中获得的交联酶分子的配制品，并由此
c) 生产测试化学基质。
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