JPH01181798A - 胆汁酸測定用試験紙 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は体液中の胆汁酸の量を測定する試験紙に関する
。

（従来の技術） 胆汁に含有される胆汁酸は血液、尿などの体液中にも微
量含有される。このような体液中の胆汁酸は肝胆道系疾
患によりその量が変化し、特に血液中の胆汁酸量はこの
ような疾患の鋭敏なマーカーとなることが知られている
。例えば、乳児の胆道閉塞症においては血液中もしくは
尿中の胆汁酸量が増加することが知られている。

胆道閉塞症は乳児約１万人あたり１人という高率で発生
しており、患者は迅速な手術が必要とされる。疾病の認
知が遅れた場合には死亡率も高い。このような疾患を早
期発見するためにも体液中、特に、血液中の胆汁酸を集
団検診時などに精度良く測定することが望まれる。

胆汁酸を含有する試料溶液中の胆汁酸量を測定する方法
は、例えば、特公昭５９−１３１９７号、特開昭５６−
１４４０９６号勿よび特開昭５６−１５１４９９号公報
に開示されている。

それによれば、まず、胆汁酸を含む試料を酸性下で熱処
理しく特公昭５９−１３１９７号公報）、あるいは、オ
キサミド酸、ピルビン酸などを添加して（特開昭５６−
１４４０９６号公報、特開昭５６−１５１４９９号公報
）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）などの、測定を妨害する酵
素を失活させる。次いで、これに３α−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼ（３α−Ｈ５Ｄ）、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ジアホラー
ゼおよびテトラゾリウム塩を含有する反応用溶液をＰＨ
８〜９のアルカリ条件下で反応させる。胆汁酸の水酸基
は３α−Ｈ５Ｄの存在下でＮＡＤ＋と反応してカルボニ
ル基となり次のようにケト型の胆汁酸を生じる。

ＮＡＤＨはジアホラーゼの存在下で電子受容性の色原体
であるテトラゾリウム塩と反応して次のようにホルマザ
ンを生じる。ＮＡＤＨは再び酸化されてＮＡＤ＋となる
。テトラゾリウム塩の代わりにレザズリンを用いてもよ
く、この場合はレゾルフィンが生成する。

生じたホルマザン（レゾルフィン）のモル数はＮＡＤＨ
のモル数（つまり、胆汁酸のモル数）に相当する。その
ため、このホルマザンの吸光度（レゾルフィンの蛍光強
度）を測定することにより胆汁酸を定量することが可能
である。

このような方法により試料中の胆汁酸を感度良（測定す
ることができるが、溶液系での反応を利用した測定法で
あるため煩雑な操作を必要とする。そのため、マススク
リーニングや簡便に胆汁酸を検出するためには不適当で
ある。

このような欠点を解決するため、特開昭６１−２６８１
９９号公報では、高分子素材からなる担体に３α−Ｈ５
Ｄ１ＮＡＤ＋、ジアホラーゼ＄よびテトラゾリウム塩か
らなる試薬系組成物が担持された胆汁酸測定用試験紙が
開示された。

この試験紙と体液中の胆汁酸が接触すると、溶液法の場
合と同様に胆汁酸の水酸基が３α−Ｈ５Ｄの存在下でＮ
ＡＤ＋と反応してカルボニル基となりケト型胆汁酸を生
じる。ＮＡＤＨはジアホラーゼの存在下でテトラゾリウ
ム塩と反応してホルマザンを生じる。ＮＡＤＨは再び酸
化されてＮＡＤ＋となる。生じたホルマザンのモル数は
ＮＡＤＨのモル数即ち胆汁酸のモル数に相当する。その
ため、このホルマザンによる呈色を肉眼または光学機器
を用いて測定し胆汁酸の量を測定する。

この場合、体液中に胆汁酸以外に試験紙の試薬系組成物
と反応することができる成分が存在し、その結果測定を
不正確なものにすることがある。特に重症患者由来の体
液の場合に、真の胆汁酸値からのズレが大きくなる例が
多い。そのような悪影響を与える成分としては、乳酸と
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、アルコールとアルコール脱
水素酵素、グルタミン酸とグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、アルデヒド類とアルデヒド脱水素酵素および／また
はホルムアミドとホルムアミドデヒドロゲナーゼ等があ
る。

例えば、乳酸と乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が存在すると
、試験紙の試薬系組成物中のＮＡＤ＋と反応して、乳酸
はピルビン酸を生じ、伎成したＮＡＤＨは、ジアホラー
ゼの存在下でテトラゾリウム塩をホルマザンとし該試験
紙を呈色せしめる。

テトラゾリウム塩　　ホルマザン この例のよう杏ζ、胆汁酸を測定すべき体液中に乳酸と
乳酸脱水素酵素が存在する場合には、試験紙の呈色には
胆汁酸による呈色に乳酸が乳酸脱水素酵素によって脱水
素反応したことによる呈色が加わるため、真の胆汁酸量
を測定することができない。

このような欠点を除くため、特公昭５９−１３１９７号
公報では、検体である体液を酸性（ｐ）ｆＯ，１〜６．
０）にし次いで熱処理（温度２０〜４５℃、時間１〜３
０分間）することにより、体液中の酵素を予め失活させ
てお（こと、特開昭６１−２６８１９９号公報の明細書
中では、検体である体液に予めオキサミド酸、ピルビン
酸などを加えＬＤＨ反応などを阻害させることが提案さ
れている。

しかしながら、このような処理は検査技師にとって煩雑
で面倒なことであり、余分な時間を要するという問題点
があった。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の問題点を解決するものであり、その
目的は体液中の胆汁酸を共存生体成分の影響を受けるこ
となく、正確かつ簡便に測定できる試験紙を提供するこ
とにある。

（問題点を解決するための手段詔よび作用）高分子素材
からなる担体の同一個所にの３α−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドもしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
７オスフエイト、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩
からなる試薬系組成物と◎エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、エチレングリコールビス（β−アミノエチル
エーテル）　Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’、Ｎ’四酢酸（ＥＧ
ＴＡ）、ＥＤＴＡないしはＥＧＴＡのアルカリ金属塩か
ら成る群の中から選ばれる一つ以上の添加剤Ｉとθオキ
サミド酸、ピルビン酸、蓚酸、８−クロロ−４ヒドロキ
シ−５メチルキノリン−３カルボン酸およびこれらの塩
から成る群の中から選ばれる一つ以上の添加剤■とが、
担持されたことを特徴とする胆汁酸測定用試験紙により
上記目的が達成される。

更に好ましくは、高分子素材からなる担体の同一個所に
■３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドもしくはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド７オスフエイト、ジアホラ
ーゼおよびテトラゾリウム塩からなる試薬系組成物と◎
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコ
ールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ　、　Ｎ　、
　Ｎ’、　Ｎ’四酢酸（ＥＧＴＡ）、ＥＤＴＡないしは
ＥＧＴＡのアルカリ金属塩から成る群の中から選ばれる
一つ以上の添加剤Ｉとθオキサミド酸、ピルビン酸、蓚
酸、８−クロロ−４ヒドロキシ−５メチルキノリン−３
カルボン酸およびこれらの塩から成る群の中から選ばれ
る一つ以上の添加剤■とが担持された部分Ａと、部分Ａ
に担持されたものから３α−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼのみを欠く成分が担持された部分Ｂとの組
合せよりなることを特徴とする胆汁酸測定用試験紙によ
り上記目的が達成される。

本発明の試験紙に用いられる担体は公知のすべての担体
が用いられつる。すなわち、それらは高分子素材からな
り、具体的には、天然もしくは合成繊維からなる抄紙や
不織布のほかメンブレンフィルターなどである。試料が
尿または血清である場合には、市販の濾紙など天然もし
くは合成繊維からなる抄紙や不織布が好適に用いられる
。試料が全血である場合には、合成繊維からなる抄紙や
不織布、メンブレンフィルターなどが好適に用いられる
。メンブレンフィルターとしては、穴径が０．１〜０，
４μｍの酢酸セルロース系の膜が好ましい。合成紙とし
ては、例えば、種水化学工業Ｍ製のセルポア（親水性タ
イプ）が好適である。

本発明に使用される試薬系組成物は、胆汁酸を基質とす
る３α−Ｈ３ＤおよびＮＡＤ＋、更にＮＡＤ＋の反応生
成物であるＮＡＤＨを基質とするジアホラーゼおよび発
色基質であるテトラゾリウム塩から構成される。

上記試薬系組成物において、ＮＡＤ＋の代わりにニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドフナスフエイト（ＮＡ
ＤＰ＋）が用いられてもよい。ＮＡＤＰ＋もＮＡＤ＋と
同様に補醪素として働き、還元されると還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドフォスフエイト（ＮＡＤ
ＰＨ）を生じ、ＮＡＤＰＨもジアホラーゼの基質として
働く。

以下の説明において、ＮＡＤ＋はＮＡＤＰ＋であっても
よ＜ＮＡＤＨはＮＡＤＰＨであってもよいものとする。

これらの試薬系組成物のうち、ＮＡＤ＋、ジアホラーゼ
および発色基質は、３α−Ｈ５Ｄの働きで体液中の胆汁
酸と反応して試験紙を呈色せしめるばかりでなく、体液
中に含まれる乳酸脱水素酵素などの酸化還元系の酵素と
その基質（例えば乳酸）と反応して試験紙を呈色せしめ
る。

そこで本発明者らは、該試験紙の同一個所に前記試薬系
組成物と共に、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）
　Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　　四酢酸（ＥＧＴＡ）、ＥＤ
ＴＡないしはＥＧＴＡのアルカリ金属塩から成る群の中
から選ばれる一つ以上の添加ｍＩと、オキサミド酸、ピ
ルビン酸、蓚酸、Ｓ−クロロ−４ヒドロキシ−５メチル
キノリン−３カルボン酸セよびこれらの塩から成る群の
中から選ばれる一つ以上の添加剤■とが担持された試験
紙を調製し、体液中の胆汁酸を測定したところ、共存生
体成分の影響を殆どうけることなく、胆汁酸量を正確に
測定できることが分かり、本発明を完成した。

添加剤の使用量は、添加剤Ｉは担体１００ｍあたり１〜
１０．０００■、添加剤■は担体１゜Ｏｄあたり０．１
〜５００Ｍｇの範囲で充分にその効果を発揮できる。

添加剤工の担体への担持に際しては、ＥＤＴＡＪ３よび
ＥＧＴＡはＰＨが７以下の時、水に溶解しにくいので、
これらのアルカリ金属塩、例えば、ＥＤＴＡモノナトリ
ウム、ＥＤＴＡジナトリウム、ＥＧＴＡジカリウム塩等
の形で添加する方が水に溶解し易く、使用しゃすい。

また添加剤を担体へ担持するに際しては、■試薬系組成
物の二部を含浸させる時と同時に行う方法＠該試薬系組
成物の全部を含浸させる時と同時に行う方法θ該試薬系
組成物を含浸させる時とは別に、添加剤の溶液だけを含
浸させる方法などがあり、また添加剤Ｉと添加剤■とを
、同時にあるいは別々に含浸させる方法が考えられるが
、いずれの方法も使用可能である。しかし、テトラゾリ
ウム塩を含まない試薬系組成物を溶解した水溶液中に添
加剤Ｉおよび添加剤■も同時に溶解しておくことにより
、これらを同時に含浸させる方法が、工程数が増えない
ので好ましい。

次に試験紙の調製方法および使用方法について詳しく説
明する。

ＮＡＤ＋、３α−Ｈ３Ｄ、ジアホラーゼ、添加剤工およ
び添加剤■を蒸溜水に溶解した水溶液を調製する。これ
を前記のような担体に含浸させた後、凍結乾燥を行う。

ここで用いられる酵素の由来は特に限定されないが、耐
有機溶剤性、経時安定性などに優れた酵素が好ましい。

このような酵素として、３α−Ｈ５Ｄとしてはシュード
モナステストステローニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔｅ
ｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ　）由来のものが、そしてジアホ
ラーゼとしてはバチルスステアロサーモフィルス（Ｂａ
ｃｉ　１１ｕｓ　　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ　）由来のものが好適に用いられる。３α−Ｈ５Ｄ
およびジアホラーゼは担体１００ｃｌｌあたりそれぞれ
０．１〜ｌ００００１Ｕの割合で、ＮＡＤＰは０．１〜
１００Ｍｇの割合で担持される。過少であると胆汁酸に
よる発色が充分にあこらず、過剰であるとその分解生成
物により酵素反応が阻害される。

上記水溶液中に酵素や補酵素の活性化剤や安定化剤が含
有されていてもよい。酵素活性化剤としては、例えばト
リトンＸ−１００（商品名）などの界面活性剤が好適に
用いられる。そして酵素安定化剤としては、例えばウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）などの蛋白質が好適に用いら
れる。上記界面活性剤や蛋白質が添加されていると、Ｎ
ＡＤＰや酵素（３α−１（ＳＤおよびジアホラーゼ）が
これら化合物に包含される。

このような界面活性剤や蛋白質は、後述のテトラゾリウ
ム塩を担持させる工程で使用される非水溶媒に溶解しな
いため、非水溶液中の色原体であるテトラゾリウム塩と
上記酵素や補酵素が直接接触するのが避けられる。その
結果、保存中における下地の発色が抑制される。

さらに、増粘剤が含有されていてもよい。増粘剤により
、いわゆる窓枠現象が抑制される。

窓枠現象とは、例えば、上記水溶液を担体に含浸させて
乾燥させるときに水溶液中の溶質が担体周辺部に移動し
て濃縮されたり、得られた試験紙に検体溶液を滴下した
ときに試験紙に含有されているＮＡＤＰ、３α−Ｈ８Ｄ
などの試薬が試験紙周辺部に移行して濃縮される現象を
いう。

このような窓枠現象が起こると胆汁酸の測定が正確にな
されない。上記増粘剤としては、メチルセルロース、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。増
粘剤が含まれると担体（試験紙）に含浸された液相の粘
度が増大するため溶質の移動が抑制され、その結果、窓
枠現象が抑制される。上記酵素活性化剤、酵素安定化剤
、増粘剤などはそれぞれ担体Ｚｏｏ−あたり２００ｙ以
下、好ましくは１〜１００ｗｇの割合で担持される。

このように酵素などを含む水溶液が含浸された担体の凍
結乾燥工程では、充分に水分を除去することが重要であ
る。担体に水分が残留していると次工程で担持されるテ
トラゾリウム塩の安定性が極端に低下する。

次に、上記凍結乾燥後の担体にテトラゾリウム塩を非水
溶媒に溶解させた溶液を含浸させる。

テトラゾリウム塩としては、ニトロテトラゾリウムブル
ー（ＮＴＢ）もしくはニトロブルーテトラゾリウム（Ｎ
ＢＴ）と呼ばれる３・３′−（３・３′−ジメトキシ−
４・４′−ビフェニレン）−ビス［２−（ｐ−二トロフ
ェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロラ
イド］が好適に用いられる。

非水溶媒は、テトラゾリウム塩を溶解させることが可能
であればよく、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類；酢酸エチルなどが用いられる。

テトラゾリウム塩は担体１００ｄあたり０．１〜５００
ｗｇの割合で担持される。過少であると胆汁酸による発
色が充分に詔こらず、過剰であると溶媒に溶けにくくな
り、また下地の色が濃くなるので色調の変色の判別が難
しくなる。テトラゾリウム塩溶液を含浸させた担体は速
やかに、好ましくは凍結乾燥により、乾燥される。

このようにして得られた試験紙を、適当な大きさの細片
に裁断しプラスチックフィルム製のスティックの端に貼
着させて試験紙が作製される。

この試験紙を用いて体液などの検体中の胆汁酸の測定が
行われる。

試験紙に検体を滴下させると、従来の技術の項で述べた
反応機構による反応が生じ、ホルマザンが生成し試験紙
が呈色される。この反応は、通常１〜３００秒で起る。

検体中の胆汁酸濃度は次の手順で測定される。

■　適当な反射光測定装置を使用して、検体が滴下され
た試験紙部分に一定波長の光を照射しその反射光強度を
求める。

◎　検体滴下からの経過時間を変えて（例えば、検体滴
下から１０秒後と１２０秒後）この測定を２回行う。

反射光強度は反応が進み呈色が進むと減少する。

θ　２回の測定値の差、すなわち、この経過時間内の反
射光強度の減少度を求める。

■　この反射光強度の差を、予め濃度既知の標準胆汁酸
溶液を検体として作成された、反射光強度の差と胆汁酸
濃度との関係を示す検量線と比較することにより、検体
中の胆汁酸濃度を決定する。

本発明によると、従来の胆汁酸測定試験紙の試薬系組成
物に、添加剤Ｉ右よび添加剤■を加えたところ、胆汁酸
の測定には何ら影響を与えることなく、胆汁酸以外によ
って呈色する反応をほぼ完全に抑制することができた。

この作用について次に考察する。

胆汁酸以外でこの試験紙の呈色を起こす原因物質は、■
前述のＬＤＩ’ｉやアルコール脱水素酵素（ＡＤ１’！
　）などの各種の酵素とその基質、＠発色基質（テトラ
ゾリウム塩）（対する還元物質（例えばアスコルビン酸
）、などが考えられる。

そして、これらの呈色原因物質の反応には、以下に示す
ように金属が微妙に関与している。

すなわち、■に関しては、これらの酵素類は二価の金属
イオンを含有し、これらの金属イオンの存在で酵素活性
を発現する場合が多い。例えば、アルコール脱水素酵素
やアルカリホスフデターゼは亜鉛、アミラーゼはカルシ
ウム、エノラーゼはマグネシウムをその活性発現に必要
とする。

＠に関しては、例えば、アスコルビン酸の還元作用の発
現には、金属の酸化作用が関与していると考えられてい
る。

一方、添加剤Ｉに含まれるＥＤＴＡ％ＥＧＴＡまたはこ
れらのアルカリ金属塩は、アルカリ土類金属、希土類、
遷移金属ときわめて安定な水溶性の錯塩を形成して、金
属を捕捉する。また、微量の金属またはイオンを錯イオ
ンにすることにより、その触媒としての作用を妨げる性
質がある（下記に示すアスコルビン酸が酸化されること
の抑制は、この性質による）。

そこで、ＥＤＴＡ、ｇＧＴＡまたはこれらのアルカリ金
属塩が試験紙に添加されると、ＥＤＴＡなどの金属イオ
ン捕捉作用によって、ＬＤＨ，ＡＤＩ（などの脱水素酵
素、その他この試薬系に影響を与える体液中の諸要素類
の酵素活性の抑制、および体液中のアスコルビン酸など
の還元性を有する物質が酸化されなくなるため、アスコ
ルビン酸などによる発色基質の還元反応の抑制などが起
こると推定される。尚、この時、３α−Ｈ８Ｄおよびジ
アホラーゼの活性発現には、金属イオンは関係していな
いように思われる。従って、添加剤■により胆汁酸の測
定に影響を与えることな（、胆汁酸以外の物質による呈
色反応が抑制できたものと考えられる。

また、添加剤■のオキサミド酸、ピルビン酸、蓚酸、ｓ
−クロロ−４ヒドロキシ−５メチルキノリン−３カルボ
ン酸およびこれらの塩は、いずれもＬＤｉ（の阻害作用
を有する。従って、これらを使用すると、ＬＤＨを触媒
とする体液中の乳酸の反応が抑制される。

以上のように添加剤■および添加剤■の作用により、胆
汁酸以外の物質による呈色反応がそれぞれ単独で使用す
る場合に比べて、より完全に抑制される。

本発明に詔いて、更にいかなる検体に右いても常に正確
に胆汁酸の定量を行うには、一般の生化学物質の分析等
で通常実施されるブランク測定を行うことが好ましい。

即ち対照の試験紙（ブランク測定用）を準備し、一つの
検体を前述したような胆汁酸試験紙と対照の試験紙（ブ
ランク測定用）で試験し、それぞれの反射光強度の差を
胆汁酸の量に相当させるような測定方法である。

このような測定方法には、次のような試験紙が使用され
る。

高分子素材からなる担体の同一個所に■３α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドもしくはニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドフォスフエイト、ジアホラーゼ右よびテトラ
ゾリウム塩からなる試薬系組成物と＠エチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ　）、エチレングリコールビス（β−
アミノエチルエーテル）　Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’、　Ｎ
’四酢酸（ＥＧＴＡ）、ＥＤＴＡないしはＥＧＴＡのア
ルカリ金属塩から成る群の中から選ばれる一つ以上の添
加剤工とθオキサミド酸、ピルビン酸、蓚酸、８−クロ
ロ−４ヒドロキシ−５メチルキノリン−３カルボン酸お
よびこれらの塩から成る群の中から選ばれる一つ以上の
添加剤■とが担持された部分Ａと、部分Ａに担持された
ものから３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
のみを欠く成分が担持された部分Ｂとの組合せよりなる
ことを特徴とする胆汁酸測定用試験紙である。

との試験紙の調製は、次のように行われる。

試験紙の部分Ａは、■試薬系組成物と◎添加剤Ｉとの添
加剤■とを、前述のようにして担体に担持せしめて調製
される。試験紙の１分Ｂは、部分Ａに担持せしめた成分
から３α−Ｈ９Ｄのみを欠く成分を、同様にして担体に
担持せしめて調製される。このようにして得られた試験
紙の部分Ａ、Ｂを、適当な大きさの細片に哉断しプラス
チックフィルム製のスティックの端（貼着させて試験紙
が作製される。この時、試験紙の部分Ａ、Ｂは、別々の
スティックに貼着されても良いし、または、−枚のステ
ィックの両端に貼着されても良い。

この試験紙を使用して、 検体中の胆汁酸濃度は次の手順で測定される。

■　適当な反射光測定装置を使用して、検体が滴下され
た試験紙部分昏こ一定波長の光を照射しその反射光強度
を求める。

＠　検体滴下からの経過時間を変えて（例えば、検体滴
下から１０秒後と１２０秒後）この測定を２回行う。　
　　　　　　　　　　５反射光強度は反応が進み呈色が
進むと減少する。

０２回の測定値の差、すなわち、この経過時間内の反射
光強度の減少度を求める。

■　この測定を同一検体に右いて試験紙の部分ＡとＢに
ついて行い、その反射光強度減少度をそれぞれＲｅｆ（
６）、　Ｒｅｆ　ＱＳ）とする。

■　Δ＝　Ｒｅｆ　（Ａ）　−Ｒｅｆ　（Ｂ）を求め、
予め濃度既知の標準胆汁酸溶液を検体として作成された
、Ｒｅｆ　（Ａ）　−Ｒｅｆ　＠と胆汁酸濃度との関係
を示す検量線と比較することにより、検体中の胆汁酸濃
度を決定する。

この試験紙を使用すると、このように、試験紙の部分Ａ
に生じた呈色度から試験紙の部分Ｂに生じた呈色度を減
じた値を使用して、検体中の胆汁酸量を求められるので
、検体中の共存成分による胆汁酸測定値への影響が除か
れる。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

（施例１ （４）胆汁酸測定用試験紙の調製：３α−Ｈ５Ｄ３０１
　Ｕ、ジアホラー−￥６８００ＩＵ、β−ＮＡＤ＋　１
０．２　ｊ９、ＥＤＴＡ−２Ｎａ　　（同仁化学製）１
００ｓｙ、オキサミド酸ナトリウム５■、ＰＥＧ１６ｓ
ｙ、Ｂ５Ａｌ００Ｍｇ右よびＴｒｉｔｏｎＸ　（商品名
）　１０　Ｉｌｌ　を蒸留水１０ｉｄに溶解した。この
水溶液を３００−の濾紙（Ｗｈａｔｍａｎｎ　Ｋ　３　
）　に含浸させ、凍結乾燥した。

次に、ニトロブルーテトラゾリウム（和光純薬製、ＮＴ
Ｂ）の０．０３４Ｗ／Ｗ％！タノール溶液を調整し、こ
れを上記凍結乾燥後の濾紙に含浸させた後、速やかに乾
燥させた。このようにして得られた試験紙を６　ｓｗ　
Ｘ　１０　ｍの小片に切断し、試験紙の部分Ａを得た。

次に上記の試薬組成中３α−Ｈ３Ｄを除いた以外は全く
同様な方法で試験紙の部分Ｂを調製した。

これらの試験紙の部分Ａ、Ｂを６　Ｘ　６０　ｓａｔの
ポリスチレンフィルム製のスティックの端に両面テープ
で貼着して胆汁酸測定用試験紙を得た。

■）反射光測定装置 反射光強度は第１図に示す装置を使用して測定した。

この測定装置ｌは、試薬を含浸させた胆汁酸測定用試験
紙部分２を載置する透明板３と、この透明板３の下方に
配置された発光素子４と、迷光防止板５を介してこの発
光素子４の近傍に配置された受光素子６と、この受光素
子６で検知された試験紙２からの反射光の強度を数値表
示する表示手段８とを有する。

表示手段８は増巾・測定回路・Ａ−Ｄ変換器７を介して
受光素子６に電気的に接続される。発光素子４と増巾・
測定回路・Ａ−Ｄ変換器７とは測定用スイッチ９にて接
続されている。発光素子４′としては、５００〜６００
ｎｍ付近に発光スペクトルの極大を有する発光ダイオー
ド（スタンレー社製のＥＢＧ５５０４、Ｓ）が用いられ
る。受光素子６としては、５００〜６００ｎｍ付近の波
長の光に感度を有する光検出素子、シリコンホトダイオ
ード（浜松ホトニクス社製の５１２２６−５ＢＱ）がる
。

測定装置１を用い、胆汁酸は次のようにして測定される
。ポリスチレンフィルム製のスティック２１の発端に、
胆汁酸測定用試験紙部分２を貼着し、この試験紙部分２
に検体（尿、血清、検量線作成用標準液など）を滴下す
る。検体の滴下と同時に図外のタイマーをオンとし、同
時にこの試験紙部分２側を透明体３に対向させるかたち
で透明板３上に載置する。遮光カバー２２を閉じる。そ
して、経時的に測定用スイッチ９をオンにし発光素子４
を発光させる。試験紙部分２にて反射された光を受光素
子６にて受け、増巾・測定回路・Ａ−Ｄ変換器７を経て
表示手段８にて反射光強度を数値表示させる。

（Ｃ）　　検量線の作成 正常人プール血清に胆汁酸（コール酸ナトリウム）を加
えて、胆汁酸濃度Ｏ％１０．２５．５０．１００μｍｏ
ｌ／ｌ　　の標準胆汁酸溶液を調製した。

実施例１（Ａ）で調製した試験紙の部分Ａ、Ｂに標準胆
汁酸溶液を２０μＥ滴下させた。滴下１０秒後と１２０
秒後に５４０　ｎｍにおける反射光強度を実施例１０３
）の反射光測定装置を使用して測定し、それらの測定値
から１０秒と１２０秒後の反射光強度の差を求めた。試
験紙の部分Ａ、Ｂについてこの差をそれぞれＲｅｆ　（
Ａ）　、　Ｒｅｆ　（Ｂ）とし、△＝　Ｒｅｆ　（Ａ）
　−Ｒｅｆ　（Ｂ）を求めると、第１表のようになった
。

（以下余白） 第１表 第２図に示す検量線が得られた。反射光強度差としてＲ
ｅｆ（Ａ）のみをとれば、ブランク測定を行わない試験
紙に相当し、Ｒｅｆ　（Ａ）　−Ｒｅｆ　（Ｂ）をとれ
ば、ブランク測定を行う場合に相当する。

た以外は実施例１　（Ｃ）と全く同様にして、肝疾患患
者血清の胆汁酸濃度測定した。

肝疾患患者血清として、２検体について測定した。それ
ぞれの検体名を検体１詔よび検体２として、その反射光
強度の差を第２表に示す。

第２表 Ｒｅｆ　ＣＡ）　、Δ＝　Ｒｅｆ　ＣＡ）　−Ｒｅｆ　
０３）の値を第２図の検量線と比較することにより、胆
汁酸濃度は次のように求まった。

Ｒｅｆ（４）からのみ測定 検体１　＝　２９１ｔｒｎｏｌ／１ 検体２　＝　５８　ｐｍｏｌ／Ｉ Ｒｅｆ　（Ａ）　−Ｒｅｆ　（Ｂ）から測定検体１　＝
　２７　ｔｔｍｏｌ／１ 検体２　＝　５０　ｐｒｎｏｌ／１ また、この患者血清中の胆汁酸の濃度を溶液法の胆汁酸
測定キット「エンザバイル」（第−化学薬品膜）を用い
て測定すると、検体１　＝　２８　ｐｍｏｌ／ｌ　、検
体２　＝　５１　ｔｔｒｎｏｌ／ｌとなった。

この値を本発明の試験紙で求めた値と比較すると、検体
１については、Ｒｅｆ（４）からのみの測定値（２９ｐ
ｒｎｏｌ／ｌ　）　　右よびＲｅｆ（Ａ）−Ｒｅｆ（Ｂ
）からの測定値（２７μｍｏ／／ｌりと良く一致した。

検体２については、　Ｒｅｆ（４）−Ｒｅｆ［Ｆ］）か
らの測定値（５０μｍｏＩ！ｅｌりと良く一致したが、
Ｒｅｆ　（Ａ）からのみの測定値（５８ｐｍｏｌ／Ｉり
とは、かなりずれていた。

比較例１ 実施例１（４）に記述した試験紙の調製法において、Ｅ
ＤＴＡ−２Ｎａおよびオキサミド酸ナトリウムを除いた
以外は、全く同様にして調製した試験紙を用いて、実施
例１と同様にして実施例１と同じ検体の胆汁酸濃度を測
定した。

標準胆汁酸濃度と反射光強度の差の関係は第３表のよう
になり、これから第３図に示した検量線が得られた。

（以下余白） 第３表 実施例１と同じ検体の胆汁酸濃度を測定すると、その反
射光強度の差は第４表のようになった。

第４表 Ｒｅｆ　（Ａ）　、Δ＝　Ｒｅｆ　ＣＡ）　−Ｒｅｆ　
（Ｂ）の値を第３図の検量線と比較することにより、胆
汁酸濃度は次のように求まった。

Ｒｅｆ（４）からのみ測定 検体１　＝　　５５　ｐｍｏｆ／１ φ体２　＝　１１０　ｐｍｏｌ／Ｉ Ｒ６ｆ　（Ａ）　−Ｒｅｆ　Ｑ３）から測定検体１　＝
　３２　ｐｍｏｌ／１ 検体２　＝　５６　ｔｔｒｎｏｌ／１ この結果を実施例１のエンザバイルで測定した値と比較
すると、検体１，２ともに、Ｒｅｆ（Ａ）からのみ測定
したときは、エンザバイルの測定値と大きく異っており
、Ｒｅｆ囚−ｕｅｆ（Ｂ）から測定したときも、エンザ
バイルの測定値とは、かなりずれていた。

以上、実施例１と比較例１より、ＥＤＴＡ−２Ｎａ　詔
よびオキサミド酸ナトリウムを添加した試験紙を使用す
ると、Ｒｅｆ（Ａ）からのみの測定の場合、検体によっ
ては（例、検体２）エンザバイルでの測定値とかなりず
れるものがあるが、これらの添加剤を含まない試験紙で
の測定値に比較してエンザバイルの測定値にはるかに近
い値を示す。

また、Ｒｅｆ　（Ａ）　−Ｒｅｆ　（Ｂ）から測定する
と、ＥＤＴＡ−２Ｎａ　およびオキサミド酸ナトリウム
を添加した試験紙のときは、これらを添加しない試験紙
に比し、エンザバイルの測定値により近い測定値が得ら
れることが分った。

実施例２ 実施例１（４）に記述した試験紙の調製法において、Ｅ
ＤＴＡ−２Ｎａ　１００４　の代わりに、ＥＧＴＡ−２
Ｎａ　　１００４（シグマ社製）を加えた以外は、全（
同様にして調製した試験紙を用いて、実施例１と同様に
して検量線を作成した。

この試験紙を用いて、実施例１と同じ検体について胆汁
酸濃度を求めると、次のようになった。

Ｒｅｆ（Ａ）からのみ測定 検体１　＝　３０　ｔｘｒｎｏｌ／１ 検体２　＝　６’　Ｏｐｒｎｏｌ／１ ・Ｒｅｆ　（Ａ）　−Ｒｅｆ　０３）から測定　　゛検
体１　＝　２９　ｐｒｎｏｌ／１ 検体２　＝　５１　ｐｍｏｌ／１ 実施例３ 実施例１（４）に記述した試験紙の調製法にぷいて、オ
キサミド酸ナトリウム５ηの代わりに、ピルビン酸５１
１Ｐを加えた以外は、全（同様にして調製した試験紙を
用いて、実施例１と同様にして検量線を作成した。

この試験紙を用いて、実施例１と同じ検体について胆汁
酸濃度を求めると、次のようになった。

Ｒｅｆ（Ａ）からのみ測定 検体１　＝　２７　ｔｔｒｎｏＩ！／１検体２　＝　５
７　ｐｒｎｏｌ／Ｉ Ｒｅｆ　（Ａ）　−Ｒｅｆ　（Ｂ）から測定検体１　＝
　２８　ｓｍｏｇ／ｌ 検体２　＝　４９　ｐｒｎｏｌ／１ 実施例４ 実施例１（４）に記述した試験紙の調製法に右い゛て、
ＥＤＴＡ　　２ＮａｌＯＯｑの代わりに、ＥＧＴＡ−２
Ｎａ　　１００ｓ＋ｙ（シグマ社製）を、オキサミド酸
ナトリウム５ｑの代わりに、ピルビン酸５１１Ｐを加え
た以外は、全く同様にして調製した試験紙を用いて、実
施例１と同様にして検量線を作成した。

この試験紙を用いて、実施例１と同じ検体について胆汁
酸濃度を求めると、次のようになった。

Ｒｅｆ（４）からのみ測定 検体１　＝　２９　ｐｍｏｌ／１ 検体２　＝　６１　ｐｍｏｌ／Ｉ Ｒｅｆ　（Ａ）　−Ｒｅｆ　（Ｂ）から測定、検体ｌ＝
　２９　ｐｍｏｌ／１ 検体２　＝　５２　ｔｔｍｏｌ／１ 以上、実施例２，３詔よび４のいずれの試験紙の測定値
においても、添加剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａ右よびオキ
サミド酸ナトリウムを使用した実施例１とほぼ同じ結果
を示した。

（発明の効果） 本発明の胆汁酸測定用試験紙は、高分子素材からなる担
体の同一個所にの３αヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドもしく
はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフエイ
ト、ジアホラーゼ＄よびテトラゾリウム塩からなる試薬
系組成物と◎エチレンジアミン西酢酸（ＥＤＴＡ）、エ
チレングリコールビス（β〜ルアミノエチルエーテル　
Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’　、　Ｎ’四酢酸（ＥＧＴＡ）、
１ｉ：ＤＴＡないしはＥＧＴＡのアルカリ金属塩から成
る群の中から選ばれる一つ以上の添加剤工とθオキサミ
ド酸、ピルビン酸、蓚酸、８−クロロ−４ヒドロキシ−
５メチルキノリン−３カルボン酸およびこれらの塩から
成る群の中から選ばれる一つ以上の添加剤■とが、担持
されたことを特徴とするものである。ので、体液中の共
存成分の影響を除いて、胆汁酸の量を測定することが出
来、胆汁酸量を正確番こ測定し得る。

更に、本発明の対照試験紙を使用し、Ｒｅｆ（Ａ）−Ｒ
ｅｆｌ）から胆汁酸濃度を求めれば、体液中の種々の共
存物質の影響を更に抑制して、あらゆる種類の肝胆道系
疾患の検体中１の胆汁酸の量を常に正確に測定し得ると
共に、同時再現性も向上する。

従って、試験紙という簡便な方法で、しかも短時間のう
ちに、溶液法のような煩雑な方法で得られる値に匹敵す
る正確さで胆汁酸の量を測定し得、本発明法は、集団検
診での病気の早期発見や、ベツドサイドでの緊急時の検
査などに利用価値が高い。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で使用した反射光測定装置を示す概略
図、 第２図は、標準胆汁酸溶液を本発明の試験紙で測定した
時の標準胆汁酸濃度と反射光強度差の関係を示す検量線
、 第３図は、標準胆汁酸溶液を従来法の試験紙で測定した
時の標準胆汁酸濃度と反射光強度差の関係を示す検量線
である。 １−・胆汁酸測定装置、２・・・胆汁酸測定用試験紙部
分、３・・・透明板、４・・−発光素子、５・・・迷光
防止板、６・・・受光素子、７・・・増巾・測定回路・
Ａ−Ｄ変換器、８・・・表示手段、９・・・測定用スイ
ッチ、２１・・・プラスチック製スティック、２２・・
・遮光カバー。 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）高分子素材からなる担体の同一個所に［イ］３α−
   ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチドもしくはニコチンアミドアデ
   ニンジヌクレオチドフォスフェイト、ジアホラーゼおよ
   びテトラゾリウム塩からなる試薬系組成物と［ロ］エチ
   レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール
   ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′
   四酢酸（ＥＧＴＡ）、ＥＤＴＡないしはＥＧＴＡのアル
   カリ金属塩から成る群の中から選ばれる一つ以上の添加
   剤 I と［ハ］オキサミド酸、ピルビン酸、蓚酸、８−
   クロロ−４ヒドロキシ−５メチルキノリン−３カルボン
   酸およびこれらの塩から成る群の中から選ばれる一つ以
   上の添加剤IIとが、担持されたことを特徴とする胆汁酸
   測定用試験紙。 ２）高分子素材からなる担体の同一個所に［イ］３α−
   ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチドもしくはニコチンアミドアデ
   ニンジヌクレオチドフォスフェイト、ジアホラーゼおよ
   びテトラゾリウム塩からなる試薬系組成物と［ロ］エチ
   レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール
   ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′
   四酢酸（ＥＧＴＡ）、ＥＤＴＡないしはＥＧＴＡのアル
   カリ金属塩から成る群の中から選ばれる一つ以上の添加
   剤 I と［ハ］オキサミド酸、ピルビン酸、蓚酸、８−
   クロロ−４ヒドロキシ−５メチルキノリン−３カルボン
   酸およびこれらの塩から成る群の中から選ばれる一つ以
   上の添加剤IIとが担持された部分Ａと、部分Ａに担持さ
   れたものから３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
   ーゼのみを欠く成分が担持された部分Ｂとの組合せより
   なることを特徴とする胆汁酸測定用試験紙。