JP2016073220A - アカントアメーバの消毒評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】安全、正確かつ高感度なアカントアメーバに対する消毒効果を評価する方法の提供。【解決手段】下記工程（１）〜（４）を含む、アカントアメーバに対する消毒効果の評価方法。（１）消毒処理に供したアカントアメーバを、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の存在下で乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物を主成分として含む培地を用いて培養する工程（２）前記培養したアカントアメーバを固相に捕集する工程（３）前記固相に、物理的応力を加えて３，５−ジフェニル−１−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）ホルマザン（ＭＴＴホルマザン）可溶性溶媒を適用することにより、前記固相に捕集したアカントアメーバからＭＴＴホルマザンを抽出する工程（４）前記抽出したＭＴＴホルマザンの量により、前記消毒処理のアカントアメーバに対する消毒効果を評価する工程【選択図】図２

Description

本発明は、アカントアメーバの消毒評価方法に関する。詳しくは、本発明は、ＭＴＴ法を応用したアカントアメーバの消毒評価方法に関する。

アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）は、自然界に広く存在する原生生物の一種であるアカントアメーバ属微生物の総称であり、土壌や水中などに生息し、水道水にも生息する場合がある。また、アカントアメーバは、感染症の病原体であることが広く知られており、例えば、角膜炎や肉芽腫性脳炎を引き起こす。

アカントアメーバ角膜炎を罹患すると、眼に強い痛みを感じるばかりか、重症化すると角膜に穴が開き失明する可能性もある。アカントアメーバ角膜炎はコンタクトレンズ使用者に特に頻発しており、その要因の一つとしてコンタクトレンズの不適切な使用やケア方法が挙げられる。

コンタクトレンズを使用する際には、単回使用のコンタクトレンズを除き、コンタクトレンズケア用品等による清浄が求められる。コンタクトレンズの中でも、特に含水性の材料からなるソフトコンタクトレンズは、真菌類や細菌類は勿論のこと、アカントアメーバの温床となりやすい。そこで、ソフトコンタクトレンズは、コンタクトレンズ用ケア用品などによって消毒することが求められる。

係る事情により、ソフトコンタクトレンズ用ケア用品においては、その消毒効果が非常に重要であり、その消毒効果は各種消毒評価方法によって確認される。ところが、真菌類や細菌類に対する消毒評価方法はガイドラインがすでに定められているものの、アカントアメーバに対する消毒評価方法には公定法とよべる定まった方法がない。

アカントアメーバの消毒評価方法の一つに、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法がある。この方法は、所定の消毒液により消毒処理を施したアカントアメーバを段階希釈した後培養し、各希釈液における生存アカントアメーバ数（陽性数）と死滅アカントアメーバ数（陰性数）とから消毒能を評価する方法である。しかし、本方法では、陽性数及び陰性数の判断に大きな差が生じやすく、その評価結果の正確性は低い。そこで、生存アカントアメーバ数を正確に把握する方法が望まれている。

例えば、生細胞数を測定する方法としてはＭＴＴ法が知られている。ＭＴＴ法は、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（以下、ＭＴＴとよぶ。）が生細胞内のミトコンドリア内脱水素酵素により還元されて３，５−ジフェニル−１−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）ホルマザン（以下、ＭＴＴホルマザンとよぶ。）が生成されることを利用する方法である。ＭＴＴ法では、被験試料にＭＴＴを添加し、得られたＭＴＴホルマザン量から被験試料中の生細胞数を求める。

非特許文献１には、ＭＴＴ法を利用したＨｅＬａ細胞の細胞数測定方法として、ＨｅＬａ細胞の培養液中にＭＴＴ溶液を添加及び反応させ、回収したＨｅＬａ細胞にホルマザン溶解液（塩酸／イソプロピルアルコール溶液又はＤＭＳＯ）を加えて、該反応により生じたＭＴＴホルマザンの量を吸光度としてマイクロプレートリーダーにて測定することにより、細胞数を計測する方法が記載されている。また、同様の方法が特許文献１にも記載されている。

特許文献２には、ＭＴＴと同じ水溶性のテトラゾリウム化合物であるＷＳＴ−１と電子キャリアーである１−ＭＰＭＳとを組み合わせることにより、ＭＴＴを用いる場合よりも微生物の増殖状況や活性を簡便に測定できることが記載されている。

一方、非特許文献２には、アカントアメーバの培養方法として、ペプトン類の一種であるプロテオースペプトンを主成分とするＰＹＧ培地を用いる培養方法が記載されている。また、非特許文献３には、種々のペプトン類が記載されている。

特開平５−２４４９９３号公報 特開２００１−２０４４９２号公報

"同仁化学研究所 細胞増殖測定細胞染色プロトコル"、［ｏｎｌｉｎｅ］、株式会社同仁化学研究所、［平成２６年９月１８日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：http://www.dojindo.co.jp/technical/pdf/catalog-project.pdf〉，ｐｐ．１２〜１８ Investigative Ophthalmology and Visual Science, March 2011, Vol.52, No.3,pp.1793-1799 "BD Bionutrientsテクニカルマニュアル Advanced Bioprocessing第3版"、［ｏｎｌｉｎｅ］、日本ベクトン・ディッキンソン、［平成２６年９月１８日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：http://https://www.bdj.co.jp/hkdqj2000001lwn0-att/67-001-00_BD-Bionutrients-technical-manual.pdf〉

非特許文献１及び特許文献１に記載の方法は、ＭＴＴの比色定量を原理とするものである。これらの方法では、ＭＴＴホルマザン溶液を得るための溶媒として、ジメチルスルホキシドやジメチルスルホキシドを含むイソプロパノール、ジメチルホルムアミドなどが用いられている。しかし、ジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミドなどの有機溶媒は、ＭＴＴホルマザンに対する溶解性が高い反面、分析装置の本体や部品を侵襲すること、脂溶性が高く皮膚への浸透力が高いことから被験者が危険に晒されること、引火性があることから使用場所が限られることなど、その使用について問題がある。そこで、これらの問題がある溶媒に代えて、メタノールやイソプロパノールなどの低級アルコール類を使用することが考えられる。しかし、低級アルコール類はＭＴＴホルマザンに対する溶解性が低く、ＭＴＴホルマザンを効率よく抽出することができないという問題がある。

ところでＭＴＴ法を用いた生細胞数測定法は、前記のとおりにＭＴＴが生細胞内のミトコンドリア内脱水素により還元されることで生成されるＭＴＴホルマザン量から生細胞数を求める方法であることから、生細胞を培養する工程を含む。非特許文献２に記載があるとおり、アカントアメーバの培養には、ペプトン含有物であるプロテオースペプトンを主成分とし、さらにイースト抽出物及びグルコースを含むＰＹＧ培地が一般的に用いられる。ところが、ＰＹＧ培地はＭＴＴとの反応性が強く、生細胞内のミトコンドリア内脱水素による還元とは別に培地成分によりＭＴＴが還元されることから、ＰＹＧ培地を用いてはアカントアメーバの生細胞数を正確に測定できないという問題がある。

特許文献２には、大腸菌をミューラヒントン培地で培養し、次いでＭＴＴを供することにより発生した大腸菌内のＭＴＴホルマザンの量を吸光度測定することが記載されている。しかし、テトラゾリウム化合物としてＭＴＴを用いた場合、たとえ電子キャリアーを共存させたとしても、生じたホルマザンが細胞外に分泌されるＷＳＴ−１に比べて、検出感度が低くなることが記載されている。さらに特許文献２では、大腸菌をミューラヒントン培地で培養しているところ、アカントアメーバはミューラヒントン培地では培養できないという問題がある。非特許文献３にはアカントアメーバの増殖に適したペプトン類についての記載はない。

上記したように、現行のＭＴＴ法そのままでは、アカントアメーバに対する消毒性を評価する方法に適しているとは到底いえない。そこで、本発明は、アカントアメーバの培養及びホルマザンの生成反応を正確に行い、かつ、分析装置や人体に対して安全な溶媒を用いることにより、安全、正確かつ高感度なアカントアメーバに対する消毒効果を評価する方法を提供することを、本発明が解決しようとする課題とする。

本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、ＰＹＧ培地に代えて、乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物を主成分として含む培地は、アカントアメーバの増殖性が高く、かつ、共存するＭＴＴに対する還元作用が低いことを見出した。

次いで、本発明者らは、ＭＴＴホルマザンの抽出溶媒として一般的に用いられている、ヘキサン、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒は測定装置本体や部品を侵襲する可能性が高く、抽出液の定量測定に使用できる分析装置及び分析方法に制限が生じることから、これらの問題が少ない低級アルコールの使用について検討した。特に、低級アルコールを抽出溶媒として用いた場合であっても、ＭＴＴホルマザンを溶解できるような工程について検討を行ったところ、培養したアカントアメーバとＭＴＴとを反応させて得たＭＴＴホルマザン含有アカントアメーバを固相に捕集し、次いで該固相に遠心力や圧力などの物理的応力を加えて低級アルコールを通過させることにより、ＭＴＴホルマザンを効率よく抽出することに成功した。

本発明は、上記した知見や成功例に基づき、アカントアメーバに対して増殖性があり、かつ、ＭＴＴに対する還元性が少ない成分を主成分とする培地を用い、かつ、ＭＴＴホルマザンの抽出溶媒として低級アルコールを用いつつもＭＴＴホルマザンの抽出効率を上げた、アカントアメーバに対する消毒効果を評価する方法として完成されたものである。

したがって、本発明によれば、下記工程（１）〜（４）を含む、アカントアメーバに対する消毒効果の評価方法が提供される。
（１）消毒処理に供したアカントアメーバを、ＭＴＴの存在下で乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物を主成分として含む培地を用いて培養する工程
（２）前記培養したアカントアメーバを固相に捕集する工程
（３）前記固相に、物理的応力を加えてＭＴＴホルマザン可溶性溶媒を適用することにより、前記固相に捕集したアカントアメーバからＭＴＴホルマザンを抽出する工程
（４）前記抽出したＭＴＴホルマザンの量により、前記消毒処理のアカントアメーバに対する消毒効果を評価する工程

好ましくは、前記胃以外の動物組織の抽出物が、心臓及び脳からなる群から選ばれる少なくとも１種の動物組織の抽出物である。

好ましくは、前記乳タンパク質の加水分解物が、カゼイン又は乳清の加水分解物である。

好ましくは、前記物理的応力が、遠心力又は圧力である。

本発明の別の側面によれば、下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、アカントアメーバの生細胞数の測定方法が提供される。
（Ａ）アカントアメーバを、ＭＴＴの存在下で乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物を主成分として含む培地を用いて培養する工程
（Ｂ）前記培養したアカントアメーバを固相に捕集する工程
（Ｃ）前記固相に、物理的応力を加えてＭＴＴホルマザン可溶性溶媒を適用することにより、前記固相に捕集したアカントアメーバからＭＴＴホルマザンを抽出する工程
（Ｄ）前記抽出したＭＴＴホルマザンの量により、アカントアメーバの生細胞数を決定する工程

本発明の方法によれば、アカントアメーバに対する消毒効果を安全、正確かつ高感度に評価することができることから、コンタクトレンズ装用者のアカントアメーバに起因する眼疾患を発生する割合を低下させるコンタクトレンズケア用品や抗アカントアメーバ剤のさらなる開発が期待できる。

図１は、生存アカントアメーバ濃度を算出するための検量線を表す図である。 図２は、比較対照及び試料のアカントアメーバ減少量を表す図である。

以下、本発明の詳細について説明する。
本発明の方法はアカントアメーバに対する消毒効果の評価方法に関し、少なくとも下記工程（１）〜（４）を含む。
（１）消毒処理に供したアカントアメーバを、ＭＴＴの存在下で乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物を主成分として含む培地を用いて培養する工程
（２）前記培養したアカントアメーバを固相に捕集する工程
（３）前記固相に、物理的応力を加えてＭＴＴホルマザン可溶性溶媒を適用することにより、前記固相に捕集したアカントアメーバからＭＴＴホルマザンを抽出する工程
（４）前記抽出したＭＴＴホルマザンの量により、前記消毒処理のアカントアメーバに対する消毒効果を評価する工程

本発明の方法は、生細胞数の測定方法として広く用いられているＭＴＴ法に基づいた、アカントアメーバの生細胞数を測定するのに適した方法である。本発明の方法は、アカントアメーバの培養に使用する培地及び生成したＭＴＴホルマザンの抽出工程に特徴を有する。

本発明の方法における工程（１）は、消毒処理に供したアカントアメーバを、ＭＴＴの存在下で乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物を主成分として含む培地を用いて培養する工程である。

アカントアメーバに供する消毒処理は特に限定されず、例えば、アカントアメーバと消毒剤とを接触させること、アカントアメーバを加熱すること、アカントアメーバを物理的に破砕することなどのアカントアメーバを殺滅するための化学的及び物理的操作が挙げられるが、好ましくはアカントアメーバと消毒剤とを接触させる消毒処理である。

工程（１）で用いる培地は、乳タンパク質の加水分解物、胃以外の動物組織の抽出物又はその両方を主成分として含む。乳タンパク質の加水分解物は、牛や豚などの哺乳動物の乳に由来するタンパク質を酸や酵素を用いることなどによって加水分解したものであれば特に限定されず、例えば、カゼインの加水分解物、乳清の加水分解物などが挙げられる。胃以外の動物組織の抽出物としては、例えば、脳、心臓又はその両方の抽出物が挙げられる。乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物は、これらの中でも炭水化物の含有率が低いものが好ましく用いられる。

乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物の具体例としては、カザミノ酸、カゼインダイジェスト、カシトン、ラクトアルブミン加水分解物、トリプチケース、トリプトン、ブレインハートインフュージョンブロスなどが挙げられ、これらは単独で、又は二種以上を組み合わせて使用することができる。これらのうち、ＭＴＴとの反応性及びアカントアメーバの増殖性を考慮した場合、好ましくはカザミノ酸、カゼインダイジェスト、トリプチケース、トリプトン、ブレインハートインフュージョンブロスであり、より好ましくはカザミノ酸、カゼインダイジェスト、トリプトン、ブレインハートインフュージョンブロスであり、さらに好ましくは炭水化物の含有率が比較的低いカザミノ酸、トリプトン、ブレインハートインフュージョンブロスである。

乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物の入手方法は特に限定されない。例えば、乳タンパク質の加水分解物は、乳そのもの、カゼイン、乳清といった乳を、塩酸といった酸やペプシンといった酵素などで当業者に知られる条件で処理し、必要があれば凍結乾燥といった乾燥処理に供することにより得ることができる。また、胃以外の動物組織の抽出物は、脳や心臓といった胃以外の臓器を精製水などで蒸煮し、必要があれば凍結乾燥といった乾燥処理に供することにより得ることができる。乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物は市販されているものを用いてもよく、これらの市販品としては、例えば、非特許文献３に記載されているものがある。

液体培地として調製時の培地の全体量に対する乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物の配合量はアカントアメーバを増殖し得る程度の量であれば特に限定されないが、例えば、０．１〜９０Ｗ／Ｖ％であり、好ましくは０．２５〜７５Ｗ／Ｖ％であり、より好ましくは０．５〜５０Ｗ／Ｖ％であり、さらに好ましくは１．０〜１０Ｗ／Ｖ％である。乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物の配合量が０．１Ｗ／Ｖ％未満である場合はアカントアメーバに増殖能を付与することができず、該配合量が９０Ｗ／Ｖ％を超える場合は浸透圧等の影響によりアカントアメーバの増殖を抑制する可能性がある。

工程（１）で用いる培地は、乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物に加えて、アカントアメーバの増殖能への影響を考慮し、例えば、ｐＨ５．０〜８．０、好ましくはｐＨ５．５〜７．５、より好ましくは６．０〜７．０の範囲となるような緩衝剤を添加してもよい。

緩衝剤としてはアカントアメーバの増殖能を阻害するものでなければ特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、トリスヒドロキシアミノメタン緩衝剤などが挙げられる。これらのうち、アカントアメーバの増殖性を考慮すれば、リン酸緩衝剤が好ましく用いられる。

緩衝剤の配合量が少なすぎる場合は目的の緩衝効果が得られず、他方では緩衝剤の配合量が多過ぎる場合は培地中での析出やアカントアメーバの増殖を阻害することが懸念されることから、培地全量に対する緩衝剤の配合量は、例えば、０．００５〜２０Ｗ／Ｖ％であり、好ましくは０．０１〜１０Ｗ／Ｖ％である。

工程（１）で用いる培地には、上記成分に加えて、本発明の目的を損なわない程度に、エキス、糖類、無機物並びにその塩及び水和物などの各種の添加剤を配合することができる。

添加剤の具体例としては、エキスとしては酵母エキス等；糖類としては、グルコース、スクロース、グリコーゲン、グルカン、フルクタン等；無機物としては、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）・六水和物、硫酸マグネシウム・七水和物、塩化カルシウム、塩化カルシウム・二水和物等が挙げられるが、これらに限定されない。

工程（１）で用いる培地における乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物とその他の成分との配合量は、例えば、乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物の配合量が２０〜５０質量部であり、かつ、その他の成分の合計の配合量が１〜５質量部である。乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物の配合量は、培地成分全体の量に対して、７０〜９９Ｗ／Ｗ％であることが好ましく、８０〜９８Ｗ／Ｗ％であることがより好ましく、９０〜９６Ｗ／Ｗ％であることがさらに好ましい。

工程（１）で用いる培地の具体例は、乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物 １０〜３０質量部、酵母エキス ０．１〜５質量部、グルコース ０．０１〜０．１質量部、マグネシウム塩 ０．０００１〜０．０１質量部、カルシウム塩 ０．００００１〜０．０００１質量部、鉄塩 ０．００００１〜０．０００１質量部、リン酸塩 ０．０００１〜０．００１質量部、及びクエン酸塩 ０．０００１〜０．０１質量部からなる培地である。このような培地は、アカントアメーバに対する増殖能があり、かつ、ＭＴＴとの反応性が小さいことから、アカントアメーバの生細胞数測定用培地として有用である。また、このような培地と、ＭＴＴ、ＷＳＴ−１、トリフェニルテトラゾリウム、テトラゾリウムバイオレット、ニトロブルーテトラゾリウム、テトラニトロブルーテトラゾリウム、テトラゾリウムブルークロライド、ｐ−イオドニトロテトラゾリウムなどのテトラゾリウム化合物とを含むキットは、アカントアメーバの生細胞数測定用キットとして有用である。

工程（１）で用いられる培地の調製は、一般的に知られる培地の調製方法に準じて行うことができ、特に限定されない。例えば、精製水に乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物並びにその他の成分を同時に、又は各成分の溶解性を確認しながら各成分を前後して添加することにより調製することができる。工程（１）で用いられる培地は、乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物並びにその他の成分を混合して得られる粉末状培地、乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物並びにその他の成分を水に溶解して得られる液体状培地、乳タンパク質の加水分解物及び胃以外の動物組織の抽出物並びにその他の成分にさらに寒天などを添加して凝固させた固形状培地などを包含する。

工程（１）では、上記培地にＭＴＴを加えて、アカントアメーバを培養する。培地に加えるＭＴＴは、ＭＴＴそのもの又はＭＴＴを溶解したＭＴＴ溶液のどちらでもよい。ＭＴＴ溶液の調製に用いられる溶媒はアカントアメーバの増殖能やＭＴＴホルマザンの生成に影響を与えないものであれば特に限定されないが、例えば、リンゲル液、その他の生理的食塩水、精製水などが挙げられる。

アカントアメーバを培養する条件は、アカントアメーバの増殖及びＭＴＴホルマザンの生成に適した条件であれば特に限定されず、例えば、２０〜３０℃で、好ましくは約２５℃で、数時間〜数十時間、好ましくは１〜２４時間の条件である。

本発明の方法における工程（２）では、工程（１）により培養したアカントアメーバを固相に捕集する。

工程（２）で用いる固相は、アカントアメーバを捕集できるものであれば特に限定されないが、例えば、アカントアメーバの大きさに対して十分に孔径が小さい濾材などが挙げられる。濾材の孔径は、アカントアメーバの大きさが１０μｍ以上であることから、１μｍ以下が好ましく、０．５μｍ以下がより好ましい。

工程（２）の具体例として、アカントアメーバ含有溶液を固相である濾材の一方の側から適用し、遠心や圧力などの物理的応力を加えて、液体成分を濾材の他方の側から抜き取る濾過をすることにより、アカントアメーバを固相に捕集する工程が挙げられるが、これに限定されない。

本発明の方法における工程（３）では、工程（２）によりアカントアメーバを捕集した固相に、物理的応力を加えてＭＴＴホルマザン可溶性溶媒を通過させることにより、前記固相に捕集したアカントアメーバからＭＴＴホルマザンを抽出する。

工程（３）のＭＴＴホルマザンを抽出するためのＭＴＴホルマザン可溶性溶媒としては、分析装置や人体に対して比較的安全性が高い低級アルコールを用いることが好ましい。ただし、低級アルコールは、ＭＴＴホルマザンに対する溶解性が比較的低い。そこで低級アルコールを用いたＭＴＴホルマザンの抽出に際しては、物理的応力を加えることにより、ＭＴＴホルマザンに対する溶解性が比較的低い溶媒を用いたとしても、ＭＴＴホルマザンに対する溶解性が比較的高いジメチルスルホキシド等の溶媒や低級アルコールであるイソプロパノールと塩酸や水酸化ナトリウムとの混合物を用いた場合と同程度のＭＴＴホルマザンの抽出効率が得られる。したがって、低級アルコール及び物理的応力を用いることにより、固相に捕集したアカントアメーバを破砕し、かつ、アカントアメーバ内外に蓄積したＭＴＴホルマザンを低級アルコール中に抽出することができる。

工程（３）におけるＭＴＴホルマザンの抽出の具体例としては、アカントアメーバを捕集した濾材の一方の側から低級アルコールを適用し、一方の側から他方の側に向けて物理的応力を加えて、低級アルコールを濾材に通過させる濾過を行うことによって、濾材の他方の側から抽出液としてＭＴＴホルマザン含有物を得ることが挙げられるが、これに限定されない。この際の加える物理的応力としては、圧力、遠心力などが挙げられるが、遠心力が好適に用いられる。

加える物理的応力が弱すぎる場合はＭＴＴホルマザンを抽出しきれず、該物理的応力が強すぎる場合は濾材などの固相を破壊する可能性があることから、物理的応力が遠心力である場合、遠心速度は１００〜１０，０００ｒｐｍが好ましく、５００〜５，０００ｒｐｍがより好ましく、１，０００〜３，０００ｒｐｍがさらに好ましい。物理的応力が圧力である場合は、上記遠心力と同程度の応力になる圧力である。

抽出溶媒が有機溶媒である場合、物理的応力を加える時間が重要となり、該時間が短すぎる場合はＭＴＴホルマザンを抽出し得る程度の物理的応力が得られず、該時間が長すぎる場合は抽出溶媒が蒸発する可能性があり、いずれにしても好ましくない。そこで、物理的応力を加える時間は３０秒〜１０分が好ましく、１分〜７分３０秒がより好ましく、１分３０秒〜５分がさらに好ましい。

物理的応力の負荷は、一般的に知られる物理的応力の負荷操作に準じて行うことができ、特に限定されないが、例えば、遠心分離器、ポンプ、シリンジ、アスピレーターなどの機器や器具を用いる操作を単独で、又はこれらの２種以上の操作を組み合わせて実施することができる。

本発明の方法における工程（４）では、工程（３）により抽出して得たＭＴＴホルマザンの量により、消毒処理が奏するアカントアメーバに対する消毒効果を評価する。抽出されたＭＴＴホルマザンの量が少ない場合は消毒処理によるアカントアメーバに対する消毒効果が大きいと評価でき、他方で抽出されたＭＴＴホルマザンの量が多い場合は消毒処理によるアカントアメーバに対する消毒効果が小さいと評価できる。この際、工程（１）において、消毒処理に供したアカントアメーバを用いた系とは別に、消毒処理に供していないアカントアメーバを用いた系を比較対照とすれば、正確な消毒効果の判定ができるようになる。また、消毒効果に際しては、既存の消毒処理と比較することにより、例えば、既存の消毒剤の有する消毒効果と比較することにより、アカントアメーバに対して高度な殺滅効果を示す消毒剤の選別が可能になる。このように、本発明の別の態様としては、本発明のアカントアメーバに対する消毒効果の評価方法を利用した、抗アカントアメーバ剤のスクリーニング方法が提供される。

本発明の方法では、ＭＴＴホルマザンを抽出する前にアカントアメーバを固相に抽出し、余分な培養液（反応液）を除去することから、使用するテトラゾリウム化合物はＭＴＴであることが好ましいが、本発明の方法を改変すれば、ＭＴＴに代替してその他のテトラゾリウム化合物、例えば、ＷＳＴ−１、トリフェニルテトラゾリウム、テトラゾリウムバイオレット、ニトロブルーテトラゾリウム、テトラニトロブルーテトラゾリウム、テトラゾリウムブルークロライド、ｐ−イオドニトロテトラゾリウムなどのテトラゾリウム化合物を用いる方法とすることができる。

本発明の別の態様は、下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、アカントアメーバの生細胞数の測定方法である。
（Ａ）アカントアメーバを、ＭＴＴの存在下で乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物を主成分として含む培地を用いて培養する工程
（Ｂ）前記培養したアカントアメーバを固相に捕集する工程
（Ｃ）前記固相に、物理的応力を加えてＭＴＴホルマザン可溶性溶媒を適用することにより、前記固相に捕集したアカントアメーバからＭＴＴホルマザンを抽出する工程
（Ｄ）前記抽出したＭＴＴホルマザンの量により、アカントアメーバの生細胞数を決定する工程

本発明の測定方法の工程（Ａ）〜（Ｄ）は、本発明の評価方法の工程（１）〜（４）のそれぞれの項目を参照して実施できる。

以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限又は限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

表１に示す条件にて、ＭＴＴホルマザン抽出法に関する評価を実施し、その結果を表２に示す。また、表３に示す処方にて調製した培地の性能を評価し、その結果を表４に示す。さらに表５に示すＭＴＴホルマザン検出条件にて消毒評価を実施し、その結果を図１〜２に示す。以下、これらの詳細について記載する。

［１．ＭＴＴホルマザン抽出法］
（１）ＭＴＴホルマザン分散液の調製
ＭＴＴホルマザン（東京化成工業）０．００１ｇを秤量し、ＰＰ製容器に移した。これに、リンゲル溶液１／４濃度（以下、１／４リンゲル液とよぶ。）１０ｍＬを加え、超音波を照射することによりＭＴＴホルマザンを十分に分散させ、ＭＴＴホルマザン分散液を調製した。

（２）遠心力によるＭＴＴホルマザンの回収
ＭＴＴホルマザン分散液０．３ｍＬを、孔径０．４５μｍの親水性ＰＴＦＥフィルターが予め取り付けられたマイクロチューブ（コスモスピンフィルターＨ、ナカライテスク社）へ分取した。このマイクロチューブを１，５００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離することにより、遠心力による応力を加え、ＭＴＴホルマザンをフィルターに捕集した。１／４リンゲル液の入ったマイクロチューブを除き、ＭＴＴホルマザンを捕集したフィルターを新品のマイクロチューブに取り付けた後、該フィルター上から抽出溶媒（メタノール、プロパノール又はジメチルスルホキシド）０．３ｍＬを加えた。このマイクロチューブを１，５００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離することにより、フィルター中に捕集したＭＴＴホルマザンを抽出溶媒中に溶解させ回収した。後述する表１に示すとおり、このようにして実施したＭＴＴホルマザン回収系のうち、抽出溶媒としてメタノール及びプロパノールを用いた回収系をそれぞれ実施例１及び２とし、ジメチルスルホキシドを用いた回収系を比較例３とした。

（３）圧力によるＭＴＴホルマザンの回収
ＭＴＴホルマザン分散液０．３ｍＬを、孔径０．４５μｍの親水性ＰＴＦＥフィルターを取り付けたＰＰ製シリンジ（コスモナイスフィルターＳ、ナカライテスク社）へ分取した。次いで押出速度が３０秒／滴となるようにシリンジを押すことにより圧力を加え、ＭＴＴホルマザン分散液中のＭＴＴホルマザンをフィルターに捕集し、１／４リンゲル液を除いた。シリンジ中に抽出溶媒（プロパノール）０．３ｍＬを加えて、押出速度が３０秒／滴となるようにシリンジを押すことで圧力を加えることにより、フィルター中に捕集したＭＴＴホルマザンを抽出溶媒中に溶解させ回収した。後述する表１に示すとおり、このようにして実施したＭＴＴホルマザン回収系を実施例３とした。

（４）無応力によるＭＴＴホルマザンの回収
ＭＴＴホルマザン分散液０．３ｍＬを、孔径０．４５μｍの親水性ＰＴＦＥフィルターが予め取り付けられたマイクロチューブ（コスモスピンフィルターＨ、ナカライテスク社）へ分取した。このマイクロチューブを１，５００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離することにより、遠心力による応力を加え、ＭＴＴホルマザンをフィルターに捕集した。１／４リンゲル液の入ったマイクロチューブを除き、ＭＴＴホルマザンを捕集したフィルターを新品のマイクロチューブに取り付けた後、該フィルター上から抽出溶媒（メタノール又はプロパノール）０．３ｍＬを加えて、５分間静置した。静置後、応力をかけることなく、フィルター上部から抽出溶媒を回収した。後述する表１に示すとおり、このようにして実施したＭＴＴホルマザン回収系のうち、抽出溶媒としてメタノール及びプロパノールを用いた回収系をそれぞれ比較例１及び２とした。

（５）評価結果
抽出操作後、次の３項目についてＭＴＴホルマザンの回収性を評価した。

１）ＭＴＴホルマザンの残存
ＭＴＴホルマザンで捕集したフィルターを目視にて確認するとき、青紫のＭＴＴホルマザンが残存していなかった場合に「適合」とし、残存していた場合に「不適合」とした。

２）抽出溶媒の残存
シリンジ及びマイクロチューブを目視にて確認するとき、抽出溶媒が残存していなかった場合に「適合」とし、抽出溶媒がフィルターを透過せずに残存していた場合に「不適合」とした。

３）抽出溶媒のポリエーテルエーテルケトン耐性
耐薬品性の高いポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）に対する耐薬品性を比較し、抽出溶媒におけるＰＥＥＫの耐薬品性がある場合に「適合」とし、耐薬品性がない場合は「不適合」とした。

実施例１〜３及び比較例１〜３について実施した上記３項目の回収評価結果を後述する表２に示す。表２が示すとおり、実施例１〜３は、上記３項目についてすべて適合であり、ＭＴＴホルマザンの抽出方法並びに分析装置及びその部品への影響に問題がないことを示している。

［２．培地］
（６）培地の調製
表３に示す処方に従って、本発明の実施例４〜６及び比較例４〜６の培地について、各成分を混合して得た混合物に精製水１，０００ｍＬを量り込み、室温にて各成分が均一になるように撹拌することにより調製した。得られた培地を滅菌し、各滅菌培地を調製した。なお、表３中の「ブレインハートインフュージョンブロス」は脳及び心臓に由来する動物組織を分解して得られたものであり、「プロテオースペプトン」は牛又は豚の胃に由来する動物組織を分解して得られたものである。また、トリプトン、カザミノ酸、ブレインハートインフュージョンブロス、プロテオースペプトン、モルトエクストラクト及びフィトンは、市販品（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた。

（７）評価結果
４）ＭＴＴとの反応性
実施例４〜６及び比較例４〜６の各滅菌培地０．２ｍＬを４８ウェルカルチャープレートに分注した後、ＭＴＴ溶液０．０２ｍＬをさらに加え、２５℃インキュベーター内で２４時間静置した。なお、ＭＴＴ溶液は、非特許文献２の第１２頁の記載を参照して、ＭＴＴ２５ｍｇを１／４リンゲル液５ｍｌに加えて溶解することにより調製した。

静置後、各ウェル内の全内容物をスピンフィルター（コスモスピンフィルターＨ、ナカライテスク社）に移し、１，５００ｒｐｍ、５分の条件で遠心濾過した後、メタノールを抽出溶媒として用いて該フィルター上に捕集したＭＴＴホルマザンを同条件で遠心濾過することにより抽出した。抽出物をＨＰＬＣにて表５に示す条件で検出し、ＭＴＴホルマザン面積値を求めた。

得られたＭＴＴホルマザン面積値を、ＰＹＧ培地である比較例４について得られたＭＴＴホルマザン面積値と比較することにより、ＭＴＴホルマザン相対率として各培地のＭＴＴ反応性を次式により求めた。

ＭＴＴ反応性が２０％未満であるとき、その培地はＭＴＴに対する反応性が低い培地であると判断した。

５）アカントアメーバ増殖能
前培養したアカントアメーバを回収した。回収したアカントアメーバに１／４リンゲル液を加えて洗浄した後、遠心して上清を除去することにより、アカントアメーバを回収した。回収したアカントアメーバを、実施例４〜６及び比較例４〜６の培地を用いて、アカントアメーバ濃度が５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにアカントアメーバ懸濁液を調製した。Ｔ−２５カルチャーフラスコ内に該アカントアメーバ懸濁液５ｍＬを分注し、２５℃インキュベーター内で３日間培養した後、該フラスコ内のアカントアメーバを回収し、血球計算盤にてアカントアメーバ数を計測した。各培地を用いて培養したアカントアメーバ数について、ＰＹＧ培地である比較例４のアカントアメーバ数と比較することにより、アカントアメーバ数相対率として次式によりアカントアメーバ増殖能を求めた。

アカントアメーバ増殖能が８０〜１２０％の範囲内にあるとき、その培地はＰＹＧと同等のアカントアメーバ増殖能を達成し得る培地であると判断した。

実施例４〜６及び比較例４〜６について実施した上記２項目の評価結果を後述する表４に示す。表４が示すとおり、実施例４〜６は、上記２項目について、いずれともＭＴＴに対する反応性が低い培地であり、かつ、ＰＹＧと同等のアカントアメーバ増殖能を達成し得る培地であると評価できる。

［３．消毒評価］
前培養したアカントアメーバを回収し、１／４リンゲル液にて１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう懸濁し、これを接種原液とした。

接種原液０．１ｍＬを、１／４リンゲル液１０ｍLに接種し、初発アカントアメーバ濃度が１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、これを標準試料とした。１／４リンゲル液の代わりにダルベッコリン酸緩衝液を用いて調製したものを、比較対照とした。１／４リンゲル液の代わりに塩酸ポリヘキサニド５．０μｇ／ｍＬ含有ダルベッコリン酸緩衝液を用いて調製したものを試料とした。

２５℃で４時間静置後、標準試料、比較対照及び試料各１ｍＬを、不活性剤含有溶液（１０％（Ｖ／Ｖ）ポリソルベート８０含有１／４リンゲル液）９ｍＬを含むポリプロピレン製１５ｍＬ遠沈管に添加することにより、塩酸ポリヘキサニドを中和により不活性化した１０倍希釈液を調製した。

上記１０倍希釈液の全量を、５，０００ｒｐｍ、１０分間の条件で遠心処理し、アカントアメーバを沈殿させた。上清を除去した後、表３に記載の実施例４の培地を１０ｍＬ加え、アカントアメーバを再懸濁し、１０倍希釈液（１）として調製した。

新しい遠沈管に前記１０倍希釈液（１）１ｍＬを分取した後、新たな実施例４の培地を９ｍＬ添加し、１０倍希釈液（２）を調製した。同一の操作をさらに２度繰り返し、１０倍希釈液（３）及び１０倍希釈液（４）について希釈系列を調製した。

調製した前記１０倍希釈液（１）〜（４）の各０．２ｍＬを４８ウェルカルチャープレートに播種し、２５℃で１週間培養した。培養後、ウェル内の培地を新たな実施例４の培地 ０．２ｍＬに交換し、さらに０．５％（Ｗ／Ｖ）ＭＴＴ溶解１／４リンゲル液を０．０２ｍＬ／ウェルになるように加えた。次いで、プレートを２５℃にて一晩反応させた。

ＭＴＴホルマザン含有アカントアメーバを含む反応物を、スピンフィルター（コスモスピンフィルターＨ、ナカライテスク社）を用いて、１，５００ｒｐｍ、５分間のスピン条件にて遠心分離することによりフィルター上に回収した。マイクロチューブを交換した後、フィルターにメタノール０．４ｍＬを添加し、１，５００ｒｐｍ、５分間のスピン条件で遠心し、アカントアメーバ内のＭＴＴホルマザンをメタノール中に溶出した。

得られたメタノール溶出液の吸光度を後述する表５の条件にてＨＰＬＣにより測定し、標準試料を用いて得られた吸光度の面積値の対数値（ＭＴＴホルマザン面積値）とアカントアメーバ濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）とから検量線を作成した（図１を参照）。得られた検量線から比較対照及び試料の生存アカントアメーバ濃度を算出し、初発アカントアメーバ濃度から生存アカントアメーバ濃度を引き、それぞれのアカントアメーバ減少量を求めた。結果を図２に示す。図２に示すとおり、比較対照に比べて、消毒剤を含む試料では、アカントアメーバが減少したことがわかる。

以上の結果から、本発明の方法によれば、ＭＴＴ法を応用したアカントアメーバ評価方法が得られることが示された。

本発明の方法により、コンタクトレンズ装用者のアカントアメーバに起因する眼疾患を発生する割合を低下させるコンタクトレンズケア用品や抗アカントアメーバ剤のさらなる開発を促進することができ、アカントアメーバに関連する疾患の罹患者や罹患するおそれがある者の健康と福祉に資することができる。

Claims (5)

1. 下記工程（１）〜（４）を含む、アカントアメーバに対する消毒効果の評価方法。
   （１）消毒処理に供したアカントアメーバを、ＭＴＴの存在下で乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物を主成分として含む培地を用いて培養する工程
   （２）前記培養したアカントアメーバを固相に捕集する工程
   （３）前記固相に、物理的応力を加えてＭＴＴホルマザン可溶性溶媒を適用することにより、前記固相に捕集したアカントアメーバからＭＴＴホルマザンを抽出する工程
   （４）前記抽出したＭＴＴホルマザンの量により、前記消毒処理のアカントアメーバに対する消毒効果を評価する工程
2. 前記胃以外の動物組織の抽出物が、心臓及び脳からなる群から選ばれる少なくとも１種の動物組織の抽出物である、請求項１に記載の評価方法。
3. 前記乳タンパク質の加水分解物が、カゼイン又は乳清の加水分解物である、請求項１又は２に記載の評価方法。
4. 前記物理的応力が、遠心力又は圧力である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の評価方法。
5. 下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、アカントアメーバの生細胞数の測定方法。
   （Ａ）アカントアメーバを、ＭＴＴの存在下で乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物を主成分として含む培地を用いて培養する工程
   （Ｂ）前記培養したアカントアメーバを固相に捕集する工程
   （Ｃ）前記固相に、物理的応力を加えてＭＴＴホルマザン可溶性溶媒を適用することにより、前記固相に捕集したアカントアメーバからＭＴＴホルマザンを抽出する工程
   （Ｄ）前記抽出したＭＴＴホルマザンの量により、アカントアメーバの生細胞数を決定する工程