JP6506002B2 - アカントアメーバ用培地 - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
MTT、WST−1、トリフェニルテトラゾリウム、テトラゾリウムバイオレット、ニトロブルーテトラゾリウム、テトラニトロブルーテトラゾリウム、テトラゾリウムブルークロライド及びp−イオドニトロテトラゾリウムからなる群から選ばれるテトラゾリウム化合物と
を含む、アカントアメーバの生細胞数測定用キットが提供される。
本発明の培地は乳タンパク質の加水分解物又は胃以外の動物組織の抽出物を主成分として含む。
(1)消毒処理に供したアカントアメーバを、MTTの存在下で本発明の培地を用いて培養する工程
(2)前記培養したアカントアメーバを固相に捕集する工程
(3)前記固相に、物理的応力を加えてMTTホルマザン可溶性溶媒を適用することにより、前記固相に捕集したアカントアメーバからMTTホルマザンを抽出する工程
(4)前記抽出したMTTホルマザンの量により、前記消毒処理のアカントアメーバに対する消毒効果を評価する工程
(A)アカントアメーバを、MTTの存在下で本発明の培地を用いて培養する工程
(B)前記培養したアカントアメーバを固相に捕集する工程
(C)前記固相に、物理的応力を加えてMTTホルマザン可溶性溶媒を適用することにより、前記固相に捕集したアカントアメーバからMTTホルマザンを抽出する工程
(D)前記抽出したMTTホルマザンの量により、アカントアメーバの生細胞数を決定する工程
(1)MTTホルマザン分散液の調製
MTTホルマザン(東京化成工業)0.001gを秤量し、PP製容器に移した。これに、リンゲル溶液1/4濃度(以下、1/4リンゲル液とよぶ。)10mLを加え、超音波を照射することによりMTTホルマザンを十分に分散させ、MTTホルマザン分散液を調製した。
MTTホルマザン分散液0.3mLを、孔径0.45μmの親水性PTFEフィルターが予め取り付けられたマイクロチューブ(コスモスピンフィルターH、ナカライテスク社)へ分取した。このマイクロチューブを1,500rpm、5分の条件で遠心分離することにより、遠心力による応力を加え、MTTホルマザンをフィルターに捕集した。1/4リンゲル液の入ったマイクロチューブを除き、MTTホルマザンを捕集したフィルターを新品のマイクロチューブに取り付けた後、該フィルター上から抽出溶媒(メタノール、プロパノール又はジメチルスルホキシド)0.3mLを加えた。このマイクロチューブを1,500rpm、5分の条件で遠心分離することにより、フィルター中に捕集したMTTホルマザンを抽出溶媒中に溶解させ回収した。後述する表1に示すとおり、このようにして実施したMTTホルマザン回収系のうち、抽出溶媒としてメタノール及びプロパノールを用いた回収系をそれぞれ実施例1及び2とし、ジメチルスルホキシドを用いた回収系を比較例3とした。
MTTホルマザン分散液0.3mLを、孔径0.45μmの親水性PTFEフィルターを取り付けたPP製シリンジ(コスモナイスフィルターS、ナカライテスク社)へ分取した。次いで押出速度が30秒/滴となるようにシリンジを押すことにより圧力を加え、MTTホルマザン分散液中のMTTホルマザンをフィルターに捕集し、1/4リンゲル液を除いた。シリンジ中に抽出溶媒(プロパノール)0.3mLを加えて、押出速度が30秒/滴となるようにシリンジを押すことで圧力を加えることにより、フィルター中に捕集したMTTホルマザンを抽出溶媒中に溶解させ回収した。後述する表1に示すとおり、このようにして実施したMTTホルマザン回収系を実施例3とした。
MTTホルマザン分散液0.3mLを、孔径0.45μmの親水性PTFEフィルターが予め取り付けられたマイクロチューブ(コスモスピンフィルターH、ナカライテスク社)へ分取した。このマイクロチューブを1,500rpm、5分の条件で遠心分離することにより、遠心力による応力を加え、MTTホルマザンをフィルターに捕集した。1/4リンゲル液の入ったマイクロチューブを除き、MTTホルマザンを捕集したフィルターを新品のマイクロチューブに取り付けた後、該フィルター上から抽出溶媒(メタノール又はプロパノール)0.3mLを加えて、5分間静置した。静置後、応力をかけることなく、フィルター上部から抽出溶媒を回収した。後述する表1に示すとおり、このようにして実施したMTTホルマザン回収系のうち、抽出溶媒としてメタノール及びプロパノールを用いた回収系をそれぞれ比較例1及び2とした。
抽出操作後、次の3項目についてMTTホルマザンの回収性を評価した。
MTTホルマザンで捕集したフィルターを目視にて確認するとき、青紫のMTTホルマザンが残存していなかった場合に「適合」とし、残存していた場合に「不適合」とした。
シリンジ及びマイクロチューブを目視にて確認するとき、抽出溶媒が残存していなかった場合に「適合」とし、抽出溶媒がフィルターを透過せずに残存していた場合に「不適合」とした。
耐薬品性の高いポリエーテルエーテルケトン(PEEK)に対する耐薬品性を比較し、抽出溶媒におけるPEEKの耐薬品性がある場合に「適合」とし、耐薬品性がない場合は「不適合」とした。
(6)培地の調製
表3に示す処方に従って、本発明の実施例4〜6及び比較例4〜6の培地について、各成分を混合して得た混合物に精製水1,000mLを量り込み、室温にて各成分が均一になるように撹拌することにより調製した。得られた培地を滅菌し、各滅菌培地を調製した。なお、表3中の「ブレインハートインフュージョンブロス」は脳及び心臓に由来する動物組織を分解して得られたものであり、「プロテオースペプトン」は牛又は豚の胃に由来する動物組織を分解して得られたものである。また、トリプトン、カザミノ酸、ブレインハートインフュージョンブロス、プロテオースペプトン、モルトエクストラクト及びフィトンは、市販品(ベクトン・ディッキンソン社製)を用いた。
4)MTTとの反応性
実施例4〜6及び比較例4〜6の各滅菌培地0.2mLを48ウェルカルチャープレートに分注した後、MTT溶液0.02mLをさらに加え、25℃インキュベーター内で24時間静置した。なお、MTT溶液は、非特許文献2の第12頁の記載を参照して、MTT25mgを1/4リンゲル液5mlに加えて溶解することにより調製した。
前培養したアカントアメーバを回収した。回収したアカントアメーバに1/4リンゲル液を加えて洗浄した後、遠心して上清を除去することにより、アカントアメーバを回収した。回収したアカントアメーバを、実施例4〜6及び比較例4〜6の培地を用いて、アカントアメーバ濃度が500cells/mLとなるようにアカントアメーバ懸濁液を調製した。T−25カルチャーフラスコ内に該アカントアメーバ懸濁液5mLを分注し、25℃インキュベーター内で3日間培養した後、該フラスコ内のアカントアメーバを回収し、血球計算盤にてアカントアメーバ数を計測した。各培地を用いて培養したアカントアメーバ数について、PYG培地である比較例4のアカントアメーバ数と比較することにより、アカントアメーバ数相対率として次式によりアカントアメーバ増殖能を求めた。
前培養したアカントアメーバを回収し、1/4リンゲル液にて1.0×107cells/mLとなるよう懸濁し、これを接種原液とした。
Claims (4)
- 乳タンパク質の加水分解物又は心臓及び脳からなる群から選ばれる少なくとも1種の動物組織の抽出物と酵母エキス及び糖類とを主成分として含む、アカントアメーバ用培地(ただし、ペプトン/酵母エキス/グルコース(712)ブイヨン及び2%のバクトカシトンを含むPYG培地を除く)。
- 前記乳タンパク質の加水分解物が、カゼイン又は乳清の加水分解物である、請求項1に記載の培地。
- さらにpHが5.0〜8.0の範囲となるような緩衝剤を含む、請求項1〜2のいずれか1項に記載の培地。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の培地と、
MTT、WST−1、トリフェニルテトラゾリウム、テトラゾリウムバイオレット、ニトロブルーテトラゾリウム、テトラニトロブルーテトラゾリウム、テトラゾリウムブルークロライド及びp−イオドニトロテトラゾリウムからなる群から選ばれるテトラゾリウム化合物と
を含む、アカントアメーバの生細胞数測定用キット。
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