JP2948654B2 - ペルオキシダーゼ作用物質検出用試験片 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、体液や排泄物などの、試料中のペルオキシ
ダーゼ作用物質の、検出用試料片に関するものである。

［従来の技術］ 体液や排泄物、例えば、尿、吐物、胃腸内容物、糞便
などに混在する微量の血液等の検出は、潰瘍、腎炎等の
炎症、腸瘍、出血性素因等の疾病を、早急に発明する方
法の一つとして、診断上極めて重要であるが、通常、前
記疾病に起因する血液の量は、試料の絶対量に比べると
極く微量であるために、肉眼的確認は事実上不可能に近
い。

それ故、これら試料中の血液の検出のためには、顕微
鏡観察による方法が取られてきたのであるが再現性が欠
けるだけでなく、操作も複雑であり、多数の検体を短時
間に処理するには、本質的に無理であった。

この欠点を克服するために、有機ヒドロペルオキシド
と酸化呈色指示薬とを、担体に担持させた試験片が考案
された。これは、液体や排泄物中に血液が存在すれば、
その成分であるヘモグロビンの示すペルオキシダーゼ様
活性により、有機ヒドロペルオキシドは、分解されて酸
素を発生するので、この酸素によって、試験片中の酸化
呈色指示薬の色調を変化させて、検出しようとするもの
である。

この方法によれば指示薬の呈色の変化を、肉眼的ない
し光学的に測定すると伝う簡単な操作で、容易に試料中
のペルオキシダーゼ作用物質の検出ができる。

ペルオキシダーゼ作用は、白血球や細菌によっても発
現するので、この作用物質の検出は、腎またはん尿路の
疾患や、感染の診断にも有用である。

また、心筋梗塞時には尿中にミオグロビンが出現する
が、これもペルオキシダーゼ作用を有する物質であり、
診断に応用される。

これらの場合、ヒドロペルオキシドが分解して発生す
る酸素の量と、酸化呈色指示薬の呈色の強度には、比例
関係が存在するので、標準の色調あるいは吸光標準曲線
との対比により、ペルオキシダーゼ作用物質の、定量分
析も可能である。

前記の有機ヒドロペルオキシドと酸化呈色指示薬と
が、担体に保持されている形態の試験片においては、検
体中の微量のペルオキシダーゼ作用物質を、鋭敏に検出
できるように、当該試験片の検出感度を向上させたり、
劣化防止や安定化を意図した各種の試験片が、考案され
ている。

例えば、該試験片の検出感度を向上させる化合物とし
ては、特開昭49−54094号広報にはベンゾキノリン誘導
体が、特開昭54−24697号公報にはベンゾチアゾール誘
導体が有効である旨の記載がある。

また、特公昭39−14747号公報にはマイクロカプセル
化を利用して、有機ヒドロペルオキシドと酸化呈色指示
薬とを隔離して、安定性を向上させる方法が、さらに
は、特開昭51−65694号公報にはポリビニルピロリドン
のようなフィルム形成性重合体を利用して、同様に安定
化を図る例が記載されている。

有機ヒドロペルオキシドと酸化呈色指示薬との間に、
ある種の添加物質を安定化のため介入させる例として
は、特開昭49−54093号公報にはリン酸アミドが、ま
た、特開昭53−115288号公報にはトリエタノールアミン
ボレート等のホウ酸エステルが記載されているが、いず
れも、ペルオキシダーゼ作用物質の存在しない条件下
で、有機ヒドロペルオキシドと酸化呈色指示薬とが、反
応することを防止しようとするものである。

［発明が解決しようとする問題点］ ペルオキシダーゼ作用物質検出のための試験片にあっ
ては、担持されている有機ヒドロペルオキシドと酸化呈
色指示薬とは、極めて反応性に富んでいて、前項で示し
た如き方法では、保存中に両試験薬間で起きる、酸化還
元反応による試験片の劣化は、ある程度の改善は見られ
ても、効果は限定的である。

試験片が保存される環境について言えば、過酸化物質
を分解する種々の要因、例えば紫外線等の光線、温度、
湿度などの物理化学的要因や、金属粒子、酸化還元性物
質の存在などにより、試験片は容易に変色や反応性の低
下を起こすのである。

前述の試験片の劣化は、製品品質のばらつきの原因と
なるだけでなく、誤判定の要因ともなり、さらには、試
験片の長期保存性の欠如となり、品質管理上の重大な問
題点として指摘されている。

本発明は、これらの問題点を克服して、種々の因子に
よる変色や反応性等の劣化を起さず、ペルオキシダーゼ
作用物質の検出を、長期間安定して可能にした試験片
を、提供するものである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明の、ペルオキシダーゼ作用物質を検出する試験
片は、担体に少なくとも、有機ヒドロペルオキシド、酸
化呈色指示薬、および本発明の安定剤が１種、または２
種以上担持されたものであり、さらにこの種の試験片に
一般的に使用される、緩衝剤、湿潤剤、増感剤等を共存
させることを妨げない。

本発明の、ペルオキシダーゼ作用物質検出用の試験片
は、一般に紙、綿、ガラス繊維等の吸収性を持つ担体
に、前記の有機ヒドロペルオキシド、酸化呈色指示薬お
よび安定剤、さらには、緩衝剤、湿潤剤、増感剤等を担
持させた構成となっている。

吸収性の担体に、これら薬剤を含有せしめた試験片
は、ポリスチレン、ポリエチレン等のプラスチック片の
基材上に、貼り付け等の方法で固定したものが一般的使
用形態である。

本発明において使用できる安定剤としては、水または
有機溶媒に可溶な物質であって、以下の化合物群、即ち ［2,3−ジメチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−５
−オン（アンチピリン）、４−アミノ−1,5−ジメチル
−２−フェニル−３−ピラゾリン−３−オン、４−ジメ
チルアミノ−1,5−ジメチル−２−フェニル−３−ピラ
ゾリン−３−オン（アミノピリン）、および３−メチル
−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン］ のうちより選ばれた、１種または１種以上の化合物が使
用される。

本発明の安定剤を担持した試験片は、種々の因子によ
る変色や反応性の低下などの性能の劣化に対して安定で
あり、長期間にわたってその性能が維持される。

吸収性の担体に、本発明の安定剤を担持させる時の、
含浸液の濃度は、0.00001〜0.1重量％で有効であるが、
好ましくは0.0001〜0.01重量％で特に効果が大きい。本
発明の安定剤を担持させることによる試験片の安定化に
は、一般に公知な試験片の製造工程で利用が可能であ
る。

試験片に担持させる有機ヒドロペルオキシドは常温で
液体ないし固体のものが用いられるが、一般にこの化合
物は、光や熱に対して不安定であり、安定性の高い有機
ヒドロペルオキシドを、選択して使用するのが望まし
い。

安定な有機ヒドロペルオキシドとしては、ｔ−ブチル
ヒドロペルオキシド、パラメタンヒドロペルオキシド、
クメンヒドロペルオキシドなどから、１種あるいは２種
以上を選択するのがよい。

また、含浸液における、有機ヒドロペルオキシドの濃
度は、0.05〜5.0重量％、殊に0.2〜1.0重量％で調製す
るのが好ましい。

有機ヒドロペルオキシドと酸化呈色指示薬を、隔離し
て担持するのも、望ましい方法である。例えば、ゼラチ
ン、アラビアガム等の膠物質質を用いたマイクロカプセ
ルによる方法や、ポリンヴィニルピロリドン等の膜形成
性重合化合物による隔離が挙げられる。また、有機ヒド
ロペルオキシドをサイクロデキストリンで包接すること
も、安定性には有効である。

本発明に使用する酸化呈色指示薬は、有機ヒドロペル
オキシド化合物が、ペルオキシダーゼ作用物質により分
解されて発生する酸素の酸化作用を受けて発色し、肉眼
ないし光学的に判定可能となるものであれば可く、具体
的にはｏ−トリジン、ベンチジン、3,3′,5,5′−テト
ラメチルベンチジン、オルトアニシジン、2,7−ジアミ
ノフルオレン等が、0.05〜2.0重量％の濃度の含浸液と
して使用できる。

また、臨床医学上の要請から、極微量のペルオキシダ
ーゼ作用物質を検出するため、試験片には種々の増感剤
が使用される例が多くあり、増感効果を示す物質として
は、キノリン誘導体、ベンゾキノリン誘導体、ベンゾチ
アゾール誘導体、ピリジン誘導体等があるが、含浸液濃
度0.05〜1.0重量％で使用できる。

試験片中への液体の浸透を促進し、反応を容易にし、
また、酸化呈色指示薬が酸化によって生ずるラジカルカ
チオンを安定化させるために、湿潤剤を用いる場合があ
るが、ドデシル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルフォコ
ハク酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸ナト
リウム等の陰イオン性界面活性剤が適している。

また緩衝剤は、ペルオキシダーゼ使用物質の検出を鋭
敏にするために使用されるが、含浸液のpHが４〜８にな
るように、リン酸塩、クエン酸塩、フタル酸塩、コハク
酸塩等の溶媒可溶性成分が用いられる。

試験片中に、多量の水溶性物質が担持されると、測定
時にそれらが検体中に流出するおそれがあるので、これ
を防止するために、メチルセルロースやゼラチンなど
の、粘稠剤を添加することも可能である。

吸収性の担体に、前述の各種物質を担持させるには、
２つの工程に分けて実施するのが有利である。一般に溶
剤としては、低級アルコール等の有機溶媒と水との混合
物を使用し、溶剤中に所定量の有機ヒドロペルオキシ
ド、緩衝剤、湿潤剤等を溶解させ、この溶液に紙等の
吸収性の担体を浸漬した後取り出して、50〜90℃で一旦
乾燥する。さらに、酸化呈色指示膜と本発明の化合物等
が、溶解されている含浸液に浸漬して取り出し、再度乾
燥させる。

このようにして得られたペルオキシダーゼ作用物質に
感応する試験上は、適宜な大きさの小片に裁断し、プラ
スチック片等に、粘着などの方法で固定して、測定に使
用する。

この測定用試験片は、血液の100万倍希釈液に浸漬し
た後、過剰の浸漬液を除き、45秒後の色調の変化を、標
準色調と比較することにより、血液の検出が可能であ
る。また、この感度を有する試験片は、ペルオキシダー
ゼ作用物質検出用として、臨床検査などに供用可能であ
る。

本発明による試験片は、最低１年以上の保存に耐えら
れ、また、室内光線下放置しても劣化や変色を生じな
い。本発明による安定剤を含まない試験片は、放置ある
いは保存によって、経時的に発色乃至変色を生じ、検出
感度も著しく低下する。

［実施例］ 以下に、実施例を挙げて本発明の具体的に説明する
が、これによって本発明の範囲が限定されるものではな
い。

実施例1. 紙（ワットマン3MM）を次の組成の第１液に浸漬す
る。

第 １ 液 ゼラチン 0.2 アラビアゴム粉末 5.0g ドデシル硫酸ナトリウム 0.3g クエン酸３ナトリウム２水和物 9.6g クエン酸１水和物 1.7g クメンヒドロペルオキシド 1.0ml タートラジン 0.02g EDTA・2Na 5.0g 温蒸留水（約60℃） 100ml 紙を取り出し、80℃で５時間乾燥する。この紙を
次の第２液に浸漬する。

第 ２ 液 ｏ−トリンジ 0.5g ３−アミノキノリン 0.3g ポリビニルピロリドン 0.2g ４−ジメチルアミノ−1,5−ジメチル− ２−フェニル−３−ピラゾリン−３−オン 0.01g イソプロパノール 100ml 第２液を含浸した紙を取り出し、50℃で10分間乾燥
した。

このようにして得られたペルオキシダーゼ作用物質検
出用試験方は、適当な大きさに裁断し、プラスチック製
支持体に、両面接着紙等を利用して貼りつけた。

また、対照として上記製造法における第２液より、４
−ジメチルアミノ−1,5−ジメチル−２−フェニル−３
−ピラゾリン−３−オンだけを除いて製造した、ペルオ
キシダーゼ作用物質検出用試験片を用意した。

２種の試験片は、血液の100万希釈液を検体として、4
5秒後の呈色を標準色調と対比した時、共に血液の検出
が可能であった。

室内の照明下に２種の試験片を放置して、試験片の変
色と、検出感度を調べる試験を行ったところ、放置２時
間では、本発明の試験片は、変色は認め、られず、感度
も放置前と変わらないのに対し、対照の試験片は、１時
間後には既に褐変に生じ、検出感度も著しく低下してい
た。

この結果から、本発明の安定剤は、ペルオキシダーゼ
作用物質検出用試験片の、耐光安定性に著しい効果があ
るものと認められた。

次に上記２種の試験片を、乾燥剤の存在下で暗所に、
室温および37℃に保存して、劣化変色を経時的に試験し
たところ、本発明の試験片については、暗所室温の条件
で、１年経過後でも変色は認められず、血液検出感度に
も劣化は、見られなかった。

苛酷試験である37℃保存でも、３ケ月間にわたって試
験片の変色、および検出感度に劣化は観察されなかっ
た。

これに対し、対照の試験片は室温で１ケ月後、37℃で
は15日後に既に試験紙に褐変が見られ、血液の検出感度
は、著しく低下し、実用に供し得ない状態であった。

以上の結果から、実用上の条件下においても、本発明
の安定剤は、ペルオキシダーゼ作用物質検出用試験片の
保存安定性向上に、極めて顕著な効果があることが明か
となった。

実施例２ 実施例１における、４−ジメチルアミノ−1,5−ジメ
チル−２−フェニル−３−ピラゾリン−３−オンの代わ
りに、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５
−オンを用いて、実施例１と同様の操作を行ない、目的
とするペルオキシダーゼ作用物質検出用試験片を得た。

この試験片についても、実施例１の同様の試験を行な
い、本発明の安定剤を使用したものは、検出感度、耐光
安定性、保存安定性の極めて優れた、ペルオキシダーゼ
作用物質検出用試験片であることが、確認された。

実施例３ 実施例１における、４−ジメチルアミノ−1,5−ジメ
チル−２−フェニル−３−ピラゾリン−３−オンに代え
て2,3−ジメチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−５
−オン（アンチピリン）用いて、実施例１と同様の操作
を行ない、目的とするペルオキシダーゼ作用物質検出用
試験片を得た。

この試験片についても、実施例１と同様の試験を行な
い、本発明の安定剤を使用したものは、検出感度、耐光
安定性、保存安定性を極めて優れた、ペルオキシダーゼ
作用物質検出用試験片であることが、確認された。

実施例４ 実施例１における、４−ジメチルアミノ−1,5−ジメ
チル−２−フェニル−３−ピラゾリン−３−オン（アミ
ノピリン）に代えて４−アミノ−1,5−ジメチル−２−
フェニル−３−ピラゾリン−３−オンを用いて、実施例
１と同様の操作を行い、目的とするペルオキシダーゼ作
用物質検出用試験片を得た。

この試験片についても、実施例１と同様の試験を行な
い、本発明の安定剤を使用したものは、検出感度、耐光
安定性、保存安定性の極めて優れた、ペルオキシダーゼ
作用物質検出用試験片であることが、確認された。

［発明の効果］ 本発明の安定剤の使用により、検出感度、耐光安定
性、保存安定性の極めて優れた、ペルオキシダーゼ作用
物質検出用試験片の提供が、可能となった。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】有機ヒドロペルオキシド、酸化呈色指示
   薬、ならびに以下の化合物群［2,3−ジメチル−１−フ
   ェニル−３−ピラゾリン−５−オン（アンチピリン）、
   ４−アミノ−1,5−ジメチル−２−フェニル−３−ピラ
   ゾリン−３−オン、４−ジメチルアミノ−1,5−ジメチ
   ル−２−フェニル−３−ピラゾリン−３−オン（アミノ
   ピリン）、および３−メチル−１−フェニル−２−ピラ
   ゾリン−５−オン］ のうちより選ばれた、１種または１種以上の化合物を含
   有することを特徴とするペルオキシターゼ作用物質検出
   用試験片。