JPS6379071A - 多項目イムノアツセイ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は電気泳動を用いるイムノアッセイに係り、特に
多項目測定に好適なイムノアッセイに関する。
多項目測定に好適なイムノアッセイに関する。
腫瘍マーカの測定は癌の確定診断検査ではないが１組繊
細胞学的検査や、形態学的検査に比べ患者の肉体的負担
も少なく、検体が血液などの体液であるので簡単に入手
することができ、癌スクリーニング検査として適してい
る。
細胞学的検査や、形態学的検査に比べ患者の肉体的負担
も少なく、検体が血液などの体液であるので簡単に入手
することができ、癌スクリーニング検査として適してい
る。
腫瘍マーカによる癌スクリーニングが有用であるために
は、その検査の有病正診率がより高率であり、なおかつ
非癌良性疾患での無病正診率がより高率である必要があ
る。言いかたを変えれば、箱での陽性率がよい高率であ
り、なおかつ偽陽性率がより低率である必要がある。と
ころが、現在知られている各種のマーカはどれも単独で
これらの条件を十分満足させるものではない。そこで、
診断能をさらに向上させる目的で複数のマーカを組み合
わせて１ｌｌｌｆｆ定するコンビネーションアッセイ（
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ）の有用性が注
目されている。
は、その検査の有病正診率がより高率であり、なおかつ
非癌良性疾患での無病正診率がより高率である必要があ
る。言いかたを変えれば、箱での陽性率がよい高率であ
り、なおかつ偽陽性率がより低率である必要がある。と
ころが、現在知られている各種のマーカはどれも単独で
これらの条件を十分満足させるものではない。そこで、
診断能をさらに向上させる目的で複数のマーカを組み合
わせて１ｌｌｌｆｆ定するコンビネーションアッセイ（
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ）の有用性が注
目されている。
一方、各種腫瘍マーカを測定する目的で、各種のイムノ
アッセイが提案されている。しかしながら、どのイムノ
アッセイにおいても１種類の腫瘍マーカごとにしか測定
することができず、上記のコンビネーションアッセイを
行おうとすれば１個別に複数種の腫瘍マーカを測定しな
ければならない。つまり、測定しようとする数種に比例
した被検液と、手数を要す。
アッセイが提案されている。しかしながら、どのイムノ
アッセイにおいても１種類の腫瘍マーカごとにしか測定
することができず、上記のコンビネーションアッセイを
行おうとすれば１個別に複数種の腫瘍マーカを測定しな
ければならない。つまり、測定しようとする数種に比例
した被検液と、手数を要す。
このようなイムノアッセイ法の一つとして特開昭６０−
５７２５７記載の方法がある。この方法では、膜状の担
体に抗体を固定化し、この膜の面に垂直に電位勾配をか
けることにより、この方向に被測定試料中の抗原を電気
泳動によって移動せしめ、上記固定化された抗体と抗原
抗体反応を起こさせて固定させ、さらに、上記過程で固
定化させた抗原に標識された抗体を電気泳動によって移
動せしめて反応させるか、又は担体に固定化された抗体
の未反応のものに標識された抗原を固定化し、これらの
標識物の濃度を測定することにより。
５７２５７記載の方法がある。この方法では、膜状の担
体に抗体を固定化し、この膜の面に垂直に電位勾配をか
けることにより、この方向に被測定試料中の抗原を電気
泳動によって移動せしめ、上記固定化された抗体と抗原
抗体反応を起こさせて固定させ、さらに、上記過程で固
定化させた抗原に標識された抗体を電気泳動によって移
動せしめて反応させるか、又は担体に固定化された抗体
の未反応のものに標識された抗原を固定化し、これらの
標識物の濃度を測定することにより。
試料中の抗原の濃度を測定する。しかし、この方法にお
いても、複数種の腫瘍マーカを同時に測定することはで
きず１個々の腫瘍マーカを繰り返し測定せねばならない
。その結果、必要な被検液量は多量とならざるを得ない
。
いても、複数種の腫瘍マーカを同時に測定することはで
きず１個々の腫瘍マーカを繰り返し測定せねばならない
。その結果、必要な被検液量は多量とならざるを得ない
。
上記従来技術は、複数種の腫瘍マーカを測定する際に一
種類ごと別々に測定せざるを得す、測定に手間と時間を
要するとともに、多量の被検液を必要とする問題があっ
た。
種類ごと別々に測定せざるを得す、測定に手間と時間を
要するとともに、多量の被検液を必要とする問題があっ
た。
本発明の目的は、複数種の腫瘍マーカの測定を一度に行
うことにより、測定操作を短くするとともに、被検液量
を少量にすることができる。
うことにより、測定操作を短くするとともに、被検液量
を少量にすることができる。
上記目的は、電気泳動を用いるイムノアッセイにおいて
、測定対象とする複数種の抗原に対応する抗体をそれぞ
れ異なる膜状の担体に固定化させ。
、測定対象とする複数種の抗原に対応する抗体をそれぞ
れ異なる膜状の担体に固定化させ。
それらを重ね合わせ、被検試料を複数の担体中を移動さ
せて対応する抗体と抗原抗体反応を起こさせる方法によ
り達成される。
せて対応する抗体と抗原抗体反応を起こさせる方法によ
り達成される。
抗体は、結合する抗原を特異的に認識するので。
複数の抗原に対応する抗体をそれぞれ固定化した膜状の
担体を重ね合わせ、試料を通過させれば、試料中に含ま
れる各種抗原が、それぞれに対応した担体中に固定化さ
れることになる。つまり、−度の試料注入により、複数
種の抗原を同時に測定できるよ−うになる。
担体を重ね合わせ、試料を通過させれば、試料中に含ま
れる各種抗原が、それぞれに対応した担体中に固定化さ
れることになる。つまり、−度の試料注入により、複数
種の抗原を同時に測定できるよ−うになる。
以下、本発明の一実施例を図面を用いて説明する。
リング状に加工したガラス板を次の方法によりシランカ
ップリング処理した。２５ｍｕのエタノールに７５μΩ
のメタアクリル酸−３−トリメトキシシリルプロピルエ
ステルと７５０μＱの１０％酢酸を加え、攪拌した後、
この中にガラス製リングを数分間浸す。ガラス製リング
を液中より取り出し、−度乾燥させた後、次いでエタノ
ールで洗浄する。さらに１１０℃で１時間熱処理を行っ
た。
ップリング処理した。２５ｍｕのエタノールに７５μΩ
のメタアクリル酸−３−トリメトキシシリルプロピルエ
ステルと７５０μＱの１０％酢酸を加え、攪拌した後、
この中にガラス製リングを数分間浸す。ガラス製リング
を液中より取り出し、−度乾燥させた後、次いでエタノ
ールで洗浄する。さらに１１０℃で１時間熱処理を行っ
た。
電気泳動用担体として、ポリアクリルアミドゲルを用い
た。抗体を固定化した担体（以下固定化抗体膜という）
である電気泳動用担体の作製は以下のように行った。各
種の抗体（約５ ｍ ｇ ／ ｍ Ｑ ）０．５ｍＱに
０．２５％アクロレイン水溶液を２５μＱ加え、氷冷下
で３０分間反応させ後、リン酸１６Ｎ液でよく透析する
。この液に０．３２ ｇ／ｍＱのアクリルアミド溶液１
．５ｍＱ、０．０１６ｇ ／ ｍ ＱのＮ、Ｎ’−メチ
レンビスアクリルアミド溶液を１−５ ｒｎ Ｑ ｓ
４−６ ｕ Ｑ ／ ｒｎ ＱのＮ、Ｎ。
た。抗体を固定化した担体（以下固定化抗体膜という）
である電気泳動用担体の作製は以下のように行った。各
種の抗体（約５ ｍ ｇ ／ ｍ Ｑ ）０．５ｍＱに
０．２５％アクロレイン水溶液を２５μＱ加え、氷冷下
で３０分間反応させ後、リン酸１６Ｎ液でよく透析する
。この液に０．３２ ｇ／ｍＱのアクリルアミド溶液１
．５ｍＱ、０．０１６ｇ ／ ｍ ＱのＮ、Ｎ’−メチ
レンビスアクリルアミド溶液を１−５ ｒｎ Ｑ ｓ
４−６ ｕ Ｑ ／ ｒｎ ＱのＮ、Ｎ。
Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン水溶液を１
．２５ｍＱ及び１ 、２ ｍ ｇ／ ｍ ｎの過硫酸ア
ンモニウム溶液５．７５ｒｎＱを加え、攪拌して重合液
とした。
．２５ｍＱ及び１ 、２ ｍ ｇ／ ｍ ｎの過硫酸ア
ンモニウム溶液５．７５ｒｎＱを加え、攪拌して重合液
とした。
アクリル樹脂板の上に、上記シランカップリング処理し
たガラス製リングをのせ、上から重合液をすみやかに適
下し、さらにアクリル樹脂板で、ガラス製リングをはさ
み込むようにのせて押えた。
たガラス製リングをのせ、上から重合液をすみやかに適
下し、さらにアクリル樹脂板で、ガラス製リングをはさ
み込むようにのせて押えた。
尚、この際、気泡が入らないように注意した。そのまま
静置し、ゲル化させた後、アクリル樹脂板をはずし、ガ
ラス製リングの孔部に抗体を固定化させたポリアクリル
アミドゲルの結合した固定化抗体膜を得た。抗体の種類
を変え、各種の固定化抗体膜を同様に作製した。なお、
このようなガラスリングの厚みは３ｍｍ以下が好ましい
。
静置し、ゲル化させた後、アクリル樹脂板をはずし、ガ
ラス製リングの孔部に抗体を固定化させたポリアクリル
アミドゲルの結合した固定化抗体膜を得た。抗体の種類
を変え、各種の固定化抗体膜を同様に作製した。なお、
このようなガラスリングの厚みは３ｍｍ以下が好ましい
。
次に測定手順を説明する。第１図に示す如く作製した各
種の抗原に対する固定化抗体膜２，３および４を重ね合
わせ、これを、第２図に示すようにアクリル樹脂製の反
応膜保持具５により上部電解４！６の底部に取り付け、
下部電解槽７に、電解液８を電解液注入口９より注入し
、続いて上部電解槽６に電解液１ｏを電解液注入ノイズ
１１より注入する。測定試料液に１５％ショ糖溶液とな
るようにショ糖を加え、溶解させた後、試料注入ノズル
１２により１０μａを固定化抗体膜上に静かに注入する
。この際試料注入ノズル１２の先端は固定化抗体膜の近
傍に移動させる。
種の抗原に対する固定化抗体膜２，３および４を重ね合
わせ、これを、第２図に示すようにアクリル樹脂製の反
応膜保持具５により上部電解４！６の底部に取り付け、
下部電解槽７に、電解液８を電解液注入口９より注入し
、続いて上部電解槽６に電解液１ｏを電解液注入ノイズ
１１より注入する。測定試料液に１５％ショ糖溶液とな
るようにショ糖を加え、溶解させた後、試料注入ノズル
１２により１０μａを固定化抗体膜上に静かに注入する
。この際試料注入ノズル１２の先端は固定化抗体膜の近
傍に移動させる。
電極１３が陰極、ｉｌ！極１４が陽極となるように直流
電源１５を用いて電圧を印加する。印加電圧は１００ｖ
、印加時間は３０分とした。
電源１５を用いて電圧を印加する。印加電圧は１００ｖ
、印加時間は３０分とした。
つづいて、Ｇｏｌｄｍａｎの方法に準じて作製したＦＩ
ＴＣ結合抗体に、１５％ショ糖溶液となるようにショ糖
を加え溶解させた後、ｖＡｍ抗体注入ノズル１６により
２０μＱを固定化抗体膜上に静かに注入し、試料の場合
と同様に電圧を印加する。
ＴＣ結合抗体に、１５％ショ糖溶液となるようにショ糖
を加え溶解させた後、ｖＡｍ抗体注入ノズル１６により
２０μＱを固定化抗体膜上に静かに注入し、試料の場合
と同様に電圧を印加する。
印加電圧は、１００Ｖ、印加時間は３０分である。
ＦＩＴＣ結合抗体は、各種抗原に対する抗体を混合した
後、標識して得ても良いし、各抗体を標識した後、混合
して得ても良い、なお、標識抗体注入時は！！ｌ識抗体
注入ノズル１６の先端を固定化抗体膜２の近傍まで移動
させた方がよい。
後、標識して得ても良いし、各抗体を標識した後、混合
して得ても良い、なお、標識抗体注入時は！！ｌ識抗体
注入ノズル１６の先端を固定化抗体膜２の近傍まで移動
させた方がよい。
上部電解槽及び下部電解槽の電解液を、電解液排出ノズ
ル１７及び電解液排出口１８を用い除く。
ル１７及び電解液排出口１８を用い除く。
次いで、１０−２Ｍリン酸緩衝液を電解液注入ノズル、
及び電解液注入口より注ぎ、固体化抗体膜を洗浄し、そ
の後電解液排出ノズル、及び電解液排出口より、液を排
出する。
及び電解液注入口より注ぎ、固体化抗体膜を洗浄し、そ
の後電解液排出ノズル、及び電解液排出口より、液を排
出する。
固定化抗体膜を取りはずし、１つずつ順に膜中に残存す
るＦＩＴＣ量を蛍光測定により定量した。
るＦＩＴＣ量を蛍光測定により定量した。
励起波長は４８０ｎｍ、蛍光波長は５２５ｎｍとした。
測定する抗原として、ＡＥＰ （α−フェトプロティン
）、β２−ミクログロブリン、ＣＥＡ （癌胎児性抗原
）を用いて各種濃度の試料を作製し、上記測定手順に従
い測定を行い検量線を得た。その結果を第３図に示す。
）、β２−ミクログロブリン、ＣＥＡ （癌胎児性抗原
）を用いて各種濃度の試料を作製し、上記測定手順に従
い測定を行い検量線を得た。その結果を第３図に示す。
それぞれを個別に従来法に従って測定した結果とよく一
致した。相関係数はそれぞれ、ＡＦＰに対し、１．０２
、β２−ミクログロブリンに対し、０．９５．ＣＥＡに
対し、０．９７であった。
致した。相関係数はそれぞれ、ＡＦＰに対し、１．０２
、β２−ミクログロブリンに対し、０．９５．ＣＥＡに
対し、０．９７であった。
したがって本方法により同時に多項目の定量が可能であ
ることが分かる。
ることが分かる。
なお、標識抗体の標識物は各抗体毎に異なってもよいし
同種のものであってもよい。
同種のものであってもよい。
また固定された抗原の量の測定は、標識された抗原を未
反応の固定化された抗体と反応させ、これを測定する方
法によってもよい。
反応の固定化された抗体と反応させ、これを測定する方
法によってもよい。
本発明によれば、多成分の測定項目を同時に測定するこ
とができるので、操作時間の短縮及び試料の少量化の効
果がある。すなわち使用する試料量は、測定項目数に依
存しないので、−測定順目当たりの所要量は、同時に測
定する測定項目数に反比例し、多項目の測定を行うほど
その効果は大きくなる０例えば、５成分の測定を行う場
合、従来比で約５分の１の試料量で足りることになる。
とができるので、操作時間の短縮及び試料の少量化の効
果がある。すなわち使用する試料量は、測定項目数に依
存しないので、−測定順目当たりの所要量は、同時に測
定する測定項目数に反比例し、多項目の測定を行うほど
その効果は大きくなる０例えば、５成分の測定を行う場
合、従来比で約５分の１の試料量で足りることになる。
第１図（ａ）（ｂ）は５本発明の実施例の反応膜部分の
正面図及び縦断面図、第２図は本発明を行う反応部分の
装置の概略図、第３図は本発明の実施例で得られた検量
線図である。 １・・・ガラス製リング、２・・・測定項目ａに対する
固定化抗体膜、３・・・測定項目すに対する固定化抗体
膜、４・・・測定項目Ｃに対する固定化抗体膜、５・・
・反応膜保持具、６・・・上部電解槽、７・・・下部電
解槽、８・・・電解液、９・・・電解液注入口、１０・
・・電解液。 １１・・・電解液注入ノズル、１２・・・試料注入ノズ
ル。 １３・・・電極、１４・・・電極、１５・・・直料電源
、１６・・・標識抗体注入ノズル、１７・・・電解液排
出ノズル。 １８・・・電解液排出口。
正面図及び縦断面図、第２図は本発明を行う反応部分の
装置の概略図、第３図は本発明の実施例で得られた検量
線図である。 １・・・ガラス製リング、２・・・測定項目ａに対する
固定化抗体膜、３・・・測定項目すに対する固定化抗体
膜、４・・・測定項目Ｃに対する固定化抗体膜、５・・
・反応膜保持具、６・・・上部電解槽、７・・・下部電
解槽、８・・・電解液、９・・・電解液注入口、１０・
・・電解液。 １１・・・電解液注入ノズル、１２・・・試料注入ノズ
ル。 １３・・・電極、１４・・・電極、１５・・・直料電源
、１６・・・標識抗体注入ノズル、１７・・・電解液排
出ノズル。 １８・・・電解液排出口。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、電気泳動を用いて、試料中の抗原を固定化された抗
体と抗原抗体反応により固定させ、上記抗原の濃度を測
定するイムノアッセイにおいて、（イ）識別すべき抗原
を異にする複数種の抗体をそれぞれ異なる電気泳動用担
体の実質的に全域に固定させ、これらの電気泳動用担体
を積層する工程。 （ロ）被測定試料中の複数種の抗原を電気泳動によって
移動せしめ、それぞれ対応する固定化された抗体と抗原
抗体反応を起こさせ、固定させる工程、 （ハ）上記固定された抗原に、それぞれ対応する標識さ
れた抗体を電気泳動により移動させて反応させるか又は
未反応の固定された抗体に、それぞれ対応する標識され
た抗原を電気泳動により移動させて反応させる工程及び （ニ）上記標識された抗体又は標識された抗原の濃度を
それぞれの電気泳動用担体毎に測定する工程 よりなることを特徴とする多項目イムノアッセイ。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61223682A JPS6379071A (ja) | 1986-09-24 | 1986-09-24 | 多項目イムノアツセイ |
| US07/031,665 US5057438A (en) | 1986-09-24 | 1987-03-30 | Electrophoretic antigen-antibody determination with laminate of multiple membranes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61223682A JPS6379071A (ja) | 1986-09-24 | 1986-09-24 | 多項目イムノアツセイ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6379071A true JPS6379071A (ja) | 1988-04-09 |
| JPH0529066B2 JPH0529066B2 (ja) | 1993-04-28 |
Family
ID=16801994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61223682A Granted JPS6379071A (ja) | 1986-09-24 | 1986-09-24 | 多項目イムノアツセイ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6379071A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0500211A2 (en) * | 1991-02-01 | 1992-08-26 | Beckman Instruments, Inc. | On-column pre-concentration of samples in capillary electrophoresis |
| JP2007512509A (ja) * | 2003-11-05 | 2007-05-17 | エグザクト サイエンシーズ コーポレイション | 反復的親和性分離およびその使用 |
| CN107128864A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-09-05 | 上海从生生物科技有限公司 | 用于梯度凝胶胶片连续制作的全自动控制灌胶系统及方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5258086U (ja) * | 1975-10-23 | 1977-04-27 | ||
| JPS55132956A (en) * | 1979-01-31 | 1980-10-16 | Technicon Instr | Reaction method of and apparatus for composition of fluid sample and preeconcentrating apparatus |
| JPS6057257A (ja) * | 1983-09-09 | 1985-04-03 | Hitachi Ltd | イムノアツセイ法 |
-
1986
- 1986-09-24 JP JP61223682A patent/JPS6379071A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS5258086U (ja) * | 1975-10-23 | 1977-04-27 | ||
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| CN107128864A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-09-05 | 上海从生生物科技有限公司 | 用于梯度凝胶胶片连续制作的全自动控制灌胶系统及方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0529066B2 (ja) | 1993-04-28 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |