DE4126177A1 - Durchflusskondensatorzelle zur verwendung als biosensor zur kontinuierlichen, qualitativen und quantitativen bestimmung von analyten - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Durchflußkon­ densatorzelle zur Verwendung als Biosensor zur kontinuierli­ chen, qualitativen und quantitativen Bestimmung von Analyten, insbesondere mit einer Messung der Kapazität der Durchfluß­ kondensatorzelle als Funktion der Zeit, um damit Rückschlüsse auf die Analytkonzentration der Probenflüssigkeit zu erzie­ len.

Derartige Vorrichtungen sind im Stand der Technik aus der in­ ternationalen Patentanmeldung WO 88/09 499, der deutschen Of­ fenlegungsschrift DE 39 23 420 Al bekannt. Ein entscheidender Nachteil dieser bekannten Anordnungen ist die Abhängigkeit des Meßsignals vom gesamten dielektrischen Medium zwischen den Elektroden. Hier muß dem Meßsystem in der Regel ein Re­ ferenzkondensator, der unspezifische Mediumeinflüsse (Leit­ fähigkeit, Gasgehalt) kompensiert, beigestaltet werden.

In den letzten Jahren wurde die Entwicklung von Biosensoren auf dem Gebiet der Forschung stark vorangetrieben, insbeson­ dere bei der gezielten Erkennung bestimmter Stoffe aus einer komplexen Probenmatrix kommt der Verwendung der Biosensoren zunehmend Bedeutung zu. Biomoleküle (z. B. Enzyme, Antikörper Nukleinsäuren oder ganze Organismen) reagieren dabei spezi­ fisch mit dem zu detektierenden Analyten. Die sich bei der Reaktion der biologischen Komponenten mit dem Analyten än­ dernden Parameter werden für die Signalverarbeitung über einen Transducer (z. B. Elektroden, Feldeffekt-Transistoren, Photometer oder Glasfaseroptiken) in registrierbare Signale verwandelt.

Biosensoren können z. B. als Eintauchelektroden für Einmalbe­ stimmungen oder auch innerhalb eines Fließsystems zur quasi­ kontinuierlichen Bestimmung des Analyten Verwendung finden.

Im Gegensatz zur automatisierten enzymatischen Analytik wird bei den sog. Immunoassays, d. h. ein Antikörper bindet spezi­ fisch den zu detektierenden Stoff, erst seit Beginn der 80iger Jahre mit quasi-kontinuierlichen Fließsystemen gear­ beitet. Immunoassays lassen sich generell nach zwei Detek­ tionsverfahren klassifizieren; dem indirekten sowie dem di­ rekten Nachweis der Analyten.

Bei den indirekten Methoden verursacht die Ligand-Analyt Bin­ dung kein meßbares Signal. Hier muß mit markierten Analytana­ logen (sog. Konjugaten) im kompetitiven Verfahren gearbeitet werden. Dies führt zu zusätzlichen Inkubations- und Spül­ schritten für Konjugate und Substrate und damit zu höherem Geräteaufwand und längeren Analysezeiten. Ein Vorteil der in­ direkten Assays liegt jedoch in der Signalamplifikation, die das Meßsystem z. B. durch die Verwendung von Enzymmarker, er­ fährt.

Bei den direkten Meßmethoden verursacht bereits die Bindung des Analyten ein meßbares elektrochemisches, optisches oder elektrisches Signal. Zur Anwendung kommen dabei hauptsächlich piezoelektrische, optische oder photometrische Transducer. Hier kommt es zu keiner Zeitverschiebung zwischen Analytbin­ dung und Signalerfassung, und es kann das Bindungsverhalten fortwährend (on-line) aufgenommen werden.

Die Meßmethode der Verwendung eines Kondensators als Transdu­ cer im direkten Immunoassay ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung und soll im Nachfolgenden näher beschrieben werden.

Das Prinzip liegt darin, daß an zwei sich isoliert gegenüber liegenden Platten eine Spannung gelegt wird, so daß in Form ruhender Ladung Energie gespeichert wird. Die Größe der elek­ trischen Kapazität des Systems kann durch Veränderung der di­ elektrischen Eigenschaften des Mediums oder durch Variation in der Geometrie des so entstandenen Kondensators beeinflußt werden. Werden auf den Kondensatorplatten beispielsweise An­ tikörper immobilisiert, kommt es bei der Anbindung von Analy­ ten zu einer Veränderung des elektrischen Feldes zwischen den Elektrodenplatten, die im offenen Kondensator als Kammel­ eletrodenpaar ausgelegt sein können.

Da die Reaktionen der immobilisierten Antikörper mit dem Ana­ lyten nur im relativ kleinen Oberflächenbereich stattfinden, wurde nach Anordnungen gesucht, die speziell auf Änderungen in diesem Bereich reagieren. Die Entwicklung eines Transdu­ cers auf der Basis kapazitiver Messungen zielt daher auf die Anwendung sog. M-I-E Strukturen (Metall-Isolator-Elektrolyt Struktur) ab. Bei der M-I-E Struktur dient eine elektrisch leitfähige Elektrolytlösung als zweite Elektrode für das Meß­ system. Das Dielektrikum wird durch die auf der Metallplatte befindliche Isolierung gebildet. Werden an dem Dielektrikum Antikörper/Antigene gebunden, kommt es zu einer Veränderung der elektrischen Eigenschaften sowie zu einer Vergrößerung der Schichtdicke des Dielektrikums. Als Substrat für das Di­ elektrikum kamen bisher hauptsächlich Halbleitermaterialien zur Anwendung, auf denen z. B. Siliziumoxid oder organische Polymere als Isolationsschicht aufgebracht worden sind.

Aus dem oben Dargestellten ergibt sich klar die Notwendig­ keit, Biosensoren herzustellen, deren technischer Aufwand in vernünftigen Bahnen liegt und darüber hinaus kostengünstig ist.

Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Durchflußkondensatorzelle als Biosensor bereitzustellen, bei der die Vergrößerung der Schichtdicke bei Anbindung des Analyten das Dielektrikum des Kondensators gezielt und repro­ duzierbar optimiert werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im Kennzeichen des Anspruchs 1 befindlichen Merkmale gelöst, die dadurch ge­ kennzeichnet sind, daß die Arbeitselektrode aus Tantal be­ steht, das Dielektrikum sich aus auf der Arbeitselektrode anodisch abgeschiedenem Tantaloxid und einer Immobilisie­ rungsschicht zusammensetzt, die Gegenelektrode aus elektrisch leitendem Probemedium besteht und die Kontaktierung der Ge­ genelektrode mit einer Platinfolie hergestellt wird.

Zur Herstellung der oben beschriebenen Vorrichtung zur Varia­ tion der Schichtdicke eines Dielektrikums unter Verwendung einer Formierungsmethode zum Aufbringen einer Oxidschicht auf einer geeigneten Substratoberfläche (Metalloberfläche) und der Immobilisierung von analytspezifischen Liganden auf der Oxidschicht hat sich ein Verfahren als besonders günstig her­ ausgestellt, bei dem auf ein Tantalsubstrat eine aus dem Tan­ tal anodisch abgeschiedene Tantaloxidschicht in 4 % Borsäure bei Spannungen zwischen 1-250 V unter Verwendung einer Fluß­ säure zum Anätzen der Oberfläche aufgebracht wird und an­ schließend die Liganden für spezifische Analyten mit Hilfe bekannter kovalenter Bindungsmethoden immobilisiert werden.

Bei der Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es besonders wichtig und vorteilhaft, einen birnenförmigen Ab­ standshalter auf die Tantal/Tantaloxid-Elektrode aufzubrin­ gen. Dabei ist der verdünnte Teil des birnenförmigen Ab­ standshalters in Strömungsrichtung der zu analysierenden Flüssigkeit zu richten. Wichtig ist bei diesem Abstandshalter ferner noch, daß im Strömungsbereich keine scharfwinkligen Ecken vorhanden sind, die die Entstehung von Luftblasen er­ leichtern.

Als entscheidender Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache zu warten, Tantal als Grundelektrode zu wählen, um damit durch anodische Abscheidung Tantaloxidschichten her­ stellen zu können, die kleiner als 100 nm und insbesondere kleiner als 5 nm sind.

Als weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung hat sich herausgestellt, den Sensorkern, der sich aus der Tantal­ elektrode und der Tantaloxidschicht zusammensetzt, an eine im wesentlichen bekannte Viertorschaltung anzulegen, um das er­ zeugte elektrische Signal einer weiteren Verarbeitung optimal zuführen zu können.

Bei dem Verfahren zur Herstellung der Schichtdicke des besag­ ten Dielektrikums hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Tantaloberfläche etwa eine Minute lang mit Flußsäure anzuät­ zen, um damit die Oberfläche des Tantals zu vergrößern. Die anschließende anodische Abscheidung in 4% Borsäure bei klei­ nen Maximalspannungen zwischen 1-250 V Gleichspannung ist ebenfalls für die Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrich­ tung von besonderer Wichtigkeit.

Vorteilhaft bei der Formierung der Tantaloxidschicht auf dem Tantal ist ferner, die Kapazität und die Formierungsspannung während der Entstehung der Schichten gleichzeitig zu messen. Auch ist es für die Reproduzierbarkeit der Schichtdicken des Dielektrikums von äußerster Wichtigkeit und vorteilhaft, wäh­ rend des Herstellungsprozesses die Schichtdicken des Di­ elektrikums mittels Interferenzspektren zu messen und zu kon­ trollieren.

Auf die so entstandene Tantaloxidschicht können dann mittels bekannter kovalenter Bindungsmethoden Liganden, d. h. Spezifi­ sche Bindungspartner für die zu analysierenden Analyten immo­ bilisiert werden.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen sind den Unteransprüchen und der Beschreibung der Ausführungsbeispiele zu entnehmen.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen im Detail erläu­ tert. Es zeigen.

Fig. 1a eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Durchflußkondensatorzelle;

Fig. 1b eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Abstandshalters;

Fig. 2a eine schematische Darstellung des Strahlengangs bei der Interferenzmessung zur Schichtdickenbestimmung des Tantaloxids;

Fig. 2b ein Beispiel eines Interferenzspektrums;

Fig. 3 eine graphische Darstellung, in der die Spannung zur Vermehrung der Tantaloxidschicht, die Dicke der Oxidschicht und die Dauer einer Periode als Funktion der Zeit zur Formierung der Schichtdicke dargestellt ist;

Fig. 4 eine graphische Darstellung der Periodendauer in sec als Funktion der Dicke der Oxidschicht in nm;

Fig. 5 eine graphische Darstellung der Änderung der Kapazi­ tät in Prozent als Funktion der Frequenz in kHz der angelegten Wechselspannung;

Fig. 6 eine graphische Darstellung der Kapazität in nF und der Änderung der Kapazität in pF als Funktion der Zeit in Sekunden,;

Fig. 7 eine graphische Darstellung der Änderung der Kapazi­ tät in pF als Funktion der Zeit in Sekunden für ver­ schiedene Sensoren, wobei die punktierte Linie einen Sensor ohne immobilisierte Antikörper, die durchge­ zogene Linie einen Sensor mit immobilisierten BSA, die unterbrochene Linie einen Sensor mit immobili­ sierten Maus IgG für erhitzte Proben von SAM-GAL und die zweite durchgezogene Linie Sensoren mit immobi­ lisierten Maus IgG nicht erhitzten SAM-GAL dar­ stellt;

Fig. 8a eine graphische Darstellung der Änderung der Kapazi­ tät in pF als Funktion der Zeit in Sekunden;

Fig. 8b die Änderung der Kapazität in pF als Funktion der SAM-GAL in ng/ml;

Fig. 9 die Änderung der Kapazität in pF als Funktion des SAS-GAL IgG in ng/ml,;

Fig. 10 die Änderung der Kapazität in pF als Funktion der Zeit in Sekunden, wobei die gestrichelte Linie eine Inkubationszeit von 10 Minuten und die durchgezogene Linie eine Inkubationszeit von 20 Minuten darstellt;

Fig. 11 eine graphische Darstellung der Änderung der Kapazi­ tät in ppm als Funktion der Zeit in Sekunden, wobei die gestrichelte Linie für GAR IgG (20 ng/ml) und die durchgezogene Linie für SAM-GAL (20 ng/ml) steht.

Die Fig. 1 zeigt in schematischer Darstellungsweise die er­ findungsgemäße Durchflußkondensatorzelle mit ihren wesentli­ chen Bestandteilen. Hierbei bildet die Tantal/Tantaloxid­ elektrode 1, 2 den Sensorkern. Die Tantaloxidschicht 2 stellt dabei die Grundlage für die Dielektrikum des Kondensators dar. Generell lassen sich zwei Typen von Di­ elektrika unterscheiden; der sog. Barriere-Typ sowie der Po­ röse-Typ. Der Barriere-Typ ist in seiner Struktur dünn und geschlossen, während der Poröse-Typ im wesentlichen aus einer Doppelschicht, d. h. aus einer inneren dünnen Schicht, die ge­ schlossen ist und einer äußeren dicken Schicht, die porös ist, besteht. Die Dicke bei dem Barriere-Typ ist abhängig von der Maximalspannung, die bei der Entstehung der Schicht an das leitende Substrat angelegt wird, während die Dicke des Porösen-Typs von der Stromdichte der Formierungszeit und der Elektrolyttemperatur im wesentlichen abhängt.

Für die Elektrolyten werden in der Regel bei dem Barriere-Typ Borsäure oder Zitronensäure verwendet, während bei dem Po­ rösen-Typ entweder Schwefelsäure, Chromsäure oder Oxalsäure zur Anwendung kommen. Die bekannte Aluminium-Elektrolytkon­ densatoren stellen je nach Qualität eine Mischung der be­ schriebenen Typen dar und sind als Grundlage für Biosensoren nicht geeignet.

Für den vorliegenden Fall der Durchflußkondensatorzelle wurde für die Formierung des Tantaloxids auf dem Tantalsubstrat verdünnte Borsäure verwendet. Die Maximalspannungen für die anodische Abscheidung auf dem Substrat waren relativ klein. Im einzelnen wurde Tantal 1 mit einer Reinheit von 99,9+ % verwendet, daß in Flußsäure (48%) ca. eine Minute angeätzt wurde. Hierdurch kommt es zu einer Reinigung sowie zu einer Vergrößerung der Tantaloberfläche. Anschließend wird das Tan­ taloxid anodisch in 4% Borsäure auf dem Tantalsubstrat bei Maximalspannungen von 1-250 V abgeschieden. Entscheidend bei der Konstruktion der Durchflußkondensatorzelle ist die Tatsa­ che, daß mit der verwendeten Formierungsmethode des Di­ elektrikums extrem homogene, dünne Schichten erzeugt werden können. Diese dünnen Schichten sind für die Herstellung eines Biosensors von außerordentlicher Bedeutung, da die Kapazität unter anderem eine Funktion der inversen Schichtdicke ist.

Im vorliegenden Fall wird das Dielektrikum durch die auf der Metallplatte befindliche Isolierung gebildet. Werden an dem Dielektrikum Antikörper/Antigene gebunden, so führt dies zu einer Veränderung der Schichtdicke und damit zur Veränderung des Dielektrikums und letztlich zur Veränderung der elektri­ schen Eigenschaften des Kondensators.

Elektrisch gesehen stellt die Immobilisierung von Antikörpern an das Tantaloxid eine zusätzliche dielektrische Schicht dar, die Einfluß auf die Gesamtkapazität des Systems nimmt. Diese ergibt sich als Reihenschaltung der Kapazität der Tantaloxid­ schicht (Ct) sowie der Immobilisierungsschicht (Cb) zu:

Bei Anbindung des Analyten, d. h. des zu analysierenden Me­ diums an die Immobilisierungsmatrix wird eine weitere di­ elektrische Schicht (Cg) dem System zugeordnet. Daraus ergibt sich die Gesamtform:

Hieraus läßt sich die Gesamtkapazität (Cf) berechnen. Daran ist zu erkennen, daß die Gesamtkapazität eine Zusammensetzung aus mehreren Teilkapazitäten ist, wobei im vorliegenden Fall die Analytschicht (Cg) die entscheidende Rolle spielt. Mit anderen Worten heißt das, daß bei minimaler Tantaloxid- Schichtdicke die Gesamtkapazität maximal ist, während umge­ kehrt bei relativ großer Schichtdicke des Dielektrikums die Sensitivität des Meßsystems minimal wird. Das bedeutet letzt­ lich für die Herstellung eines Biosensors, daß die Schicht­ dicke des Dielektrikums optimal, d. h. so dünn wie möglich zu gestalten ist, um eine möglichst große Kapazität zu erzielen.

Dazu ist es unbedingt erforderlich, die Reproduzierbarkeit und Bestimmbarkeit der Schichtdicke zu gewährleisten. Die Schichtdicke kann dabei mittels kohärenter Lichtwellen durch Reflektion, Brechung oder Beugung an dünnen Schichten fester Körper mittels Interferenzspektren verfolgt und genauestens gemessen werden. Die Dicke einer homogenen, dünnen Tantal­ oxidschicht 2 auf Tantal 1 kann somit durch Aufnahme von In­ terferenzspektren optisch bestimmt werden. Dies wird im Prin­ zip in Fig. 2a schematisch dargestellt. Bei den hergestellten Sensoren wurde darüber hinaus während der Formierung des Tan­ taloxids die Kapazität und die Formierungsspannung gemessen. Gleichzeitig wurden mittels Spektralanalyse die Interferenz­ spektren der jeweiligen Schichten aufgenommen und die Schich­ ten des Dielektrikums bestimmt, wie dies in Fig. 3 darge­ stellt ist.

Die Kapazität nimmt bedingt durch die größer werdende Schichtdicke im Laufe der Formierung ab, da die Kapazität um­ gekehrt proportional der Schichtdicke ist. Gemessen wurde im vorliegenden Fall die Periodendauer einer Auf- und Entladung. Betrachtet man im Bereich kleiner Formierungszeiten den Zu­ sammenhang Schichtdicke/Kapazität, so erfährt man, daß bei kleinen Schichtdicken (bis zu ca. 100 nm) eine Erhöhung der Schichtdicke um 10 nm eine deutliche Abnahme der Kapazität vorliegt. Dies ist in Fig. 4 dargestellt. Dabei sind 10 nm in etwa der Größenbereich der Antigenbindungspartner.

Die Bestimmbarkeit der Schichtdicke und damit die Möglich­ keit, Sensoren reproduzierbar herzustellen, sowie die hohe Sensitivität des Systems gegenüber minimaler Schichtdickenän­ derung, sind die Voraussetzungen für die Verwendung der Di­ elektrika als Grundlage für Biosensoren der vorliegenden Er­ findung.

Beide Eigenschaften liegen in der Tatsache begründet, daß auf dem Substrat Tantal extrem dünne und homogene Schichten von Tantaloxid hergestellt werden konnten, die kleiner als 5 nm sind. Dieses ist mit anderen Materialien herkömmlicher Elek­ trolytkondensatoren, wie beispielsweise Aluminium, nicht ge­ lungen.

Auf dem oben beschriebenen Sensorkern, der sich aus dem Grundsubstrat Tantal 1 und der darauf befindlichen dünnen Tantaloxidschicht 2 zusammensetzt, wird bei der Herstellung ein Abstandshalter 5 gelegt. Die Form des Abstandshalters wurde birnenartig gewählt und spielt eine wichtige Rolle im Hinblick auf die Vermeidung der Entstehung von Luftblasen in der Durchflußkondensatorzelle. Durch den Abstandshalter wird winkellos die zu untersuchende Probenflüssigkeit 3 geleitet. Die Zuführung der Probenflüssigkeit 3 erfolgt am verdickten Teil, die Abführung der Probenflüssigkeit am zugespitzten Teil des Abstandshalters 5. Hierdurch kommt es zu einer stei­ genden Strömungsgeschwindigkeit innerhalb der Durchflußzelle, und vorhandene Luftblasen werden aus dem System herausge­ spült.

Die zu untersuchende Probenflüssigkeit 3 dient als Gegen­ elektrode. Im Abstandshalter wird als Kontaktierung zur Ge­ genelektrode eine Platinfolie 4 aufgelegt, so daß ein guter elektrischer Kontakt hergestellt ist. Die beschriebenen Ele­ mente des Sensors werden über zwei feste Platten 8, die aus elektrisch nichtleitenden Materialien bestehen, wie bei­ spielsweise Teflon, aneinandergepreßt. Die Tantal/Tantaloxid­ elektrode sowie die Kontaktierung der Gegenelektrode mit der Platinfolie 4 werden für Präzisionsmessung in bekannter Vier­ torschaltung 6 über Koaxialkabel am Meßinstrument angeschlos­ sen. Der gesamte Sensor wird mit seinem Metallmantel 7 am Meßinstrument angeschlossen und somit elektrisch abgeschirmt.

Um die Oberfläche des Biosensors für den zu bestimmenden Ana­ lyten selektiv auszulegen, wird der Bindungspartner, der zu bestimmenden Substanz auf dem Tantaloxid immobilisiert. Hierzu werden in der Literatur gängige kovalente Bindungsme­ thoden, wie die Immobilisierung über Silanisie­ rung/Glutaraldehydaktivierung oder Immobilisierung über Car­ bodiimid, verwendet.

Mit dem so hergestellten Dielektrikum, wie es in Fig. 1 im Prinzip dargestellt ist, wurden Probenmessungen durchgeführt die Ergebnisse lieferten, die mit herkömmlichen Biosensoren derzeit nicht erzielt wurden.

Die Messungen wurden auf folgende Art durchgeführt:

• - Der Durchflußkondensator wurde mit einem Arbeitspuffer durchspült, wozu ein Meßwert I gemessen wurde,;
• - anschließend wurde zu der zu untersuchenden Probenflüssig­ keit gewechselt und der Durchflußkondensator für eine be­ stimmte Zeit von dem Analyten durchströmt;
• - sodann wurde erneut zum Arbeitspuffer gewechselt, was einen Meßwert II ergab;
• - anschließend wurde der Biosensor durch Spülen mit Elutions­ puffer, z. B. Glycin/HCL, regeneriert;
• - was schließlich zu dem Meßergebnis führte, daß die Kapazi­ tätsdifferenz zwischen dem Meßwert I und Meßwert II dar­ stellt.

Hierbei wurden die ersten drei Schritte automatisch durchge­ führt. Alternativ zu dieser Meßmethode kann die Probenflüs­ sigkeit auch in den Arbeitspuffer injiziert werden.

Ferner konnte mit der beschriebenen Durchflußkondensatorzelle gezeigt werden, daß bei dem Nachweis von biologischen Mate­ rialien ein Frequenzoptimum existiert, bei welchem die Kapa­ zitätsmessungen durchgeführt werden sollten. Zur Ermittlung dieses Optimums werden die Kapazitätsänderungen für einen be­ stimmten Analyten in Abhängigkeit zur Meßfrequenz betrachtet. Die weiteren Messungen werden bei der für den Analyten opti­ malen Frequenz durchgeführt.

Eine eventuell vorhandene Drift in der Basislinie beim Durch­ spülen des Durchflußkondensators mit Arbeitspuffer kann bei der Berechnung der Kapazitätsdifferenzen rechnerisch kompen­ siert werden.

Im folgenden werden nun Meßbeispiele gegeben, die einzeln kommentiert werden.

Beispiel I

In der Fig. 5 wird eine Frequenzoptimierung für den Analyten Schaf-Anti-Maus-IgG-β-Galaktosidase (SAM-GAL) gezeigt.

Auf der Sensoroberfläche des beschriebenen Durchflußkondensa­ tors wurden Maus IgG mittels der Silanisierungs/Carbodiimid Methode immobilisiert. Anschließend wurde in beschriebener Art und Weise die Kapazitätsänderung nach 10 minütiger Inku­ bationszeit mit Schaf-Anti-Maus-IgG-β-Galaktosidase (4 Ig/ml) bei Meßfrequenzen von 100 bis 20 000 Hz gemessen.

Das Frequenzoptimum für den Analyten Schaf-Anti-Maus-Galakto­ sidase-IgG wurde bei 1000 Hz herausgefunden. Nachfolgende Messungen des Ligand-Analyt Verhaltens wurde bei 1000 Hz ge­ messen.

Beispiel II

In Fig. 6 wird der Nachweis von Schaf-Anti-Maus-IgG-β-Galak­ tosidase (SAM-GAL) (20 ng/ml) erbracht.

Das Dielektrikum der Sensoroberfläche wurde auf die beschrie­ bene Art von 250 V formiert. Auf der Sensoroberfläche wurde Maus IgG immobilisiert und das Vorhandensein von Schaf-Anti- Maus-Galaktosidase (20 ng/ml) in der Probenflüssigkeit nach­ gewiesen.

Beispiel III

Die Fig. 7 zeigt die Selektivität der Sensoroberfläche.

Um die Selektivität der Sensoroberfläche für den zu detektie­ renden Analyten zu verdeutlichen, wurde

• a) die Sensoroberfläche mit analyt-unspezifischem Protein (BSA) belegt und
• b) mit analyt-spezifischem Protein (Maus IgG) durch Wärme (15 min, 100°C) denaturierter Analyt gemessen.

Es zeigte sich, daß die Sensoren auf denen k ein bzw. unspe­ zifisches Protein immobilisiert worden war, bei Messungen von nicht denaturiertem Analyt geringe Meßsignale lieferten.

Die für den Analyten Schaf-Anti-Maus IgG spezifisch ausge­ legte Sensoroberfläche reagierte mit dem hitzedenaturierten Analyten nicht, zeigte jedoch ein signifikantes Meßsignal bei der nicht-denaturierten Probe.

Beispiel IV

Die Fig. 8a und 8b zeigen die Konzentrationsabhängigkeit des Meßsignals.

Um in der Probenanalytik eingesetzt werden zu können, muß der Durchflußkondensator Meßsignale liefern, die von der Konzen­ tration des Analyten abhängig sind. Als Beispiel wurde auf einem bis 250 V formatiertem Dielektrikum Maus IgG immobili­ siert und verschiedene Konzentrationen von Schaf-Anti-Maus- IgG-β-Galaktosidase gemessen. Hierbei zeigte sich eine signi­ fikante Abhängigkeit des Meßsignals von der Probenkonzentra­ tion.

Beispiel V

Die Fig. 9 zeigt die Abhängigkeit der Sensitivität von der Schichtdicke des Dielektrikums.

Wie weiter oben dargelegt wurde, sollte die Sensitivität und damit die Änderung der Kapazität mit sinkender Schichtdicke, d. h. mit kleinerer Formierungsspannung des Tantaloxids, zu­ nehmen, Als Beispiel wurden Meßversuche analog zu denen unter Beispiel IV durchgeführt, jedoch mit Dielektrika, die bei 5 bzw. 3 V formiert wurden. Es zeigt sich, daß die Kapazitäts­ änderung um so größer ist, je geringer die Schichtdicke des Tantaloxids auf dem Tantal ist, was zu erwarten war.

Beispiel VI

Die Fig. 10 zeigt die Zeitabhängigkeit des Meßsignals.

Das Meßsignal sollte abhängig sein von der Inkubationszeit des Analyten mit der Sensoroberfläche. In einem Beispiel wurde auf der Sensoroberfläche Maus IgG immobilisiert und Ziege-Anti-Maus IgG detektiert. Die Inkubationszeiten waren 10 bzw. 20 Minuten. Es zeigte sich, daß eine Verdoppelung der Inkubationszeit der Probe zu einer Verdoppelung des Meß­ signals führte.

Beispiel VII

Die Abbildung 11 zeigt die Aufnahme verschiedener Analyten.

Ein wichtiger Vorteil der Verwendung direkter immunologischer Analysemethoden liegt darin, daß keine markierten Bindungs­ Durchflußkondensators Kaninchen IgG immobilisiert und Ziege Anti-Kaninchen-Galaktosidase bzw. Schaf Anti-Kaninchen gemes­ sen.

Aus den dargelegten Beispielen ist ersichtlich, daß es mit dem vorgestellten Dielektrikum gelungen ist, das Ligand-Ana­ lyt Verhalten direkt zu charakterisieren. Neben der Abhängig­ keit des Meßsignals von der Analytkonzentration konnte die Anwendbarkeit des Meßsystems auf verschiedene Analyten ge­ zeigt werden. Besonders geeignet erscheint das oben beschrie­ bene Dielektrikum zum Beispiel in der fortlaufenden Analytik (on-line Analytik) biotechnischer Prozesse oder als Frühwarn­ system für Pestizide in der Trinkwasseranalytik.

Abschließend ist zu bemerken, daß Versuche mit Aluminiumsub­ straten ähnliche Versuche wie mit der oben beschriebenen Kon­ densatordurchflußzelle durchgeführt wurden, die die physika­ lischen Eigenschaften sowie die prinzipielle Eignung der Kon­ densatorzelle als Transducer für Biosensoren unter Beweis stellte. Die Qualität des entstandenen Dielektrikums war je­ doch relativ schlecht, so daß keine Analytmessungen durchge­ führt werden konnten.

Hingegen konnten auf dem Tantalsubstrat erfolgreich homogene, dünne Schichten aus Tantaloxid galvanisch abgeschieden werden und so Dielektrika hoher Güte hergestellt werden. Die repro­ duzierbare Herstellung der Sensoren wurde anhand von Schicht­ dickenbestimmung über Interferenzspektralanalyse gezeigt. Nach dem Testen verschiedener Immobilisierungsmethoden auf der Tantaloxidoberfläche konnte die Bindung verschiedener Analyte an die mobilisierten Liganden fortlaufend charakteri­ siert werden. Als Detektionslimit für z. B. Anti-Maus-IgG-β- Galaktosidase wurde bei 10 minütiger Inkubationszeit 1 ng/ml IgG bestimmt. Deren Nachweis von Ziege-Anti-Maus-IgG konnte ab 10 ng/ml geführt werden.

Alle Messungen wurden mit einem handelsüblichen Präzisionska­ pazitätsmeßgerät durchgeführt. Das Meßinstrument wurde über eine Schnittstelle an einen Rechner angeschlossen, so daß der Verlauf der Probenanalyse zeitgleich am Rechnermonitor ver­ folgt werden konnte und eine automatische Datenaufnahme gesi­ chert war.

Claims (13)

1. Vorrichtung zur Variation der Schichtdicke eines Di­ elektrikums auf einer geeigneten Substratoberfläche (1) unter Verwendung einer Formierungsmethode zum Aufbringen einer Oxidschicht (2) und Interferenzspektren von ana­ lytspezifischen Liganden auf der Oxidschicht (2), da­ durch gekennzeichnet, daß

• - die Arbeitselektrode (1) aus Tantal besteht;
• - das Dielektrikum sich aus auf der Arbeitselektrode (1) analytisch abgeschiedenen Tantaloxidschicht (2) und einer Immobilisierungsschicht aus Liganden und Analyten zusammensetzt;
• - die Gegenelektrode (3) aus elektrisch leitendem Probe­ medium besteht;
• - die Kontaktierung der Gegenelektrode (3) mit einer Pla­ tinfolie (4) hergestellt wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein birnenförmiger Abstandshalter (5) auf die Tantal/Tantaloxid-Elektrode gebracht wird, wobei der verdünnte Teil der Birne in Strömungsrichtung weist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß im Strömungsbereich der Abstandshalter (5) winkellos ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Tantaloxidschicht (2) auf dem Tantal (1) kleiner 100 nm und insbesondere kleiner 5 nm und vorzugsweise homogen verteilt ist. Tantal (1) kleiner 5 nm und homogen verteilt ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Abschirmung und der Anschluß des Sensorkerns (1) und (2) an einer Viertorschaltung (6) liegt.

6. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Probenflüssigkeit als Gegenelektrode (3) verwendet wird.

7. Verfahren zur Herstellung eines Dielektrikums in einer Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß auf ein Tantalsubstrat (1) eine aus dem Tantal anodisch abgeschiedene Tantaloxidschicht (2) in 4% Borsäure bei Spannungen zwischen 1-250 V unter Verwendung einer Flußsäure zum Anätzen der Oberfläche aufgebracht wird und anschließend die Liganden für spezifische Analyten mit Hilfe konstanter kovalenter Bindungsmethoden immobilisiert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Tantaloberfläche (1) etwa eine Minute lang mit Flußsäure (48%) angeätzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß auf die angeätzte Tantaloberfläche (1) eine Tantaloxidschicht (2) kleiner als 5 nm anodisch in 4% Borsäure bei Spannungen zwischen 1 bis 250 V Gleichspannung abgeschieden wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß während der Formierung der Tantaloxidschicht (2) die Kapazität und die Formierungsspannung an der Oxidschicht gleichzeitig gemessen wird.

11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß während der Herstellung der nach Anspruch 1 beschriebenen Vorrichtung die Schichtdicken des Dielektrikums mittels Interferenzspektren gleichzeitig gemessen werden.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Bindungspartner (Liganden) mittels bekannter kovalenter Bindungsmethoden immobilisiert werden.

13. Verfahren der nach Anspruch 1 und 2 hergestellten Vor­ richtung als Biosensor (Durchflußkondensator), mit dem fortlaufend in der Analytik biologischer Prozesse gemes­ sen wird, um das Ligand-Analyt-Verhalten direkt zu cha­ rakterisieren.