WO2001029560A1 - Elektrochemischer enzymimmunoassay - Google Patents

Elektrochemischer enzymimmunoassay Download PDF

Info

Publication number
WO2001029560A1
WO2001029560A1 PCT/EP2000/009970 EP0009970W WO0129560A1 WO 2001029560 A1 WO2001029560 A1 WO 2001029560A1 EP 0009970 W EP0009970 W EP 0009970W WO 0129560 A1 WO0129560 A1 WO 0129560A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
enzyme
substrate
microtiter plate
electrode
Prior art date
Application number
PCT/EP2000/009970
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Chun Sik Lee
Jae-Chul Pyun
Hyeck-Hee Lee
Jae-Sun Byun
Original Assignee
Kist Europe Korea Institute Of Science And Technology Europe Forschungsgesellschaft Mbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kist Europe Korea Institute Of Science And Technology Europe Forschungsgesellschaft Mbh filed Critical Kist Europe Korea Institute Of Science And Technology Europe Forschungsgesellschaft Mbh
Priority to AU10239/01A priority Critical patent/AU1023901A/en
Publication of WO2001029560A1 publication Critical patent/WO2001029560A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/30—Electrochemically active labels

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme immunoassay, for example an EIA or ELISA (enzyme-linked immunoassay).
  • Enzyme immunoassays of this type are used in medical diagnostics and numerous other areas of biomedical research, in microbiology and for scientific analysis. They essentially serve to determine and quantify any kind of antigens, haptens or antibodies.
  • the enzyme is coupled to one of the reaction partners, for example an antibody, and thus the specificity of immunological reactions with an enzyme Fitat of immunological reactions combined with an enzymatic reaction.
  • the enzyme-linked reaction partner binds, for example, specifically tightly or via further mediators, for example antibodies, to the antigen, hapten or the antibody to be detected and is thereby immobilized. After the non-immobilized reaction partners have been washed out, substrate is added so that the enzymatic reaction is started, a reaction product to be detected in a conventional manner from the substrate by means of the enzymatic reaction using the enzymatic reaction.
  • Enzyme immunoassays can be carried out in a wide variety of combinations as competitive and non-competitive tests.
  • the present invention is based on conventional enzyme immunoassays (EIA) or enzyme-linked immunoassays (ELISA), in which color detection is used to quantify or detect an analyte in a sample. This color proof is usually carried out with an optical detector.
  • EIA enzyme immunoassays
  • ELISA enzyme-linked immunoassays
  • FIG. 1 shows an example of the construction and implementation of such an EIA.
  • an antigen Ag is immobilized on a microtiter plate 1 which specifically contains an antibody Ab can bind.
  • a sample to be examined is placed on the microtiter plate 1, which possibly contains antibody Ab as analyte.
  • This then binds to the immobilized antigen Ag and is thereby immobilized itself.
  • the sample is then washed out so that only the immobilized antigens Ag and antibodies Ab remain on the microtiter plate.
  • another antibody Ab-Enz is added to the microtiter plate, which in turn binds specifically to the Ab antibody and to which an enzyme is coupled. This enzyme is chosen so that it triggers a color reaction when a certain substrate is added.
  • the intensity of the color reaction depends proportionally on the amount of immobilized enzyme, which in turn corresponds to the amount of antibody Ab.
  • Alkaline phosphatase or hydrogen peroxidase for example, are conventionally used as enzymes.
  • a wide variety of substrates are known from the literature for these enzymes.
  • the color reaction is usually stopped using a strongly acidic or basic solution after a certain reaction time after the addition of substrate.
  • the optical density can then be measured at specific wavelengths, which correspond to absorption bands of the substrate or of the product, and the amount of antibody Ab can thus be determined.
  • Electrochemical immunoassays are also known in which disposable electrodes are combined as a unit with special enzymes and meditators for this purpose. The disadvantage of this is that the entire electrodes must be disposed of after each test. Based on the conventional enzyme immunoassays in which a color reaction is optically detected, it is an object of the present invention to provide a method in which an analyte in a sample can be detected and quantified in a non-optical manner using these conventional enzyme immunoassays.
  • the conventional optical enzyme immunoassays already available can be used, but the measurement and evaluation is carried out not optically but electrochemically. All enzyme immunoassays (EIA and ELISA) that are already available can be used without any problems.
  • the electrochemical method according to the invention benefits from the already extensive automation (e.g. microtiter plates) of conventional optical enzyme immunoassays.
  • the device according to the invention which is suitable for carrying out the method, now has at least one electrode unit with at least one working electrode and at least one reference electrode, and a potentiostat for keeping the electrical potential constant between the working electrode and the reference electrode and for generating an electrical output signal. Furthermore, this device has a voltage supply for the electrode unit.
  • either the electrode units or the microtiter plate itself can be displaceable by the working electrodes in each case in the individual wells of the microtiter plate and to carry out the measurement.
  • a separate working electrode and a reference electrode can also be provided in the well arrangement of a microtiter plate for corresponding distances for each individual well.
  • the signals of the potentiostat are evaluated after conversion into digital signals, preferably by means of a microprocessor.
  • a device according to the invention is described below by way of example.
  • Figure 2 shows a device according to the invention with an electrode unit 2 which fits into a well of a microtiter plate. Furthermore, this device has a potentiostat 3 for generating the reduction / oxidation potential and for generating an output signal, a voltage supply 4 for the potentiostat, an analog / digital converter 5 and a microprocessor 6.
  • the electrodes of the electrode unit are now inserted into a well of a microtiter plate and the current generated at a constant reduction / oxidation potential is measured. This is proportional to the amount of oxidized or reduced color substrate and thus proportional to the amount of analyte to be detected.
  • This amperometric analysis is also the same as for the optical one
  • the potentiostat 3 generates analog signals and outputs them to the analog / digital converter 5, which the converts analog signals into digital signals and outputs them to the microprocessor 6, where the data is evaluated and displayed.
  • FIG. 3 shows a typical signal of an amperometric measurement as described above. This signal was measured with a microtiter plate coated with a horseradish peroxidase. It is therefore not an actual enzyme-linked immunoassay system, but it shows the applicability of the method according to the invention for enzyme immunoassay systems.
  • the same sample was subjected to an electrochemical measurement according to the method according to the invention.
  • the potential between the working and reference electrodes was kept at 0.45 V using a potentiostat.
  • the signal from the electrodes was determined for 100 s for each sample at room temperature.
  • the baseline (BL) was determined by immersing the electrode in TMB solution, which was treated with a 2 M sulfurous column. Since the sample solution on the electrode could contaminate the TMB solution for the baseline measurement, the
  • the first part (0-100 s) and the third part (200-300 s) of the total signal correspond to the baseline, which is measured for a non-colored substrate solution.
  • the second part of the signal shows a significant change from the baseline, which corresponds to a color reaction of the substrate. This second part of the signal was obtained in a colored solution which had an optical density of 0.52.
  • the measurements in FIG. 4 were carried out for the optical density at a wavelength of 450 nm.
  • BL represents the baseline of the measurement with a TMB solution in FIG. 4.
  • the average optical density of the baseline samples (n 4) corresponded exactly to the optical density of the negative control samples.
  • the electrochemical measurement was carried out. As shown in FIG. 4, the corresponding measured optical density of the sample is given for the corresponding electrochemical signal in order to facilitate the comparison.
  • the baseline was determined using a TMB solution that was quenched with 2M sulfuric acid. Each measurement was carried out for 100 s at room temperature. The difference in the electrochemical signal between a negative signal and a positive signal is obviously large enough in FIG. 4 to carry out a correct determination of the assay result. There is only a slight difference between the baseline BL and the signal from the negative control sample.
  • optical density of the baseline BL is identical to the optical density of the negative control, i.e. an optical density of 0.05. 4 clearly shows that an electrochemical measurement can be applied directly to conventional EIA or ELISA kits.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Enzymimmunoassay (EIA, ELISA) mit einer Probe, wobei ein Reaktionspartner zu der Probe gegeben wird, an den ein Enzym gekoppelt ist, das bei Zugabe eines Substrates eine Redox-Reaktion und Farbreaktion des Substrates auslöst, und wobei nicht gebundene Reaktionspartner entfernt und anschliessend Substrat zu der Probe gegeben wird, wobei Elektroden in die Probe eingebracht und die Probe elektomchemisch vermessen wird.

Description

Elektrochemischer Enzymimmunoassay
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Enzy- mimmunoassay, beispielsweise ein EIA oder ELISA (en- zymgekoppelter Immunoassay) . Derartige Enzymim- munoassays werden in der medizinischen Diagnostik und zahlreichen anderen Bereichen der biomedizinischen Erforschung, in der Mikrobiologie und zur wissenschaftlichen Analytik eingesetzt. Sie dienen im we- sentlichen der Bestimmung und Quantifizierung von jeglicher Art von Antigenen, Haptenen oder Antikörpern.
Herkömmliche Enzymimmunoassays beruhen auf der Ver- wendung von Enzymen, z.B. Peroxidase, alkalische
Phosphatase oder Galaktosidase etc. und den entsprechenden Substraten als Detektionssysteme. Dabei wird das Enzym an einen der Reaktionspartner, beispielsweise einen Antikörper gekoppelt und damit die Spezi- fität von immunologischen Reaktionen mit einer enzy- fitat von immunologischen Reaktionen mit einer enzy- atischen Reaktion kombiniert. Der enzymgekoppelte Reaktionspartner bindet beispielsweise spezifisch dicht oder über weitere Mediatoren, beispielsweise Antikörper, an das zu erfassende Antigen, Hapten oder den zu erfassenden Antikörper und wird dadurch immobilisiert. Nach Auswaschen der nichtimmobilierten Re- aktionspartner wird Substrat zugegeben, so daß die enzymatische Reaktion gestartet wird, wobei in her- kommlicher Weise aus dem Substrat mittels der enzyma- tischen Reaktion ein photometπsch oder fluorome- trisch nachzuweisendes Reaktionsprodukt erzeugt wird.
Als Reaktionspartner werden dabei häufig monoklonale Antikörper eingesetzt, die hochspezifisch f r die nachzuweisende Substanz oder den nachzuweisenden Organismus sind. Enzymimmunoassays können dabei als kompetitive und nichtkompetitive Tests in den verschiedensten Kombinationen durchgeführt werden.
Üblich ist es heutzutage, Enzymimmunoassays als Fest- phasen-Immunotests durchzufuhren, beispielsweise als ELISA.
Die vorliegende Erfindung geht dabei aus von herkömmlichen Enzymimmunoassays (EIA) oder enzymgekoppelten Immunoassays (ELISA) , bei denen ein Farbnachweis zur Quantifizierung oder Erfassung eines Analyten in einer Probe angewendet wird. Dieser Farbnachweis wird gewohnlicherweise mit einem optischen Detektor durchgeführt .
Figur 1 zeigt ein Beispiel für den Aufbau und die Durchfuhrung eines derartigen EIA. Als erstes wird ein Antigen Ag an einer Mikrotiterplatte 1 immobilisiert, das spezifisch einen gesuchten Antikörper Ab binden kann. Daraufhin wird auf die Mikrotiterplatte 1 eine zu untersuchende Probe gegeben, die gegebenenfalls Antikörper Ab als Analyt enthält. Dieser bindet dann an das immobilisierte Antigen Ag und wird dadurch selbst immobilisiert. Die Probe wird daraufhin ausgewaschen, so daß nur die immobilisierten An- tigene Ag und Antikörper Ab auf der Mikrotiterplatte verbleiben. In einem dritten Schritt wird ein weiterer Antikörper Ab-Enz auf die Mikrotiterplatte gege- ben, der seinerseits spezifisch an den Antikörper Ab bindet und an den ein Enzym gekoppelt ist. Dieses Enzym ist dabei so gewählt, daß es bei Zugabe eines bestimmten Substrates eine Farbreaktion auslöst. Die Intensität der Farbreaktion hängt dabei proportional von der Menge an immobilisiertem Enzym ab, die wiederum der Menge an Antikörper Ab entspricht. Als Enzyme kommen dabei beispielsweise herkömmlicherweise alkalische Phosphatase oder Wasserstoffperoxidase zum Einsatz. Für diese Enzyme sind aus der Literatur ver- schiedenste Substrate bekannt.
Um die Farbreaktion der Enzyme zu stoppen, wird gewöhnlich nach einer gewissen Reaktionszeit nach der Zugabe von Substrat die Farbreaktion mittels einer stark sauren oder basischen Lösung gestoppt. Daraufhin kann die optische Dichte bei bestimmten Wellenlängen, die Absorptionsbanden des Substrates bzw. des Produktes entsprechen, gemessen werden und so die Menge an Antikörper Ab bestimmt werden.
Es sind auch elektrochemische Immunoassays bekannt, bei denen Einmal-Elektroden mit hierfür speziellen Enzymen und Meditatoren als Einheit kombiniert werden. Nachteilig daran ist, daß nach jedem Test die gesamten Elektroden zu entsorgen sind. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nunmehr ausgehend von den herkömmlichen Enzymimmunoassays, bei denen eine Farbreaktion optisch detektiert wird, ein Verfahren anzugeben, bei denen unter Verwendung dieser herkömmlichen Enzymimmunoassays auf nichtoptische Weise ein Analyt m einer Probe erfaßt und quantifiziert werden kann.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren durch Anspruch 1 sowie durch die Vorrichtung nach Anspruch 7 gelost. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfmdungsgemäßen Verfahrens und der erfmdungsgemaßen Vorrichtung werden m den abhangigen Ansprüchen gegeben.
Ausgehen von den oben beschriebenen herkömmlichen Enzymimmunoassays, die ein Enzym einsetzen, das unter Zugabe eines Substrates eine Farbreaktion auslost, wurden diese Enzymimmunoassays erfmdungsge aß dadurch weiterentwickelt, daß Elektroden m die Probe eingebracht werden und die Probe elektrochemisch vermessen wird. Grundlage für diese Möglichkeit ist dabei die Erkenntnis, daß der Schritt, mit dem die En- zymtatigkeit beendet wird (Zugabe einer sauren oder basischen Losung) lediglich die Enzyme deaktiviert, edoch die bereits emgefarbten Substrate (reduziert bzw. oxidiert) nicht zerstört. Dadurch kann deren Re- dox-Zustand zur Messung verwendet werden.
Denn die quantitative Farbentwicklung erfolgt auf- grund eines Elektronentransfers zwischen den Substraten. Dies bedeutet, daß die Farbreaktion durch das Enzym mittels Oxidations- und Reduktionsreaktionen der Substrate erfolgen. Abweichend von herkömmlichen Enzymimmunoassays kann nunmehr jedoch die Menge an oxidiertem und reduziertem Substrat elektrochemisch bestimmt werden. Diese Menge an oxidiertem und redu- ziertem Substrat ist proportional der optischen Dichte bei der entwickelten Farbe der Enzymreaktion. Es ist daher bei herkömmlichen Farb-Enzymimmunoassays nicht nur möglich, die Farbreaktion des Enzyms op- tisch zu erfassen sondern auch erfindungsge äß durch ein elektrochemisches Verfahren den Analyten zu erfassen und quantitativ zu bestimmen.
Vorteilhaft ist dabei insbesondere, daß die herkömm- liehen, bereits zur Verfügung stehenden optischen Enzymimmunoassays eingesetzt werden können, jedoch die Vermessung und Auswertung nicht optisch sondern elektrochemisch erfolgt. So können sämtliche bereits erhältlichen Enzymimmunoassays (EIA und ELISA) prob- lemlos eingesetzt werden. Insbesondere profitiert das elektrochemische Verfahren nach der Erfindung von der bereits weitgehenden Automatisierung (z.B. Mikroti- terplatten) herkömmlicher optischer Enzymimmunoassays .
Die erfindungsgemäße Vorrichtung, die sich zur Durchführung des Verfahrens eignet, weist nunmehr mindestens eine Elektrodeneinheit mit mindestens einer Arbeitselektrode und mindestens einer Referenzelektrode auf sowie einen Potentiostaten zur Konstanthaltung des elektrischen Potentiales zwischen der Arbeitselektrode und der Referenzelektrode und zur Erzeugung eines elektrischen Ausgangssignales . Weiterhin weist diese Vorrichtung eine Spannungsversorgung für die Elektrodeneinheit auf.
Im Falle eines Enzymimmunotestes, der auf einer Mikrotiterplatte durchgeführt wird, können entweder die Elektrodeneinheiten oder auch die Mikrotiterplatte selbst verschiebbar sein, um jeweils die Arbeitselektroden in die einzelnen Näpfchen der Mikrotiterplatte einzubringen und die Messung durchzuführen. Alternativ können auch für jedes einzelne Näpfchen eine eigene Arbeitselektrode und eine Referenzelektrode in der Näpfchenanordnung einer Mikrotiterplatte entsprechenden Abständen zur Verfügung gestellt werden.
Die Auswertung der Signale des Potentiostaten erfolgt, nach Wandlung in digitale Signale, vorzugsweise mittels eines Mikroprozessors.
Im folgenden wird beispielhaft eine erfindungsgemäße Vorrichtung bechrieben.
Figur 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Elektrodeneinheit 2, die in ein Näpfchen einer Mikrotiterplatte paßt. Weiterhin weist diese Vorrichtung einen Potentiostaten 3 zur Erzeugung des Reduk- tions/Oxidationspotentiales und zur Erzeugung eines Ausgangssignales eine Spannungsversorgung 4 für den Potentiostaten einen Analog/Digitalwandler 5 sowie einen Mikroprozessor 6 auf.
Zur Messung werden nun die Elektroden der Elektrodeneinheit in ein Näpfchen einer Mikrotiterplatte einge- führt und der bei einem konstanten Reduktions/Oxi- dations-Potential erzeugte Strom gemessen. Dieser ist proportional zu der Menge an oxidiertem bzw. reduziertem Farb-Substrat und damit proportional zu der Menge an zu erfassendem Analyten. Diese amperometri- sehe Analyse wird ebenfalls, wie bei der optischen
Erfassung, unmittelbar nach der Beendigung der enzy- matischen Reaktion mittels einer sauren bzw. alkalischen Lösung durchgeführt.
Der Potentiostat 3 erzeugt analoge Signale und gibt diese an den Analog/Digital-Wandler 5 aus, der die analogen Signale in digitale Signale wandelt und diese an den Mikroprozessor 6 ausgibt, wo eine Auswertung und Darstellung der Daten erfolgt.
Figur 3 zeigt ein typisches Signal einer amperomet- rischen Messung wie oben beschrieben. Dieses Signal wurde mit einer Mikrotiterplatte gemessen, die mit einer Meerrettich-Peroxidase beschichtet war. Es handelt sich daher nicht um ein eigentliches enzymge- koppeltes Immunoassaysystem, zeigt jedoch die Anwendbarkeit des erfmdungsgemaßen Verfahrens f r Enzym- lmmunoassaysysteme .
Für die Messungen aus Fig. 3 wurden Proben mit unter- schiedlichen optischen Dichten hergestellt. Hierzu wurde eine Mikrotiterplatte, die mit verschiedenen Konzentrationen einer Meerrettichperoxidase beschichtet. Daraufhin wurde eine Farbreaktion mit einer Sub- stratlosung durchgeführt, wie m folgenden beschrie- ben:
a. Es wurden verschiedene Konzentrationen von Meer- rettichperoxidaxelosung auf einer Mikrotiterplatte hergestellt durch Remverdunnung mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7.0). Nach Inkubation für 30 mm bei Zimmertemperatur wurde die Platte dreimal mit dem Phosphatpuffer gewaschen.
b. Um die Farbreaktion durchzufuhren wurde die mit Meerrettichperoxidase beschichtete Mikrotiterplatte mit einer Losung von 3,3'-, 5,5'- Tetra- methylbenzidm (TMB) behandelt, die auf herkömm¬ liche Weise hergestellt wurde. Nach Inkubation für 30 mm wurde die Reaktion mit 2 M schwef- liger Säule gestoppt. Die optische Dichte wurde bei einer Wellenlange von 450 nm gemessen, wozu ein ELISA-Lesegerät verwendet wurde.
Nachdem die optische Dichte gemessen wurde, wurde dieselbe Probe einer elektrochemischen Messung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen. Das Potential zwischen der Arbeits- und der Referenzelektrode wurde mittels eines Potentiostaten auf 0,45 V gehalten. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde das Signal von den Elektroden für 100 s für jede einzelne Probe bei Zimmertemperatur bestimmt. Vor und nach jeder Messung wurde die Basislinie (BL) durch Eintauchen der Elektrode in TMB-Lösung bestimmt, die mit 2 M schwefliger Säule behandelt wurde. Da die Probenlösung auf der Elektrode die TMB-Lösung für die Grundlinienmessung kontaminieren könnte, wurde die
Elektrode mehrfach mit destilliertem Wasser gespült, bevor sie in die TMB-Lösung eingetaucht wurde.
Der erste Teil (0-100 s) und der dritte Teil (200- 300 s) des Gesamtsignals entsprechen der Grundlinie, die bei einer nichtgefärbten Substratlösung gemessen wird. Der zweite Teil des Signals (100-200 s) zeigt eine signifikante Änderung gegenüber der Grundlinie, die einer Farbreaktion des Substrates entspricht. Dieser zweite Teil des Signals wurde in einer gefärbten Lösung erhalten, die eine optische Dichte von 0, 52 aufwies .
Nicht dargestellte Messungen ergaben, daß die elek- trochemische Analyse der Enzymreaktion im Bereich optischer Dichten zwischen 0 und 3 elektrische Signale ergibt, die proportional zu der optischen Dichte sind. Damit eignen sich die elektrochemischen Signale in gleicher Weise wie die optischen Signale eines En- zymimmunoassays zur Bestimmung und Quantifizierung eines Analyten. Eine derartige elektrochemische Bestimmung eines Enzymimmunoassays wird nun in Fig. 4 dargestellt. Hierzu wurde ein im Handel erhältlicher EIA-Typ Diagno- stik-Kit für den HIV-Virus (AIDSDIA 1/2, hergestellt von Dong-A Pharmaceutical Co. Ltd. in Seoul, Korea) verwendet. Dabei wurden sämtliche experimentellen Schritte gemäß dem Protokoll dieses Kits durchgeführt. Eine negative und eine positive Kontrollprobe, die in dem Kit enthalten sind, wurden für den hier durchgeführten Test verwendet und es wurde eine vierfache Probenerfassung durchgeführt, d.h. n = 4.
Die Messungen in Fig. 4 wurden für die optische Dich- te bei einer Wellenlänge von 450 nm durchgeführt. BL stellt in Fig. 4 die Grundline der Messung mit einer TMB-Lösung dar. Die drei Proben, die mit einer optischen Dichte von 0,05 bezeichnet sind, entsprechen den Negativkontrollproben, während die drei Proben mit einer optischen Dichte von 0,62, 0,62 bzw. 0,73 den Positivkontrollen entsprechen. Die durchschnittliche optische Dichte der Grundlinien-Proben (n = 4) entsprach genau der optischen Dichte der Negativkontrollproben .
Der Durchschnittswert der optischen Dichte gemessen bei 450 nm für die Negativkontrolle (n = 4) betrug 0,65 mit einer Standardabweichung von 0,05. Der Durchschnittswert der optischen Dichte für die Posi- tivkontrolle (n = 4) betrug 0,05 mit einer Standardabweichung von 0. Werden die Richtlinien für die Interpretation des Ergebnisses gemäß dem verwendeten Kit berücksichtigt, so entsprechen diese Werte korrekten Ergebnissen für eine Negativkontrolle und eine Positivkontrolle . Nach der Messung der optischen Dichte wurde die elektrochemische Messung durchgeführt. Wie in Fig. 4 dargestellt, wird bei dem entsprechenden elektrochemischen Signalen die entsprechende gemessene opti- sehe Dichte der Probe angegeben, um den Vergleich zu erleichtern. Wie oben beschrieben, wurde die Grundlinie mittels einer TMB-Losung bestimmt, die durch 2 M schweflige Saure gequenscht wurde. Jede Messung wurde für 100 s bei Zimmertempertur durchgeführt. Der Un- terschied des elektrochemischen Signales zwischen einem negativen Signal und einem positiven Signal ist Fig. 4 offensichtlich groß genug, um eine richtige Bestimmung des Assay-Ergebnisses durchzufuhren. Zwischen der Grundlinie BL und dem Signal der negativen Kontrollprobe besteht nur eine geringe Differenz.
Dies entspricht der Tatsache, daß die optische Dichte der Grundlinie BL identisch mit der optischen Dichte der Negativkontrolle, d.h. einer optischen Dichte von 0,05, bestimmt wurde. Die Fig. 4 zeigt also deutlich, daß eine elektrochemische Messung direkt auf herkömmliche EIA- oder ELISA-Kits angewandt werden kann.
Zusammenfassend soll noch einmal festgestellt werden, daß bisherige elektrochemische Verfahren Immuno- ssays im wesentlichen mit Elektroden arbeiteten, die fest gebundene Enzyme und Mediatoren aufwiesen und als Einmalelektroden bzw. Wegwerfelektroden verwechselt werden. Demgegenüber gibt die vorliegende Anmel- ung em Verfahren an, bei dem unmittelbar herkommiche EIA oder ELISA-Systeme elektrochemisch vermessen werden können. Anders gesagt können die gefärbten Sub- trate wie im Falle einer optischen Messung mittels einer elektrochemischen Methode erfaßt werden. Dies erfolgt vorteilhafterweise durch amperometrische Ver- fahren. Entscheidend bei dem vorgestellten Verahren ist dabei, daß herkömmliche EIA und ELISA-Systeme oh- ne jegliche Veränderungen angewandt werden können,

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Durchführung eines Enzymimmunoassays (EIA, ELISA) mit einer Probe, wobei ein Reaktionspartner zu der Probe gegeben wird, an den ein Enzym gekoppelt ist, das bei Zugabe eines Substrates eine Redox-Reaktion und Farbreaktion des Substrates auslöst, und wobei nicht gebundene Reaktionspartner entfernt und an- schließend Substrat zu der Probe gegeben wird, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß Elektroden in die Probe eingebracht und die Probe elektrochemisch vermessen wird.
2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentra¬ tion an oxidiertem Substrat und/oder reduziertem Substrat bestimmt wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym alkalische Phosphatase oder Wasserstoffperoxidase verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Festphasen-Immuntest durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder eh- rere Proben auf einer Mikrotiterplatte angeordnet werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspru- ehe, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Zweiseiten-B dungstest oder Kompetitions- test durchgeführt wird.
7. Vorrichtung mit einer Aufnahme für Probenbe- halter für einen Enzymimmunoassay, g e k e n n z e i c h n e t durch mindestens eine Elektrodeneinheit mit mindestens einer Arbeitselektrode, die m den Probenbe- halter einbringbar ist, und mindestens einer Re- ferenzelektrode, mindestens einen Potentiostaten zur Konstant- haltung des elektrischen Potentiales zwischen der mindestens einen Arbeitselektrode und der mindestens einen Referenzelektrode und zur Er- zeugung eines elektrischen Ausgangssignales der
Elektrodeneinheit, sowie eine Spannungsversorgung für die mindestens eine Elektrodenemheit .
8. Vorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch, gekennzeichnet durch einen Analog-Digital- and- ler zur Wandlung des Ausgangssignales em digitales Ausgangssignal .
9. Vorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch, gekennzeichnet durch einen Mikroprozessor zur Auswertung des digitalen Ausgangssignales.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahme für den Probenbehälter eine Aufnahme für eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Näpfchen zur Aufnahme jeweils einer Probe ist.
11. Vorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrodeneinheit für jedes der Näpfchen der Mikrotiterplatte zumindest eine Arbeitselektrode aufweist, die in das zugeordnete Näpfchen einbringbar ist.
12. Vorrichtung nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche , dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Elektrodeneinheit mindestens eine Arbeitselektrode aufweist, die zu den einzelnen
Näpfchen der Mikrotiterplatte verfahrbar ist und/oder die Probenaufnahme derart verfahrbar ist, daß die mindestens eine Arbeitselektrode der Elektrodeneinheit nacheinander in jedes der Näpfchen der Mikrotiterplatte einbringbar ist.
PCT/EP2000/009970 1999-10-21 2000-10-10 Elektrochemischer enzymimmunoassay WO2001029560A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU10239/01A AU1023901A (en) 1999-10-21 2000-10-10 Electrochemical enzyme immuno assay

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19950785.6 1999-10-21
DE1999150785 DE19950785C2 (de) 1999-10-21 1999-10-21 Verfahren zur Durchführung eines Elektrochemischen Enzymimmunoassays

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001029560A1 true WO2001029560A1 (de) 2001-04-26

Family

ID=7926449

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2000/009970 WO2001029560A1 (de) 1999-10-21 2000-10-10 Elektrochemischer enzymimmunoassay

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU1023901A (de)
DE (1) DE19950785C2 (de)
WO (1) WO2001029560A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10211540A1 (de) * 2002-03-15 2003-10-16 Kist Europe Forschungsges Mbh Vorrichtung für einen Enzymimmunoassay, Elektrode hierfür und Verfahren zur Durchführung eines Enzymimmunoassays

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD213066A1 (de) * 1982-12-28 1984-08-29 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von marker-enzymen beim enzymimmunoassay

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4230983A (en) * 1978-11-24 1980-10-28 Agro Sciences, Inc. Seed viability analyzer
JPS60155962A (ja) * 1984-01-25 1985-08-16 Fuji Photo Film Co Ltd イオン活量測定装置
GB8432069D0 (en) * 1984-12-19 1985-01-30 Iq Bio Ltd Apparatus for immunoassay
WO1992021959A1 (en) * 1991-06-06 1992-12-10 Diagnostic Concepts International, Inc. Method and apparatus for electrochemical determination of biological substances
DE19602078A1 (de) * 1996-01-20 1997-07-24 Bst Bio Sensor Tech Gmbh Vorrichtung für amperometrische kompetitive homogene Enzymimmunotests

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD213066A1 (de) * 1982-12-28 1984-08-29 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von marker-enzymen beim enzymimmunoassay

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HE YA-NAN ET AL: "An improved ELISA for the determination of thyroglobulin with differential pulse voltammetry.", ANALYTICAL LETTERS, vol. 29, no. 14, 1996, pages 2463 - 2474, XP000973128, ISSN: 0003-2719 *
HE YA-NAN ET AL: "Differential pulse voltammetric enzyme-linked immunoassay for the determination of Helicobacter pylori specific immunoglobulin G (IgG) antibody.", TALANTA, vol. 44, no. 5, 1997, pages 823 - 830, XP000973112, ISSN: 0039-9140 *
IVNITSKII D M ET AL: "AN AMPEROMETRIC SENSOR FOR REGISTERING THE RESULTS OF ENZYME IMMUNOASSAY", PRIKLADNAYA BIOKHIMIYA I MIKROBIOLOGIYA, vol. 21, no. 6, 1985, pages 821 - 825, XP000973039, ISSN: 0555-1099 *
JIAO KUI ET AL: "Detection of TMV with ODA-H2O2-HRP voltammetric enzyme-linked immunoassay system.", TALANTA, vol. 47, no. 5, December 1998 (1998-12-01), pages 1129 - 1137, XP000973111, ISSN: 0039-9140 *
JU HUANGXIAN ET AL: "Enzyme-linked immunoassay of alpha-1-fetoprotein in serum by differential pulse voltammetry.", ELECTROANALYSIS, vol. 11, no. 2, February 1999 (1999-02-01), pages 124 - 128, XP000973110, ISSN: 1040-0397 *
ROSEN I ET AL: "ALKALINE PHOSPHATASE AS A LABEL FOR A HETEROGENEOUS IMMUNOELECTROCHEMICAL SENSOR. AN ELECTROCHEMICAL STUDY", JOURNAL OF ELECTROANALYTICAL CHEMISTRY AND INTERFACIAL ELECTROCHEMISTRY,NL,ELSEVIER, AMSTERDAM, vol. 258, no. 1, 10 January 1989 (1989-01-10), pages 27 - 39, XP000670666, ISSN: 0022-0728 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10211540A1 (de) * 2002-03-15 2003-10-16 Kist Europe Forschungsges Mbh Vorrichtung für einen Enzymimmunoassay, Elektrode hierfür und Verfahren zur Durchführung eines Enzymimmunoassays

Also Published As

Publication number Publication date
DE19950785A1 (de) 2001-05-23
AU1023901A (en) 2001-04-30
DE19950785C2 (de) 2002-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3850515T2 (de) Vorrichtung zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von biologisch aktiven Substanzen.
DE2654723C2 (de) Magnetischer Festphasenträger für immunologische Bestimmungen sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung
DE68920176T2 (de) Festphasenanalytische Vorrichtung und Verfahren zum Gebrauch derselben.
EP0703452B1 (de) Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis einer zu bestimmenden Substanz
DE3922960A1 (de) Verfahren zur bestimmung eines analyten
WO2000042434A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur bestimmung eines analyten
DE69819643T2 (de) Zwei-Inkubations mit markiertem Antigen verwendenes Immunoassay
DE19540098C2 (de) Verfahren und Mehrkanalbiosensor zur Mehrkomponentenanalyse von Mischungen und/oder Gemischen
EP0268978B1 (de) Verfahren und Testträger zur Bestimmung eines Analyten
EP2282206A2 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung mehrerer Analyten mit simultaner internen Kontrolle in einer grafischen Kombination
DE4217474A1 (de) Verfahren und Mittel zur Bestimmung eines Analyts
WO2001029560A1 (de) Elektrochemischer enzymimmunoassay
EP0249877B1 (de) Verfahren zur Herstellung eines immunreaktiven Trägermaterials für die heterogene immunologische Analyse
DE3852162T2 (de) Farbstoff produzierende Zusammensetzung, diagnostischer Testsatz und ihre Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung eines Ligands unter Verwendung eines Peroxidase-markierten Rezeptors.
DE19541033C1 (de) Elektrochemisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bindungsproteinen
DE4344646A1 (de) Vorrichtung für einen kompetitiven Immuno-Assay zur Bestimmung von Haptenen
WO1997016712A9 (de) Elektrochemisches verfahren zur quantitativen bestimmung von bindungsproteinen
DE10223960A1 (de) Enzymimmunoassay
DE19645569C1 (de) Vorrichtung zum quantifizierenden und differenzierenden Nachweis verschiedener Biomoleküle in einem einzigen Testansatz
DE102008054716A1 (de) Inprozesskontrolle in einem Verfahren zur Herstellung von EPO
EP0627626B1 (de) Nachweis von viralen oder bakteriellen Antigenen mittels Durchflusscytometrie
DE2850503C2 (de) Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antibiotika
DE4314493A1 (de) Verfahren und Teststreifen zur Bestimmung eines Analyten
DE4216980A1 (de) Immunosensorische Nachweisverfahren und Vorrichtung zu deren Durchführung
DE19722815A1 (de) Verfahren zum quantifizierenden und differenzierenden Nachweis verschiedener Biomoleküle an fester Phase in einem einzigen Testansatz

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AU BA BB BG BR BZ CA CN CR CU CZ DM DZ EE GD GE HR HU ID IL IN IS JP KP KR LC LK LR LT LV MA MD MG MK MN MX MZ NO NZ PL RO SG SI SK SL TR TT TZ UA US UZ VN YU ZA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP