DE4216980A1

DE4216980A1 - Immunosensorische Nachweisverfahren und Vorrichtung zu deren Durchführung

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Publication number: DE4216980A1
Application number: DE19924216980
Authority: DE
Inventors: Frieder Prof Dr Scheller; Werner Dr Ing Lurz
Original assignee: Eppendorf Netheler Hinz GmbH; Eppendorf Geraetebau Netheler and Hinz GmbH
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 1992-05-19
Filing date: 1992-05-19
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2012-05-20
Also published as: DE4216980C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung immunologischer Nachweisverfahren zur Bestimmung von blutgruppenspezifischen Antigenen oder Antikörpern gegen diese blutgruppenspezifischen Antigene mittels Immunosensorsy stemen, auf deren Oberfläche spezifische Bindungspartner für die Blutgruppen-Antigene immobilisiert sind.

Immunologische Verfahren zur Bestimmung von Blutgruppen unter Verwendung immobilisierter Bindungspartner sind dem Prinzip nach bekannt. Beispielsweise beschreibt die US-P 4 943 522 Vorrich tungen und Verfahren zur Durchführung spezifischer Bindungspaar untersuchungen mit immobilisierten Antikörpern, wobei die be schriebenen Vorrichtungen zum einmaligen Gebrauch bestimmt sind und sich besonders für den qualitativen Nachweis durch visuelle Beobachtung eignen. Weiterhin werden halb quantitative Bestim mungen beschrieben, die auf dem Prinzip der Verdünnungsreihe beruhen. Ferner sind nach der US-P 4 943 522 quantitative Mes sungen der Farbe, Fluoreszenz oder Radioaktivität unter Einsatz zusätzlicher Meßgeräte möglich.

Die DE-PS 36 17 763 beschreibt optische Vorrichtungen zur Durch führung immunologischer Bestimmungen, die besonders zur Bestim mung der ABO-Blutgruppen geeignet sind und bei denen Antikörper auf optischen Leitern gebunden vorliegen. Die Vorrichtungen sind zur quantitativen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern ge eignet.

Verfahren und Vorrichtungen, die auf dem SPR-Prinzip (Surface Plasmon Resonance) basieren und demnach ebenfalls den optischen Verfahren zuzuordnen sind, werden in der WO 90/05303 und der WO 90/05305 beschrieben. Bei der SPR-Technik werden Änderungen des Brechungsindex in einer Schicht nahe eines dünnen Metallfilms durch die resultierenden Änderungen der Intensität eines reflek tierten Lichtstrahls gemessen. Die eigentliche Nachweisreaktion kann hierbei auf einer immunochemischen Reaktion beruhen.

Nachteilig an den bekannten Verfahren ist, daß beispielsweise bei optischen Verfahren ihr Einsatz zur Untersuchung stark ge färbter Flüssigkeiten, wie z. B. Blut, häufig mit Problemen be haftet ist; der Einsatz von Radioaktivität erfordert besondere Vorsichtsmaßnahmen, was eine allgemeine Anwendung erschwert.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren mit hoher Empfind lichkeit für die Serologie zu schaffen, das die sichere und vorzugsweise gleichzeitige Bestimmung blutgruppenspezifischer Antigene und Antikörper gegen blutgruppenspezifische Antigene gestattet. Das Verfahren soll nicht auf die Blutgruppenbestim mung nach dem AB0-System einschließlich der Untergruppen A₁ und A₂, Lewis und D(R_H) beschränkt sein, sondern soll auch den Nach weis von Serumantikörpern gegen Antigene auf den roten Blutkör perchen, vor allem vom Typ Kell, Duffy, Ridd und R_H, ermöglichen. Ferner soll eine Vorrichtung zur Durchführung derartiger Ver fahren geschaffen werden.

Zur Lösung der Aufgabe wird erfindungsgemäß ein Verfahren vor geschlagen, bei dem elektrochemische oder piezoelektrische Transduktoren, beschichtet mit Lektinen und/oder Antikörpern, als Immunosensoren verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Meßverfahren beruht auf der Bindung des nachzuweisenden Analyten an eine Transduktoroberfläche und den Nachweis der Bindung des Analyten an die Transduktoroberfläche durch elektrisch gemessene Größen am Transduktor, wie zum Bei spiel den vom Transduktor abfließenden Strom oder die am Trans duktor in Bezug auf eine Referenzelektrode meßbare Spannung oder die bei Anlegen einer Wechselspannung beobachtbare Frequenzände rung eines piezoelektrischen Transduktors. Als Analyte werden die zu bestimmenden Teilchen bezeichnet.

Erfindungsgemäß wird derjenige Teil des Immunosensors Transduk tor genannt, der den Meßeffekt erfaßt. Im Fall der elektrochemi schen Verfahren umfaßt der Transduktor elektrisch leitende Mate rialien, während in den piezoelektrischen Verfahren piezoelek trische Materialien eingesetzt werden.

Im Fall der elektrochemischen Verfahren wird das Binden des nachzuweisenden Analyten an die Transduktoroberfläche des Immu nosensors durch die Bildung elektrodenaktiver Produkte nachge wiesen, die zu einer Strom- oder Spannungsänderung führen. Wie nachfolgend näher erläutert, werden die elektrodenaktiven Pro dukte entweder durch Markerenzyme aus geeigneten Enzymsubstraten oder aber durch Stoffwechselreaktionen des Analyten selbst ge bildet und durch amperometrische oder potentiometrische Meßver fahren nachgewiesen.

Die erfindungsgemäß eingesetzten piezoelektrischen Materialien sind beispielsweise piezoelektrische Schwingquarze, die hoch sensitiv Veränderungen der Massebeladung anzeigen und deshalb für Immunosensoren besonders geeignet sind. Zunächst wurden piezoelektrische Immunosensoren für den Nachweis gasförmiger Antigene beschrieben (G. Guilbault, GBF Monograph 10 (1987) 1871). Das Eintauchen des Schwingquarzes in Wasser führt jedoch durch die hohe Viskosität zu einer starken Dämpfung.

Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen einen oder mehrere der beschriebenen Transduktoren in Form von Immunosensoren, auf deren Oberfläche ein Bindungspart ner, d. h. ein blutgruppenspezifisches Antigen, ein erythrozy tenbindendes Lektin und/oder Antikörper, direkt oder auf einer semipermeablen Membran angeordnet sind, welche sich unmittelbar vor der Transduktoroberfläche befindet. Die Vorrichtung kann ferner eine Meßkammer mit Probenzu- und -abführung sowie die Auswertungselektronik umfassen.

Erfindungsgemäß erfolgt die Bestimmung von blutgruppenspezifi schen Antigenen und damit die Bestimmung der Blutgruppen einer seits und die Bestimmung von Antikörpern andererseits auf die nachfolgend im einzelnen erläuterte Weise.

1. Blutgruppenbestimmung

Ein mit einer erythrozytenbindenden Lektin- oder Antikörper schicht überzogener Sensor wird mit der zu untersuchenden Blutprobe in Kontakt gebracht. Das verwendete Lektin bzw. der Antikörper bindet Erythrozyten abhängig von ihrer Blut gruppe. Nach einer Inkubationszeit von 1 bis 20 Minuten wird der Sensor aus der Blutprobe entfernt und abgespült. Bei der Blutgruppe 0 erfolgt keine Bindung von Erythrozyten.

Im Fall der elektrochemischen Verfahren wird der Sensor zum Nachweis der Blutgruppenantigene der gebundenen Erythrozyten anschließend mit blutgruppenspezifischen, enzymmarkierten (monoklonalen) Antikörpern oder blutgruppenspezifischen, enzymmarkierten Lektinen in Kontakt gebracht. Beispiele für in Betracht kommenden Lektine sind: Blutgruppe B: Lektin aus Eunymus europaeus, Blutgruppe A: Lektin aus Helix aspera oder H. Pomotia, Blutgruppe A₁: Lektin aus Dolichos biflo rus, Blutgruppe A₂: Lektin aus Ulex europaeus. Dabei reagie ren die enzymmarkierten Antikörper oder Lektine mit dem komplementären Antigenen auf der Zelloberfläche der gebunde nen Erythrozyten (Abb. 1), indem sie den jeweils kom plementären Partner binden. Zur Vermeidung der unspezifi schen Adsorption wird der Sensor mit einer 2%igen Kälber serum-Lösung "geblockt".

Monoklonale Antikörper oder Lektine für die Blutgruppen A, B, AB und die Untergruppen A₁, A₂, Lewis und D(R_H) sind käuf lich erhältlich. Die Markierung der Antikörper bzw. Lektine mit den Markerenzymen erfolgt nach Standardverfahren der Proteinchemie.

Nach einer Inkubationszeit von etwa 5 Minuten wird die Sen soroberfläche zur Entfernung nicht gebundener markierter Antikörper abgespült.

Die Markerenzyme werden so gewählt, daß bei Zugabe des En zymsubstrats ein elektrodenaktives Reaktionsprodukt gebildet wird bzw. so, daß ein Substrat für die Enzymelektrode in der Reaktion entsteht. Die elektrodenaktiven Reaktionsprodukte lassen sich durch amperometrische oder potentiometrische Meßverfahren nachweisen.

Werden die einzelnen Blutgruppen (A, B, AB) und Untergruppen (A₁, A₂) nacheinander überprüft, kann für alle eingesetzten Antikörper das gleiche Markerenzym verwendet werden.

Als Markerenzyme bieten sich alkalische Phosphatase, Oxida sen und Peroxidasen an. Bevorzugte Oxidasen sind Glucose oxidase Lactatoxidase.

Bevorzugte Substrate sind im Fall der alkalischen Phospha tase para-Aminophenylphosphat und im Fall der Peroxidase Ferrocyanid. Als elektrodenaktive Produkte werden para-Ami nophenol (alkalische Phosphatase), Wasserstoffperoxid (Oxi dasen) bzw. Ferricyanid (Peroxidase) gebildet.

Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß die Bestimmung aller Blutgruppen gleichzeitig erfolgen kann. Hierbei müssen die blutgruppenspezifischen Antikörper jedoch für jede Gruppe unterschiedliche Markeren zyme tragen, die elektrochemisch unterscheidbare Produkte liefern und deren Substrate nicht miteinander reagieren.

Für den gleichzeitigen Einsatz von drei Antikörperspezies bieten sich z. B. alkalische Phosphatase, Lactatoxidase und β-Galactosidase als Markerenzyme an. Die Anzeige dem para- Aminophenols erfolgt bei +200 mV, die Anzeige von para-Ami nophenols und Wasserstoffperoxids bei +600 mV. Das Reak tionsprodukt der β-Galactosidase wird mit einer Glucoseoxi dase-Elektrode bei +600 mV angezeigt.

Für die elektrochemische Anzeige der Reaktionsprodukte wer den die üblichen amperometrischen und potentiometrischen Elektroden eingesetzt. Die Erythrozyten-bindende semiperme able Membran befindet sich unmittelbar vor der Elektroden oberfläche, um einen kurzen Diffusionsweg der elektroche misch aktiven Produkte zu gewährleisten.

Bei gleichzeitiger Anzeige der Produkte mehrerer Markerenzy me befindet sich für jedes Produkt jeweils eine elektrisch separate Indikatorelektrode unmittelbar hinter der Lektin membran.

Für das oben beschriebene Verfahren lassen sich Sensoren verwenden, an deren Oberfläche erythrozytenbindende Lektine und/oder Antikörper fixiert sind. Lektine und Antikörper werden entweder auf der Elektrodenoberfläche oder auf einer semipermeablen Membran, welche sich unmittelbar vor der Elektrode befindet, immobilisiert. Die Fixierung der Anti körper für die Gruppen A, B, AB, A₁, A₂, Lewis und D(R_H) erfolgt dabei vorzugsweise über den FC-Teil mittels Protein A oder durch etablierte Immobilisierungsverfahren über den Kohlenhydratteil. Vorteil dieses Verfahren ist, daß die hierbei verwendeten Antikörper bereits mit dem Markerenzym markiert sein können. Auf diese Weise wird ein zusätzlicher Reaktionsschritt zur Markierung gebundener Erythrozyten überflüssig. Der Meßeffekt wird hierbei dadurch ausgelöst, daß die Aktivität der gebundenen Markerenzyme durch die Bindung der großen Antigene an die Antikörper erniedrigt wird ("Enzym-modifizierender Immuntest"). Bei Blutgruppe 0 tritt demnach weder bei Anti A noch bei Anti B ein Meßsignal auf. Dieser "Inhibitor-Effekt" ist auch in Gegenwart der Blutprobe auswertbar, d. h. es ist kein Spülschritt vor der Messung erforderlich. Der Meßeffekt tritt nur bei dem Sensor auf, der die entsprechenden für die Blutgruppe spezifischen Antikörper trägt. Bei Blutgruppe 0 wird demnach kein Meßsig nal an den Enzym-Immunosensoren beobachtet.

Erfolgt die Bestimmung gebundener Erythrozyten durch den Nachweis von Stoffwechselreaktionen der Blutkörperchen, kann auf Markerenzyme ganz verzichtet werden (Abb. 2). Das Vorhandensein gebundener Erythrozyten an den jeweiligen Antikörper wird hierbei z. B. durch folgende Reaktion nach gewiesen:

- In Gegenwart von Glucose und Methylblau tritt ein star ker Sauerstoffverbrauch auf, der sich mittels Clark- Elektrode nachweisen läßt.
- Erythrozyten enthalten Lactat-Dehydrogenase. Diese reduziert bei pH 9 in Gegenwart von Lactat und des Mediators Phenaziniummethosulfat, Ferricyanid zu Ferro cyanid, das bei +50 mV an einer Platinelektrode oxi diert werden kann.
- Das Hämoglobin der Blutkörperchen besitzt peroxidanti sche Aktivität, die durch die Oxidation reduzierter Substrate quantifiziert werden kann. Bevorzugtes Sub strat ist Ferrocyanid, das sich bei -400 mV an einer Platinelektrode nachweisen läßt.

Im Fall der piezoelektrischen Verfahren führt die Massezu nahme des piezoelektrischen Materials durch das Binden der Erythrozyten an die Transduktoroberfläche zu einer Frequenz erniedrigung, die meßtechnisch erfaßt wird. Die erythrozy tenbindenden Lektine können auf der Transduktoroberfläche oder auf einer semipermeablen Membran, welche sich unmittel bar vor der Transduktoroberfläche befindet, immobilisiert sein.

Nach der Anzeige der entsprechenden elektrochemischen Signa le, die durch die Bindung der Erythrozyten hervorgerufen werden, lassen sich die oben beschriebenen Sensoren durch Abspalten der gebundenen Blutkörperchen regenerieren. Dazu wird entweder der pH-Wert auf 2 erniedrigt oder die Ionen stärke des Mediums erhöht. Die immobilisierten und gegebe nenfalls enzymmarkierten blutgruppenspezifischen Antikörper sind für die Messung von mindestens 100 Blutproben regene rierbar, danach muß der Sensor erneut mit Antikörpern be laden werden.

2. Antikörper-Bestimmung im Serum (Plasma)

Der Nachweis von Antikörpern gegen blutgruppenspezifische Antigene erfolgt mittels standardisierter Erythrozyten, die jeweils einen Antigentyp auf der Zelloberfläche tragen. Die Testerythrozyten werden an die Oberfläche des Immunosensors gebunden, anschließend wird der so präparierte Sensor mit der zu untersuchenden Blutprobe in Kontakt gebracht. Dabei werden die zu den Testerythrozyten komplementären Antikörper der Untersuchungsprobe spezifisch an diese gebunden. Die Testerythrozyten werden vorzugsweise über eine Lektin- oder Antikörperschicht an die Tranduktoroberfläche gebunden. Nach einer Inkubationszeit von 1 bis 20 Minuten wird der Sensor von der Blutprobe getrennt und abgespült.

Im Fall der elektrochemischen Verfahren erfolgt der Nachweis der gebundenen Antikörper entweder mittels enzymmarkierter Antihuman-Antikörper oder durch enzymmarkiertes Protein A oder Protein G, die beide an den FC-Teil der Patienten-Anti körper binden. Hierzu wird der Sensor mit einer Lösung, die die entsprechenden Antihuman-Antikörper oder das Protein A oder G enthält in Kontakt gebracht und anschließend-wieder gespült (Abb. 3). Die weitere Prozedur ist der Blut gruppenbestimmung analog.

Im Fall der piezoelektrischen Verfahren wird das Binden der Antikörper an die Transduktoroberfläche durch eine Frequenz änderung angezeigt.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß sich mehrere Antikörpertypen nebenein ander nachweisen lassen. Wie zuvor unter Punkt 1 erläutert, erfolgt der Nachweis entweder zeitlich nacheinander oder aber gleichzeitig. Hierzu können ein Transduktor mit mehre ren separaten Indikatoroberflächen oder mehrere separate Transduktoren eingesetzt werden.

Von den gegenwärtig bekannten insgesamt 25 verschiedenen Antikörpern sind die Merkmale Kell, Duffy, Kidd und vor allem R_H am wichtigsten.

Die Erfindung hat den prinzipiellen Vorteil, daß alle "bin denden", d. h. auch die nicht agglutinierten Antikörper er faßt werden.

Das erfindungsgemäße Immunosensorsystem und Verfahren ermöglicht es, blutgruppenspezifische Antigene und Antikörper gegen blut gruppenspezifische Antigene sicher und aus einer Blutprobe nach zuweisen. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfah rens besteht darin, daß sich mehrere Analyte nebeneinander nach weisen lassen.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und Figu ren erläutert.

Beispiel 1

An vier 2 × 2 cm große Stücke einer 20 µm dicken Zellulosemem bran werden nach der Aktivierung mit Cyanbromid in bekannter Weise monoklonale Antikörper gegen jeweils ein bestimmtes Blut gruppenantigen (A, A₁, A₂, B) fixiert. Jede dieser mit Antikör pern beladenen Membranen werden (wie bei Enzymelektroden üblich) mit einem Haltering über eine Stabelektrode gespannt. Unmittel bar hinter der Membran befindet sich die Platin-Indikatorelek trode und eine breitflächige Gegenelektrode aus Silber, die mit AgCl überzogen ist. Jede Stabelektrode mit Haltering wird in eine Mikrodurchflußzelle eingesetzt, anschließend werden die vier Durchflußzellen mit kurzen Schläuchen (Durchmesser etwa 1 mm) miteinander verbunden. Durch diese Meßzellenkombination wird 2%iges Kälberserum zum Blocken der Membranoberfläche und anschließend physiologische Kochsalzlösung (0,25 bis 0,5 ml/min) gepumpt und die Platinelektrode auf -600 mV gegen die AgCl/Ag- Elektrode mit einem Potentiostaten polarisiert. Nach einer Ein laufzeit von 20 Minuten hat sich der Strom der Elektrode stabi lisiert. Nun werden 200 µl unverdünntes Blut in die vier Meßkam mern gepumpt und der Fluß für 10 Minuten gestoppt, um die spezi fische Wechselwirkung der auf der Membran fixierten Antikörper mit den Erythrozyten zu ermöglichen. Danach wird das Blut aus den Meßzellen mit physiologischer Kochsalzlösung ausgespült. Nach 2 Minuten wird 5 mM Glucose in physiologischer Kochsalzlösung, die 1 mM Phenaziniummethosulfat enthält, durch die 4 Meß kammern gepumpt. Nur bei der Immunoelektrode, an die Erythrozy ten über die jeweiligen fixierten Antikörper gebunden sind, tritt innerhalb von 30 s eine Erniedrigung des Sauerstoff-Reduk tionsstromes auf. Dabei sinkt der Strom von einem Ausgangswert von 80 bis 150 nA auf 20 bis 40 nA ab.

Aus der Kombination der vier Meßwerte ergibt sich die Blutgruppe des untersuchten Bluts.
Blutgruppe A: nur Signal bei Elektrode mit Anti A
Blutgruppe B: nur Signal bei Elektrode mit Anti B
Blutgruppe 0: kein Signal bei Elektrode mit Anti A und Anti B
Blutgruppe AB: Signal bei Elektrode mit Anti A und Anti B
Blutgruppe A₁: Signal bei Elektrode mit Anti A₁.

Nach der Messung erfolgt die Regenerierung der Immunomembran, indem die Mikromeßkammern mit Glycin-HCl-Puffer pH2 für zwei Minuten gespült werden. Danach beginnt ein neuer Meßzyklus.

Beispiel 2

Auf die Oberfläche von Kohleelektroden (Querschnitt 1 mm) werden nach der bekannten Carbodiimid-Methode blutgruppenspezifische Antikörper gegen die Gruppen AB bzw. B fixiert. Diese Antikörper tragen als Markerenzym alkalische Phosphatase, die nach bekann ten Verfahren, z. B. mittels Glutaraldehyd, an das Antikörpermo lekül gebunden wurden.

Die beiden Immunoelektroden werden in eine Durchflußzelle mit einer antikörperfreien Vergleichs- und drei Gegenelektroden ein gebracht. Die Meßzelle wird von physiologischer Kochsalzlösung durchströmt, die 1 mM Aminophenylphosphat enthält und die Immu no- und die Vergleichselektrode werden auf +200 mV polarisiert. Nach etwa 10 Minuten erreicht der Strom einen stationären Wert von 50 bis 200 nA. Nun erfolgt die Injektion der zu analysieren den Blutprobe, die ebenfalls 1 mM Aminophenylphosphat enthält. Durch die Bindung der Erythrozyten an die enzymmarkierten Anti körper erfolgt eine deutliche Erniedrigung des Elektrodenstromes bei der Elektrode, die die komplementären Antikörper auf den Erythrozyten besitzt.

Auswertung und Regenerierung erfolgen analog zu Beispiel 1.

Beispiel 3

Zur Untersuchung von Plasma auf den Gehalt an R_H-Antikörpern werden "Testerythrozyten", die das Antigen R_H⁺ tragen, analog zu Beispiel 1 an eine Zellulosemembran, die mit Antikörpern gegen die Blutgruppe (A oder B) der verwendeten "Testerythrozyten" beladen ist, gebunden. Diese Membran befindet sich wie im Bei spiel 1 beschrieben, vor einer Mikro-Stabelektrode, die Meßelek trode ist jedoch auf +600 mV polarisiert.

Nach Erreichen eines stationären Stroms beim Durchleiten von physiologischer Kochsalzlösung wird Patientenplasma in die Meß zelle eingebracht und für 15 Minuten in Kontakt mit der "Ery throzytenmembran" belassen. Danach wird für 5 Minuten mit phy siologischer Kochsalzlösung gespült und anschließend eine Lösung von Protein A (100 ng/ml), das mit Glucoseoxidase markiert ist, vor die "Erythrozytenmembran" geleitet. Nach einer Inkubation von 2 Minuten wird erneut mit physiologischer Kochsalzlösung gespült und anschließend eine 5 mM Lösung von Glucose in physio logischer Kochsalzlösung durch die Meßzelle geleitet. Das Vor handensein von R_H-Antikörpern im untersuchten Plasma macht sich durch eine deutliche Stromerhöhung bemerkbar, anderenfalls bleibt die Stromstärke konstant.

Nach der Messung erfolgt eine Abspaltung der Erythrozyten analog Beispiel 1. Danach kann die Membran erneut mit Testerythrozyten beladen werden.

Beispiel 4

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wird Lektin aus Sophora japonica an eine Zellulosemembran gebunden und diese Membran vor eine Stabelektrode in eine Durchflußkammer eingebracht. Nach Polari sierung der Meßelektrode auf 600 mV und Stabilisierung des Stro mes in physiologischer Kochsalzlösung, wird die zu untersuchende Blutprobe für 10 Minuten mit der Lektin-Membran in Wechselwir kung gebracht und dann mit physiologischer Kochsalzlösung ge spült. Anschließend werden nacheinander mit Lactatoxidasen mar kierte Antikörper, die spezifisch für die Blutgruppen A, B und A₁ sind, in die Meßkammer gepumpt. Nach 10minütiger Inkubation wird mit einer 2 mM Lactatlösung gespült. Die Bindung der en zymmarkierten Antikörper an die Erythrozyten vor der Meßelek trode ruft einen signifikanten Stromabfall durch den O₂-Verbrauch bei der Lactatumsetzung hervor.

Auswertung und Regenerierung erfolgen analog zu Beispiel 1.

Beispiel 5

Antikörper gegen die Blutgruppen A und B werden jeweils auf die silanisierte Oberfläche einer Goldelektrode auf einem 25 MHz- Schwingquarz mittels Glutaraldehyd nach bekannter Vorschrift fixiert. Die beiden beladenen Schwingquarze werden in eine Durchflußzelle eingebracht und mit je einem Oszillator und Fre quenzzähler zur Signalauswertung verbunden.

Die Meßzelle wird mit physiologischer Kochsalzlösung durchspült und anschließend das zu untersuchende Blut eingebracht. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wird erneut gespült. Bei Bindung von Erythrozyten aus dem Blut an die mit Antikörpern beladenen Schwingquarze tritt eine Frequenzerniedrigung von 500 bis 2000 HZ ein. Auswertung und Regenerierung erfolgen analog zum Beispiel 1.

Fig. 1 zeigt eine mit einer Lektinschicht überzogene Transduk toroberfläche. Das Lektin L bindet den Erythrozyten spezifisch über das Blutgruppenantigen B auf der Oberfläche des Erythrozy ten. Zum Nachweis der Blutgruppenantigene wird der Erythrozyt mit einem enzymmarkierten blutgruppenspezifischen Antikörper in Kontakt bebracht, der ebenfalls über ein Blutgruppenantigen B auf der Oberfläche des Erythrozyten gebunden wird. Das Markeren zym E katalysiert die Reaktion des Enzymsubstrats S zum trans duktoraktiven Produkt P, das durch Diffusion an die Transduktor oberfläche gelangt, wo es meßtechnisch erfaßt wird.

Fig. 2 zeigt die Bestimmung gebundener Erythrozyten durch Stoffwechselreaktionen der Blutkörperchen. Der Erythozyt wird durch das an die Transduktoroberfläche fixierte Lektin L spezi fisch über ein Blutgruppenantigen auf der Oberfläche des Ery throzyten gebunden. Stoffwechselreaktionen des gebundenen Ery throzyten führen zur Umsetzung eines Substrates S zu einem transduktoraktiven Produkt P.

Fig. 3 zeigt die Antikörper-Bestimmung im Serum. Testerythrozy ten werden z. B. über Lektine an die Transduktoroberfläche fi xiert und anschließend mit der zu untersuchenden Probe in Kon takt bebracht. Dabei werden zu den Testerythrozyten komplementä re Serumantikörper gebunden. Der Nachweis erfolgt z. B. durch enzymmarkiertes Protein A oder Protein G, die beide an den FC- Teil der Serumantikörper binden. Das Markerenzym E katalysiert die Umsetzung des Enzymsubstrats S zum transduktoraktiven Pro dukt P, das durch Diffusion an die Transduktoroberfläche ge langt, wo es meßtechnisch erfaßt wird.

Claims

1. Immunosensorisches Verfahren zum Nachweis von blutgruppen spezifischen Antigenen der Erythrozytenoberfläche oder Anti körpern gegen dieselben (Analyte) mittels immobilisierter, spezifischer Bindungspartner für die jeweiligen Analyte, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen oder mehrere spezifische Bindungspartner auf der Oberfläche eines elektrochemischen oder piezoelektri schen Transduktors oder auf einer semipermeablen Mem bran, welche sich unmittelbar vor der Transduktorober fläche befindet, immobilisiert,
b) die Transduktoroberflächer mit einem den/die Analyten enthaltenden Medium unter Bedingungen in Kontakt bringt, welche die Bindung der jeweiligen Analyte an die spezifischen Bindungspartner auf der Transduktor oberfläche zulassen, und man
c) die Bindung der Analyte an die Transduktoroberfläche durch elektrisch gemessene Größen am Transduktor nach weist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten, spezifischen Bindungspartner blutgruppen spezifische Antikörper oder Lektine sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe

a) einen elektrochemischen Transduktor verwendet, und in Stufe
c) die Bindung der Analyte an die Transduktoroberfläche nachweist, indem man die Transduktoroberfläche mit einem Medium, das für den gegebenenfalls gebundenen Analyten spezifische, enzymarkierte Antikörper oder Lektine sowie geeignete Enzym-Substrate enthält, unter Bedingungen in Kontakt bringt, welche die Bindung der spezifischen, enzymmarkierten Antikörper oder Lektine an den gebundenen Analyten und die Bildung elektroden aktiver enzymatischer Umsetzungsprodukte zulassen, wobei man das Potential des Transduktors in bezug auf eine Referenz-Elektrode oder nach Anlegen einer Span nung den vom Transduktor abfließenden Strom mißt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe

c) ein Medium wählt, das ein(en) spezifisches(en), enzym markiertes(en) Antikörper oder Lektin enthält, das (der) für einen der nachzuweisenden Analyten spezifisch ist,
d) die Transduktoroberfläche mit einem zweiten Medium in Kontakt bringt, das ein(en) zweites(en) spezifisches(en), enzymmarkiertes(en) Antikörper oder Lektin enthält, das (der) für einen zweiten nachzuwei senden Analyten spezifisch ist und der das gleiche Markerenzym wie das (der) erste spezifische, enzymmar kierte Antikörper oder Lektin trägt, man wie in Stufe (c) das Potential oder den Strom mißt und man die Stufe (d) für jeden nachzuweisenden Analyten wiederholt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (c) ein Medium wählt, das für jeden nachzuweisenden Analyten einen spezifischen, enzymmarkierten Antikörper oder Lektin enthält, jeder Antikörper oder Lektin ein anderes Markerenzym trägt und die Markerenzyme getrennt nachweisbare Produkte liefern.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Markerenzym alkalische Phosphatase, eine Oxidase oder Peroxidase verwendet.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym alkalische Phosphatase und als Substrat para-Ami nophenylphosphat verwendet.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxidase Glucoseoxidase oder Lactatoxidase verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Peroxidase und als Substrat Ferrocyanid verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markerenzyme alkalische Phosphatase, Lactatoxydase und β-Galactosidase verwendet.

11. Verfahren zur Bestimmung von blutgruppenspezifischen Antige nen mittels eines Immunosensorsystems gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die gebundenen Erythrozyten anhand von Stoffwechselreaktion nachweist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man der Untersuchungsprobe Glucose und Methylenblau zusetzt und die Bestimmung anhand des Sauerstoffverbrauchs der gebunde nen Erythrozyten oder anhand der in Erythrozyten enthalten den Lactatdehydrogenase oder durch die peroxidantische Akti vität der Erythrozyten durchführt.

13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe

a) einen oder mehrere spezifische Bindungspartner wählt, die mit einem Markerenzym markiert sind, und in Stufe
c) die Bindung der Analyte an die Transduktoroberfläche nachweist, indem man die Transduktoroberfläche mit einem Medium, das geeignete Enzym-Substrate enthält, unter Bedingungen in Kontakt bringt, welche die Bildung elektrodenaktiver enzymatischer Umsetzungsprodukte zulassen, wobei die Aktivität der Markerenzyme durch den gebundenen Analyten vermindert wird und man das Potential des Transduktors in bezug auf eine Referenz- Elektrode oder nach Anlegen einer Spannung den vom Transduktor abfließenden Strom mißt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß man in Stufe (a) standardisierte Erythrozyten (Testerythrozyten) auf der Oberfläche des Transduktors immo bilisiert, die jeweils einen Antigentyp auf der Zellober fläche tragen.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (c) enzymmarkierte Antihuman-Antikörper oder enzym markiertes Protein A oder Protein G wählt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Transduktor eine amperometrische oder potentiometrische Elektrode verwendet.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekenn zeichnet, daß man in Stufe

a) einen Transduktor mit piezoelektrischen Eigenschaften wählt und in Stufe
c) bei Anregung des Transduktors mit einer Wechselspannung mit konstanter Frequenz die Änderung der Frequenz des Transduktors in Folge der Zunahme der Masse oder der Schichtdicke nachweist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekenn zeichnet, daß der Transduktor nach der Messung regeneriert wird.

19. Vorrichtung zur immunosensorischen Bestimmung von Analyten umfassend einen oder mehrere elektrische oder piezoelektri sche Transduktoren, dadurch gekennzeichnet, daß die Trans duktoroberfläche oder eine unmittelbar vor der Transduktor oberfläche angeordnete, semipermeable Membran ganz oder teilweise mit immunologischen Bindungspartnern für die nach zuweisenden Analyte beschichtet ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Transduktoroberfläche oder die vor der Transduktorober fläche angeordnete Membran mit blutgruppenspezifischen Anti genen der Erythrozytenoberfläche oder Antikörpern oder/und Lektinen gegen dieselben beschichtet ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeich net, daß der oder die Transduktoren mit einer oder mehreren Meßkammern mit Probenzu- und -abführung sowie einer elek tronischen Einrichtung für die Erfassung elektrischer Meß größen des Transduktors verbunden sind.