DE3916432A1 - Verfahren und vorrichtung zur konzentrationsbestimmung eines antikoerper-antigenpaares - Google Patents

Description

Die Erfindung ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Konzentrationsbestimmung eines Antikörpers-Antigenpaares, bei dem ein Partner des Paares an einem Träger gebunden ist mittels elektrochemischer Methoden.

Eine Substanz, die bei Wirbeltieren eine Immunantwort hervorrufen kann, nennt man Antigen. Das Immunsystem unterscheidet sehr gut zwischen ähnlichen Antigenen, z. B. zwischen zwei Proteinen, die sich nur in einer einzigen Amminosäure unterscheiden, oder zwischen zwei Enantiomeren. Die wesentliche Eigenschaft des sogenannten Immunsystems besteht darin, daß gegenüber von Fremdantigenen mit jeweils hochspezifischer Art reagiert wird mit der Produktion entsprechender Antikörper in den B-Lymphocyten. Die Antikörper besitzen die Eigenschaft, daß sie eine völlig individuelle Bindungsstelle für ein ganz bestimmtes Antigen besitzen. Die einfachsten Antikörper stellen Y-förmige Makomoleküle mit zwei identischen Antigen-Bindungsstellen dar. Der Fuß des Y bestimmt, was mit dem Antigen nach der spezifischen Bindung geschehen wird. Durch proteolytische Enzyme, wie Papain und Pepsin, können Antikörper-Moleküle in unterschiedliche Fragmente gespalten werden. Papain schneidet Antikörper in drei Teile, gemäß den drei Armen des Y. Die oberen Arme bilden zwei identische, sogenannte Fab-Fragmente mit je einer Antigen-Bindungsstelle, der untere Arm ein sogenanntes Fc-Fragment, das in vielen Fällen auskristallisiert. Immunoglobin G (IgG)-Antikörper sind die Hauptklasse der Immunoglobine im Blut. Der Organismus produziert auf einen Antigenreiz stets eine Antikörperfamilie mit verwandten Reaktions- und Spezifitätsmuster, sogenannte heteroklonale Antikörper. G. Köhler und C. Milstein gelang 1975 die in-vitro-Synthese eines monoklonalen Antikörpers mit einer bestimmten Spezifität in beliebiger Menge. Monoklonale Antikörper sind inzwischen für zahlreiche Anwendungen verfügbar. Die hohe Spezifität von monoklonalen Antikörpern für ihr jeweiliges Antigen macht sie zu extrem vielseitigen Werkzeugen, mit deren Hilfe eine große Palette von Molekülen erkannt werden kann.

An eine feste Phase gebundene monoklonale Antikörper eignen sich beispielsweise in der sogenannten Affinitätschromatographie als Hilfsmittel zur Isolierung bestimmter Antigene aus einer heterogenen Mischung. Die Kombination monoklonaler Antikörper verschiedener Spezifitäten erlaubt aufgrund charakteristischer Reaktionsmuster die Unterscheidung und Klassifizierung von Antigenen in Form einer qualitativen Analyse.

Quantitative Bestimmungen lassen sich durch kompetitive Bindungstests oder Sandwichtests ausführen. In kompetitiven Prüfungen werden markierte Antigene benutzt. Ist das Antigen radioaktiv markiert, wird das Verfahren als Radio-Immuno-Assay (RIA) bezeichnet. Ist am Antigen ein Enzym, beispielsweise Meerettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase oder β-Galactosidase kovalent gebunden, nennt man das Verfahren Enzym-Immuno-Assay (EIA). Das markierte Antigen und das zu messende Antigen konkurrieren um die Bindung an den trägergebundenen Antikörper, so daß sich die unbekannte Menge Antigen bestimmen läßt, wenn zum Vergleich eine Reaktion mit reinem Antigen bekannter Konzentration durchgeführt wird. Bei den sogenannten Sandwichtests werden markierte Antikörper benutzt. Das zu bestimmende Antigen wird an eine trägergebundenen Antigen gebunden und durch einen markierten Zweitantikörper quantitativ bestimmt.

Beide Bestimmungsverfahren weisen erhebliche Nachteile auf. Die kompetitiven Tests benötigen reines Antigen, das ohne Änderung der Immunreaktivität markiert werden muß. Die Eichkurve ist nicht linear und die Reaktion kann nicht in Gegenwart eines Überschusses an Reagens ablaufen. Beim sogenannten Sandwichtest benötigt man große Mengen gereinigter Antikörper. Die Eichkurve ist in diesem Falle in einem noch kleineren Bereich linear. Bei radioaktiver Markierung kommen Entsorgungsprobleme hinzu.

Allen bekannten Methoden ist gemeinsam, daß eine Phasentrennung erforderlich ist, so daß die Handhabung kompliziert ist. Die Durchführung der Immunassays ist zwar einfach, erfordert jedoch eine Reihe von Arbeitsschritten und mehrere Stunden. Ohne Phasentrennung laufen sogenannte homogene Enzym-Immuno-Assays (EMIT) ab, die kompetitiv arbeiten. Dabei erfolgt eine Inhibierung oder Stimulierung der katalytischen Aktivität des Enzym-Markers im Antikörper-Antigen-Enzym-Komplex. Diese wird verglichen mit der katalytischen Aktivität des Enzyms in freien Antigen-Enzymkonjugat. Der Mechanismus ist noch ungeklärt und dieses Verfahren eignet sich auch nur für kleine Moleküle.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, die die Nachteile der bekannten immunologischen Verfahren vermeidet und sicher und zuverlässig und schnell die Bestimmung der Konzentration von Antigenen bzw. Antikörpern erlaubt.

Die Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 und die Meßkette gemäß Anspruch 8.

Die Unteransprüche richten sich auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.

Die Bestimmung der Konzentration von Stoffen, dessen Molekülsorte (Hapten oder Antigen) erfolgt durch eine immunologische Reaktion, weil derartige Stoffe selektiv mit speziellen Antikörpern reagieren, die erfindungsgemäß auf Elektrodenoberflächen der Meßzelle immobilisiert sind. Üblicherweise ruft die immunologische Reaktion keine große oder selektive Spannungsänderung hervor, es ist jedoch bei der erfindungsgemäßen gemäßen Anordnung und Arbeitsweise möglich, genau meßbare und reproduzierbare Zellspannungsänderungen durch Veränderung der Austauschstromdichte eines potentialmitbestimmenden Ions zu erreichen, so daß die immunologische Reaktion indirekt verfolgt werden kann.

Ist der Antikörper in aktiver Form auf der Elektrode gebunden, können damit Antigene bestimmt werden. Umgekehrt ist es möglich, Antigene an die Elektrodenoberfläche aktiv zu binden und die korrespondierenden Antikörper in der Meßlösung zu bestimmen.

Bei der erfindungsgemäßen ionenselektiven Meßanordnung mit einer ionenselektiven Meßelektrode und einer potentialkonstanten Bezugselektrode oder einer kompensierend arbeitenden Elektrode ohne Oberflächenbedeckung mit einem Partner des Antikörper-Antigenpaares wird die elektrische Spannung zwischen den Elektroden mit einem Voltmeter mit einem geeigneten Innenwiderstand gemessen, während beide Elektroden, die auch als sogenannte Einstab-Meßkette ausgebildet sein können, in die Meßlösung eintauchen bzw. mit ihr in Kontakt stehen. Es können auch Metallelektroden in Form von Drahtelektroden oder planare Mehrschichtelektroden zum Belegen mit Antigen oder Antikörper und zur Messung verwendet werden. Dabei wird der Ionenaustauschwiderstand an der Phasengrenze bestimmt. Geeignete automatisch arbeitende Vorrichtungen zur Bestimmung und Aufzeichnung komplexer Impedanzebenen sind bekannt und erhältlich. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt dann durch Mustervergleich nach immunologischer Reaktion.

Der Zusammenhang zwischen Meßkettenspannung und der jeweils vorliegenden Meßionenkonzentration läßt sich durch die bekannte Nernst-Gleichung beschreiben. Störungen durch Mitanzeige von Störionen lassen sich quantitativ durch den Selektivitätskoeffizienten K _M-S in einer erweiterten Nernst-Gleichung ausdrücken.

Völlig überraschend wurde gefunden, daß unter bestimmten Bedingungen die Selektivität einer ionenselektiven Membran von Elektroden reversibel verändert werden kann. Arbeitspunkt der Meßkette ist der Knickpunkt der erweiterten Nernstgleichung

in der bedeuten

E = EMK der Meßkette, bestehend aus einer ionenselektiven Elektrode und einer Bezugselektrode
E _o = EMK der Meßkette beim Bezugszustand:
a _M = 1; a _S = 0
S = empirische Konstante, genannt: Steilheit, bei Kationen +, bei Anionen -; theoretisch

a _M = Meßionenaktivität in der Lösung
a _S = Störionenaktivität in der Lösung
K _M-S = empirische Konstante, genannt Selektivitätskoeffizient, aus potentiometrischen Messungen erhältlich
Z _M = Wertigkeit des Meßions
Z _S = Wertigkeit des Störions

Am Arbeitspunkt der Meßkette tragen sowohl das Meßion als auch das Störion zum Phasengrenzpotential bei.

Um eine Selektivitätsänderung direkt messen zu können, wird ein sogenanntes Mischpotential an der Elektrodenoberfläche eingestellt, beispielsweise ein Mischpotential von Natrium- und Kaliumionen. Wird unter den Bedingungen des Mischpotentials die Oberflächensituation verändert, beispielsweise durch die immunologische Reaktion des an die Membranoberfläche gebundenen Partners eines Antikörper-Antigenpaares, verändert sich der Selektivitätskoeffizient, weil durch diese zusätzliche Belegung der Membranoberfläche durch das Reaktionsprodukt der immunologischen Reaktion konkurrierende Ionen behindert oder bevorzugt werden. Es kommt zu einer Änderung der Austauschstromdichte mindestens eines potentialmitbestimmenden Ions.

Besonders ausgeprägt ist die Veränderung des Selektivitätskoeffizienten, wenn Wasserstoffionen oder auch OH-Ionen an der Potentialbildung beteiligt sind, da diese Ionen die Bedeckung der Membranoberfläche, die durch die immunologische Reaktion verändert wird, besser durchdringen können, als die meisten anderen solvatisierten Ionen.

Messungen können im pH-Wertbereich von 4-9, vorzugsweise 6,5-8, erfolgen, je nach Ionenkonzentration der potentialbestimmenden Ionen in der Meßlösung. Als potentialbestimmende Ionen sind einwertige Kationen besonders bevorzugt, denn deren Austauschstromdichte läßt sich durch die Reaktionsprodukte der immunologischen Reaktion besonders gut verändern. Der gewünschte pH-Wert wird mittels eines Puffersystems eingestellt. Neben handelsüblichen Glaselektroden können auch PVC-Membranelektroden für die Messung großer Kationen oder Anionen (z. B. Tetrabutylammonium oder Tetraphenylborat) verwendet werden. Solche elektrochemischen Meßketten und ihre Verwendung zu Messungen, bei denen die Austauschstromdichte mit einem AC-Impedanzverfahren bestimmt wird, sind in J. Electroanalyt. Chemistry 229 (1987) S. 249-263 beschrieben. Durch die erfindungsgemäße Belegung mit einem Partner eines Antigen-Antikörperpaares und die immunologische Reaktion bei der Messung wird der Phasenübergang der großen Ionen von der Immunoreaktion stark beeinflußt, so daß die quantitative Messung von Konzentrationen möglich ist. Die Meßkette kann auch aus einem kationenselektiven Elektrodenpaar bestehen.

Verwendet man anstelle eines Elektrolyten ein Redoxsystem, wird eine Metallelektrode mit einer potentialkonstanten oder mit einer kompensatorisch wirkenden Vergleichselektrode ohne Antikörperbelegung als Meßkette verwendet, wobei die Meßlösung das Metall der Elektrode in Lösung enthält. Beispielsweise eine Zn- oder Cu-Elektrode in Kombination mit ZnSO₄- oder CuSO₄-Lösung. Die Metallsalzlösungen haben Konzentrationen von 10^-2 bis 10^-6 M/l. Um einen Partner eines Antikörper-Antigenpaares in aktiver Form auf einer Elektrode zu immobilisieren, ist dessen Bindung durch Fragmentkristallisation oder anderweitige Bindung an ein auf der Elektrode abgelagertes Protein besonders geeignet.

Geeignete Proteine sind Humanimmoglobuline, wie Protein der Reihen A oder G.

Beispielsweise Immunoglobin A, A1, A2 aus menschlichem Plasma, Immunoglobulin G, G1, G2, G3, G4 aus menschlichem Plasma, Immunoglobulin G Fragmente aus menschlichem Plasma, Immunoglobulin aus menschlichem Plasma, aber auch unspezifische Immunoglobuline von Tieren.

Es können auch gentechnisch veränderte Proteine verwendet werden, wie ein rekombiniertes Protein G streptococci mit MG 1700, das gentechnologisch in Escheria coli hergestellt wird.

Als Belegungsvermittler können aber auch andere Proteine, wie Rinderserumalbumin, verwendet werden.

Die Proteine lassen sich mit unterschiedlichen Verfahren auf den Elektroden immobilisieren. Besonders bewährt hat sich eine Silanisierung der Elektrodenoberfläche mit Aminosilanen, wie beispielsweise Aminopropyltriethoxysilan aus Lösungen der Silane in organischen Lösungsmitteln bei erhöhter Temperatur. Die endständigen Aminogruppen lassen sich zur Bindung des Proteins aktivieren, beispielsweise mit Formaldehyd.

Auf derart vorbehandelten Elektrodenoberflächen werden geeignete spezifische Proteine durch Eintauchen der Elektroden in Proteinlösungen mit einer Konzentration von 0,1-10 mg Protein/ml physiologischer Lösung abgelagert.

Derart vorbehandelte Elektroden binden Antikörper oder Antigene eines Paares in aktiver Form bei Kontakt mit gelöstem Antikörper oder Antigen. Die Konzentration des Antikörpers oder Antigens sollte in physiologischer Lösung 0,1-10 mg/l betragen. Eine Kontaktzeit von 60-90 reicht zum Binden einer für Meßzwecke ausreichenden Menge des Partners eines Paares aus.

Bei der Messung bringt man eine derart belegte Elektrode und eine Elektrode mit konstantem Potential in Kontakt mit der Meßlösung, in die danach der zu bestimmende Partner des Antikörper-Antigenpaares in Lösung eingebracht wird. Die immunologische Reaktion erfolgt unmittelbar und löst Veränderungen der Zellspannung aus. Anschließend kann die Meßelektrode wieder regeneriert werden durch Spalten des Reaktionsproduktes der immunologischen Reaktion und Aktivieren des auf der Elektrode immobilisierten Partners. Derartige Spaltungsreaktionen sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise durch Inberührungsbringen mit einer 0,1 m sauren Lösung (pH 2,5) von Glycin.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Meßkette lassen sich zahlreiche Antigen-Antikörperpaare quantitativ bestimmen, wenn einer der Partner auf der Meßelektrode in aktiver Form immobilisiert ist. Zu den immobilisierbaren Antikörpern gehören polyklonale Antikörper und deren Konjugate, wie Anti-Maus Jg Gl-G3, Anti-Kaninchen Jg G, Anti-Ziege Jg G, primäre monoklonale Antikörper, wie Komplementproteine der Faktoren C3a, C4a und C5a, Anti-Komplement C3a alpha-chain human, Anti-Complement C3b alpha-chain human, Anti-Complement C3b beta-chain human, Anti-Complement C5 human, Anti-Complement C5b human, monoklonale Antikörper gegen Cytoskelettproteine und Intermediarfilamente, Cytokeratine, Neurofilamente, Gliale Filamentproteine, Desmin, Vimentin, insbesondere Anti-alpha-Actin human, Anti-Cytokeratin Nr. 13, Anti-Cytokeratin Nr. 18, Anti-Cytokeratin Nr. 19, Anti-Cytokeratin basisch Nr. 1-8, Anti-Desmine ascites, Anti-Glialfilamentprotein, Anti-Vimentin, monoklonale Antikörper gegen membranbeständige Antigene und Proteine der extrazellulären Matrix, insbesondere Anti-Desmoglein, Anti-Desmoplakine 1 und 2, Anti-Desmoplakin 1, Anti-Clathrin, Anti-Plakoglubin, Anti-Epithelium human, Anti-Synapthophysin, sekundäre polyklonale Antikörper und deren Konjugate, insbesondere Antigen-Jg A human, Antigen-Jg D human, Anti-Jg E human, Anti-Jg G human und Anti-Jg M human.

Erfindungsgemäße Meßketten mit Elektroden, auf denen ein Partner des Antigen-Antikörperpaares in der beschriebenen Weise immobilisiert ist, können unmittelbar vor der Messung, aber auch lagerfähig hergestellt werden. Besonders bevorzugt ist es, Elektroden mit einem Bindungsprotein auf Vorrat herzustellen und je nach Bedarf mit dem gewünschten Partner des Antikörper-Antigenpaares zu belegen.

Die erfindungsgemäße Arbeitsweise wird anhand von Beispielen noch näher erläutert.

Beispiel 1

Es werden zwei handelsübliche natriumselektive Glaselektroden (Schott) in einer 50 ml fassenden Meßzelle an ein Voltmeter mit hochohmigem Differenzeingang angeschlossen. Eine der beiden Membranen wurde zuvor mit Antikörper A-MRP-14 oder A-MRP-8 (Proteine oder molaren Masse 14 000 bzw. 8000) so überzogen, daß eine maximale Zahl von selektiven Bindungsstellen für Antigene frei liegt. Die Bindung der Antikörper in aktiver Form an die Membranoberfläche erfolgt über Fragmentkristallisation an ein an der Membranoberfläche abgelagertes Protein, beispielsweise Protein G oder A, durch Eintauchen der Elektrode in eine Lösung mit einer Konzentration von 5 mg Antikörper pro ml physiologischer Lösung während 60 bis 90 Minuten.

Zur Ablagerung des Proteins auf der Elektrode wird diese zunächst mit Aminopropyltriethoxysilan durch Eintauchen der Elektrode in eine 1-10%ige Silanlösung in Toluol bei 90°C für die Dauer von 20-40 Minuten silanisiert. Die endständigen Aminogruppen werden dann mit Paraformaldehydlösung (1-10% in 10^-3 molarem Boratpuffer) während 10-30 Minuten bei Raumtemperatur für die Bindung des Proteins aktiviert.

Als Elektrolyt in der Meßzelle dient Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) mit einer Konzentration von 5 × 10^-5 M/L Na⁺ und 1 × 10^-2 M/L K⁺. Nach Zugabe von jeweils 1 µg, 9 µg bzw. 10 µg Antigen zur Meßlösung tritt eine immunologische Reaktion zwischen dem Antigen und Antikörper auf, die die Ionenselektivität der Membran verändert, so daß sich die Meßkettenspannung wie in Fig. 1 wiedergegeben ändert. Innerhalb von Bruchteilen einer Sekunde ändert sich die Spannung in Abhängigkeit von der Konzentration des Antigens um mehrere Millivolt, wobei die Empfindlichkeit etwa 2 Millivolt/µg des zu bestimmenden Antigens beträgt.

Um die Reproduzierbarkeit zu überprüfen, wurde die Membran nach der ersten Meßreihe regeneriert. Derartige Regenerationen sind dem Fachmann für die betreffenden immunologischen Reaktionen bekannt. Im vorliegenden Falle wurde die natriumselektive Elektrode in einer Lösung von 0,1 M/L Glycin/0,1 M/L HCl bei pH 2,5 für mehrere Minuten eingetaucht und anschließend mit Meßelektrolytlösung gespült und wieder in die Meßzelle eingebracht. Nach erneutem Zugeben von 10 µg Antigen erhöht sich die Spannung in gleicher Weise wie bei der ersten Meßreihe.

Die Linearität der Kalibrierkurve erlaubt es, quantitative Ergebnisse in wenigen Sekunden zu erhalten. Die in Fig. 1 wiedergegebene Methode des Aufstockens mit Standardlösungen ermöglicht Standardadditionsauswertetechnik. Das in der Figur erkennbare Rauschen des Meßsignals ist durch einen Magnetrührer verursacht. Wenn dieser nach dem Durchmischen der Lösung nach der Zugabe der Probe abgestellt wird, ergeben sich unverrauschte Signale, deren Empfindlichkeit nur durch die Schreibstiftdicke des Aufzeichnungsgerätes bestimmt wird. Die Geräteempfindlichkeit kann noch um Größenordnungen verstärkt werden, wobei dann Empfindlichkeiten unter 1 µg Protein möglich sind.

Die Empfindlichkeit der Meßmethode läßt sich insbesondere durch Verkleinerung des Meßvolumens erhöhen. Bei einer mittleren Tropfengröße von 0,05 mm erreicht man auf diese Weise Empfindlichkeiten von 10 ng (Picomolbereich). Durch die Verkleinerung der Oberflächen der benutzten Elektroden werden die elektrochemischen Eigenschaften der beschriebenen Methode der Selektivitätsmodulation nicht verändert. Im Gegenteil, bei der Verkleinerung der Elektrodenoberfläche von der für das Beispiel benutzten Membran von 2 cm² auf beispielsweise 2 mm² läßt sich die Menge an Antikörper für die immunologische Reaktion erheblich verringern.

Fig. 2 zeigt die Potentialänderung bei Zugabe von 5 µg Antigen bei pH 7 in Tris-HCl-Puffer bei unterschiedlichen Natriumionenkonzentrationen mit der Meßelektrode, auf der Antikörper in der zuvor beschriebenen Weise immobilisiert ist. Diese Figur läßt erkennen, daß bei einer Konzentration von 8 × 10^-6 M/L Natriumionen und 1 × 10^-2 1 × 10^-2 M/L K⁺ das für die Messung günstige Mischpotential ausgebildet ist. Mit steigender Natriumionenkonzentration verringert sich die durch die immunologische Reaktion ausgelöste Veränderung des Selektivitätskoeffizienten und damit die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Empfindlichkeit kann auch bei steigender Natriumionenkonzentration erhalten bleiben durch Anpassung des Mischpotentials.

Beispiel 2

Eine Metallelektrode und eine potentialkonstante bzw. kompensatorisch wirkende Vergleichselektrode aus dem gleichen Metall ohne Antikörperbelegung wird in die Meßlösung eingetaucht. Die Belegung erfolgt, wie in Beispiel 1 angegeben, mit Antikörper A-MRP-14 unter Verwendung von Protein G als Immobilisierungshilfe. Bei Verwendung einer Zn-Elektrode oder Cu-Elektrode enthält die Meßlösung ZnSO₄ oder CuSO₄ in Konzentrationen zwischen 10^-2 und 10^-6 M/L. Zur Ausbildung eines Mischpotentials dienen Redoxsystem mit unterschiedlichem Redoxpotential. Im vorliegenden Falle wurden Fe²⁺/Fe³⁺ oder Anionen Fe(CN)₀^3-/Fe(CN)₆^4- in Konzentrationen von 1 × 10^-2 M/L₀ verwendet. Die erhaltenen Spannungsänderungen bei Zugabe von Antigen in den in Beispiel 1 angegebenen Konzentrationen liegen im Bereich von 5-30 mV.

Claims (10)

1. Verfahren zur Konzentrationsbestimmung eines Antikörper-Antigenpaares, bei dem ein Partner des Paares an einen Träger gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Elektrode mit einer ionenselektiven Membran, auf der der Partner des Paares gebunden ist, in einer elektrochemischen Meßkette mit einer Elektrode konstanten elektrischen Potentials, die in die Meßlösung eintauchen, verwendet und die nach Einbringen des anderen Partners in der Meßlösung ablaufende immunologische Phasengrenzreaktion zwischen den Partnern des Antikörper-Antigenpaares hervorgerufene Zellspannungsänderung oder die ihr zugrundeliegende Veränderung der Austauschstromdichte eines potentialmitbestimmenden Ions mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrolytkonzentration in der Meßlösung ausreichend ist, um bei Beginn der immunologischen Reaktion ein Mischpotential von einem Störion und einem Meßion auszubilden und die immunologische Reaktion zwischen den Partnern des Paares die Ionenselektivität der Membran verändert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle einer Elektrode mit einer ionenselektiven Membran und einer Bezugselektrode ein kationensensitives Elektrodenpaar verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Elektrolyten mit einem Redoxsystem verwendet, um bei Beginn der immunologischen Reaktion ein Mischpotential auszubilden und man das durch die immunologische Reaktion zwischen den Partnern des Paares veränderte Misch-Redoxpotential mißt.

5. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zwei identische ionenselektive Meßelektroden verwendet, von denen die Membran der ersten mit dem Antikörper und die Membran der anderen mit dem Antigen in aktiver Form an der Oberfläche belegt ist.

6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Belegung der Elektrode mit dem Partner des Antikörper- Antigenpaares unmittelbar vor der Messung durch Inberührungbringen einer vorbehandelten Elektrode mit einer Lösung des Antikörpers in physiologischer Lösung für eine Zeit von 60 bis 90 Minuten vornimmt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elektrode durch Eintauchen in eine Lösung eines Proteins in physiologische Lösung für 60 bis 90 Minuten unter Bindung des Proteins vorbehandelt.

8. Elektrochemische Meßkette zur Konzentrationsbestimmung eines Antikörper-Antigenpaares mit zwei Elektroden, von denen eine ein konstantes Potential aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß auf der anderen Elektrode ein Partner eines Antikörper-Antigenpaares in aktiver Form gebunden ist.

9. Meßkette nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode mit dem gebundenen Partner des Antikörper-Antigenpaares eine Membranelektrode ist.

10. Meßkette nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode mit dem gebundenen Partner eine Mehrschichtenelektrode in Drahtform oder planarer Form ist.