FR2459481A1

FR2459481A1 - Procede et appareil pour effectuer une determination immunologique electrochimiluminescente

Info

Publication number: FR2459481A1
Application number: FR8012258A
Authority: FR
Inventors: Bruce J Oberhardt; Neil Wotherspoon
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-06-18
Filing date: 1980-06-03
Publication date: 1981-01-09
Also published as: GB2052046B; JPS566162A; GB2052046A; US4280815A; IT8021755A0; IT1130345B; JPS632063B2; CA1132903A; DE3022426C2; DE3022426A1; FR2459481B1

Abstract

DANS UN PROCEDE ET AVEC UN APPAREIL POUR EFFECTUER UNE DETERMINATION IMMUNOLOGIQUE ELECTROCHIMILUMINESCENTE, ON PRODUIT DE FACON PRECISE ET UNIFORME PAR VOIE ELECTROCHIMIQUE UN OXYDANT QUE L'ON UTILISE POUR DECLENCHER LA CHIMILUMINESCENCE 27 D'UN COMPOSE REAGISSANT IMMUNOLOGIQUE A MARQUEUR CHIMILUMINESCENT. LA REFERENCE 10 DESIGNE UNE ANODE PORTANT LES ANTICORPS EN REGARD D'UNE CATHODE TRANSPARENTE 11 ASSOCIEE A UN TUBE MULTIPLICATEURS D'ELECTRONS PHOTO-ELECTRIQUES 15.

Description

La présente invention concerne un procédé et un appa-

reil pour effectuer une détermination immunologique électro-

chimiluminescente et en particulier l'emploi de techniques en phase solide pour améliorer la sensibilité, l'exactitude et la précision de ces déterminations.

Les techniques de détermination immunologique chimi-

luminescente consistent généralement à former un mélange réactif constitué d'une quantité connue d'un anticorps et d'un échantillon biologique contenant une quantité inconnue d'antigène à déterminer ou vice versa. On ajoute au mélange

réactif une quantité connue d'un composé réagissant immunolo-

gique compétitif qui est marqué avec un marqueur chimilumi-

nescent. On incube le mélange réactif, et le composé réagis-

sant immunologique marqué entre en compétition avec le com-

posé réagissant immunologique de l'échantillon vis-à-vis de la quantité connue du composé réagissant complémentaire,

comme il est bien connu dans l'art.

Après l'incubation, on sépare généralement l'excès

de composé réagissant immunologique marqué non fixé du mélan-

ge réactif et on ajoute un oxydant pour déclencher la chimi-

luminescence du composé réagissant immunologique marqué fixé.

La valeur mesurée de la chimiluminescence indique la quantité

d'antigène de l'échantillon biologique.

Les déterminations chimiluminescentes nécessitent l'emploi de quantités très précises de divers réactifs et/ou

composés réagissants, en raison des concentrations générale-

ment faibles du composé réagissant immunologique de l'échan-

tillon. Un des objets de l'invention est d'ajuster de façon précise la quantité de l'oxydant utilisé pour déclencher la chimiluminescence et d'apporter de façon précise et uniforme

l'oxydant aux composés réagissants immunologiques chimilumi-

nescents fixés pour obtenir une détermination immunologique

plus sensible, plus exacte et plus précise.

De pluts, l'invention concerne un procédé pour effec-

tuer des déterminations immunologiques chimiluminescentes évitant le stade de séparation qui est généralement malaisé

et long.

L'invention a également pour objet de conserver ou de réutiliser une partie des composés réagissants ou des réactifs qui sont souvent coûteux, pour des déterminations

immunologiques ultérieures.

L'invention concerne l'emploi de techniques en phase solide pour effectuer des déterminations immunologiques

chimiluminescentes. Dans un premier stade du procédé de l'in-

vention, on mélange un échantillon biologique contenant le composé réagissant immunologique à déterminer avec un composé réagissant immunologique compétitif qui porte un marqueur

chimiluminescent. On introduit ce mélange entre deux électro-

des dont les surfaces sont très voisines. Sur les surfaces

d'une des électrodes, généralement l'anode, ou à leur voisi-

nage, un composé réagissant immunologique complémentaire des

composés réagissants immunologiques en solution est immobili-

sé. Le composé réagissant immunologique complémentaire peut être sous une forme déshydratée de façon à ce que ce réactif ait une durée de conservation prolongée avant l'emploi et être réhydraté par la solution des composés réagissants immunologiques. On incube ensuite le mélange des composés réagissants immunologiques pour provoquer une fixation compétitive. Apres une période d'incubation appropriée, on peut séparer l'excès des composés réagissants immunologiques non fixés pour que les composés réagissants immunologiques ayant réagi demeurent

fixés à l'électrode.

On produit ensuite l'oxydant nécessaire pour déclen-

cher la chimiluminescence, qui est généralement un peroxyde ou de l'oxygène mono-atomique, sur les surfaces d'une des électrodes par application d'une tension déterminée entre les électrodes. On mesure la chimiluminescence provoquée par l'oxydation du marqueur chimiluminescent pour déterminer la quantité de composé réagissant immunologique à mesurer dans l'échantillon.

Le procédé ci-dessus améliore la sensibilité, l'exac-

titude et la précision de la détermination immunologique chimiluminescente par production de façon reproductible et apport de façon uniforme d'une quantité précise d'oxydant aux composés réagissants immunologiques fixés par ajustement

de la tension appliquée entre les électrodes.

Les composés réagissants immonologiques fixés à l'électrode produisant l'oxydant (anode) sont directement en contact avec l'oxydant lorsqu'il est produit à la surface de l'électrode. La chimiluminescence produite est limitée à une zone très localisée entre les deux surfaces des électrodes adjacentes, ce qui réduit les pertes géométriques du signal lumineux et améliore l'exactitude et la fiabilité de la mesure.

Une des électrodes ou les deux peuvent être transpa-

rentes si bien que la lumière émise par chimiluminescence peut être mesurée directement au site de réaction. Egalement,

une des électrodes peut faire partie intégrante d'un détec-

teur optique pour réduire au minimum la perte de lumière.

On peut, pour supprimer le stade de séparation des procédés de l'art antérieur, produire une petite quantité d'oxydant au début du cycle d'incubation. On opère ainsi pour

déterminer la valeur de fond de tout composé réagissant immu-

nologique marqué non fixé suffisamment voisin de l'électrode

productrice pour présenter une chimiluminescence. La sous-

traction de tout signal produit par un composant quelconque non fixé du signal total de réaction rend inutile un stade

de séparation ou de lavage. On peut éliminer le stade de sé-

paration selon une autre technique qui consiste à effectuer

l'analyse temporelle du signal produit en réponse au déclen-

chement électrique. Le composé à marquage chimiluminescent fixé au composé réagissant immunologique complémentaire est

plus près du site de production de l'oxydant et par consé-

quent il produit un signal détectable qui précède dans le temps le signal produit par le composé chimiluminescent non fixé qui est plus éloigné de l'anode et on peut différencier

ces signaux en fonction du temps.

Les composés réagissants immunologiques sont coûteux et il est donc souhaitable de les réutiliser. L'invention

permet le réemploi du composé réagissant immunologique immo-

bilisé fixé à l'électrode par élimination après chaque déter-

mination de la totalité des composés réagissants immunologi-

ques fixés pour laisser le composé réagissant immunologique fixé à l'anode prêt à un nouvel emploi. On peut pour cela

dissocier les antigènes ayant réagi, par exemple, de l'anti-

corps fixé à l'électrode.

L'invention a pour objets: une détermination immunologique chimiluminescente améliorée; un procédé et un appareil pour effectuer une déter- mination immunologique chimiluminescente en phase solide;

la réalisation d'une détermination immunologique chi-

miluminescente plus sensible, plus exacte et plus précise par ajustement soigneux de la quantité, de l'uniformité et

de la fixation dans le temps de l'apport de l'oxydant néces-

saire pour déclencher la chimiluminescence; et

un procédé et un appareil pour effectuer une détermi-

nation immunologique chimiluminescente pratique et peu coûteuse.

D'autres caractéristiques et avantages de l'inven-

tion ressortiront de la description qui suit faite en regard

des dessins annexés dans lesquels: la figure 1 est un schéma de l'appareil utilisé dans la détermination immunologique chimiluminescente en phase solide de l'invention; la figure la est un schéma du mélange de la solution

d'échantillon avec la solution de composé réagissant immuno-

logique marqué et de l'introduction ultérieure des solutions mélangées entre les électrodes de l'appareil illustré par la figure 1 pour former un mélange réactif; la figure lb est un schéma du mélange réactif formé entre les électrodes de l'appareil illustré par la figure 1; la figure lc est un schéma du mélange réactif de la figure lb après l'incubation; la figure ld est un schéma du mélange incubé de la

figure lc après entraînement par lavage des composés réagis-

sants immunologiques n'ayant pas réagi ou n'étant pas fixés d'entre les électrodes; la.figure le est un schéma montrant les composés réagissants immunologiques incubés et lavés de la figure ld, la production de l'oxydant provoquant la chimiluminescence des produits réactifs et la mesure de la lumière émise par chimiluminescence; les figures 2a à 2g sont des diagrammes montrant comment on peut utiliser l'appareil de la figure 1 pour effectuer une détermination chimiluminescente ne nécessitant pas de stade de lavage ou de séparation;

la figure 2a montre le mélange réactionnel formé en-

tre les électrodes;

la figure 2b montre une impulsion électrique appli-

quée à l'anode de la figure 2a;

la figure 2c est un graphique de l'émission lumineu-

se produite par l'impulsion de la figure 2b; la figure 2d illustre le mélange de la figure 2a après l'incubation; la figure 2e illustre une impulsion électrique que l'on applique à l'anode de la figure 2d;

la figure 2f est un graphique de l'émission lumineu-

se produite par l'impulsion de la figure 2e;

la figure 2g est un graphique de l'émission lumineu-

se globale; les figures 3a à 3f illustrent schématiquement un

autre mode de réalisation du procédé illustré par les figu-

res 2a à 2g; la figure 3a illustre un mélange réactif introduit entre une paire d'électrodes modifiées semblables à celles illustrées par les figures 1 et 2a; la figure 3b illustre l'impulsion électrique que l'on applique aux électrodes de la figure 3a;

la figure 3c est un graphique de l'émission lumineu-

se produite par l'impulsion de la figure 3b;

la figure 3d illustre le mélange réactif de la figu-

re 3a après l'incubation;

la figure 3e illustre l'impulsion électrique appli-

quée à l'anode de la figure 3d;

la figure 3f est un graphique de l'émission lumineu-

se produite par l'impulsion de la figure 3e; les figures 4a et 4b illustrent en vue latérale et

en plan un mode de réalisation à écoulement continu de l'ap-

pareil de la figure 1; et la figure 5 est une vue en plan d'un autre mode de

réalisation de l'appareil de la figure 1 permettant d'effec-

tuer simultanément plusieurs réactions.

L'invention va maintenant être décrite en détail.

De façon générale l'invention concerne l'emploi de techniques en phase solide pour effectuer une détermination

immunologique chimiluminescente. Pour simplifier, la descrip-

tion ci-après concerne une réaction portant sur des anti- gènes marqués entrant en compétition avec les antigènes d'un échantillon vis-à-vis d'anticorps complémentaires. Cependant

il convient de noter que l'on peut facilement appliquer l'in-

vention à une détermination d'anticorps d'un échantillon en-

trant en compétition avec des anticorps marqués vis-à-vis

d'antigènes complémentaires.

La figure 1 montre schématiquement l'appareil de dé-

termination à l'état solide de l'invention. L'appareil de dé-

termination à l'état solide est constitué de façon générale de deux électrodes adjacentes 10 et 11. L'électrode 10 est une anode et l'électrode 11 est une cathode en raison de la polarité de la source de tension continue 12 à laquelle elles

peuvent être raccordées par un interrupteur 13.

Des anticorps 14 sont portés par l'anode 10 ou immo-

bilisés sur elle. Les anticorps peuvent être fixés à l'anode selon des techniques connues dans l'art telles que par exemple celles indiquées ciaprès: (1) On peut fixer les anticorps par covalence à une surface en métal ou en oxyde métallique faisant partie de la surface de l'anode 10. Des techniques utiles à cet effet ont été mises au point par General Electric Company, comme décrit dans les articles suivants: I. Giaever, Visual Detection of Carcinoembryonic Antigen on Surfaces, tiré-à-part No. 7891 et J.I. Treu, Mie Scattering, Maxwell Garnett Theory, and the Giaever Immunology Slide, tiré-à-part No. 8018, General Electric Company, Corporate Research and Development, P.0, Box 43, Schenectady, New York 12301 U.S.A. (2) On peut imprégner des anticorps 14 d'un gel mince tel qu'un gel d'agarose (non représenté) que l'on peut appliquer en une couche sur la surface de l'anode 10. On

trouvera des procédés de couplage des gels dans la littératu-

re concernant la chromatographie d'affinité, par exemple Cuatrecasas, P., J. Biol. Chem., 245, 2059 (1970); Cuatrecasas, P., Anfinsen, C.B., Methods Enzymol., 22, 345 (1971); Cuatrecasas, P., J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970); Cuatrecasas P., Wilchek M., Anfinsen C.B., Proc Nati. Acad. Sciences USA, 61, 636 (1968); Lang T., Suckling C.J., Wood

H.C.S., J. Chem. Soc., 19, 2189 (1977).

(3) On peut imprégner une membrane mince (non repré-

sentée) des anticorps 14 ou fixer ces anticorps à cette mem-

brane et déposer la membrane en une couche sur la surface 16 de l'anode 10, etc.: Axon R., Porath J., Ernback S., Nature, 214, 1302 (1967); Hirata A.A. et Brandrics M.W., J.

of Immunology, 100, 641 (1968).

La cathode 11 est de préférence transparente de fa-

çon à laisser passer la lumière provoquée par la chimilumi-

nescence dans la détermination pour qu'elle atteigne un tube multiplicateur d'électrons photo-électriques 15. Par exemple 1 cathode 11 peut être faite de verre revêtu d'une couche

transparente mince d'une matière conductrice de l'électrici-

té telle que l'or ou l'oxyde d'étain qui est déposée sur la

surface de verre de la cathode 11.

Dans un autre mode de réalisation, la cathode 11

peut faire partie intégrante du tube multiplicateur d'élec-

trons photo-électriques 15, la surface de verre du tube 15

étant revêtue de la matière conductrice (voir la figure 5).

Dans un autre mode de réalisation, la cathode peut être sous forme d'une grille métallique ou d'une toile (non

représentée).

Les figures la à le illustrent successivement le pro-

cédé de l'invention. La figure la montre un échantillon bio-

logique 20 contenant une quantité inconnue d'antigène 21 à déterminer. A la solution d'échantillon 20, on ajoute une quantité connue d'antigène 21a à marquage chimiluminescent appartenant au même type d'antigène que celui de la solution pour obtenir la solution 20a. Le marquage de composés

réagissants immunologiques par des substances chimilumines-

centes est décrit dans l'article suivant: Schroeder H.R.

et Yeager F.M., Analytical Chemistry, 50, 1114 (1978). On introduit la solution 20a entre les électrodes 10 et 11 de

l'appareil de la figure 1 comme illustré pour former le mé-

lange réactif 23 illustré par la figure lb. Le mélange réac-

tif 23 est constitué (en résumé) d'une quantité inconnue d'antigène 21 de l'échantillon à déterminer, d'une quantité connue d'antigène 21a à marquage chimiluminescent compétitif

et d'une quantité connue d'anticorps complémentaire 14 immo-

bilisé sur la surface 16 de l'anode 10.

La figure lc montre le mélange réactionnel 23 après

l'incubation. Comme on le voit, la majeure partie des anti-

gènes 21 et 21a s'est unie de façon compétitive à l'anti-

corps 14.

Comme le montre la figure id, on élimine d'entre les électrodes 10 et 11 comme le montrent les flèches 24, l'excès d'antigènes 21 et 21a non fixés par lavage au moyen d'une solution aqueuse d'électrolyte dont une partie est retenue

entre les électrodes 10 et 11 après le lavage.

La figure le illustre l'appareil de la figure 1 avec

le mélange 23 incubé et lavé placé dans la solution électro-

lytique, l'ensemble étant entre les électrodes 10 et 11. On

peut alors effectuer la mesure de la détermination immunolo-

gique chimiluminescente.

On ferme l'interruoteur 13 pendant une période de

temps donnée pour appliquer un potentiel entre les électro-

des 10 et 11. Le potentiel électrique est suffisant pour produire un oxydant tel que le peroxyde d'hydrogène (H202)

et/ou l'oxygène mono-atomique (O) à la surface 16 de l'élec-

trode 10. L'oxydant produit à la surface 16 baigne les anti-

gènes marqués 21a en s'introduisant à travers les intersti-

ces 25 des anticorps 14 fixés à la surface de l'électrode

16 ce qui provoque la chimiluminescence.

La production d'un oxydant dans l'électrolyte peut

s'effectuer par électrolyse au niveau de l'électrode 10 cons-

tituant une anode selon la réaction suivante H -2e - H20+ HO2 Dans ce cas il n'y a pas obligatoirement libération d'oxygène gazeux (O2) mais production de peroxyde et/ou d'oxygène mono-atomique à la surface de l'électrode. Bien

que l'on ignore la nature de l'oxydant, l'application d'élec-

tricité libère un oxydant qui oxyde le marqueur chimilumines-

cent et lui permet de produire de la lumière.

Le tube multiplicateur d'électrons photo-électriques

qui reçoit les photons émis comme illustré par les flè-

ches 27, mesure la chimiluminescence de l'antigène marqué 21a. La production et l'apport de l'oxydant sont réglés de façon précise et exacte du fait que l'on maintient de façon précise le potentiel appliqué aux électrodes 10 et i1

pendant un intervalle de temps donné et que l'oxydant pro-

duit est appliqué directement à l'antigène à marquage chimi-

luminescent 21a fixé.

La chimiluminescence qui résulte du déclenchement précis (oxydation) du marqueur chi.miluminescent fixé à l'antigène 21a est mesurée de façon précise car la totalité de l.a réaction s'effectue entre les surfaces 16 et 17 des électrodes. Les électrodes 10 et il ont de préférence une

forme circulaire correspondant à la forme du tube multipli-

cateur d'électrons photo-électriques; les diamètres respec-

tifs des électrodes 10 et 11 étant bien supérieurs à la dis-

tance qui les sépare. De la sorte, un minimum d'énergie lumi-

neuse est perdu au pourtour des électrodes 10 et il et les

photons sont détectés sur un angle solide important.

Les figures 2a à 2g illustrent un appareil pour effectuer une détermination immunologique ne nécessitant pas un stade de lavage ou de séparation. La figure 2a illustre un appareil semblable à celui de la figure 1 (vue partielle) recevant au départ la solution immunoréagissante 23 avant

l'incubation comme illustré par la figure lb. Lorsqu'on fer-

me l'interrupteur 13 pendant un intervalle de temps bref, les électrodes 10 et il reçoivent une impulsion de courant de courte durée comme illustré par la figure 2b. La fixation immunologique ne s'est pas encore produite et par conséquent il n'y a pas d'émission lumineuse par l'antigène marqué 21

fixé à l'anticorps 14. Cependant une certaine quantité d'an-

tigène marqué 21a peut être très voisine de la surface 16

de l'anode il et émettre de la lumière sous l'effet de l'oxy-

dant produit à la surface 16. Cette émission de lumière est

transformée en un signal électrique par le tube photomultipli-

cateur 15 (figure 1) comme illustré par la figure 2c et mise en mémoire et elle indique la valeur de fond de la lumière

due à l'antigène marqué 21a libre dans la solution 23.

La figure 2d illustre l'appareil de la figure 2a après que l'incubation se soit effectuée et que la réaction par fixation compétitive soit achevée. Les antigènes 21 et 21a sont fixés à l'anticorps 14 comme illustré et une partie

des antigènes 21 et 21a demeure libre dans la solution 23.

On envoie une impulsion de courant brève aux électrodes 10 et 11, comme illustré par la figure 2e par fermeture de l'interrupteur 13 (figure 1) après un intervalle de temps donné nécessaire pour produire l'oxydant. L'antigène marqué 21a fixé à l'anticorps 14 émet de la lumière sous l'effet de l'oxydant produit à la surface 16 de l'anode 10, de même que

tout antigène marqué 21a libre dans la solution 23 à proxi-

mité de la surface 16. Cette émission lumineuse combinée est

illustrée schématiquement par la figure 2f.

Les émissions lumineuses des figures 2c et 2f sont respectivement transformées en signaux électriques par le tube multiplicateur d'électrons photo-électriques 15 (figure 1) et mises en mémoire. On obtient la différence "AS" entre les signaux de sortie, comme illustré par la figure 2g selon des techniques classiques de comparaison. La différence "AS" constitue une mesure de la réaction moins les effets de fond

et on l'obtient sans stade de séparation.

Les figures 3a à 3f illustrent un autre mode de réa-

lisation de l'invention rendant inutile un stade de lavage

ou de séparation. La surface 17 de l'électrode il est consti-

tuée d'anticorps immobilisé 14a, qui n'est pas spécifique des

antigènes 21 et 21a dans la solution 23. Cependant l'anti-

corps 14a est choisi de façon à présenter un profil de surfa-

ce semblable à celui des antigènes 21 et 21a dans la solution

23, de même que l'anticorps 14 sur la surface 16 de l'élec-

trode 10. Egalement l'interrupteur 13 de la figure 1 (non représenté) est modifié pour inverser le sens de passage du

courant entre les électrodes 10 et 11 (interrupteur bipolaire).

Le principe de l'appareil de la figure 3a repose sur l'hypothèse selon laquelle il n'est pas toujours possible d'introduire la solution 23 entre les électrodes 10 et 11 et

d'obtenir un signal initial d'émission lumineuse dû unique-

ment à l'antigène marqué libre 21a, c'est-à-dire qu'il peut il se produire une certaine fixation lors de l'introduction de la solution. Les figures 3a à 3f illustrent une détermination immunologique sans séparation qui permet d'obtenir un signal

de fond malgré une certaine fixation initiale entre l'anti-

gène 21a et l'anticorps 14. Comme le montrent les figures 3a à 3f, on introduit la solution 23 entre l'électrode modifiée il et l'électrode

(figure 3a). On place l'interrupteur 13 modifié (non re-

présenté) dans une première position pendant la durée At1, comme indiqué par l'impulsion 30 (figure 3b) pour charger positivement l'électrode 11 et produire ainsi l'oxydant à la surface 17. Une émission lumineuse 31 (figure 3c) produite par la première impulsion 30 (figure 3b; intervalle At1) est due uniquement à l'antigène 21a de fond, c'est-à-dire qu'il n'y a pas d'émission lumineuse par l'antigène 21a fixé à l'anticorps 14a. La raison en est que l'anticorps 14a ne

fixe pas l'antigène 21a (il n'est pas spécifique de cet anti-

gène). Donc l'émission lumineuse 31 est uniquement due à l'antigène marqué libre 21a qui a migré suffisamment près de la surface 17 de l'électrode il pour être oxydé par l'oxydant produit.

Ensuite on bascule l'interrupteur 13 dans une secon-

de position (non représentée) pour fournir une impulsion positive 32 de durée At2 à l'électrode 10. La durée At2 de l'impulsion 32 est égale à la durée At1 de l'impulsion 30, si bien que des quantités égales d'oxydant sont produites à la surface 17 de l'électrode 10. Le signal de sortie 33 (figure 3c) est légèrement supérieur au signal de sortie 31, par suite d'une certaine fixation initiale de l'antigène 21a et de l'anticorps 14. On soustrait le signal de sortie 31 du signal de sortie 33, selon des techniques classiques pour obtenir une mesure de la fixation initiale moins le

bruit de fond.

Les trois derniers stades du procédé sont illustrés par les figures 3d à 3f. Dans la figure 3d, la solution 23 est incubée si bien que les antigènes 21 et 21a sont fixés de façon compétitive à l'anticorps 14 à la surface 16 de l'électrode 10. On ferme l'interrupteur 13 pour envoyer une impulsion positive 34 à l'électrode 10, comme illustré par la figure 3e. Le signal lumineux 35 produit, illustré par la figure 3f, mesure la réaction de fixation compétitive qui s'est effectuée lors de l'incubation (figure 3d) et le fond

du à l'antigène marqué libre 2la dans la solution 23.

Pour obtenir la mesure vraie de la quantité d'anti-

gène, on soustrait le signal 31 du signal 35 par une techni-

que classique. On obtient également une mesure cinétique par

soustraction du signal 31 du signal 33 pour la première lec-

ture (temps antérieur) et soustraction du signal 33 du signal

35 (temps ultérieur).

On peut citer comme exemple de deux anticorps ayant des profils moléculaires semblables mais qui ne sont pas spécifiques des mêmes antigènes, l'anticorps anti-albumine et l'anticorps anti-digoxine. Dans le procédé ci-dessus, on

choisit des anticorps ayant des structures (ou profils) molé-

culaires semblables, de façon à ce que le signal de fond 31 soustrait produit à la surface 17 de l'électrode soit à tous égards semblable au signal 33 produit à la surface 16 de l'électrode à l'exception de toute émission possible due à

la réaction initiale entre l'antigène 21a et l'anticorps 14.

Les figures 4a et 4b illustrent respectivement une vue latérale partielle et une vue en plan partielle du mode de réalisation en écoulement continu de l'invention. Le mode de réalisation en écoulement continu est constitué d'une anode 40 et d'une cathode combinée à un tube multiplicateur

d'électrons photo-électriques 41. La surface 42 du tube mul-

tiplicateur d'électrons photo-électriques 41 est revêtue d'un métal conducteur mince 43 transmettant la lumière qui est couplé par le contact 44 à une des bornes de la source de tension 12 (figure 1) pour qu'on obtienne une combinaison

électrode/détecteur, comme précédemment décrit.

Un tube d'écoulement en spirale 45 est intercalé entre les électrodes 40 et 41 et est représenté en plan par la figure 4b. La spirale 45 est constituée d'un tube 47 qui s'enroule vers le centre 53 et se replie sur lui-même en 54 si bien que l'entrée 48 est adjacente à la sortie 49. La

* paroi supérieure 50 du tube 47 est constituée par la surfa-

ce métallique 43 du tube multiplicateur d'électrons photo-

électriques 41, si bien que la spirale 45 fait partie

intégrante du tube multiplicateur d'électrons photo-électri-

ques 41. La paroi inférieure 51 de la spirale 45 est consti-

tuée par la surface 46 de l'électrode 40, si bien que la

spirale fait également partie intégrante de l'électrode 40.

Un dispositif de pompage (non représenté) fait s'écouler un mélange d'antigènes 21 et 2la et d'anticorps 14 (l'anticorps est alors libre dans la solution) dans le tube 47. On introduit au départ le mélange par l'orifice d'entrée 48 et on le laisse remplir la totalité du tube 47

jusqu'à ce qu'il apparaisse à l'orifice de sortie 49. On ar-

rête ensuite l'écoulement. On applique une tension entre les électrodes 40 et 41 et le tube multiplicateur d'électrons photo-électriques (nonreprésenté) mesure la valeur de la chimiluminescence. On évacue alors le mélange réactif que l'on a mesuré, par l'orifice de sortie 49 pour le rejeter et on introduit un nouveau mélange réactif par l'entrée 48 pour l'analyser. On peut mélanger et incuber les mélanges réactifs successifs avant de les introduire individuellement par

l'entrée 48.

Selon les indications précédentes, on peut également effectuer une mesure cinétique avec les appareils illustrés par les figures 3a à 3g et 4a à 4f. On mélange deux composés réagissants immunologiques compétitifs (un de ces composés réagissants immunologiques a un marqueur chimiluminescent)

et on introduit le mélange entre les électrodes 10 et 11.

On soumet les électrodes 10 et il à des impulsions périodi-

ques, comme décrit, pendant l'incubation pour produire un oxydant. On suit ainsi la réaction en continu pour obtenir les valeurs de l'émission lumineuse par chimiluminescence

qui indiquent la vitesse cinétique de réaction de la détermi-

nation immunologique, comme précédemment décrit.

La figure 5 illustre un autre mode de réalisation de

l'invention dans lequel le tube 47 placé entre les électro-

des 40 et 41 est compartimenté pour délimiter plusieurs cham-

bres réactionnelles par exemple la à lOa. Chaque chambre com-

porte comme représenté des orifices d'entrée lb à lOb et des orifices de sortie lc à lOc correspondants. Le fonctionnement de cette structure est semblable à celui décrit pour les figures 4aet4b. Chaque chambre la à lOa peut contenir un I4 1élange réactif différent, c'est-k-dire qu'on peut effectuer

dans chaque chambre des déterminations immunologiques diffé-

rentes, et est munie de sa propre paire d'électrodes. Les cham-

bres Ia à IOa sont isolées électriquement si bien que l'on peut soumaitre individuellement chaque chambre à des impulsions

pour effectuer une mesure.

De préférence on fait fonctionner les chambres Ia à IOa de La figure 5 de façon successive pour qu' il n'y ait pas de confusion entre les mesures. Cependant on peut remplir

et vider chaque chambre Ia à IOa simultanément ou successive-

ment. L'invention permet le réemploi de l'anticorps I4 immobilisé sur la surface I6 de l'électrode IO. Après les opérations d'incubation et de mesure précitées illustrées par les figures Ia à le, 2a à 2g et 3a à 3f, on peut lyser les antigènes 2I et 21a fixés à l'anticorps I4 de l'électrode IO ou les libérer d'autre façon de l'anticorps I4, de façon à ce que l'anticorps I4 demeure disponible pour une détermination

immuỏlogique ultérieure.

On peut effectuer la lyse ou la libération des anti-

gènes fixés de plusieurs façons: (I) on peut introduire un agent de libération au contact de l'électrode 10. L'agent de libération peut être un

agent chaotrope (ou de désorganisation), un détergent, le chlo-

rure de magnésium, un sel de type thiocyanate soluble ou un

sel de type citrate soluble.

(2) On peut appliquer à l'électrode IO un courant élec-

trique de potentiel suffisant pour libérer les antigènes fixés; et

(3) On peut également libérer les antigènes par modi-

fication du caractère de la solution par exemple modification

de son pH, de sa tonicité ou de sa température.

Bien entendu l'invention est susceptible de diverses

variantes sans sortir de son cadre.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour effectuer une détermination immuno-

logique sur un échantillon contenant un composé réagissant immunologique, caractérisé en ce qu'il comporte des stades consistant à: (a) former un mélange réactionnel constitué du

composé réagissant immunologique de l'échantillon, d'un com-

posé réagissant immunologique complémentaire et d'un compose réagissant immunologique compétitif vis-à-vis du composé

réagissant immunologique de l'échantillon, un marqueur chimi-

luminescent étant fixé à ce composé réagissant immunologique compétitif; (b) incuber ce mélange réactionnel pour former un produit réactionnel;

(c) produire électriquement un oxydant pour déclen-

cher chimiquement le composé réagissant immunologique à mar-

quage chimiluminescent dans le produit réactionnel; et

(d) mesurer la chimiluminescence du composé réagis-

sant immunologique à marquage chimiluminescent déclenché.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte des stades complémentaires consistant à: (e) limiter le mélange réactionnel entre une paire d'électrodes; et

(f) appliquer une tension déterminée entre la pai-

re d'électrodes pour produire l'oxydant.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en

ce qu'il comporte un stade complémentaire consistant à appli-

quer ladite tension entre la paire d'électrodes pendant un

intervalle de temps déterminé.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en

ce que le stade (f) comporte un stade d'application de ten-

sions déterminées de valeur prédéterminee entre la paire d'électrodes avant et/ou pendant le stade (b) et en ce que

le stade (f) comporte la mesure de la chimiluminescence pen-

dant l'application de ces tensions déterminées.

5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en

ce qu'il comporte un stade complémentaire consistant à immo-

biliser le composé réauissant immunologique complémentaire

sur la surface d'une des électrodes.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le composé réagissant immunologique immobilisé est déshydraté et en ce qu'il comporte un stade complémentaire consistant à réhydrater le composé réagissant immunologique immobilisé avant le stade d'incubation (b). 7. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le composé réagissant immunologique complémentaire est fixé à une membrane adjacente à la surface d'une des électrodes. 8. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le composé réagissant immunologique est contenu dans

une couche de gel adjacente à la surface d'une des électrodes.

9. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en

ce qu'il comporte un stade complémentaire consistant à élimi-

ner par lavage tout excès de composés réagissants immunologi-

ques d'entre la paire d'électrodes après le stade d'incuba-

tion (b) et avant le stade de mesure (d).

10. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comporte de plus un stade consistant à libérer tout composé réagissant immunologique à marquage chimiluminescent fixé du composé réagissant immunologique complémentaire après

le stade de mesure (d).

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé

en ce que pour effectuer ledit stade de libération on modi-

fie le pH du mélange.

12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que pour effectuer ledit stade de libération on modifie

la tonicité du mélange.

13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que pour effectuer ledit stade de libération on modifie

la température du mélange.

14. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'on effectue ledit stade de libération par voie électrochimique. 15. Procédé selon la revendication 10, caractérisé

en ce que ledit stade de libération comporte un stade complé-

mentaire consistant à introduire un agent de libération dans

le mélange.

16. Procédé selon la revendication 10, caractérisé I7 en ce que l'agent de libération est un agent chaotrope (ou de désorganisation). I7. Procédé selon la revendication I6, caractérisé

en ce que l'agent de libération est constitué d'un détergent.

18. Procédé selon la revendication I6, caractérisé en ce que l'agent de libération est choisi parmi le groupe constitué par le chlorure de magnésium, un sel soluble de

type thiocyanate et un sel soluble de type citrate.

I9. Appareil pour effectuer une détermination immuno-

I0 logique, caractérisé en ce qu'il est constitué de: une paire d'électrodes métalliques ayant deux surfaces adjacentes, au moins une de ces électrodes portant un premier

composé réagissant immunologique et au moins une de ces élec-

trodes transmettant la lumière; un dispositif pour introduire entre les surfaces des électrodes une solution réactive constituée d'au moins un second et un troisième composé réagissant immunologique, le second composé réagissant immunologique étant compétitif avec le premier composé réagissant immtuologique vis-à-vis de la fixation avec le troisième composé réagissant immunologique, et le second composé réagissant immunologique étant marqué par une subtance chimiluminescente; un dispositif pour appliquer un potentiel électrique

entre les électrodes pour oxyder la substance chimiluninescen-

te; et un dispositif pour mesurer la chimiluminescence de la

substance chimiluminescente.

20. Appareil selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'une des électrodes est constituée d'une membrane à laquelle le premier composé réagissant immunologique est fixé. 2I. Appareil selon la revendication I9, caractérisé en ce que ladite électrode est constituée d'une couche de

gel contenant le composé réagissant immunologique.

22. Appareil selon la revendication I9, caractérisé

en ce que le dispositif de mesure est constitué d'un détec-

teur adjacent à l'électrode transmettant la lumière.

23. Appareil selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'électrode transmettant la lumière fait partie

intégrante du détecteur.

24. Appareil selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'électrode transmettant la lumière est constituée d'un substrat transparent portant une pellicule transparente mince d'une matière conductrice de l'électricité. 25. Appareil selon la revendication 19, caractérisé

en ce que le dispositif d'introduction consiste en une struc-

ture tubulaire placée entre la paire d'électrodes.

26. Appareil selon la revendication 25, caractérisé

en ce que la structure tubulaire a une configuration spira-

lée.