DE3003190A1

DE3003190A1 - Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung von immunoassays

Info

Publication number: DE3003190A1
Application number: DE19803003190
Authority: DE
Inventors: Bruce J Oberhardt; Leonard Ornstein
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-01-31
Filing date: 1980-01-30
Publication date: 1980-08-07
Also published as: GB2041003A; GB2041003B; FR2448149A1; JPS55132956A; IT8067150A0; US4307070A; IT1133058B; JPH0225141B2; FR2448149B1; CA1139262A

Description

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TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA

Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung von Immunoassays

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung einer immunologischen Reaktion in rascher und kostensparender Weise durch Vorkonzentrieren, der Reaktionsteilnehmer.

Auf dem Gebiet der Immunoassays liegen die Eeaktionsteilnehmer häufig in sehr verdünnter Form vor, was zu Assays führt, die eine ausgedehnte Inkubationszeit erfordern, um ein beobachtbares Ergebnis zu liefern, und die außerdem unempfindlich sind.

Beispielsweise ist für die Bestimmung von einigen Serumbestandteilen, wie Spuren von Hormonen (beispielsweise ACTH), die Konzentration so niedrig, daß die Umsetzung; mit der entsprechenden stöchiometrischen Menge des spezifischen Antikörpers länger als 24 h bis zu ihrer Vervollständigung benötigt. (Siehe beispielsweise Thoreil and Larson, Radioimmunoassay and Related Techniques Methodology and Clinical Application, C. V. Mosby Co., St. Louis, 1978, Seiten 144, 186, 198, 200).

Wenn die Konzentration von Antikörper und Antigen um das Dreihundertfache erhöht werden könnte, so würde die TDimolekulare Reaktionsgeschwindigkeit zwischen ihnen um das 300 χ 300 = 9000Ofache erhöht werden, was dazu führen würde·, eine 24stündige Reaktionsdauer auf weniger als 1 s zu verringern.

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Wenn die bei einem Immunoassay angewandte Markierung ' ein Chromophor, Fluorophor, eine Spinmarkierung oder dgl. ist, so ist die Empfindlichkeit, mit der die markierte Substanz bestimmt werden kann, direkt der Konzentration der markierten Substanz in dem für den Assay schließlich zur Verfügung stehenden Volumen proportional (wenn das Detektorsystem auf dieses Volumen geeicht worden ist). Daher liefern diese Methoden, die der Konzentrierung der Reaktionsteilnehmer für den Immunoassay zur Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit dienen, auch zu einem beträchtlichen Anwachsen der Empfindlichkeit des Assays.

Trotz der Tatsache, daß ein Vorkonzentrieren als zweckmäßig erkannt worden ist, gibt es derzeit kein praktisches Mittel zur Erzielung dieses Ergebnisses. Die Reaktionsteilnehmer können durch Zentrifugieren vorkonzentriert werden, jedoch ist dieses Verfahren nicht gänzlich zufriedenstellend. Erstens müssen die vorkonzentrierten Reaktionsteilnehmer häufig, wenn sie aus der Zentrifuge zu Reaktionszwecken ausgebracht werden, teilweise erneut verdünnt werden. Zweitens erfordert dieses Verfahren normalerweise

kostspielige Einrichtungen. Drittens ist das Verfahren außerordentlich zeitaufwendig. Dies ist insbesondere bei Reaktionsteilnehmern der Fall, die ein niedriges Molekulargewicht haben, wie beispielsweise bei kleinen Antigenen, wie Angiotensin und Haptenen.

Die Erfindung erzielt eine Vorkonzentrierung von mindestens einem Reaktionsteilnehmer der Umsetzung in demselben Medium, in dem die umsetzung durchgeführt wird. Dadurch wird der oben erwähnte Nachteil der erneuten Verdünnung umgangen. Außerdem werden erfindungsgemäß die Reaktionsteilnehmer bis zu solchen Konzentrationen vorkonzentriert, die um ein Vielfaches größer sind als diejenigen, die nach bisherigen Verfahren, angewandt auf Immunoassays, im allgemeinen erreichbar.waren. Schließlich werden erfindungsgemäß sämtliche genannten Ziele

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mit niedrigen Kosten und rasch erreicht.

Gemäß einer bekannten Bestimmungsmethode wird die Umsetzung der Immunoreaktionsteilnehmer, Antigen (oder Hapten) einerseits und Antikörper andererseits, innerhalb einer lokalisierten Zone eines Gelmediums durchgeführt. Die Versuchssubstanz wird durch Elektrophorese durch das Gel wandern und mit der immobilisierten Reaktionskomponente in reaktiven Kontakt kommengelassen. Nach Gleichgewichtseinstellung werden die nichtumgesetzten oder ungebundenen Substanzen durch weitere Elektrophorese von dem immobilisierten Reaktionsteilnehmer weiter entfernt und so abgetrennt. Ein derartiges System ist beispielsweise aus der US-PS 3 966 897 bekannt. Die vorliegende Erfindung befaßt sich jedoch nicht damit, wie die Reaktionsteilnehmer innerhalb des Gelreaktionsmediums vorkonzentriert werden können.

Ein anderes Verfahren zur Konzentrierung von Bestandteilen einer Flüssigkeitsprobe innerhalb eines Mediums ist aus der US-PS 3 384 564 als Scheibenelektrophorase (discelectrophoresis) bekannt. Bei diesem Verfahren wird ein diskontinuierliches elektrisches Feld quer über ein Gelmedium entwickelt. Verschiedene Bestandteile einer Flüssigkeitsprobe mit demselben Ladungsvorzeichen wandern anfangs mit verschiedenen Geschwindigkeiten durch das Gel. Jeder Bestandteil konzentriert sich rasch in einer engen Zone, und das Verfahren endet in einem Fließgleichgewicht, bei dem sämtliche Bestandteile mit demselben Ladungsvorzeichen mit derselben Geschwindigkeit in einer bestimmten Ordnung in dem Gel wandern.

Während dieses Verfahren zum Trennen und Konzentrieren von Bestandteilen einer Probe verwendet worden ist, so ist es niemals als Verfahren zum Zusammenbringen zweier immonologischer Spezies bei hoher Konzentration zur Durchführung

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einer gesteuerten Umsetzung verwendet oder dafür auch nur · vorgeschlagen worden.

Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich grundsätzlich von den bekannten Immunoassays dadurch, daß erfindungsgemäß die Bestandteile einer Umsetzung selektiv ausgesiebt werden, um sie zu konzentrieren. Wenn bei den bisherigen Immunoassay-Verfahren Moleküle der Reaktionsteilnehmer durch ein Medium in einem elektrophoretisehen Feld wandern, so diffundieren sie dabei leicht unregelmäßig in jede Richtung. Demzufolge verdünnt sich eine verdünnte Substanz, die durch eine Flüssigkeit oder ein Gelmedium wandert, leicht weiter» Dies ist deswegen so, weil einige Moleküle des Reaktionsteilnehmers nach hinten diffundieren, selbst während die Gesamtmasse der Substanz in einem elektrischen Feld durch das Medium vorwärtswandert. Bei dem bisher bekannten Verfahren wurde das letztmögliche Potential zur Erzielung extrem großer Reaktionsgeschwindigkeiten niemals voll verwirklicht. Dies ist deswegen der Fall, weil die Reaktionsteilnehmer nicht in konzentrierter Form zusammengebracht werden.

Erfindungsgemäß wird ein Gel oder nicht der Konvektion unterliegendes Medium ausgewählt, um eine nichtzufällige Wanderung der reagierenden Moleküle durch Konvektion zu eliminieren. Eine der reagierenden Spezies läßt man durch das Medium in Richtung auf eine Konzentrierungs- oder Barrierenzone wandern, die für kleine Ionen durchlässig, jedoch für die reagierenden Reakti ons teilnehmer undurchlässig ist. Diese Konzentrierungs- oder Barrierenzone erlaubt nicht das ¥#iterwandern der ankommenden Reaktionsteilnehmer. Die fortbestehende elektrojphoretische Kraft verursacht dann die Moleküle der Substanz, sich in einer engen Zone sehr dicht an der Barriere zu konzentrieren, so daß die Reaktionsteilnehmer innerhalb eines sehr kleinen ¥oluiaeiits sehr stark angereichert werden. Wenn der andere Beaktionsteilnehmer

bereits konzentriert und innerhalb der Konzentrierungszone vorhanden ist, löst das Ankommen und das sich Anreichern des komplementären Reaktionsteilnehmers eine sehr rasche Umsetzung aus. In einer anderen Ausführungsform kann der zweite Reaktionsteilnehmer dem System zugesetzt werden, nachdem der erste sich angereichert hat. Er wandert ebenfalls auf die Barriere zu und konzentriert sich in derselben Zone wie der erste. Im Falle einiger Immunoreaktionen kann es erforderlich sein, daß anschließend an die Umsetzung gebundene und nicht gebundene Reaktionsteilnehmer voneinander getrennt werden. Dies kann dadurch erreicht werden, daß man beispielsweise die .Richtung der elektrophoretischen Kraft umkehrt. In diesem Falle kann der umgesetzte Reaktionsteilnehmer in dem Medium immobilisiert werden, weil seine Größe zufolge der Umsetzung zugenommen hat und er nicht im Medium v/andern kann. Die Moleküle der nicht umgesetzten Reaktionsteilnehmer können jedoch aus der Umsetzungszone ebenso schnell, wie.sie hineingelangt sind, wieder herauswandern. Die Bestimmung des unbekannten Reaktionsteilnehmers in der Probe kann anschließend innerhalb des Mediums nach bekannten Verfahren durchgeführt werden.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Durchführung einer raschen Umsetzung zwischen an-: fangs verdünnten Reaktionsteilnehmern, wobei ein oder mehrere Reaktionsteilnehmer innerhalb desselben Mediums vorkonzentriert und umgesetzt werden, und insbesondere die Schaffung eines kostengünstigen, raschen Verfahrens zur Durchführung von Immunoassays.

Weiterhin ist Aufgabe der Erfindung die Schaffung von Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung eines empfindlicheren Immunoassays.

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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Umsetzung eines Bestandteils einer Flüssigkeitsprobe innerhalb eines porösen Mediums, in dem dieser Bestandteil wanderngelassen wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(ä) den Bestandteil der Probe innerhalb des Mediums wandern läßt,

(b) den Bestandteil innerhalb eines Teils des Mediums konzentriert und

(c) den konzentrierten Bestandteil mit einem in diesem Teil des Mediums vorhandenen Reaktionsteilnehmer umsetzt.

Die Wanderung des Bestandteils wird elektrisch induziert. Das Verfahren läßt sich auf immonologische Umsetzungen anwenden, bei denen mindestens eine Komponente der Umsetzung innerhalb des Reaktionsmediums vorkonzentriert wird, bevor die Umsetzung stattgefunden hat. Das Medium besitzt eine eingeschränkte Neigung zur Konvektion sowie eine semipermeable Barriere für die Konzentrierung. Mit anderen Worten, erlaubt das Medium die Bewegung der Reaktionsteilnehmer durch das Medium in einer genau gesteuerten und selektiven V/eise. Die Steuerung der Wanderung und das selektive Aussieben der Reaktionsteilnehmer in dem Medium werden dazu benutzt, um sie zu konzentrieren, wenn sie gezwungen werden, durch relative Bewegung zueinander in reaktiven Kontakt miteinander zu treten. Im Sinne der Erfindung ist ein Gel ein Medium, das keine Konvektion erlaubt, und eine hochviskose Flüssigkeit ein Medium, das eine sehr eingeschränkte Konvektion aufweist.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Zeichnungen näher erläutert, worin

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F i g. 1 ein schematischer Schnitt durch eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung,

Fig. 1a und 1b schematische Schnitte durch andere Ausführungsformen der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung,

Fig. 2a bis 2g schematische Darstellungen aufeinanderfolgender Zustände beim Betrieb der Vorrichtung gemäß Fig. 1,

F i g . 3 ein schematisches Diagramm der Reaktionssignale, die beim Betrieb der Vorrichtung gemäß Fig. 1 gemäß den in Fig. 2a bis 2g dargestellten Zuständen erhalten worden sind, und

Fig. 4 eine schematische perspektivische Ansicht eines automatisierten Systems

darstellen.

Gemäß Fig. 1 kann in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Gleichstromquelle 10 ein Potential zwischen Elektroden 11 und 12 erzeugen. Die Elektrode 11 ist in eine Pufferlösung 13 eingetaucht, die in einem oberen Abschnitt 14 eines Behälters 15 enthalten ist. Die Elektrode 12 ist in eine Pufferlösung 16 eingetaucht, die in einem unteren Abschnitt 17 des Behälters enthalten ist. Ein Mittelabschnitt 18 des Behälters 15 dient als elektrische Brücke zwischen den Elektroden 11 und 12. Der mittlere Abschnitt 18 enthält zwei Gelschichten 19 und 20, von denen die obere Schicht 19 aus einem Gel mit großen Poren und die untere Schicht 20 aus einem Gel mit kleinen Poren besteht.

Wenn ein Immunoassay eines bestimmten Antigens 25 (Ag) durchgeführt werden soll, wird eine dünne Schicht

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einer konzentrierten, bekannten Menge an Antikörpern 9 (Ab), die mit dem bestimmten Antigen 25 (Ag) reagieren kann, zwischen den Gelschichten 19 und 20 angeordnet. Die Probe 22, die eine unbekannte Menge des Antigens 25 (Ag), das bestimmt werden soll, sowie eine bekannte Menge an markiertem Antigen 25' (Ag*) enthält, wird oben auf die Gelschicht 19 in der Pufferlösung 13, wie dargestellt, aufgebracht. Die Probe 22 kann mit einer nichtionischen Substanz, wie beispielsweise Saccharose, in 20 bis hO%±ger Konzentration zur Erhöhung der Dichte der Antigenprobe 22 vermischt werden, um ein leichtes Absetzen in Form einer Schicht unter dem Puffer 13 zu ermöglichen.

Die Porengröße des Gels 20 mit kleinen Poren wird so gewählt, daß weder Antikörper (Ab) noch Antigene (Ag+Ag*) diese Schicht durchdringen können. Dadurch werden die Reaktionsteilnehmer in einer dünnen Schicht an der Grenze zwischen den Schichten 19 und 20 festgehalten und angereichert. Die Immunoreaktion wird dadurch auf diese enge Zone 21 beschränkt. Da die Reaktionsteilnehmer bei ihrer Umsetzung in der Schicht 21 konzentriert sind, wird eine sehr rasche Umsetzung erzielt.

Wenn das Verfahren begonnen werden soll, wird ein Schalter 23 in den Leitungen 24 geschlossen, so daß zwischen den Elektroden 11 und 12, wie oben erwähnt, eine Spannung angelegt wird. Zusammen mit einer geeigneten Auswahl des pH-Wertes und der elektrischen Polarität führt dies zu einer elektrophoretisehen Wanderung der Antigene 25 und 25' in der Probe 22 in Richtung auf die Antikörperschicht 21. Die Erfindung betrifft lediglich diejenigen Paare von Reaktionsteilnehmern der immonologischen Umsetzung, bei denen mindestens einer ionisch ist oder ionisch gemacht werden kann, und, falls beide ionisch sind, die Paare von gleichen Ladungsvorzeichen und in einem geeigneten pH-Wert-Bereich von etwa 3,0 bis 10,0 beweglich sind.

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In den Fig. 2a bis 2g sind in schematischer Reihen-" folge verschiedene Zustände im Ablauf der elektrophoretischen Wanderung dargestellt, die in der Vorrichtung gemäß Fig. 1 abläuft. Fig. 2a zeigt den ersten Zustand der Wanderung mit markierten Antigenen 25' (Ag*) und unmarkierten Antigenen 25 (Ag) in verdünnter Form innerhalb der Probe 22, die sich oben auf der Gelschicht 19 befinden.

Gemäß Fig. 2b werden die Antigene 25 und 25' einer leichten Vorkonzentrierurig unterzogen, wenn die Spannung zwischen den Elektroden 11 und 12 angelegt worden ist. Diese leichte Vorkonzentrierung ist der Tatsache zuzuschreiben, daß die Antigene nunmehr in das Gelmedium 19 eintreten, das die Wanderungsgeschwindigkeit leicht verringert. Die Antigene 25 und 25^f bilden nunmehr ein leicht vorkonzentriertes Band 26.

Fig. 2c zeigt die nächste Stufe vor der Immunoreaktion, wo das leicht vorkonzentrierte Band 26 der Antigene seine Wanderung durch das Gel 19.mit großen Poren begi.nnt.

Während dieser Zeit können die konzentrierten Antikörper 9 (Ab) in Schicht 21, wenn sie nicht immobilisiert sind, Jedoch das gleiche Ladungsvorzeichen wie die Antigene 25 und 25^f aufweisen, ebenfalls in Richtung auf« die Gelschicht 20 gewandert sein, wobei sie eine noch stärker konzentrierte Schicht an der Phasengrenze der Schichten 20 und 21 bilden.

Fig. 2d zeigt, wie das Band 26 der Antigene in die Konzentrierungszone oberhalb der Gelschicht 20 gewandert ist. Auf dieser Stufe in dem Bestimmungsverfahren wird der Strom aufrechterhalten, bis das Band 26 äußerst konzentriert geworden ist und sich mit den Antikörpern 9 in Schicht (Fig. 2e) vereinigt. Danach wird die Spannung über Schalter 23 gemäß Fig. 1 ausgeschaltet, wie in Fig. 2f darge-

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stellt. Die konzentrierten Antigene (Ag und Ag*) werden nun der Umsetzung mit den konzentrierten Antikörpern (Ab) nach dem Verfahren der kompetitiven Bindung überlassen. Nachdem eine rasche Gleichgewichtseinstellung stattgefunden hat, wird eine umgekehrte Spannung über Schalter 23 an die Elektroden 11 und 12 angelegt, um eine Wanderung in umgekehrter Richtung und damit Abtrennung von jeglichen nicht gebundenen Antigenen (25 und 25') zu bewirken, wie in Fig. 2g dargestellt.

Fig. 3 zeigt eine grafische Darstellung der Detektorsignalstärke längs des mittleren Abschnittes 15, erzeugt durch die Markierung des Antigens 25' (Ag*).

Die Menge an Antigenen (Ag) in der ursprünglichen Probe 22 wird auf übliche Weise berechnet, indem man das markierte Antigen 25' (Ag*) entweder in dem gebundenen Anteil 27 und bzw. oder dem ungebundenen Anteil 28 der Reaktion bestimmt, wie in Fig. 3 dargestellt.

Die Markierung, die zur Kennzeichnung des Antigens 25' verwendet wird, kann eine beliebige Markierung aus einer Anzahl bekannter Substanzen sein, wie beispielsweise ein fluoreszierendes, chemilumineszierendes, enzym- oder radioaktives Reagenz usw. Diese Substanzen ergeben ein beobachtbares und meßbares Signal, wie sich aus Fig. 3 ergibt.

Wenn die Schicht 21 nicht vorhanden ist, können die Antikörper 9 (Ab) in analoger Weise wie bei den Antigenen vor dem Einbringen der Probe 22 konzentriert werden. Dies wird dadurch herbeigeführt, daß man vor dem Assay eine verdünnte Lösung der Antikörper 9 in die Pufferlösung 13 einbringt und zwischen den Elektroden 11 und 12 die Spannung anlegt. Dann wandern die Antikörper (Ab) in analoger Weise, wie in den Fig. 2b bis 2d für das Antigen gezeigt, durch das Gel 19 hindurch. Wenn die Antikörper (Ab) die Oberfläche

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des Gels 20 mit kleinen Poren erreichen, können sie nicht weiterwandern und werden dadurch in einer Schicht, die in dem untersten Teil der Schicht 19 angeordnet ist, extrem angereichert.

Während der zusätzlichen Zeit, die zum Vorkonzentrieren der Antikörper nach dem zuletzt beschriebenen Verfahren erforderlich ist, kann es zu bevorzugen sein, die Vorkonzentrierungsmethode unter Verwendung der Schicht 21 anzuwenden.

Das beschriebene modifizierte System kann wie folgt weiter abgeändert werden:

Gemäß Fig. 1a ist eine Membran 29 quer über den Boden von Gel 19 in einer Vorrichtung angeordnet, die analog derjenigen von Fig. 1 ist. Die Membran 29 dient als Ersatz für das Gel 20. Das Gel 19 ist ein Gel mit großen Poren, das den Durchtritt sowohl der Antigene 25 und 25' (Ag+Ag*) als auch der Antikörper 9 (Ab) ermöglicht. Die Membran 29 erlaubt lediglich den Durchtritt von kleinen Ionen, jedoch nicht von Antigenen 25 und 25' (Ag+Ag*) oder Antikörpern (Ab). Daher werden die Antikörper 9, wenn vor dem Assay die elektrophoretische Wanderung der Antikörper 9 (Ab) ablaufengelassen wird, in einer Schicht unmittelbar an der Membran 29 ganz am unteren Ende des Gels 19 angereichert. Die Bestimmung der Antigene 25 (Ag) wird analog derjenigen gemäß Fig. 2a bis 2g durchgeführt.

Fig. 1b erläutert eine v/eitere Modifizierung der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung. Der mittlere Abschnitt enthält nunmehr zwei getrennte Gelschichten 45 und 55 mit großen Poren, zwei Gele oder Membranen 36 bzw. 46 mit mittleren Poren, eine Schicht 38 aus Antikörpern 9 sowie ein Gel mit kleinen Poren oder eine Membran 39.

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Die antigenhaltige Probe 22 wird, wie oben erwähnt, unter die Pufferlösung 13 geschichtet und setzt sich auf der Schicht 36 ab, wie dargestellt. Wenn die Spannung angelegt wird, beginnen die Antigene 25 und 25' der Probe 22 durch die Gelschicht 36 zu wandern. Die Funktion dieser Gelschicht 36 mit mittleren Poren besteht darin, daß sie gegenüber großen Proteinen in der Probe 22, die zusammen mit den Antigenen 25 und 25' gewandert sind, undurchlässig ist. Derartige große Proteine können Substanzen, wie Albumin oder Gammaglobuline sein. Diese Substanzen werden durch die erste Zwischenschicht 36 aufgehalten, bevor sie in die Nähe der Konzentrierungszone gelangen, so daß sie den Assay nicht stören können. Die zweite Zwischenmembran oder Gelschicht 46 dient dem Zweck, die Antikörper 9 innerhalb der Schicht 38 festzuhalten. Die Antikörper bleiben innerhalb dieser Schicht 38, weil sie weder aus ihr nach oben in die Zwischenschicht 46 noch nach unten in die Gelschicht mit kleinen Poren oder Membranschicht 39 wandern können. Somit kann das Anlegen einer Spannung in beliebiger Richtung nicht die Wanderung der Antikörper aus der Konzentrierungszone (Schicht 38) heraus verursachen. Diese Ausführungsform hat dieselbe Wirkungsweise wie die in Fig. 1a dargestellte, da die Antigene 25 und 25^l oberhalb einer undurchlässigen Membran oder Gelschicht 39 stark angereichert werden, wo sie sich mit der Antikörperschicht 38 vereinigen und reagieren. Bei der Stromrichtungsumkehr wandert nichtumgesetztes markiertes Antigen 25^f in die Schicht 55 zurück, die frei von Probensubstanzen ist, die den Nachweis und die Messung stören könnten.

Gemäß Fig. 4 ist ein automatisiertes System mit einem kontinuierlichen Band 60 aus Gelmaterialien vorgesehen, das von einer nicht dargestellten Vorratsrolle in Richtung auf eine ebenfalls nicht dargestellte Aufnahmerolle abgewickelt wird. Das Band 60 kann, wie dargestellt, einen Kunststoffrücken 62 zur Stützung tragen. Das Band 60 wird

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in entwässerter Form aufbewahrt und wird beim Abwickeln von der Vorratsrolle durch Kontakt mit einem nicht dargestellten Befeuchtungsdocht rehydratisiert. Das Aufbewahren des Bandes in entwässerter Form gestattet das vorherige Einbringen von markierten Antigenen (Ag*) und Antikörpern (Ab) in das Band. Somit braucht lediglich die Probe dem System zugefügt zu werden, um einen Assay durchführen zu können. Diskrete Abschnitte 64 des Bandes 60 werden periodisch der Reihe nach vorbei an einem Paar Dochten 63 und 65, die in Flüssigkeitskontakt mit einem Paar Flüssigkeitsvorräten 81 stehen, die Pufferlösungen 67 bzw. 68 sowie Elektroden 69 bzw. 70 enthalten, eingeteilt. Jeder Abschnitt 64 des Bandes 60 enthält sämtliche Komponenten für einen vollständigen Assay. Diese Vorrichtung ist analog derjenigen aufgebaut, die in Fig. 1b dargestellt ist, wobei das Gelmaterial in Form eines.flachen, kontinuierlichen Bandes vorliegt, um eine automatische Reihe von Testen durchführen zu können. Ein Probenabgabegefäß 66 ist oberhalb des Bandes 60 angeordnet und liefert in jedem Abschnitt 64 in eine Vertiefung 61 eine Probe, sowie jeder Abschnitt 64 in Flüssigkeitskontakt mit den angrenzenden Dochten 63 bzw. 65 bewegt wird. Jede Probe wandert durch die Endschicht 71 des Bandes 60. Die Energiequelle 80 bewirkt das Anlegen eines elektrischen Feldes über die Vorratsgefäße 81 und Dochte 63 und 65 quer über das Band 60 längs des Abschnittes 64, der sich zwischen den Dochten 63 und 65 erstreckt. Das elektrische Feld veranlaßt die Probe in der Endschicht 71 des Bandes 60, sich infolge elektrophoretischer Wanderung quer über den Bandabschnitt 64 in Richtung auf die andere Endschicht 72 des Bandes 60 zu bewegen. Bestandteile innerhalb des Bandes werden unterhalb der Bandoberfläche abgeschieden und wandern somit innerhalb des Bandes, so daß Oberflächeneffekte und ein "Überlaufen" (spill over) ausgeschlossen sind.

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Wenn die Probe quer über den Bandabschnitt 64 wandert, trifft sie auf eine Gelschicht 73, die dazu dient, Komponenten mit großen Molekülen, wie Albumin und Gammaglobuline, zurückzuhalten, und die außerdem einen markierten Bestandteil 25' (Ag*) enthält, der dem Bestandteil (Ag), der in der Probe bestimmt werden soll, äquivalent ist. Die markierten Bestandteile (Ag*) und die Bestandteile der Probe (Ag) wandern nun in ein Gel mit gr.oßen Poren in einer Mittelschicht 74 und anschließend in die Schichten 75 und 76. Die Schicht 76 enthält eine Immunospezies 9 (Ab), die gegenüber den markierten Bestandteilen (Ag*) und den Bestandteilen der Probe (Ag) komplementär ist. Das (Ab) ist in der Schicht 76 eingefangen, damit es mit diesen Bestandteilen (Ag* und Ag) reagieren kann. Die Gelschicht 75 ist gegenüber den Antigenen (Ag* und Ag) sowie gegenüber kleinen Ionen durchlässig. Die Gelschicht 76 ist lediglich gegenüber kleineren Ionen durchlässig, jedoch nicht gegenüber den Molekülen des Antigens (Ag* oder Ag) oder Antikörpers (Ab).

Wenn die Umsetzung der Bestandteile mit den komplementären Immunospezies stattgefunden hat, wird der betreffende Abschnitt 64, der diese Reaktionsteilnehmer enthält, einer zweiten Station 90 zugeteilt, die entsprechende Vorratsgefäße 81', Pufferlösungen 67' und 68', (nicht dargestellte) Elektroden 69' und 70' sowie Dochte 63' und 65' aufweist. Diese zweite Station 90 dient dazu, ein elektrisches Feld umgekehrter Polarität quer über die Abschnitte 64 anzulegen, so daß jegliches nichtgebundene Ag und Ag* zurück in die Schicht 74 wandert. Der Abschnitt 64 wird nunmehr an einer Ablesestation 100 vorbeigeführt, die einen Abtastdetektor aufweist, damit die Menge an markiertem Bestandteil in Schicht 74 und bzw. oder Schicht 76 abgelesen werden kann. Jeder Abschnitt 64 wird somit abwechselnd an der Probenaufgabe-, Elektrophorese- und Ablesestation vorbeigeführt. Die Stationen sind derart angeordnet, daß sie

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einen hohen Durchsatz gewährleisten. Jedoch können selbstverständlich mehrere der Behandlungsstationen miteinander verbunden werden, wobei der Durchsatz etwas sinkt.

Sämtliche Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. Durchführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens dienen dazu, eine Konzentrierung einer oder mehrerer der Bestandteile bei einer Umsetzung während des Verfahrens der Elektrophorese durch ein Medium mit eingeschränkter oder fehlender Konvektion durchzuführen. Die konzentrierten bzw. angereicherten Bestandteile werden innerhalb desselben Mediums, das für die Konzentrierung verwendet wird, zur Umsetzung gebracht, wobei eine erneute Verdünnung und eine Überführung entfallen können. Sämtliche Umsetzungen werden innerhalb desselben Mediums messend verfolgt, was ebenfalls zweckmäßig ist.

Obwohl die vorstehende Beschreibung Immunoassay-Verfahren betrifft, so können auch dieselben Vorrichtungen leicht für viele andere chemische Umsetzungen mit verdünnten Reaktionsteilnehmern verwendet werden. In sämtlichen dieser Umsetzungen sind die Bestandteile und Immunospezies entweder von Natur aus ionisch oder können durch geeignete chemische Behandlung und geeignete Wahl des pH-Wertes in der Lösung ionisch gemacht werden.

Die Umsetzungen können innerhalb des Gelmaterials durch viele übliche fluorometrische, fotometrische, kolorimetrische usw. Verfahren messend verfolgt werden.

Medien mit fehlender Konvektion, wie Gele, sind in der Vorrichtung zur Steuerung der Wanderung von Materialien bevorzugt. Gele, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können aus üblichen Materialien ausgewählt werden, wie beispielsweise aus Sephadex, Acrylamid, Agarose usw. Die Wanderung muß genau gesteuert werden, damit man die sehr

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hohen Konzentrierungen erreichen kann, die nötig sind. Vorzugsweise sind die Gele auch durchscheinend oder durchsichtig, so daß die Umsetzung innerhalb des Gels auch optisch verfolgt werden kann.

Weiter ist es bevorzugt, eine Diffusion oder Wanderung derjenigen Materialien zu verhindern, die vor dem Versuch innerhalb von Gelzonen abgeschieden worden sind. Beispielsweise müssen die vorher abgeschiedenen Antikörper, die innerhalb einer schmalen Zone oder auf einer Membran innerhalb des Gels angeordnet sind, in ihrer umschriebenen Zone eingeschlossen werden. Dies kann durch bauliche Maßnahmen, wie beispielsweise Umgeben dieser Materialien mit Schichten mit kleinen Poren, erzielt werden. Es kann aber auch ein geringes elektrophoretisches Potential aufrechterhalten werden, um sie an Ort und Stelle festzuhalten. In einigen Fällen können die Antikörper sogar an eine Membran kovalent gebunden oder durch gebundenen Latex an ihr befestigt werden usw.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß erfindungsgemäß mindestens ein Reaktionsteilnehmer oder Bestandteil während seiner Wanderung durch ein Medium mit beschränkter Konvektion vorkonzentriert wird und außerdem konzentrierte Bestandteile und Reaktionsteilnehmer innerhalb desselben Mediums umgesetzt werden, um sowohl eine rasche als auch empfindliche Umsetzung zu erzielen.

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Claims

30Ü3190 Poicnicawäliö Reiche! u. Eeichel <£«* 6 Frankfort a. M. 1 Parksiioß© 13 TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytowi, N.Y., VStA Patentansprüche

1. Verfahren zum Umsetzen eines Bestandteils einer Flüssigkeitsprobe innerhalb eines porösen Mediums, in den dieser Bestandteil wanderngelassen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) den Bestandteil der Probe innerhalb des Mediums wandern läßt,

(b) den Bestandteil innerhalb eines Teiles des Mediums anreichert und

(c) den angereicherten Bestandteil mit einem innerhalb dieses Teils des Mediums vorhandenen Reaktionsteilnehmer umsetzt.

2♦ Verfahren gemäß Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß man den Reaktionsteilnehmer innerhalb des Mediums vorkonzentriert, indem man

(d) den Reaktionsteilnehmer innerhalb des Mediums wandern läßt und

(e) den Reaktionsteilnehmer innerhalb dieses Teils des Mediums anreichert.

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3. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Bestandteil ein geladenes Ion verwendet und daß man weiter in der Stufe (a) ein elektrisches Feld längs des Mediums anlegt, um den aus dem geladenen Ion bestehenden Bestandteil innerhalb des Mediums wandern zu lassen.

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4. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (b)

(d) die Wanderung des Bestandteils durch eine Barriere oder Sperrschicht, die quer über das Medium senkrecht zur Wanderungsrichtung des Bestandteils angeordnet und für den Bestandteil undurchlässig, jedoch für kleinere Moleküle durchlässig ist, begrenzt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Bestandteil ein -geladenes Ion verwendet und daß man in Stufe (a) ein elektrisches Feld längs des Mediums anlegt, um den Bestandteil in For"m des geladenen Ions innerhalb des Mediums v/andern zu lassen, und in der Konzentrierungsstufe (b) die Wanderung des Bestandteils durch eine Barriere oder Sperrschicht begrenzt, die quer über das Medium senkrecht zur Wanderungsrichtung des Bestandteils angeordnet und gegenüber dem Bestandteil undurchlässig, gegenüber kleinen Ionen jedoch durchlässig ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß der Bestandteil und der Reaktionsteilnehmer gleiches Ladungsvorzeichen haben und daß man weiter

(e) ein elektrisches Feld einer gegebenen Polarität längs des Mediums anlegt, so daß die Wanderungsrichtung des Bestandteils auf die Barriere oder Sperrschicht zu gerichtet ist,

(f) das elektrische Feld praktisch aufrechterhält, bis der Bestandteil in Kontakt mit dem Reaktionsteilnehmer kommt,

(g) den Bestandteil und den Reaktionsteilnehmer miteinander reagieren läßt und

(h) das elektrische Feld umkehrt, um nicht umgesetzten Bestandteil von umgesetztem Bestandteil zu trennen.

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7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem

(i) den umgesetzten Bestandteil zur Bestimmung der Menge dieses Bestandteils in der Probe mißt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem

(h) den nicht umgesetzten Bestandteil zur Bestimmung der Menge dieses Bestandteils in der Probe mißt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1,

d a du rch gekennzeichnet, daß man außerdem

(d) die Umsetzung zwischen dem Bestandteil und dem Reaktionsteilnehmer mißt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bestandteil eine immunologische Spezies und als Reaktionsteilnehmer eine komplementäre immunologische Spezies des Bestandteils verwendet, wobei die Probe eine unbekannte Menge des Bestandteils in Kombination mit einer bekannten Menge an markiertem Bestandteil enthält, und man in Stufe (c) außerdem

(d) den bekannten und den unbekannten Anteil des Bestandteils an eine bekannte Menge an Reaktionsteilnehmer kompetitiv bindet.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem

(i) jeglichen ungebundenen Bestandteil von jeglichem gebundenem Bestandteil innerhalb des Mediums abtrennt.

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12. Verfahren gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem - - .

(j) den gebundenen Bestandteil zur Bestimmung der unbekannten Menge des Bestandteils in der Probe mißt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem

(j) den ungebundenen Bestandteil zur Bestimmung der unbekannten Menge des Bestandteils in der Probe mißt,

14. Vorrichtung zur Umsetzung eines Bestandteils einer Flüssigkeitsprobe innerhalb eines porösen Mediums, in dem der Bestandteil ein geladenes Ion ist, das mittels eines elektrischen Feldes, das längs des Mediums angelegt ist, wanderngelassen wird, bestehend aus: Mitteln (66) zur Einführung der Probe (22) in das Medium (18, 64), Mitteln (10, 80) zum Anlegen eines elektrischen Feldes an das Medium zur Konzentrierung des Bestandteils (25, 25') innerhalb eines Teils des Mediums, mindestens einem Reaktionsteilnehmer (9), der in diesem Anteil des Mediums enthalten ist, und Mitteln (100) zum Messen der Umsetzung des Bestandteils mit dem Reaktionsteilnehmer innerhalb des Teils des Mediums.

15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet, daß das Medium (18, 64) ein Gel ist.

16. Vorrichtung gemäß Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet, daß das Medium (18, 64) porös ist.

17. Vorrichtung gemäß Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet, daß das Medium (18, 64) aus einer Anzahl von Schichten (19, 20, 21; 19, 35; 36, 45, 46, 38, 39, 55; 71, 73, 74, 75, 76, 77, 72) besteht. 030032/0776

18. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß jede Schicht porös ist und eine gegebene Porengröße aufweist.

19. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium im wesentlichen ein solches mit eingeschränkter Konvektion ist.

20. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Bestandteil (25, 25') eine immunologische Spezies und daß der Reaktionsteilnehmer (9) sein Komplement ist.

21. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Mediums eine Barriere oder Sperrschicht (20, 29, 39, 77) aufweist.

22. Vorrichtung gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Barrieren- oder Sperrschicht den Reaktionsteilnehmer (9) trägt.

23. Vorrichtung zum Vorkonzentrieren einer Komponente einer Umsetzung innerhal"b eines Mediums, das diese Umsetzung unterstützt, bestehend aus einer Barrieren- oder Sperrschicht (20, 29, 39, 77), die innerhalb des Mediums angeordnet ist, und Mitteln zum elektrischen Steuern der Wanderung der Komponente in Richtung auf die Barrieren- oder Sperrschicht zum Vorkonzentrieren der Komponente innerhalb des Mediums.

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24. Automatisches System zum Vorkonzentrieren eines ionischen, immunologisch reaktionsfähigen Bestandteils einer Probe innerhalb eines Reaktionsmediums, bestehend aus

einem kontinuierlichen Band (60), das sich längs eines Beschickungsweges vorwärtsbewegt und das ein Gelmedium (64) zum Ermöglichen der Wanderung des Bestandteils (25, 25') sowie eine semipermeable Barrieren- oder Sperrschicht (77) innerhalb dieses Gelmediums zum Konzentrieren bzw. Anreichern des Bestandteils aufweist,

einer Aufgabestation (66), die längs des Beschickungsweges angeordnet ist, zum Aufbringen einer Probe auf einen Teil des Bandes, wobei die aufgegebene Probe das Gelmedium des Bandabschnittes anschließend an die Wanderung in Richtung auf die Barrieren- oder Sperrschicht durchwandert,

einer ersten Station längs des Beschickurigsweges zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer über das Band, um zu veranlassen, daß der Bestandteil in dem Gelmedium in Richtung auf die Barrieren- oder Sperrschicht zur Anreicherung wandert, und

Mitteln zum Vorwärtsbewegen des Bandes längs des Beschickungsweges, so daß der Bandabschnitt an der Station und der ersten Station, an der das elektrische Feld angelegt wird, vorbeiwandert.

25. Automatisches System gemäß Anspruch 24,. dadurch gekennzeichnet, daß das Gelmedium eine Schicht (76) aufweist, die einen markierten ionischen Bestandteil (9) enthält, der in bezug auf die immunologische Reaktion äquivalent dem Probenbestandteil(25, 25') ist, der darin angeordnet ist, und daß weiter der markierte Bestandteil zusammen mit dem Probenbestandteil in dem elektrischen Feld wandert.

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26. Automatisches System gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Barrieren- oder Sperrschicht (77) einen komplementären immunologisch reaktionsfähigen Bestandteil (9) zur Umsetzung mit dem markierten (25') und Probenbestandteil (25) trägt, wenn diese in Richtung auf die Barrieren- oder Sperrschicht wandern.

27. Automatisches System gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem eine zweite Station zum Anlegen eines elektrischen Feldes längs des Beschickungsweges zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer über das Band aufweist, wobei das elektrische Feld hinsichtlich des ersten elektrischen Feldes von umgekehrter Polarität ist, um nichtumgesetzte Bestandteile von den umgesetzten Bestandteilen abzutrennen.

28. Automatisches System gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem eine Ablesestation (100) längs des Beschickungsweges stromabwärts von der Station für das zweite elektrische Feld aufweist, um die umgesetzten und bzw. oder nichtumgesetzten Bestandteile zu ermitteln.

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