DE3003191A1

DE3003191A1 - Scheiben-elektrophorese mit gelen (disc-gel-elektrophorese)

Info

Publication number: DE3003191A1
Application number: DE19803003191
Authority: DE
Inventors: Martin J Lee; Leonard Ornstein
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-01-31
Filing date: 1980-01-30
Publication date: 1980-08-07
Also published as: IT1133056B; FR2448152A1; GB2040313A; IT8067148A0; JPH01158355A; CA1126203A; FR2448152B1; DE3003191C2; GB2040313B; JPH0257670B2; US4288425A; JPS55132946A; JPH0226187B2

Description

TECHNICON INSTRUMENTS CORPOfIATION, Tarrytown, N. Y., VStA

Scheiben-Elektrophorese mit Gelen (Disc-Gel-Elektrophorese}

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Durchführung von Immunossays und insbesondere Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung empfindlicher Immunoassays in rascher und bequemer Weise.

Typischerweise umfassen klinische Immunoassayverfahren das Vermischen einer verdünnten Probe Blutserums, die eine Spur eines interessierenden Antigens enthält, mit einem aliquoten Anteil von Antikörper, der dazu hergestellt worden ist, damit er in spezifischer Weise und ausschließlich mit dem in Spuren vorhandenen Antigen reagiert. Der Antikörper wird normalerweise in mäßigem stöchiometrischen Überschuß über die maximale Menge an Antigen zugesetzt, die man in der abnormsten von natürlich vorkommenden Proben erwartet.

Die Umsetzung zwischen diesen beiden Molekülarten ist bimolekular, und ihre Geschwindigkeit ist dem Produkt ihrer Konzentrationen proportional. Wenn die Konzentration eines

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Antigens nur 10 g/ml beträgt, wie es für viele natürlich vorkommende "Hormone" üblich ist, kann die Zeitdauer bis zur Vervollständigung der Umsetzung über 24 h betragen. Dieses führt zu unzweckmäßig langdauernden Bestimmungsverfahren.

Außerdem ist bei derartig niedrigen Konzentrationen das Vermögen, die Umsetzung nachzuweisen, stark gefährdet.

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Für derartige Bestimmungen werden Abwandlungen der berühmten Isotopenverdünnungstechnik angewandt. In ihrer einfachsten Form wird eine Probe aus einem mit einem radioaktiven Isotop markierten Antigen dem Gemisch in einer Menge zugesetzt, die einen leichten Überschuß über das stöchiometrische Äquivalent des zugesetzten Antikörpers darstellt. Das markierte Antigen tritt mit dem unmarkierten Antigen hinsichtlich des Antikörpers in Wettbewerb und wird im Verhältnis von markiertem zu unmarkiertem Antigen gebunden. Nach Beendigung der Umsetzung wird der gebildete Antigen/Antikörper-Komplex nach einer von einer Vielzahl von Methoden vom nichtumgesetzten Antigen abgetrennt, und die Radioaktivität einer der beiden oder beider voneinander getrennter Fraktionen kann zur Bestimmung der Anfangskonzentration an Antigen in der Serumprobe verwendet werden.

Es ist klar, daß andere markierte Antigene, beispielsweise fluoreszenzmarkierte, chemilumineszenzmarkierte, spinmarkierte usw., in analogen Bestimmungsarten verwendet werden können. Im allgemeinen hängt die Fähigkeit von alternativen Verfahren zur Konkurrenz mit den Verfahren, die sich radioaktiver Markierungen bedienen, hinsichtlich der Empfindlichkeit von der Empfindlichkeit des Bestimmungsverfahrens für Fluoreszenz, Chemilumineszenz usw. ab. Im Gegensatz zu den Verhältnissen bei der Radioaktivität ist die Empfindlichkeit vieler Verfahren zur Bestimmung dieser anderen Markierungen selbst stark konzentrationsabhängig.

Wenn Verfahren, die sich nicht der Isotopenmethode bedienen, hinsichtlich der Empfindlichkeit vergleichbar mit den Radioisotopen-Verdünnungsmethoden sind oder gar eine größere Empfindlichkeit aufweisen, werden sie häufig bevorzugt. Das Gesundheitsrisiko, das mit der Exposition von Laborpersonal gegenüber radioaktiven Substanzen verbunden ist, fällt bei der Verxvendung von nichtradioaktiven Markierungen natürlich SOFk^flityPXOffi besitzen die Reagenzien

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mit nichtisotopen Markierungen eine längere Lebensdauer, weil radioaktive Immunoassayreagenzien typischerweise eine ganz bestimmte und kurze Halbwertszeit aufweisen. Außerdem lassen die niedrigeren Kosten von nichtradioaktiven Reagenzien und die einfacheren und weniger kostspieligen Einrichtungen zu ihrer Bestimmung nichtradioaktive Markierungen wünschenswerter erscheinen.

Daher würde ein Immunoassayverfahren unter Verwendung nichtradioaktiver Markierungen, das sowohl das Antigen als auch den Antikörper auf das 3OOfache oder darüber anreichert und daher die Reaktionsgeschwindigkeit um das 90000fache oder darüber erhöht, einen enormen Vorteil gegenüber bereits bestehenden Verfahren darstellen, die stark zeitaufwendig sind, wie beispielsweise das Verfahren gemäß "Radioimmunoassay & Related Techniques Methodology & Clinical Application" von Thorell & Larson, Verlag CV. Mosby Co., St. Louis, 1978, Seiten 144, 186, 198, 200.

Trotz der Tatsache, daß das Vorkonzentrieren als zweckmäßig erkannt worden ist, gibt es bisher kein zweckmäßiges Mittel zur Herbeiführung dieses Ergebnisses. Reaktionsteilnehmer können durch Zentrifugieren vorkonzentriert werden, jedoch ist diese Technik nicht gänzlich zufriedenstellend. Erstens müssen die vorkonzentrierten Reaktionsteilnehmer häufig teilweise erneut verdünnt werden, wenn sie aus der Zentrifuge zur Umsetzung entnommen werden. Zweitens erfordert dieses Verfahren normalerweise aufwendige Einrichtungen. Drittens ist das Verfahren unangemessen zeitaufwendig. Dies trifft besonders für Reaktionsteilnehmer mit niedrigem Molekulargewicht, wie beispielsweise kleine Antigene, wie Angiotensin und Haptene, zu.

Erfindungsgemäß wird eine Vorkonzentrierung beider Reaktionsteilnehmer der Umsetzung in demselben Medium erzielt, in dem die Umsetzung durchgeführt wird. Dies besei-

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tigt den oben erwähnten Nachteil der erneuten Verdünnung. Außerdem werden erfindungsgemäß die Reaktionsteilnehmer zu Konzentrationen angereichert, die um ein Vielfaches größer sind als die im allgemeinen in bisher bekannten Verfahren, die auf Immunoassays angewandt worden sind, erreichbaren Konzentrationen. Außerdem werden erfindungsgemäß sämtliche genannten Ziele mit niedrigen Kosten und auf rasche Weise verwirklicht.

Eine bekannte Bestimmungsmethode ist durch die Umsetzung von immunologischen Reaktionsteilnehmern, Antigen (oder Hapten) einerseits und Antikörper andererseits, innerhalb einer lokalisierten Zone eines Gelmediums gekennzeichnet. Die Zu untersuchende Substanz wird elektrophoretisch durch das Gel in Reaktionskontakt mit dem immobilisierten Reaktionsteilnehmer wandergelassen. Nach Einstellung des Gleichgewichtes werden die nichtumgesetzten oder ungebundenen Substanzen durch weitere Elektrophorese weg von dem immobilisierten Reaktionsteilnehmer geführt und damit abgetrennt. Ein derartiges System ist aus der US-PS 3 966 897 bekannt. Nicht hervorgeht aus dieser Patentschrift jedoch, wie die Reaktionsteilnehmer innerhalb des gelförmigen Reaktionsmediums vorkonzentriert werden können.

Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich ganz allgemein von den bisher bekannten Immunoassayverfahren durch Konzentrieren der Bestandteile einer Umsetzung in demselben Medium, in dem sie auch umgesetzt werden. Bei den bekannten Verfahren wird das höchste Potential zur Erzielung außergewöhnlich hoher Reaktionsgeschwindigkeiten niemals voll verwirklicht, weil die Reaktionsteilnehmer nicht in konzentrierter Form zusammengebracht werden.

Gemäß den Verfahren und Vorrichtungen der Erfindung

werden scheibenelektrophoretische (disc-electrophoretic)

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Techniken sowohl zum Konzentrieren als auch zum Inkontakt-. bringen der immunologischen Reaktionsteilnehmer innerhalb desselben Mediums angewandt. Die Verfahren erlauben eine Bewegung der'Reaktionsteilnehmer durch das Medium in genau gesteuerter Weise. Die Steuerung der Wanderung der Reaktionsteilnehmer in dem Medium wird dazu verwendet, sie vor der Weiterwanderung, die zu ihrem Reaktionskontakt miteinander führt, anzureichern.

Die erfindungsgemäßen Verfahren bestehen aus folgenden Stufen: (a) Wandernlassen der immunoreaktiven Bestandteile in einem Medium und Anreicherung der Bestandteile in diesem· Medium, (b) Weiterwanderlassen der konzentrierten Bestandteile innerhalb des Mediums in reaktionsfähigen Kontakt miteinander und (c) Umsetzen der konzentrierten Bestandteile innerhalb des Mediums.

Die scheibenelektrophoretischen (disc-electrophoretic) Vorrichtungen gemäß der Erfindung besitzen die folgenden Vorteile:

1. Eine 24stündige Immunoreaktion kann auf weniger ', als 1 s abgekürzt werden

( 24 h ^ 90000 s _ χ

^v 90000 90000

2. umgesetzte und nichtumgesetzte markierte Antigene -werden automatisch getrennt.

3. Bei Verwendung nichtradioaktiver Markierungen wird eine hohe Empfindlichkeit erzielt.

4. Vorrichtung und Handhabung sind einfach.

5. Die- Kosten sind niedrig.

Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Durchführung einer raschen Umsetzung mit anfänglich verdünnten Reaktionsteilnehmern.

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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, immunologische Reaktionsteilnehmer innerhalb desselben Mediums vorzukonzentrieren und umzusetzen.

Weiter ist es Ziel der Erfindung, Immunoassays kostengünstig und rasch durchzuführen.

Schließlich ist es Ziel der Erfindung, Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung eines empfindlicheren Assays anzugeben.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert, worin

F i g . 1 einen schematischen Schnitt durch eine typische Vorrichtung zur Durchführung der scheibenelektrophoretischen Konzentrierung.

F i g . 2 einen schematischen Schnitt durch eine Vorrichtung zur Durchführung eines Immunoassays gemäß der Erfindung,

F i g . 3 ein schematisches Diagramm, in dem die Porengröße in Abhängigkeit von der Länge eines Gradientengels aufgetragen ist, das in der Vorrichtung zur Durchführung eines Immunoassays gemäß der Erfindung verwendet wird, und

F i g . 4 eine schematische perspektivische Ansicht eines automatisierten Immunoassay-Bestimmungssystems gemäß der Erfindung

darstellen.

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In Fig. 1 ist eine typische scheibenelektrophoretische Vorrichtung in Form eines schematischen Schnittes dargestellt.

Bei einem typischen Scheiben-Elektrophoreseverfahren, wie es aus der US-PS 3 384 564 bekannt ist, wird ein PoIyacrylamidgel 1 mit großen Poren in einem Glasrohr 2 hergestellt. Das Gel 1 dient als Medium zur Verhinderung der Konvektion, behindert jedoch ansonsten die Bewegung von Ionen in einem angelegten elektrischen Feld nur unbedeutend. Das Gel wird mit einer beträchtlichen Konzentration (beispielsweise 0,06M) an einem Salz einer schwachen Base, wie beispielsweise von Trishydroxymethylaminomethan (TRIS) mit. Salzsäure m_" L einem pH-Wert in der Nähe von 6,7 hergestellt und bildet einen TRIS/HCl-Puffer, bei dem die Ionenarten TRIS⁺ und Cl" sind. Das Rohr 2 ist derart angeordnet, daß sein oberes Ende 3 in den oberen Riffer 5 des Behälters 4 reicht und sein unteres Ende 6 in den unteren Puffer 7 des Behälters 8 eintaucht. Oberer und unterer Behälter 4 bzw. 8 enthalten Puffer 5 bzw. 7 aus einer typischen Lösung von TRIS und Glycin in einer Konzentration in der Größenordnung von 0,5M. Der obere Behälter 4 enthält eine Kathode 9 und der untere Behälter 8 eine Anode 10, die über Stellung A eines Schalters 11 mit der Kathode (-) bzw. Anode (+) einer Spannungsquelle 12 verbunden sind, die In der Lage ist, bei etwa 200 V Potential zwischen den Elektroden 9 und 10 einige Milliampere zu liefern.

Wenn ein Gemisch aus serumhaltigern Antigen (Ag), Antikörper (Ab) und markiertem Antigen (Ag*) mit einer 40%igen wäßrigen Lösung von Saccharose vermischt wird, um eine Lösung mit einer Dichte zu erzielen, die beträchtlich größer ist als diejenige des Puffers 5, kann das Gemisch sehr einfach unter die Pufferlösung 5 auf die Oberfläche des Gels 1 pipettiert werden.

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Wenn der Schalter 11 in die Stellung A geschlossen wird, wird ein elektrisches Feld längs der Länge von Gel 1 angelegt. Jegliche Probenmoleküle, die eine insgesamt negative Ladung tragen, wozu normalerweise die meisten Serumproteine und Antigene gehören, beginnen nun durch Gel 1 in dem Rohr 2 nach unten in Richtung auf den anodischen Behälter 8 zu wandern.

Wie aus der US-PS 3 334 564 und Ornstein, L., Ann. N. Y. Acad. Sei. 121, Seiten 321-349, (1964) bekannt ist, reichern sich diese negativ geladenen Spezies in einer Reihe von nichtdargestellten, benachbarten, scheibenförmigen Zonen an. Die Spezies mit der höchsten Beweglichkeit nach der des Chlorions Cl befindet sich in der vordersten Zone unmittelbar hinter dem Cl". Sämtliche anderen Anionen befinden sich in nachfolgenden Zonen in abnehmender Ordnung ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit, wobei die letzte Zone von dem langsamsten Anion belegt wird, das eine Mobilität besitzt, die derjenigen des Glycinations bei etwa pH 8,9 am nächsten kommt. Die letzte Zone wird von dem Glycination eingenommen. Das Anion in jeder Zone konzentriert sich so lange, bis die Zunahme der Leitfähigkeit dieser Zone einen, lokalen Abfall im Potentialgradienten erzeugt, der ausreicht, um die Geschwindigkeit des Anions auf diejenige zu vermindern, die genau gleich der des Cl~- Ions in Gel 1 vor der ersten Zone ist. Bei konstantem Strom von der Spannungsquelle 12 wandert der Stapel von Zonen danach mit konstanter Geschwindigkeit in intakter Form, wobei die Dicke jeder Zone konstant bleibt und direkt proportional der Konzentration der Komponenten in der Ausgangsprobe ist. Diese Erscheinung wird Stapelbildung beim Fließgleichgewicht (steady-state-stacking) genannt. Die Endkonzentration in jeder Zone ist von der Ausgangskonzentration unabhängig; sie hängt lediglich von der Konzentration an Chlor -Ionen in Gel 1 ab, die durch die Ausgangsbedingungen festgelegt wird. Das bedeutet, daß Serumbe-

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standteile, die anfangs in Konzentrationen von etwa 6 χ 1O~ M vorhanden sind, um etwa das 1000Ofache angereichert werden (0,06/6 χ 10~ ). Diejenigen Bestandteile, die anfangs in Konzentrationen von 2 χ 10" M vorhanden sind, werden um etwa das 300fache angereichert usw. (Siehe Ornstein, L., Ann. N.Y. Acad. Sei., 121, Seiten 321-349 (1964).

Das Verfahren der Stapelbildung beim Fließgleichgewicht trennt jedoch, während es anreichert, so daß die typische Vorrichtung gemäß Fig. 1 in unmodifizierter Form die Antigene (Ag und Ag*) und Antikörper (Ab) nicht zu einer Umsetzung zusammenbringt.

Die im folgenden im einzelnen beschriebene Erfindung wird gemäß den oben und in der genannten Literatur erwähnten Lehren durchgeführt.

Gemäß Fig. 2 besitzt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ein Gel oder eine Membran 13, quer über dem Boden 6 von Gel 1 des Rohres 2. Die Membran besitzt Poren, die groß genug sind, daß sie den Durchtritt von Ionen, wie beispielsweise Cl", TRIS⁺ und Antigenen (Ag), zu gestatten, jedoch gegenüber größeren Ionen, wie Antikörpern (Ab), undurchlässig sind.

Bei der Durchführung des Assays wird der Antikörper (Ab) bei Stellung A des Schalters in herkömmlicher elektrophoretischer Weise unter Verwendung eines TRIS/HCl-Puffers im Gel 1 zunächst in das Gel 1 eingebracht. Der TRIS/HC1-Pffer wird außerdem in beiden Behältern 4 und 8 verwendet.

Die Wanderung des Antikörpers (Ab) in Gel 1 führt zu einem engen, konzentrierten, unbeweglichen Band aus Antikörpern (Ab) in einer Schicht 14 unmittelbar oberhalb der Membran 13. Danach wird der Schalter 11 in Aus-Stellung umgelegt.

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Nunmehr wird der Puffer 5 im Behälter 4 durch TRIS/ Glycin ersetzt und die Serumprobe und markiertes Antigen (Ag*) mit Saccharose vermischt und auf die Oberfläche 3 von Gel 1 geschichtet. Der Schalter 11 wird erneut in Stellung A gebracht. Das Probenantigen (Ag) und markierte Antigen (Ag*) sowie andere Anionen bilden einen Stapel und wandern innerhalb des Gels 1, wie oben für Fig. 1 angegeben.

Wenn die konzentrierte Antigenschicht (Ag + Ag*) in die immobile Antikörperschicht 14 gelangt, erfolgt die Immunoreaktion. Überschüssiges, nichtumgesetztes Antigen (Ag + Ag*) tritt durch diese Schicht 14 hindurch in die Pufferflüssigkeit 7. Die Menge an markiertem Antigen (Ag*) in Schicht 14 und bzw. oder in der Pufferlösung 7 wird gemessen, um den Antigengehalt (Ag) der.Probe zu bestimmen.

Alternativ kann ein Gel im Rohr 2 gemäß Fig. 1 mit einem Gradientengel von in Wanderungsrichtung abnehmender Porengröße hergestellt werden, wie in der Darstellung gemäß Fig. 3 gezeigt ist.

In dieses Gradientengel gemäß Fig. 3 wird Antikörper (Ab) in üblicher Weise mit TRIS/HCl-Puffer in Gel 1 eingebracht. TRIS/HCl-Puffer wird auch in beiden Behältern 4 und 8 verwendet. Dies führt zu einem konzentrierten, immobilen Band am - nicht dargestellten - Ort, an dem die Porengröße im Gradientengel dem Durchmesser des Antikörpermoleküls äquivalent ist (Margulis, J. und Kenrick, K.G. Biοehem. Biophys. Res. Commun. 27, Seiten 68 (1967)). Schalter 11 wird ausgeschaltet. Der obere Puffer 5 wird nunmehr durch TRIS/Glycin ersetzt.

Das Serumprobenantigen (Ag) und das markierte Antigen (Ag*) werden mit Saccharose vermischt und nun, wie oben für Fig. 1 beschrieben, auf die Oberfläche 3 des Gels 1 geschichtet. Schalter 11 wird in Stellung A einge-

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schaltet, und die Probenionen einschließlich der Antigene (Ag + Ag*) wandern und bilden einen Stapel in dem Gel, wie oben beschrieben. Wenn die konzentrierte Antigenschient in die immobile Antikörperschicht gelangt, erfolgt die Immunoreaktion, und überschüssiges, nichtkombiniertes Antigen läuft weiter durch die Reaktionsschicht hindurch und weiter abwärts im Gel. Die Menge an Markierung in der immobilen oder freien Antigenschicht (nicht dargestellt) oder in beiden Schichten wird anschließend gemessen.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen -Vorrichtung wird die langsamer wandernde Immunospezies (typischerweise der Antikörper), wie oben im Hinblick auf das Verfahren gemäß Fig. 1 erwähnt, konzentriert. Der konzentrierte Antikörper wird teilweise das Gel 1 hinunter wanderngelassen.

Die Antigene (Ag + Ag*) werden mit einer Saccharoselösung und mit einer Konzentration an TRIS/HCl von etwa 0,06m vermischt und auf die Oberfläche 3 von Gel 1 geschichtet. Schalter 11 wird nun in Stellung A gebracht. Die Antigene bilden einen Stapel in konzentrierter Form hinter dem Cl~-Ion und überholen die langsamer wandernden Antikörper.

Eine Immunoreaktion findet statt. Die überschüssigen Antigene bewegen sich an der Umsetzungszone vorbei. Die Umsetzung wird in den umgesetzten und bzw. oder nichtumgesetzten Schichten gemessen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird das Sj^stem gemäß Fig. 1 derart angeordnet, daß die Pufferzusammensetzung in dem oberen und unteren Behälter 5 bzw. 7 anfänglich unterschiedlich sind. Beispielsweise enthält der obere Behälter 5 ein langsames Anion, wie Gylcinat, wie oben beschrieben. Das untere Gefäß 7 enthält nunmehr ein langsames Kation, wie Glucamin

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(glucamine). Das Gel 1 enthält das Salz aus einem schnellen Kation und einem schnellen Anion, wie Ammoniumacetat. Der pH-Wert der Gellösung wird so eingestellt, wie aus Ornstein, L., Ann. N.Y. Acad. Sei. 121, Seiten 341 (1964) zu ersehen, das während des Ansatzes eine immunoreaktive Spezies, wie beispielsweise der Antikörper (Ab) kationisch und die andere Immunospezies anionisch ist.

Die anonische Spezies, beispielsweise das Probenantigen (Ag) und das markierte Antigen (Ag*)» werden in einer Saccharoselösung, wie oben erwähnt, aufgebracht und bilden einen Stapel und reichern sich an, wie oben beschrieben.

Nachdem der Stapel gebildet worden ist, wird der Schalter¹ 11 ausgeschaltet. Der obere und untere Behälter 4 bzw. 8 werden in - nicht dargestellte - getrennte Gefäße entleert. Das Gelrohr 2 wird aus dem oberen Behälter 4 entfernt, umgekehrt und in dieser umgekehrten Stellung in das Gefäß 8 erneut eingesetzt. Der Puffer 7, der vorher im unteren Behälter 8 enthalten war, wird nunmehr in den oberen Behälter 4 gegossen und der Puffer 5 aus dem oberen Behälter 4 in den unteren Behälter 8.

Die kationische Spezies, beispielsweise der Antikörper, wird in einer Saccharoselösung auf den Oberteil 3 (vorher Boden 6) des Gels 1 aufgebracht. Der Schalter 11 wird nun in Stellung B gebracht, und die kationische Spezies bildet zwischen dem vorauseilenden NEL⁺-IOn und dem nachfolgenden Glucamin-Kation in einer hochkonzentrierten Schicht einen Stapel, der nunmehr nach unten wandert. Die zuvor zu einem Stapel angeordneten anionischen Antigene (Ag -t- AG*) wandern weiter (aber nun aufwärts). Mit der Zeit treffen sich die beiden entgegengesetzt wandernden konzentrierten Schichten aus immunorekativem Spezies (nicht dargestellt) und reagieren miteinander. Die Messung wird ausgeführt, wie oben beschrieben.

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In Fig. 4 ist ein automatisiertes System zur Durchführung eines Immunoassays gemäß der Erfindung und insbesondere gemäß der zuletzterwähnten Methode erläutert.

Ein Gelmaterial 31, das sich zur Unterhaltung einer immunologischen Reaktion eignet und die Wanderung und Anreicherung der immunologischen Spezies vor der Umsetzung gestattet, wird von einem biegsamen Stützband oder Stützgewebe 33 aus Kunststoff gehaltert. Das Gelmaterial 31 wi^d auf dem Band oder Gewebe 33 gebildet, das von einer nichtdargestellten Vorratsrolle abgewickelt und anschließend wieder auf eine nichtdargestellte Aufnahmerolle aufgewickelt wird.

Das Gel 31 ist in diskreten Abschnitten 32 angeordnet, von denen jeder für die Durchführung einer einzigen Umsetzung bestimmt ist. Jeder Abschnitt 32 wird an einer Reihe von BearbeitungsStationen vo.rbeigeführt, die durch die Pfeile 50, 60. 70 und 80 angedeutet sind und später näher erläutert werden. Jeder Abschnitt 32 umfaßt ein Paar Vertiefungen 34 bzw. 35. Die Vertiefung 34 erhält Antigene (Ag + Ag*) aus einer über dem Band angeordneten Abgabeeinrichtung 37, während die Vertiefung 35 Antikörper 38 (Ab) aus einer Ausgabevorrichtung 39 erhält. Beide Ausgabeeinrichtungen bilden die Ausgabestation 50.

Nachdem ein bestimmter Abschnitt 32 die immunologischen Reaktionsteilnehmer 36 und 38 aufgenommen hat, wird er zu einer Station 60 zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer über das Band 30 geführt. Die immunologischen Reaktionsteilnehmer, die in die Vertiefungen 34 bzw. 35 eingebracht worden sind, wandern unter dem Einfluß des elektrischen Feldes unter der oberen Oberfläche 40 des Gels 31. Das Gel ist durch die aufnehmenden Vertiefungen 34 und 35 so eingerichtet, daß es die Wanderung der Reaktionsteilnehmer unter seiner oberen Oberfläche 40 unterstützt, um Oberflächen-

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effekte und ein Überlaufen ("spill over") zu eliminieren.

Die Station 60 umfaßt zwei Behälter 41 und 42, die Pufferlösungen 43 "bzw. 44 aus Glycinat (langsames Anion) und Glucamin (langsames Kation) enthalten, wie oben erwähnt. Die Ionen der Puffer 43 und 44 werden über die entsprechenden Benetzungsdochte 45 und 46, die in Flüssigkeitskontakt mit den entsprechenden Seiten 47 und 48 von Gel stehen, dem Gel 31 angeboten.

Die Wanderung der Ionen wird durch entsprechende Elektroden 51 und 52, die in den Lösungen 43 bzw. 44 angeordnet sind, bewirkt. Die Spannungsquelle 53 liefert den Elektroden 51 und 52 Strom.

Wie oben erwähnt, enthält das Gel 31 das Salz eines schnellen Kations und eines schnellen Anions, wie beispielsweise Ammoniumacetat von einem geeigneten pH-Wert.

Wenn ein Abschnitt 32 von Gel 31 der Station 60 zugeteilt wird, beginnen die Antigene 36 und Antikörper 38 quer über das Gel 31 aufeinanderzu zu wandern, wie durch die Pfeile 55 angedeutet. Die immunologischen Reaktionsteilnehmer 36 und 38 reichern sich an und treffen sich anschließend und reagieren miteinander in einem mittleren Abschnitt von Gel 31. Der Strom von der Spannungsquelle 53 kann während der Umsetzung zwischen den immunologischen Spezies abgeschaltet oder verringert werden.

Danach wird der Abschnitt 32 einer zweiten Station zugeführt, die Bestandteile aufweist, die mit denen der Station 60 gleichartig sind, und bei der ein weiteres elektrisches Feld quer über das Gel 31 angelegt vrlvd, um umgesetzte und nichtumgesetzte Bestandteile zu trennen, wie dargestellt.

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Der Abschnitt 32 wird nunmehr an einer Abtastdetektorstation 80 vorbeigeführt, die das markierte Antigen (Ag*) in dem gebundenen Anteil 66 und bzw. oder dem nichtgebundenen Anteil 61 mißt, um die Menge an Probenantigen (Ag) zu bestimmen.

Diese automatische Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung benötigt keine Umkehrung des Gels 31, wie oben beschrieben, weil durch die .Anordnung des Gels 31 in einer flachen, horizontalen Lage Gravitationswirkungen eliminiert worden sind.

Dem geübten Fachmann wird klar, daß ein Teil, wenn nicht die Gesamtheit der Stationen 50, 60, 70 und 80 miteinander kombiniert werden kann. Jedoch gestattet das erläuterte System mit getrennten Stationen einen größeren Durchsatz, da mehrere Vorgänge zur gleichen Zeit ablaufen können. Auch können die Reagenzien Ag* und Ab in ein trockenes Gel eingebracht sein, das kurz vor seiner Verwendung rehydratisiert wird.

Sämtliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung führen zu einer Anreicherung eines oder mehrerer der Bestandteile einer Umsetzung während der elektrophoretischen Wanderung durch ein Medium mit beschränkter oder fehlender Konvektion. Die angereicherten Bestandteile werden in reaktiven Kontakt innerhalb desselben Mediums gebracht, das für ihre Anreicherung verwendet wird, wodurch die Notwendigkeit der erneuten Verdünnung und. der Überführung eliminiert \vird. Sämtliche Umsetzungen werden ferner innerhalb desselben Mediums messend verfolgt bzw. überwacht, was ebenfalls sehr zweckmäßig ist.

In sämtlichen Umsetzungen, auf die sich die Erfindung bezieht, sind die Bestandteile und immunologischen Spezies entweder natürliche Ionen oder können durch geeignete chemi-

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sehe Behandlung ionisch gemacht werden, wie beispielsweise durch Bindung an ein Zentralion (liganding) oder Derivatbildung sowie Auswahl des pH-Wertes der Lösung.

Die Umsetzungen können innerhalb des Gelmaterials durch viele übliche Verfahren, beispielsweise fluorometrisch, fotometrisch, kolorimetrisch oder sogar isotopisch usw., messend verfolgt werden.

Medien mit fehlender Konvektion, wie Gele, sind in den Vorrichtungen zur Steuerung der Wanderung von Materialien bevorzugt. Gele, die in den Vorrichtungen gemäß der Erfindung verwendet werden können, können aus üblichen Materialien ausgewählt werden, wie beispielsweise Sephadex^² Agarose, Polyacrylamid usw. Die Wanderung in Form eines Fließgleichgewichtsstapels wird durch die Kohlrausch'ehe Steuerungsfunktion genau gesteuert, um die sehr hohen Konzentrierungen zu erzielen, die erwünscht sind. Vorzugsweise sind diese Gele außerdem durchscheinend oder durchsichtig, so daß die Umsetzung innerhalb, des Gels auch optisch überwacht werden kann.

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Claims

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ÜT^i/'V^ol 9560

TECHMICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA

Patentansprüche

1 .·' Scheibenelektrophoretisches Verfahren zur Analyse eines Probenbestandteils, der eine ionische Ladung trägt, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) den Probenbestandteil in ein poröses Medium einbringt,

(b) ein elektrisches Feld quer über das Medium anlegt, um den Bestandteil innerhalb des Mediums wandern und sich in einem ersten Teil davon anreichern zu lassen,

(c) den angereicherten Bestandteil weiter durch einen zweiten Teil des Mediums, der einen Reaktionsteilnehmer enthält, v/andern zu lassen, um eine Umsetzung damit zu verursachen, und

(d) die Umsetzung mißt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem

(e) nichtumgesetzte Anteile des Bestandteils von umgesetzten Anteilen des Bestandteils abtrennt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem

(f) den Probenbestandteil durch Messung entweder des umgesetzten oder der nichtumgesetzten Anteils des Bestandteils in dem Medium bestimmt.

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4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe verwendet, die außerdem ein markiertes Äquivalent des Probenbestandteils enthält, und man in Stufe (c) den Bestandteil und sein markiertes Äquivalent mit dem Reaktionsteilnehmer nach dem Prinzip der kompetitiven Bindung umsetzt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem

(e) den Reaktionsteilnehmer in das Medium einführt und

(f) den Reaktionsteilnehmer sich vor seiner Umsetzung mit dem Bestandteil anreichern läßt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Reaktionsteilnehmer zugleich mit dem Bestandteil anreichert.

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7. Automatisches scheibenelektrophoretisches System zum Analysieren einer Probe hinsichtlich eines Bestandteils, der eine Ionenladung trägt, bestehend aus

einem porösen Medium (31), das in einem kontinuierlichen Band (33) zur Aufnahme des Probenbestandteils (36) angeordnet ist,

Mitteln zum Vorwärtsbewegen des Bandes längs eines Bes chi ckungswege s,

einem ersten Mittel (50, 37) längs des Beschickungsweges zum Aufbringen des Probenbestandteils (3-6) auf das poröse Medium,

einem zweiten Mittel (41, 42, 51, 52, 43, 44) längs des Beschickungsweges zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer über das poröse Medium, um den Probenbestandteil (36) innerhalb eines ersten Abschnittes des porösen Mediums wandern und sich anreichern zu lassen und ihn anschließend in konzentrierter Form bis zu einem reaktiven Kontakt mit einem Reaktionsteilnehmer (33), der in einem zweiten Abschnitt des porösen Mediums angeordnet ist, relativ wandern zu lassen, und

einem dritten Mittel (80) längs des Beschickungsweges zum Messen der Umsetzung zwischen dem Bestandteil und dem Re akti onste ilnehmer.
8. System gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsteilnehmer (38) eine andere Mobilität besitzt als der Bestandteil (36) und praktisch über das gesamte poröse Medium dispergiert ist.
9. System gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß das Band (33) mehrere poröse Medien (31) enthält, die auf dem Band derart angeordnet sind, daß sie nacheinander behandelt v/erden, wenn sich das Band längs des Beschickungsweges fortbewegt.

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1 O. System gemäß Anspruch ,·,
dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer über das poröse Medium nach erfolgter Umsetzung betreibbar ist, um nichtumgesetzten Bestandteil (36 oder 61) von umgesetztem Bestandteil (66) zu trennen.
11. System gemäß Anspruch 7,

dadurch gekennzeichnet, daß das Medium (31) ein Gel ist.
12. System gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß der Probenbestandteil (36) und der Reaktionsteilnehmer (38) Antigene bzw. Antikörper sind.
13. System gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß der Probenbestandteil (36) und der Reaktionsteilnehmer (38) Antikörper bzw. Antigene sind.
14. System gemäß Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ein markiertes Äquivalent des Probenbestandteils (36) enthält, das sich mit dem Reaktionsteilnehmer (38) kompetitiv bindet.
15· System gemäß Anspruch 7,

dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Aufbringen (50) ein Mittel (39) zum Aufbringen des Reaktionsteilnehmers (38) auf das poröse Medium (31) umfaßt.
16. System gemäß Anspruch 7,

dadurch gekennzeichnet, daß das Mitte], zum Anlegen eines elektrischen Feldes derart betreibbar ist, daß es den Reaktionsteilnehmer (38) innerhalb des porösen Mediums vor der Umsetzung wandern und sich anreichern läßt. 030032/0777

BAD ORIGINAL
17. Scheibenelektrophoretische Vorrichtung zum Analysieren einer Probe hinsichtlich eines Bestandteils, der eine ioni-' sehe Ladung trägt, bestehend aus

einem posören Medium (1) zur Aufnahme des Probenbestandteils,

Mitteln zum Einführen des Probenbestandteils in das Medium ,

Mitteln (9, 10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes quer über das Medium, um den Probenbestandteil wandern und sich innerhalb des Mediums in einem ersten Teil davon vor der Umsetzung mit einem in einem zweiten Teil des Mediums angeordneten Reaktionsteilnehmer anreichern und anschließend weiter innerhalb des Mediums in reaktivem Kontakt mit dem Reaktionsteilnehmer v/andern zu lassen, und

Mitteln zum Messen der Umsetzung zwisehen dem Probenbestandteil und dem Reaktionsteilnehmer.
18. Vorrichtung gemäß Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß das Medium (1) ein Gel ist.
19. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Gelmedium einen Porengroßengradienten aufweist.
20. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium eine Membran (13) zum Festhalten des Reaktionsteilnehmers aufweist, die für den zu untersuchenden Bestandteil durchlässig ist.
21. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Medium (1) eine beschränkte Konvektion aufweist.

0 30Q32/0777
22. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem Mittel zum Einführen des Reaktionsteilnehmers in das poröse Medium (1) aufweist.
23. Vorrichtung gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel umfaßt, durch die der Reaktionsteilnehmer ebenfalls innerhalb des Mediums v/andern und sich anreichern gelassen wird, wenn das elektrische Feld quer über das Medium angelegt ist.
24. Vorrichtung gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel enthält, durch die der angereicherte Reaktionsteilnehmer ebenfalls unter dem angelegten elektrischen Feld in reaktiven Kontakt mit dem Probenbestandteil relativ weiter wandergelassen wird.

030032/0777