JPH01158355A - デイスク電気泳動分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫分析法、ことに感度の高い免゛疫分析を
迅速適宜に行う方法に関する。

臨床上の分析法では、問題の抗原様のこん跡を含む血清
の希釈試料をとくに排他的にこん跡の抗原と反応するよ
うに調製した成る比率の抗体と混合する。

この抗体は通常、自然に生ずる試料のうち最も異常なも
のの中に存在すると考えられる最高量の抗原に中程度の
化学量論的当量にして加える。

これ等の２種の分子間の反応は二分子綬応であり、その
速度はこれ等の分子の濃度の相乗積に比例する。

抗原の濃度が１０−１２ｇ／ｒｒｄｌ程度に低いとぎ（
一般に多くの自然生成のホルモンの場合のように）は、
反応の終る時間は２４ｈｒより長い。この場合分析手順
が不当に長くなる。

さらにこのような低い濃度では反応の検出が著しく困難
になる。

秤杆の有名な同位元素希釈法がこのような分析のために
使われている。その最も簡単なものでは、加えられる抗
体の化学量論的当量をわずかに越える量で放射性同位体
トレーサー的（ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌＶｌａｂｅｌｌ
ｅｄ）抗原（以下ラベル抗原と言う）の試料を混合物に
加える。このラベル抗原は、抗体に対する非ラベル抗原
と拮抗しラベル抗原の非ラベル抗原に対する比率に比例
して結合する。反応の終った後、反応した抗原−抗体錯
化合物を反応してない抗原から分離する（多数の方法の
うちの任意の１つにより）。そしてこれ等の互いに分離
した部分のどちらか一方又は両方の部分の放射能を使い
血清試料中の抗原の初めの濃度を定めることができる。

その他のラベル抗原（たとえばけい光ラベル、化学発光
ラベル、スピンラベル等の抗原）が同様な種類の分析に
使うことができるのは明らかである。−般に放射性ラベ
ル法に対し別の方法で感度が匹敵できるかどうかは、け
い光ラベル、化学発光ラベル等による分析手順の感度に
依存する。放射能とは異なってこれ等の他のラベルを検
出する方法の多くのものの感度は濃度に極めて依存する
。

非同位体法の感度が放射性同位元素希釈法に匹敵し又は
この希釈法より高い場合には、このような非同位体法が
好適なことが多い。実験室員が放射性物質にざらされる
ことに伴う健康の阻害は非放射性ラベルを使うことによ
りなくなる。さらに非同位体トレーサーでは、放射性の
免疫分析試薬が有限の短い半減期を持つので、試薬寿命
が一層長くなる。又非放射性試薬の費用が一層安くまた
これ等の試薬を検出する器具の法が一層簡単で一層安価
であるから、非放射性ラベルの方が望ましい。

従って非放射性ラベリングを使い抗原及び抗体を３００
倍又はそれ以上に自動的に濃縮する（従って反応速度を
９０，０００倍又はそれ以上に高める）免疫分析法は、
極めて時間のかかる既存の方法たとえば、米国セントφ
ルイス市のスイー争ブイ・モスビー・カムパニ（Ｃ，Ｖ
、Ｍｏ５ｂｙ　　Ｃｏ、）から１９７８年に刊行されソ
レル（Ｔｈｏ　ｒｅ　Ｉ　Ｉ　＞及びラーメン（ｌａｒ
ｓｏｎ＞を著者とする論文「放射性免疫分析及び関連技
術の方法論及び臨床的応用」の第１４４．１８６．１９
８及び２００頁に記載の方法より著しく有利である。

予（ｉ’ｒＡｉＲ１？ｉを望ましいと認めてはいても、
従来この成績を得るのに便宜の手段が得られていない。

反応物は遠心法により予備濃縮することができるが、こ
の方法では十分には満足ができない。第１の例では予備
濃縮した反応物は、これ等を反応のために遠心機から取
出すときに部分的に再希釈しなければならないことが多
い。第２にこの方法では通常高価な設備を必要とする。

第３にこの方法は異常に時間がかかる。このことはとく
に低分子量の種たとえばアンジオテンシン（ａｎにｌ　
ｉ　ｏｔｅｎｓ　ｉ　ｎ）及びハプテン（ｈａｐｔｅｎ
）のような小さな抗原の場合にいえる。

本発明では、反応が行われる媒質自体内で両反応物につ
いて予備濃縮を行う。この場合再希釈による前記した障
害がなくなる。さらに本発明では各反応物を、免疫分析
に適用する従来の方法で一般に行われているよりも多数
倍も高度に濃縮する。さらに本発明ではこれ等の目的を
すべて安価にかつ迅速に達成することができる。

従来の分析法では免疫反応物すなわち抗原（又はハプテ
ン）及び抗体がゲル媒質の局部的区域内で反応する。試
験物質は電気泳動によりゲルを経て移動させ不動化した
反応物に反応しながら接触させる。

平衡状態になった債、反応してない又は結合してない物
質はさらに電気泳動により不動化反応物から分離する。

前記したような方式は米国特許第３，９６６．８９７号
明細書に記載しである。

しかしこの特許明細書にはゲル媒質内で各反応物を予備
濃縮することは記載してない。

本発明は一般に従来の免疫分析に比べて、反応の各成分
をこれ等の成分が内部で反応する同じ媒質内で濃縮する
ことが異なっている。従来は極めて急速な反応速度の得
られる最終電位は決して十分には生じない。その理由は
各反応物が濃縮された状態にならないからである。

本発明による分析法は、免疫反応物を同じ媒質内で円板
状に濃縮し集める電気泳動法を使う。本方法では各反応
物を精密に制御して媒質を経て移動させる。媒質中の反
応物の移動の制御は、これ等の反応物の反応を伴う相互
の接触を生ずる次の移行に先だってこれ等の反応物を濃
縮するのに使う。

本発明分析法は、（ａ＞免疫反応成分を媒質中で移行さ
せこの媒質中で濃縮し、（ｂ）濃縮した各成分を前記媒
質内でざらに相対的に移動させ相互に反応を伴って接触
させ、（ｃ）！縮した各成分を前記媒質内で反応させる
ことから成っている。

本発明によるディスク（ｄ　ｉ　ｓｃ）電気泳動分析方
法は次の利点がある。

１．２４ｈｒの免疫反応は１　ｓｅｃ以下に短縮される
（たとえば２４ｈｒｘ９０，０００ｓｅｃ　／ｈｒ−ニ
ー９０．０ＯＯ＝１ＳｅＣ） ２、反応し又反応してないラベル抗原の自動分離３、非
放射性ラベルによる高い感度 ４、簡単な装置及び取扱い ５、安価なこと 本発明の目的は、初めに希釈した各反応物による迅速な
反応を生じさせる方法を提供しようとするにある。

本発明の他の目的は、免疫反応物を同じ媒質内で予備濃
縮して反応さＶようとするにある。

なお本発明の他の目的は、免疫分析を行う安価迅速な方
法を提供しようとするにある。

ざらに本発明の目的は、−層感度の高い分析を行う方法
を提供しようとするにある。

以下本発明によるディスク電気泳動分析法の実施例を添
付図面について詳細に説明する。

第１図にはディスク電気泳動装置を竪断面で示しである
。

米国特許第３，３８４，５６４号明細書によるディスク
電気泳動法では孔の大きいポリアクリルアミドゲル１を
ガラス管２内に用意する。ゲル１は、対流を妨げる媒体
として作用するが、これがないと印加した電界内のイオ
ンの運動をわずかしか妨げない。

ゲル１はかなりの濃度（たとえば０．０６Ｍ＞の弱塩基
性の塩［たとえばトリスオキシメチルアミンメタン（Ｔ
ＲＩＳ＞］と塩酸とを６．７に近いｐＨで調合し、ＴＲ
ｌ５−ＨＣｊ２緩衝液を生成する。この場合イオン種（
ｉｏｎｉｃ　５ｐｅｃｉｅｓ）はＴＲｌ５　　及びＣ１
−である。ガラス管２はその上端部３が溜め４の上部緩
衝液５内に突出し、下端部６が溜め８の下部Ｍ耐液５内
に浸るように配置しである。上下の溜め４，８は、０．
５Ｍの程度の濃度のＴＲｌ５及びグリシンの溶液から成
る緩衝液５，７を入れである。

上部溜め４は陰極９を備え、そして下部溜め８は陽極１
０を備えている。各電極９．１０は、それぞれ、各電極
９，１０を横切って約２００Ｖの電位で数ｍＡを送出す
ことのできる給電源１２の陰極（−）及び陽極（＋）に
、スイッチ１１を経て位置Ａを介して接続される。

抗原へ〇、抗体Ａｂ及びラベル抗原ＡＱ＊を含む血清の
混合物を、ざらに鮭糖の４０％水溶液と混合すれば［緩
衝液５の濃度より著しく高い濃度を持つ溶液を作るため
に１、この混合物は緩衝液５の下方のゲル１の頂部上で
極めて容易にピペットで取ることができる。

スイッチ１１を位置Ａに閉じると、電界はゲル１の長手
に沿って印加される。正味の負の電荷を持つ試料分子（
通常多くの血清たんばく質及び抗原を含む）はガラス管
２内のグル１を経て下方に溜め８に向って移行し始める
。

米国特許第３，３８４，５６４号明細書とニュ−ヨーク
科学協会年報第１２１＠（１９６４年刊）第３２１ない
し３４９頁のオースティン・エルの論文とに記載しであ
るように、これ等の負に帯電したイオン種は、若干の互
いに近接した円板形の各区域（図示しＣない）に集中す
る。塩素イオンＣＩ−より低い最高の移動度を持つイオ
ン種はＣ１−のすぐ後方の前部区域にある。他のすべて
の陰イオンは後部区域に位置し、これ等の陰イオンは電
気泳動の移動度が後部に向い逐次低くなり、最後の区域
は約ｐＨ８，９でグリシネートイオンに最も近い移動度
を持つ最も遅い陰イオンが占める。この最後の区域にグ
リシネートイオンが後続する。各区域の陰イオンは、こ
の区域の導電率の増加により、陰イオンの速度を第１の
区域の前方でゲル１内のＣ１−の速度に正確に等しい値
に減らすのに十分なだけ電位こう配に局部的低下を生ず
るまで濃縮される。次いで給電源１２からの一定の電流
により、数次の区域は元のままの一定の速度で移行し、
各区域の厚みは、一定のままに保持され、出発試料内の
各成分の濃度に正比例する。この現象は定常状態の重な
りと称する。各区域の最終濃度は、出発濃度に無関係で
あり、出発条件により定まるゲル１内ＣＪ−の濃度だけ
による。

このことは、初めに約６Ｘ１０’Ｍの濃度で存在する各
血清成分が、約１０，０００倍（０，０６÷６Ｘ１０’
）の濃度であることを意味する。初めに２Ｘ１０’Ｍで
存在するこれ等の成分は、約３００倍等の濃度になる［
ニューヨーク科学協会年報第１２１号（１９６４年刊）
の第３２１ないし３４９頁のオースティン・エルの論文
参照］。

しかし定常状態の重なり区域生成法では、濃縮に伴って
分離するから、第１図に例示した装置は、修正しないま
まにしておけば、抗原（ＡＱ及びＡｑ＊）及び抗体（Ａ
ｂ＞を集めて反応させない。

本発明は、後述のように前記の説明及び引用文献で述べ
た方法によって実施される。

本発明の１実施例によれば、第１図の装置を、上下の溜
め５，７の緩衝組成物が初めに互いに異なるようにする
。たとえば上部溜め５に前記のようにグリシネートのよ
うな遅い陰イオンを入れ、下部溜め７にはこの場合グル
カミンのような遅い陽イオンを入れる。ゲル１は酢酸ア
ンモニウムのように早い陽イオン及び早い陰イオンの塩
を含む。このゲル溶液のｐＨは（１９６４年刊行のニュ
ーヨーク科学協会年報第１２１号第３４１頁のオーステ
ィン・エルの論文に記載しであるように）、試験中に一
方の免疫反応種（たとえば抗体Ａｂ）が陽イオンであり
、他方の免疫反応種が陰イオンになるようにする。

陰イオン種（これは試料抗原ＡＱ及びラベル抗原Ａ＊と
する）は前記のように蔗糖溶液中に入れると、前記した
ように層状に重なり濃縮する。

試料が層状に重なった後、スイッチ１１をオフ位置にす
る。上下の溜め４，８を別の各溜め（図示してない）に
必ける。ゲルガラス管２を上部溜め４から取出し、逆さ
にして上側を下にしてふたたび溜め８に挿入する。前回
に下部溜め８からの緩衝液７はこの場合上部溜め４に注
入する。又前回に上部溜め４からの緩衝液５は下部溜め
８に注入する。

陽イオン種（これを抗体とする）を蔗糖溶液内のゲル１
の頂部３［前回には底部６］に装入する。この場合スイ
ッチ１１を位置Ｂに投入する。陽イオン種は、前部のＮ
Ｈ４ｈオンと、後続のグルカミン陽イオンとの間にこの
場合下方に移動する高度に濃縮した層状に重なる。前回
に重なった陰イオン抗原（八〇＋Ａｑ＊）は動き続ける
（ただしこの場合上向きに）。やがてこれ等の互いに反
対の向きに移動する２つの免疫反応種の層は互いに出会
って反応する（図示してない）。反応した層又は反応し
てない層或はこれ等の両方の層内のラベル抗原Ａ（］＋
の但を測定し、試料内の抗原Ａｇの量を定める。

第２図にはとくに前記した本発明方法による免疫分析を
行うための自動装置を例示しである。

免疫反応を支え反応に先だって免疫種を移動させ濃縮す
るグル３１は、たわみ性のプラスチック製支持テープ３
３又は帽状体に支えである。ゲル３１は、貯蔵リール（
図示してない）から巻きほぐし引続いて巻取りリール（
図示してない）にふたたび巻取るテープ３３又は帽状体
上に生成する。

ゲル３１は、それぞれ単一の反応を生ずる各別の区間３
２に配置される。各区間３２は、それぞれ矢印で示した
後述する１連の場所５０，６０，７０゜８０を過ぎて割
出しされる。各区間３２には、それぞれ１対のくぼみ３
４．３５が形成されている。分与場所５０でくぼみ３４
は、上方の分与器３７から抗原３６　（Ａｑ＋Ａｑ＊）
を受け、そしてくぼみ３５は、分与器３９から抗体３８
Ａｂを受ける。

特定の区間３２が免疫反応物すなわら抗原３６及び抗体
３８を受けた後、区間３２は、テープ３０の両端間に電
界を印加するように場所６０に割出しされる。それぞれ
くぼみ３４．３５内に入れた免疫反応剤は、電界の影響
のもとにグル３１の上面４０の下方に移動する。ゲル３
１は、受入れくぼみ３４゜３５を介しゲル上面４０の下
方への反応物の移動を支え表面効果及びこぼれをなくす
。

場所６０には、それぞれ前記したようなグリシネート（
遅い陰イオン）及びグルカミン（遅い陽イオン）の緩衝
液４３．４４を入れる２個の容器４１゜４２を設Ｃノで
ある。各緩衝液４３．４４のイオンは、ゲル３１の各側
部４７，４８に接触する湿り６月４５．４６を介してゲ
ル３１に送られる。

イオンの移動は、それぞれ緩衝液４３．４４内に配置し
た電極５１．５２を介して生ずる。

前記のようにゲル３１は適正なｐＨにおける酢酸アンモ
ニウムのような早い陽イオン及び早い陰イオンの塩を含
む。

ゲル３１の区間３２を場所６０に割出しすると、抗原３
６及び抗体３８はゲル３１を横切って矢印５５により示
すように相互に近づく向きに移動し始める。免疫反応物
すなわち抗原３６及び抗体３８はゲル３１の中央部分５
６で集中し相互に出会って反応する。電力源５３からの
電流は、各免疫反応剤間の反応中に切られ又は弱められ
る。

次に区間３２は、図示のように反応した成分及び反応し
てない成分を分離するために、ゲル３１を横切ってさら
に電位を印加するように場所６０と同じ部品を持つ第２
の場所７０に割出しされる。

区間３２は次いで走査検出場所８０に割出しされる。場
所８０は結合した部分６０′又は結合してない部分６１
或は両部会６０−、６１内でラベル抗原Ａｇ＊を測定し
、試料抗原Ａｇを定める。

この自動装置は、ゲル３１を平らな水平位置に位置させ
ることにより重力の影響をなくしであるから、前記した
ようにゲル３１を逆さにする必要がない。

当業者には明らかなように各場所５０，６０゜７０．８
０の全部ではなくても幾つかを組合わせてもよい。しか
しこの実施例のような各別の場所により、複数の試験が
１度に処理できるから作用能力が高くなる。又抗原Ａｇ
”及び抗体Ａｂは、使用の直前にふたたび湿らせる乾燥
したゲル内に含ませてもよい。

本発明の前記の実施例はすべて制限した又は対流を生じ
ない媒体を通る電気泳動移行の処理中に各反応成分の１
８！類又は複数種類の濃縮を行う。濃縮した各成分は濃
縮に使った同じｔｓ質内で反応を伴って接触するように
なり再希釈及び転送の必要がなくなる。反応はすべて同
じ媒質内で監視され便利である。

本発明により考えられる反応ではすべて、成分及び免疫
種は自然の電離性のものであるか、又は結合や誘導のよ
うな適正な化学処理と溶液のｐＨの選択とにより電離性
にすることができる。

反応は、多くの種類の標準のけい光計、光度計、比色計
又は同位体による方法によってゲル材料内で監視するこ
とができる。

ゲルのような非対流性媒体は物質の移行を制御する装置
に好適である。本発明に使うことのできるゲルはセファ
デックス（Ｓｅｐｈａｃｌｅｘ）　、寒天、ポリアクリ
ルアミド等のような標準の原料から選ぶ。定常状態の重
なり移行は、所要の極めて高い濃度が（ｑられるように
コールラウシュ調整作用により精密に制御する。これ等
のゲルは又半透明又は透明にして反応がゲル内で光学的
に監視できるようにするのがよい。

以上本発明をその実施例について詳細に説明したが本発
明はなおその精神を逸脱しないで秤杆の変化変型を行う
ことができるのはもちろんである。

【図面の簡単な説明】

第１図はディスク電気泳動濃縮を行う電気泳動装置の１
例の賢所面図、第２図は本発明方法を自動的に実施する
ためのディスク電気泳動分析装置の斜視図である。 ３１・・・ゲル、３３・・・テープ、３６・・・抗体、
３７゜３９・・・分与器、５０・・・場所（導入装置）
、５１゜５２・・・電極、５３・・・電力源、６０．７
０・・・場所（電界印加装置）、８０・・・場所（測定
装置）μＩＧ、１

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中のイオン電荷をもつ免疫反応成分をディス
   ク電気泳動分析法により定量分析するにあたり、（イ）
   該試料及び該試料中の該免疫反応成分の後述する予め定
   めた量のラベル等価物を多孔性の媒質中にその一端部か
   ら導入し、 （ロ）該媒質の両端部間に電界を印加してディスク電気
   泳動により該免疫反応成分及びそのラベル等価物を該媒
   質中で移動させ定常状態の重なりとして濃縮し、 （ハ）他方、該免疫反応成分及びそのラベル等価物と特
   異的に反応するそしてこれらと逆のイオン電荷をもつ免
   疫反応物を該媒質の他端部から導入しそしてこれらと逆
   方向にディスク電気泳動させて同様に濃縮し、 （ニ）こうして互いに近寄る方向に移動する濃縮された
   該免疫反応成分及びそのラベル等価物と該免疫反応物と
   を該媒質中で出会わせて反応させ、この反応において前
   者が後者よりも過剰量になるように該ラベル等価物の導
   入量を予め定めてあり、 （ホ）未反応の該免疫反応成分及びそのラベル等価物を
   該媒質中でさらに移動させて反応生成物から分離し、そ
   して （ヘ）未反応の該ラベル等価物の量又は反応生成物中の
   該ラベル等価物の量又はこれら両方を測定することによ
   つて該試料中の該免疫反応成分の量を定める、 ことを特徴とする、定量分析法。
2. （２）免疫反応成分として陰イオン抗原を、ラベル等価
   物としてそのラベル抗原を、そしてこれらと特異的に反
   応する免疫反応物として陽イオン抗体を、それぞれ使う
   前項（１）に記載の定量分析法。