JPH0949839A - 免疫学的測定方法 - Google Patents
免疫学的測定方法Info
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- JPH0949839A JPH0949839A JP7203422A JP20342295A JPH0949839A JP H0949839 A JPH0949839 A JP H0949839A JP 7203422 A JP7203422 A JP 7203422A JP 20342295 A JP20342295 A JP 20342295A JP H0949839 A JPH0949839 A JP H0949839A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、検出システムの簡便さを備え、標
識等を使用せず、Ｂ／Ｆ分離を必要としないホモジニア
スな方法であって、抗原抗体反応による抗体そのものの
物理量の変化に着目した抗原測定方法を提供することを
目的とする。 【解決手段】 本発明は、抗原を免疫学的に測定する方
法であって、該抗原に特異的に反応する抗体が該抗原と
反応して抗原抗体複合体を形成することにより起こる前
記抗体の表面電荷の変化により前記抗原を測定すること
を特徴とする方法に関する。
識等を使用せず、Ｂ／Ｆ分離を必要としないホモジニア
スな方法であって、抗原抗体反応による抗体そのものの
物理量の変化に着目した抗原測定方法を提供することを
目的とする。 【解決手段】 本発明は、抗原を免疫学的に測定する方
法であって、該抗原に特異的に反応する抗体が該抗原と
反応して抗原抗体複合体を形成することにより起こる前
記抗体の表面電荷の変化により前記抗原を測定すること
を特徴とする方法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗原の免疫学的測
定方法に関するものである。
定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来から知られている免疫学的分析方法
としては、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＩＡ
（エンザイムイムノアッセイ）、ＦＩＡ（フルオロイム
ノアッセイ）等がある。これらの方法はそれぞれアイソ
トープ、酵素、蛍光物質等を標識として付加した抗原ま
たは抗体を用い、これらと特異的に反応する抗体または
抗原の有無を検出する方法で、特開平０４−２３６３５
３等がある。これらの多くの場合、Ｂ／Ｆ分離（反応し
た標識抗体と未反応の標識抗体との分離）する必要があ
り、操作が複雑である。
としては、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＩＡ
（エンザイムイムノアッセイ）、ＦＩＡ（フルオロイム
ノアッセイ）等がある。これらの方法はそれぞれアイソ
トープ、酵素、蛍光物質等を標識として付加した抗原ま
たは抗体を用い、これらと特異的に反応する抗体または
抗原の有無を検出する方法で、特開平０４−２３６３５
３等がある。これらの多くの場合、Ｂ／Ｆ分離（反応し
た標識抗体と未反応の標識抗体との分離）する必要があ
り、操作が複雑である。
【０００３】また、検出システムの簡便さに注目する
と、ラテックス凝集法のように、ラテックスに抗体を吸
着させ、凝集により抗原を測定する方法で非特異的凝集
を低減させた特許として特開平０４−２３２２４６６や
特開平０５−６０７５７等がある。
と、ラテックス凝集法のように、ラテックスに抗体を吸
着させ、凝集により抗原を測定する方法で非特異的凝集
を低減させた特許として特開平０４−２３２２４６６や
特開平０５−６０７５７等がある。
【０００４】上記に挙げた方法はすべて、抗体に標識物
質を化学的に反応させて標識したり、担体に抗体を化学
吸着または物理吸着させることで抗体を固定しており抗
体自信の性能を阻害することがある。また、特にラジオ
アイソトープのように高価であるとともに安全性に問題
があるものもある。従って、上記のような標識を行わず
に抗原の測定を可能とする方法が好都合である。
質を化学的に反応させて標識したり、担体に抗体を化学
吸着または物理吸着させることで抗体を固定しており抗
体自信の性能を阻害することがある。また、特にラジオ
アイソトープのように高価であるとともに安全性に問題
があるものもある。従って、上記のような標識を行わず
に抗原の測定を可能とする方法が好都合である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記のよう
な状況を解決するため、検出システムの簡便さを備え、
Ｂ／Ｆ分離を必要としないホモジニアスな方法であっ
て、標識等を使用せず、抗原抗体反応による抗体そのも
のの物理量の変化に着目した抗原測定方法を提供する。
な状況を解決するため、検出システムの簡便さを備え、
Ｂ／Ｆ分離を必要としないホモジニアスな方法であっ
て、標識等を使用せず、抗原抗体反応による抗体そのも
のの物理量の変化に着目した抗原測定方法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】標識していない抗体が抗
原と反応したことにより生ずる抗体から得られる物理量
の情報として表面電荷の変化がある。現在一般的に広く
用いられている方法の中で、タンパク質の表面電荷の情
報が得られる方法は等電点電気泳動である。本発明者ら
の実験では、コルチゾール抗体と抗原（コルチゾール）
を反応させ、等電点電気泳動で分析すると、抗体のみの
等電点はｐＩ＝５．１であり、反応させたものはｐＩ＝
５．１の他、５．０の位置にもバンドが現れ、抗体と、
抗原抗体の複合体の等電点に差異があることが分かっ
た。本発明者らは鋭利検討の結果、かかる表面電荷の差
異に基づき、電気泳動を利用して抗原の免疫学的定量が
可能であることを見出した。このような電気泳動を利用
する抗原の免疫学的定量方法は本発明により初めてなさ
れた方法である。
原と反応したことにより生ずる抗体から得られる物理量
の情報として表面電荷の変化がある。現在一般的に広く
用いられている方法の中で、タンパク質の表面電荷の情
報が得られる方法は等電点電気泳動である。本発明者ら
の実験では、コルチゾール抗体と抗原（コルチゾール）
を反応させ、等電点電気泳動で分析すると、抗体のみの
等電点はｐＩ＝５．１であり、反応させたものはｐＩ＝
５．１の他、５．０の位置にもバンドが現れ、抗体と、
抗原抗体の複合体の等電点に差異があることが分かっ
た。本発明者らは鋭利検討の結果、かかる表面電荷の差
異に基づき、電気泳動を利用して抗原の免疫学的定量が
可能であることを見出した。このような電気泳動を利用
する抗原の免疫学的定量方法は本発明により初めてなさ
れた方法である。
【０００７】本発明は、抗原を免疫学的に測定する方法
であって、該抗原に特異的に反応する抗体が該抗原と反
応することにより起こる表面電荷の変化により前記抗原
を測定することを特徴とする方法を提供する。
であって、該抗原に特異的に反応する抗体が該抗原と反
応することにより起こる表面電荷の変化により前記抗原
を測定することを特徴とする方法を提供する。
【０００８】より詳しくは、本発明の免疫学的測定方法
は、抗体と抗原とをセルに収容し、それらを電気泳動さ
せることにより、抗原に反応した抗体と未反応の抗体
を、それぞれの表面電荷に基づく移動度の差異で区別
し、散乱光を介してそれらを検出することを特徴とする
方法に関する。
は、抗体と抗原とをセルに収容し、それらを電気泳動さ
せることにより、抗原に反応した抗体と未反応の抗体
を、それぞれの表面電荷に基づく移動度の差異で区別
し、散乱光を介してそれらを検出することを特徴とする
方法に関する。
【０００９】本発明の免疫学的方法は、抗原抗体反応の
前後において、抗体自体の物理量の変化を光学的方法に
よって測定するものであり、これによれば抗体を標識す
る必要もない。また、フローセルを用いることよって抗
原の連続測定が可能である。
前後において、抗体自体の物理量の変化を光学的方法に
よって測定するものであり、これによれば抗体を標識す
る必要もない。また、フローセルを用いることよって抗
原の連続測定が可能である。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の構成を第１図にて説明す
る。本発明の測定方法は、ドプラー効果を利用した光学
系を用いて粒子の電気泳動における移動度を測定したも
のである。抗原と抗体とを反応させた混合物の溶液をセ
ル１に入れて、電気泳動手段５によりこのセル１に電圧
を適用してこの混合物を電気泳動させる。本実施例で
は、セルに当たる照射光の位置は固定し、直線上に並ん
だ５ヶ所で移動度を測定したが、照射光の位置は必ずし
も固定されている必要はなく、移動しても同様の結果が
得られる。また、同時に光源２からの光を、この混合物
の泳動方向と垂直にセル１に照射して、その時の散乱光
と光源２からミラー４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄによって導
かれた参照光とを混合する。かかる光源としてはＨｅ−
Ｎｅレーザー光源が考えられるが、散乱光が検出される
ものであれば他の光源でも構わない。複合体または抗体
からの散乱光は周波数がシフトするので、このシフト分
を受光器３で検出し、シフト量を測定する。シフト量は
複合体等の移動速度に比例するので、この移動速度を電
場で除した移動度は、複合体等が十分に小さいときは式
（１）に従って表面電荷の状態に伴い変化する。
る。本発明の測定方法は、ドプラー効果を利用した光学
系を用いて粒子の電気泳動における移動度を測定したも
のである。抗原と抗体とを反応させた混合物の溶液をセ
ル１に入れて、電気泳動手段５によりこのセル１に電圧
を適用してこの混合物を電気泳動させる。本実施例で
は、セルに当たる照射光の位置は固定し、直線上に並ん
だ５ヶ所で移動度を測定したが、照射光の位置は必ずし
も固定されている必要はなく、移動しても同様の結果が
得られる。また、同時に光源２からの光を、この混合物
の泳動方向と垂直にセル１に照射して、その時の散乱光
と光源２からミラー４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄによって導
かれた参照光とを混合する。かかる光源としてはＨｅ−
Ｎｅレーザー光源が考えられるが、散乱光が検出される
ものであれば他の光源でも構わない。複合体または抗体
からの散乱光は周波数がシフトするので、このシフト分
を受光器３で検出し、シフト量を測定する。シフト量は
複合体等の移動速度に比例するので、この移動速度を電
場で除した移動度は、複合体等が十分に小さいときは式
（１）に従って表面電荷の状態に伴い変化する。
【００１１】 Ｕ＝Ｖ／Ｅ＝εζ／（６πη） （１） Ｕ：移動度 Ｖ：移動速度 Ｅ：電場 ε：媒体の誘電率 ζ：表面電位 η：媒体の粘性率
【００１２】このようにして、抗原抗体混合物について
の移動度に関するスペクトルを得ることができる。かか
るスペクトルには、抗原抗体複合体のピークと、未反応
抗体のピークとが存在するであろうが、予め抗体のみを
含む溶液を上記の操作にかけて得たスペクトルと対比さ
せることで、抗体及び抗原抗体複合体のピークは区別す
ることができる。この抗原抗体複合体のピークの面積ま
たは高さは、この混合物中に存在している抗原の量に相
関するであろう。即ち、抗原の量が多い程、かかるピー
クの面積または高さは大きくなるものであろう。従っ
て、抗原の定量は、かかる抗原抗体複合体のピークの面
積または高さを測定し、上記と同様の操作において既知
量の抗体を利用して作成した検量線から換算して行うこ
とができる。
の移動度に関するスペクトルを得ることができる。かか
るスペクトルには、抗原抗体複合体のピークと、未反応
抗体のピークとが存在するであろうが、予め抗体のみを
含む溶液を上記の操作にかけて得たスペクトルと対比さ
せることで、抗体及び抗原抗体複合体のピークは区別す
ることができる。この抗原抗体複合体のピークの面積ま
たは高さは、この混合物中に存在している抗原の量に相
関するであろう。即ち、抗原の量が多い程、かかるピー
クの面積または高さは大きくなるものであろう。従っ
て、抗原の定量は、かかる抗原抗体複合体のピークの面
積または高さを測定し、上記と同様の操作において既知
量の抗体を利用して作成した検量線から換算して行うこ
とができる。
【００１３】上記の抗原抗体複合物を含む混合物の溶液
は、抗体及び抗原をそれぞれ含むバッファーを一定のｐ
Ｈのバッファーに交換し、各々をポアサイズ０．１μｍ
のフィルターで濾過し、次いでそれらを混合して２５〜
３７℃で５〜１０分反応させるとで調製することができ
る。この時に用いるバッファーは、抗体及び抗原抗体複
合体の等電点付近のｐＨでないことが好ましい。本発明
者らの実験でコルチゾール抗体を用いた場合、ｐＨ＝
７．２のリン酸バッファーが好適であった。抗体の濃度
は、抗体の量が測定すべき抗原の量より過剰となるよう
に調整するのが好ましい。好ましくは、抗体の濃度は
１．５〜２．５ｍｇ／ｍｌとする。
は、抗体及び抗原をそれぞれ含むバッファーを一定のｐ
Ｈのバッファーに交換し、各々をポアサイズ０．１μｍ
のフィルターで濾過し、次いでそれらを混合して２５〜
３７℃で５〜１０分反応させるとで調製することができ
る。この時に用いるバッファーは、抗体及び抗原抗体複
合体の等電点付近のｐＨでないことが好ましい。本発明
者らの実験でコルチゾール抗体を用いた場合、ｐＨ＝
７．２のリン酸バッファーが好適であった。抗体の濃度
は、抗体の量が測定すべき抗原の量より過剰となるよう
に調整するのが好ましい。好ましくは、抗体の濃度は
１．５〜２．５ｍｇ／ｍｌとする。
【００１４】上記のセルは石英フローセルであることが
好ましいが、照射せしめた光を透過するものであれば他
のものでも構わない。本発明者らの実験では、行路長１
７ｍｍの石英セルを使用した。
好ましいが、照射せしめた光を透過するものであれば他
のものでも構わない。本発明者らの実験では、行路長１
７ｍｍの石英セルを使用した。
【００１５】前方散乱光の測定角度は、抗体の大きさが
数ナノメーターであることから、小さくすることが好ま
しい。本発明者らの実験では、５゜の測定角度を使用し
た。
数ナノメーターであることから、小さくすることが好ま
しい。本発明者らの実験では、５゜の測定角度を使用し
た。
【００１６】本願発明は以下の実施例において抗原とし
てコルチゾールを挙げて説明するが、コルチゾールに限
らず、あらゆる抗原の測定が本発明により可能である。
それには、例えばカルシトニン等が挙げられる。
てコルチゾールを挙げて説明するが、コルチゾールに限
らず、あらゆる抗原の測定が本発明により可能である。
それには、例えばカルシトニン等が挙げられる。
【００１７】本願発明はセルの容積を変更することがで
きるので、容積を小さくすればごく少量の抗体で抗原を
分析することも可能である。測定すべき抗原を含む試料
としては尿や唾液が考えられる。本発明を下記の実施例
により説明する。
きるので、容積を小さくすればごく少量の抗体で抗原を
分析することも可能である。測定すべき抗原を含む試料
としては尿や唾液が考えられる。本発明を下記の実施例
により説明する。
【００１８】
１．抗体の移動度のピークの同定 コルチゾールに特異的な抗体（ＣＹＭＢＵＳ ＢＩＯＳ
ＣＩＥＮＣＥ ＬＩＭＩＴＥＤ製の９３０１〔プロダク
トＮｏ．ＣＤＬ７２〕）の溶けているバッファーを、ｐ
Ｈ＝７．２のリン酸バッファーに交換し、ポアサイズ
０．１μｍのフィルター（製品名；ザルトリウス）で濾
過した後、図３にその構造を示す行路長１７ｍｍのフロ
ーセルに収容する。次に、かかる抗体を電気泳動手段を
利用して電気泳動させ、光源由来の光を照射し、抗体の
散乱強度に基づく移動度を受光器により測定し、この抗
体の移動度のピークの同定を行う。本実施例において、
５゜の前方散乱光の測定角度、１．５〜２．０ｍｇ／ｍ
ｌの抗体濃度の測定条件により、適度な散乱強度が得ら
れた。
ＣＩＥＮＣＥ ＬＩＭＩＴＥＤ製の９３０１〔プロダク
トＮｏ．ＣＤＬ７２〕）の溶けているバッファーを、ｐ
Ｈ＝７．２のリン酸バッファーに交換し、ポアサイズ
０．１μｍのフィルター（製品名；ザルトリウス）で濾
過した後、図３にその構造を示す行路長１７ｍｍのフロ
ーセルに収容する。次に、かかる抗体を電気泳動手段を
利用して電気泳動させ、光源由来の光を照射し、抗体の
散乱強度に基づく移動度を受光器により測定し、この抗
体の移動度のピークの同定を行う。本実施例において、
５゜の前方散乱光の測定角度、１．５〜２．０ｍｇ／ｍ
ｌの抗体濃度の測定条件により、適度な散乱強度が得ら
れた。
【００１９】タンパク質、ミセル等は、化学組成とバッ
ファー条件が一定であれば、移動度は一定であるので、
上記操作を抗原抗体反応させた複合体についても行い、
抗体と抗原抗体複合体との移動度の比較することができ
る。
ファー条件が一定であれば、移動度は一定であるので、
上記操作を抗原抗体反応させた複合体についても行い、
抗体と抗原抗体複合体との移動度の比較することができ
る。
【００２０】２．抗原抗体複合体の移動度のピークの同
定 コルチゾールと上記の抗体とを上記と同じリン酸バッフ
ァーに溶解し、各々をポアサイズ０．１μｍのフィルタ
ーで濾過した後、３７℃、１０分間反応させてから上記
のフローセルに収容し、上記と同様に散乱光の移動度を
測定し、抗原抗体複合体のピークの同定を行う。この
時、この溶液の中には、抗原と反応した抗体（複合体）
と未反応の抗体が混合しているが、未反応の抗体をセル
外に分離する必要なく、１．で求めた抗体のピークとの
比較により抗原抗体複合体のピークの同定を行うことが
できる。
定 コルチゾールと上記の抗体とを上記と同じリン酸バッフ
ァーに溶解し、各々をポアサイズ０．１μｍのフィルタ
ーで濾過した後、３７℃、１０分間反応させてから上記
のフローセルに収容し、上記と同様に散乱光の移動度を
測定し、抗原抗体複合体のピークの同定を行う。この
時、この溶液の中には、抗原と反応した抗体（複合体）
と未反応の抗体が混合しているが、未反応の抗体をセル
外に分離する必要なく、１．で求めた抗体のピークとの
比較により抗原抗体複合体のピークの同定を行うことが
できる。
【００２１】以上の結果を図２に示す。スペクトル１１
は、コルチゾール抗体の移動度を測定したものである。
スペクトル１２はコルチゾール抗体とコルチゾールとを
反応させた混合液の移動度を測定したものである。スペ
クトル１２のうち、ピーク１３はスペクトル１１のピー
クと同じで抗体に由来し、ピーク１４は抗原抗体複合体
のピークで、これは抗原と抗体と反応により抗体の表面
電荷が変化し、そのために反応複合体と未反応抗体で移
動度が異なったためと考えられる。表面電荷の変化は上
記で説明したように等電点電気泳動により確認されてい
る。即ち、移動度を測定することにより、従来技術の如
く抗原と未反応の抗体を系外に分離することなく、抗体
と抗原抗体複合体を別々に検出することができ、そのと
きのスペクトルの面積またはピーク高から、既知量の抗
原を利用して２の操作を行って得られた検量線から換算
して、抗原を定量することができる。
は、コルチゾール抗体の移動度を測定したものである。
スペクトル１２はコルチゾール抗体とコルチゾールとを
反応させた混合液の移動度を測定したものである。スペ
クトル１２のうち、ピーク１３はスペクトル１１のピー
クと同じで抗体に由来し、ピーク１４は抗原抗体複合体
のピークで、これは抗原と抗体と反応により抗体の表面
電荷が変化し、そのために反応複合体と未反応抗体で移
動度が異なったためと考えられる。表面電荷の変化は上
記で説明したように等電点電気泳動により確認されてい
る。即ち、移動度を測定することにより、従来技術の如
く抗原と未反応の抗体を系外に分離することなく、抗体
と抗原抗体複合体を別々に検出することができ、そのと
きのスペクトルの面積またはピーク高から、既知量の抗
原を利用して２の操作を行って得られた検量線から換算
して、抗原を定量することができる。
【００２２】
【発明の効果】以上述べたように、本発明では抗体を標
識する必要がないため、抗体の性能を低下させることな
く精度よく抗原を測定できる。また、抗原と反応した抗
体と、未反応の分離（Ｂ／Ｆ分離）をする必要がなく、
フロー式で連続して操作が可能なため、分析時間、手間
が大幅に短縮できる。
識する必要がないため、抗体の性能を低下させることな
く精度よく抗原を測定できる。また、抗原と反応した抗
体と、未反応の分離（Ｂ／Ｆ分離）をする必要がなく、
フロー式で連続して操作が可能なため、分析時間、手間
が大幅に短縮できる。
【図１】本発明の光学系の概略図である。
【図２】移動度と信号強度の関係を示したスペクトル図
である。
である。
【図３】本発明において用いたセルの斜視図である。
１…セル ２…特定波長を有する光源 ３…受光器 ４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ…ミラー ５…電気泳動手段 １１…抗体のみのスペクトル図 １２…抗原抗体反応物のスペクトル図 １３…抗体を示すピーク １４…抗原抗体複合体を示すピーク
Claims (7)
- 【請求項１】 抗原を免疫学的に測定する方法であっ
て、該抗原に特異的に反応する抗体が該抗原と反応して
抗原抗体複合体を形成することにより起こる前記抗体の
表面電荷の変化により前記抗原を測定することを特徴と
する方法。 - 【請求項２】 前記表面電荷の変化の情報を、前記抗原
抗体複合体を電気泳動させることにより得る、請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 前記表面電荷の変化の情報を、前記抗原
抗体複合体の電気泳動の際に光学的に得ることを特徴と
する、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 前記表面電荷の変化の情報を、前記抗原
抗体複合体の電気泳動の際に光源由来の光をそれに導
き、その散乱光を検出することにより得ることを特徴と
する、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 前記電気泳動をセル内で行い、そのセル
に前記光を照射することを特徴とする、請求項４記載の
方法。 - 【請求項６】 前記セルが、フローセルである請求項５
記載の方法。 - 【請求項７】 前記抗原がコルチゾールである、請求項
１〜６のいずれか１項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7203422A JPH0949839A (ja) | 1995-08-09 | 1995-08-09 | 免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7203422A JPH0949839A (ja) | 1995-08-09 | 1995-08-09 | 免疫学的測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0949839A true JPH0949839A (ja) | 1997-02-18 |
Family
ID=16473823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7203422A Pending JPH0949839A (ja) | 1995-08-09 | 1995-08-09 | 免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0949839A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012026729A (ja) * | 2010-07-20 | 2012-02-09 | Hitachi High-Technologies Corp | 生体試料の分析方法 |
| JP2014145680A (ja) * | 2013-01-29 | 2014-08-14 | Terumo Corp | 標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを分離する方法 |
-
1995
- 1995-08-09 JP JP7203422A patent/JPH0949839A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012026729A (ja) * | 2010-07-20 | 2012-02-09 | Hitachi High-Technologies Corp | 生体試料の分析方法 |
| JP2014145680A (ja) * | 2013-01-29 | 2014-08-14 | Terumo Corp | 標的物質−レセプター複合体と遊離レセプターとを分離する方法 |
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