DE2458671C3

DE2458671C3 - Verfahren zur Bestimmung von Steroiden durch Sättigungsanalyse

Info

Publication number: DE2458671C3
Application number: DE19742458671
Authority: DE
Inventors: Rüssel James; Chambers Virginia Edith May; Monks Reginald; Amersham Buckinghamshire Bayly (Großbritannien)
Original assignee: Radiochemical Centre Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1973-12-11
Filing date: 1974-12-11
Publication date: 1977-04-28

Description

25

Bei der Durchführung der Sättigungsanalyse mit Hilfe von radioaktiv markierten Verbindungen ist ein wesentlicher Bestandteil eine markierte Form der zu bestimmenden Substanz, die um die bindenden Stellen in quantitativ definierbarer Weise mit der nicht markierten Substanz in Konkurrenz tritt und die nach einem entsprechenden Abtrennverfahren durch Messung der Radioaktivität leicht bestimmt werden kann. Dabei werden bisher üblicherweise mit Tritium, Kohlenstoff-14 oder radioaktivem Jod markierte Substanzen angewandt. Tritium und Kohlenstoff-14 emittieren jS-Strahlen, deren Bestimmung wesentlich schwieriger und aufwendiger ist als diejenige von y-Strahlen. Die Einführung von radioaktivem Jod in Steroide wird üblicherweise durchgeführt, indem man das Jod in einen aromatischen Ring einbaut, der über ein Verbindungsglied mit dem Steroidmolekül verbunden wird. Das führt häufig zu einer Störung des Steroidmoleküls. Außerdem ist die Halbwertszeit von radioaktivem Jod, die für J-131 nur acht Tage und für J-125 60 Tage beträgt, häufig unerwünscht kurz. Ferner emittiert J-125 eine weiche y-Strahlung und Röntgenstrahlen, die so stark absorbiert werden, daß eine genaue Zählung erschwert wird.

In der DT-OS 23 64 741 werden bestimmte Selen-75-Derivate von Steroiden vorgeschlagen. Diese Verbindüngen werden erhalten durch Umsetzung von Selen-75-dioxid oder seleniger Säure-Se-75 mit einem 3-Keto-, 6-Keto-, 7-Keto- oder 17-Keto-Steroid und gegebenenfalls anschließendes Aufspalten und Alkylieren der entstehenden Diseleniddimeren.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung von Steroiden durch Sättigungsanalyse zu entwickeln, bei dem die markierte Form der zu bestimmenden Substanz mit einem radioaktiven Nuclid markiert ist, das y-Strahlung einer geeigneten Energie aussendet, eine für die praktische Anwendung günstige Halbwertszeit besitzt, mit angemessen hoher spezifischer Radioaktivität wirtschaftlich verfügbar ist, leicht in die Verbindungen eingebaut werden kann und zu einer möglichst geringen Störung des Moleküls führt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemulj gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung von Steroiden durch Sättigungsanalyse, wobei man die zu bestimmende Verbindung und eine radioaktivmarkierte Form dieser Verbindung um ein spezifisches Reagens für die Bindung, das in einer Menge vorhanden ist, die nichi ausreicht, um mit der gesamten Verbindung und der markierten Form davon eine Bindung einzugehen, ir Konkurrenz treten läßt, die gebundene Verbindung von der nichtgebundenen abtrennt und die radioaktive Konzentration in der gebundenen und/oder nichtgebundenen Verbindung mißt, das dadurch gekennzeichnet ist ά&ώ man als radioaktiv-markierte Form der Steroid-Verbinilung eine mit Selen-75 markierte Verbindung verwendet.

Das Se-75 besitzt eine längere Halbwertszeit (120 Tage) und eine energiereichere Strahlung als J-125, wodurch die Zählung erleichtert wird. Es kann leicht hergestellt werden durch Neutronenbestrahlung von angereichertem Se-74 mit spezifischen Radioaktivitäten, die für viele Zwecke geeignet sind. Wenn höhere spezifische Aktivitäten erforderlich sind, ergibt der Beschüß von AS-75 mit Protonen in einem Zyklotron im wesentlichen trägerfreies Se-75. Selen kann im Gegensatz zu Jod direkt in das Steroidskelett eingeführt werden, z. B. über Methylselengruppen. Die sterische Konfiguration des markierten Moleküls wird so in einem geringeren Ausmaß verändert, was eine bessere Bindungsaktivität des Antikörpers gegenüber dem mit Se-75 markierten Liganden ermöglicht. Die verschiedenen chemischen Methoden, die zur Selenierung mit Se-75 angewandt werden können, ermöglichen eine größere Variationsmöglichkeit bei der Markierung. Das angewandte Verfahren kann so gewählt werden, daß man Verbindungen erhält, die stabil sind und die bei der Sättigungsanalyse wirksam um die bindenden Stellen in Konkurrenz treten.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich besonders einfach durchführen, wenn die einzelnen, für die Bestimmung benötigten Substanzen in Form einer Analyseneinheit zur Verfügung gestellt werden. Eine derartige Analyseneinheit enthält dabei die folgenden Bestandteile:

a) eine mit Selen-75 markierte Form des zu bestimmenden Steroids,

b) ein spezifisches Reagens, das sich mit dem zu bestimmenden Steroid verbindet,

c) vorzugsweise eine Menge des zu bestimmenden Steroids zur Herstellung von Standardproben,

d) vorzugsweise Mittel zur Abtrennung des gebundenen von dem nicht gebundenen Steroid und

e) vorzugsweise einige Reagenzgläser zur Durchführung der Anaylse.

Dabei ist es besonders günstig, wenn die markierte Form der zu bestimmenden Substanz und das sepzifische Reagens dafür bereits in gefriergetrockneter Form in den einzelnen Reagenzgläsern enthalten sind.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Bestimmung von Cortisol mit Hilfe von Se-75

markiertem Bis-2,2'-(21-acetpxy-1-dehydrocortisol)-

diseienid

In jedes Reagenzglas wurden 5,5 ml Glycinpuffer, enthaltend 1% Natriumazid (pH 9,0), 50 μΐ mit Aktivkohle behandeltes Kaninchenserum, 2,3 ng Bis-2,2'-(21-acetoxy-l-dehydrocortisol)-deselenid-Se 75 (spezifische Aktivität ca. 6 Ci/mAtom) und 1 g Sephadex

G25 gegeben. Standardlösungen von Cortisol enthaltend C, 2,4, 8,16, 32 und 64 ng/100 ml in Puffer wurden frisch hergestellt und gleiche Teile (100 μΐ) jeder lösung • die einzelnen oben angegebenen Reagenzgläser

gegeben. Die Reagenzgläser wurden mit Kappen versehen und bei Raumtemperatur 1 h mit Hilfe eines Blutzellensuspensionsmischers rotiert. Nach dieser Zeit wurde ein Anteil (1 ml) der überstehenden Flüssigkeit aus jedem Reagenzglas entnommen und 300 s mit Hilfe eines NE8311y-Zählers gezählt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse.

Zählup.genl —
Hintergrund in 300 s

Cortisol-Konzentration
Standard μg/100 ml

34672	0
33573	0
31116	2
32296	2
31129	4
31389	4
29987	8
30954	8
29141	16
2S356	16
26842	32
25739	32
23746	64
25895	64

Beispiel 2

Verfahren zur Bestimmung von Cortisol
Anwendung von ß-Mercaptoäthanol in situ

(Bis^'-^l-acetoxy-l-dehydrocortisoO-diselcnid-Se75(100 ng) in Äthanol (10 μΐ) wurden unter Rühren zu einer Lösung von j3-Mercaptoäthanol (20 μΐ) in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7,4; 1 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur stehengelassen und dann zu einer Lösung von 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7,4; 480 ml), enthaltend Natriumazid (1%) und mit Aktivkohle behandeltes Kaninchenserum (2 ml) gegeben. Nach gründlichem Mischen wurde diese Lösung in Mengen von je 6 ml in Reagenzgläser gegeben, enthaltend jeweils 1 g Sephadex G25. Die Reagenzgläser wurden mit Kappen versehen und bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis sie benötigt wurden, um die oben angegebene Bestimmung durchzuführen.

Cortisol Standard

μg/100ml

Zählungen 100 s (korrigiert für den

Hintergrund)

Lagerzeit (Tage)

1 28

12814
13 112
13012
12 754
12 709
11 825
11980
10 988
10 876
9 636

13 007
12 356
11 884
11 486
U 624
10 467
10 930
10 078
10 365
9 967

Beispiel 3

Bestimmung von Cortisol mit Hilfe von
2-Methylseleno-l-dehydrocortisol-2!-acetat-Se75
5

In jedes Reagenzglas wurden 6 ml 0,05 m Phosphatpuffer, enthaltend 1% Natriumazid (ph 7,4), 50 μΐ mit Aktivkohle behandeltes Kaninchenserum, 2,5 ng2-Methylseleno-l-dehydrocortisol-21-acetat-Se 75 (spezifisehe Aktivität ca. 3Ci/mAiom) und 1 g Sephadex G25 gegeben.

Die Bestimmung wurde wie oben angegeben

durchgeführt. Die unten angegebenen Werte zeigen, daß eine Bestimmung mit einer steileren Dosis-Reaktions-Kurve mit Methylseleno-entsteht als mit ejerr.

Diseleno-Derivat.

Conisol Standard
μg/100 ml

Zählungen —
Hintergrund in 300 s

0	37447
0	37551
2	36495
2	36981
4	35381
4	34565
8	31090
8	32353
16	28011
16	28180
32	24135
32	7.4340
64	21601
64	21777
	Beispiel 4

CPB-Bestimmung von Cortisol mit Se75 markiertem
Bis-2,2'-(l-dehydrocorticosteron)-diselenid.

Mit Se75 markiertes Bis-2,2'-(l-dehydrocorticoste-4j ron)diselenid wurde durch basische Hydrolyse von Se75 markiertem Bis-2,2'-(21 -acetoxy-1 -dehydrocorticosteron)-diselenid hergestellt (DT-OS 23 64 741).

Mit Hilfe dieser radioaktiv markierten Substanz wurde eine Bestimmung von Cortisol, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Transcortin von Kaninchenserum wurde als Quelle für bindendes Protein und Sephadex 25 zur Trennung der proteinfreien von der gebundenen Substanz verwendet.

Typische Ergebnisse, die erhalten wurden bei Anwendung von Standardlösungen von nicht markiertem Cortisol zum Ersatz des markierten /d'-Corticostcron-diselenidssind:

Zählungen —
Hintergrund

Cortisol-Konzentration
Standard μg/l00 ml

24700
24100
22800
21800
21200
20700

Beispiel 5

RiiLÜoimmiinologische Bestimmung von Cortisol
Aniiserum gegen Conisol-J-O-e-irboxymclhvloxini-BSA wurde in Kaninchen erzeugt und Se75 iii.irkicrtes Cortisol (hergestellt entsprechend der DTOS 2Jb4 741) wurde als Kudioligand verwendet. Hs wurden Antiserum-Verdünnungskurven aufgestellt, um die optimale Verdünnung für diese Bestimmung festzustellen. Die Verdünnung von Aniiserum und 30 pg Se75 markiertes Cortisol wurde nut bekannten Mengen nicht markiertem Cortisol inkubiert. Die proteinfreie und gebundene Substanz wurden mit Hilfe von mit Dextran überzogener Aktivkohle getrennt und die Standardkurven aufgetragen. Werte für eine unbekannte Probe konnten dann auf übliche Weise aus den Siandardkurven berechnet werden.
Typische Werte für die Standardkurve sind:

Gew. Cortisol (pg)	% Se75 gebunden
0	50
400	42
1000	21
2000	12
3000	9

Antiserum-Verdünnung

°/o gebunden

1/10²
1/10³
1/1O⁴
1/10⁵
1/10⁶

85
80
45
18
13

Beispiel 7

Kupplung von Östriol-6-carboxymethyloxiin an
Selenomethionin-Se75

Isobutyl-clilorformiat (3,8 mg in 0,38 cm³ trockenem Dio>:2->) und Tributylamin (5,2 mg in 0,26 cm³ trockenem Dioxan) wurden unter wasserfreien Bedingungen zu östriol-6-carboxymethyloxim (10 mg im Vakuum getrocknet) zugegeben. Die Lösung wurde unter Rühren 25 min auf 12°C gehalten, um das gemischt Anhydrid zu bilden.

Eine Lösung von Selenomethionin-Se/5 (5,4 mg; 11,3 inCi; 400 mCi/niMol) in einer 0,1-m wäßrigen

35

Beispiel 6
Radioimmunologische Bestimmung von Testosteron

Antisera gegen Testosteron-3-carboxymethyloxim-BSA wurden in Kaninchen erzeugt.

Se75 markiertes 2-Methylseleno-l-dehydrotestosteron (spezifische Aktivität 15 - 20 Ci/mMol) wurde durch basenkatalysierte Hydrolyse von 2-Methylseleno-l-dehydrotestostcron-acetat, wie in der DT-OS 23 64 741 beschrieben, hergestellt.

Es wurden Antiserum Verdünnungskurven auf übliche Weise unter Verwendung von Antiserum und markiertem Testosteron wie oben beschrieben aufgestellt. Die erhaltenen Verdünnungskurven waren mit denjenigen identisch, die erhalten wurden, wenn mit Tritium markiertes Testosteron verwendet wurde.

Typische Werte für die Antiserum-Verdünnungskurven bei Verwendung von 25 pg markiertem Testosteron pro Reagenzglas sind

Natriumhydroxidlösung (0,9 cm³) wurde auf 5°C abgekühlt und dann zu der gemischten Anhydridlösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 4 h gerührt und dann auf Raumtemperatur gebracht Es wurde lyophilisiert und der Rückstand zwischen Äthylacetat und 0,1-m Salzsäure verteilt Die organische Schicht wurde abgetrennt und lyophilisiert Der Rückstand nach dem Lösen in 0,25cm³ Äthancl wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie (Merck Kieselgel 60 PF254 gereinigt. Eluiermittel: Chloroform, Äthanol 1 :1 gereinigt.

Die Platten wurden autoradiographisch untersucht und die Komponente mit einem Rf-Wert von ungefähr 0,6 entfernt und in Äthanol extrahiert, wobei man 360 μ Ci von Selenomethionin-Se75-Konjugat von östrio!-6-carboxymethyloxim, A_m„ 230 nm, 312 nm (Äthanol); ν maxi 660,1725 cm-' erhielt.

Bestimmung von östriol mit Hilfe von Selenomethionin-Se75-Konjugat von östriol-6-CMO

In jedes Reaganzglas wurde 0,1-m Phosphatpuffer, enthaltend 5% Humanserum (pH 7,0; 200 μΙ). Antiserum, das in Kaninchen gegen östriol-6-CMO-BSA gebildet und in 0,1 m Phosphatpuffer enthaltend 5% Humanserum 1 :200 verdünnt worden ist (200 μΐ) und Selenomethionin-Se75 Konjugat von ösiriol-6-CMO (4 ng; 400 mCi/mMol gegeben. Dann wurden Standardmengen von östriol (1,25 ng, 10 ng und 20 ng) in Humanserum zu jedem Reagenzglas gegeben und zu einem Reagenzglas Puffer anstelle von Antiserium als Blindprobe. Der Inhalt der Reagenzgläser wurde vermischt und bei Raumtemperatur 1 h inkubiert. Dann wurde Ammoniumsulfatlösung zugegeben (5,4 g (NH₄J₂SO₄-I-IO ml H_?0; 500 μΙ) und nach dem Mischen die Lösung zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und der Niederschlag in einem y-Zähler gezählt. Der prozentuale Anteil der Gesamtzählung für die an den Niederfchlag gebundene Substanz wurde berechnet.

ng östriol % der gesamten Zählungen

zugegeben minus Blindprobe

55

60

1,25
10
20

59,1
55,3
44,3
39,0

Beispiel 8 Herstellung von 2-(Methylseleno)äthylamin-Se75

Natrium (4,6 mg, 0,2 mAtom) wurde in ein Reaktionsgefäß gegeben, enthaltend rotes Selen-Se75 (14,4 mg, 0,183 mAtom, 3,3 Ci) in 25 ml flüssigem Ammoniak. Das Reaktionsgefäß war mit einer Vakuumleitung mit mehreren Anschlüssen verbunden und gegenüber der Atmosphäre über eine Carbasorb/Aktivkohle Falle offen. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr 10 min gerührt, bis eine braune Lösung von Dinatriumdiselenid erhalten wurde. Dann wurde Methyljodid (32,6 mg, 0,23 mMol) unter Rühren zu der Lösung zugegeben, wobei man eine farblose Lösung von Dimethyldiselenid erhielt. Nach ungefähr 3 min wurde eine weitere Menge Natrium (5,6 mg) in das Reaktionsgefäß gegeben, bis eine permanente blauschwarze Farbe auftrat, die die vollständige Spaltung der Diselenidbindung unter Bildung von Natriummethylselenid anzeigte. 2-Bromä'thylaminhydrobromid (41,5 mg, 0,2 mMol) wurde zu

dem Reaktionsgemisch gegeben, das dann gerührt wurde, bis der gesamte Ammoniak verdampft war. Der Rückstand wurde im Vakuum getrocknet, in Äthanol gelöst und durch präparative Dünnschichtchromatographie (Avicel FI mm Cellulose, Eluiermittel: Butanol Wasser, Essigsäure 15:25:60) gereinigt. Die Platten wurden autoradiographisch untersucht und die Hauptkomponente entsprechend der schnellstlaufenden Komponente auf einer analytischen Platte mit einem R_f-Wert von 0,81 entfernt und in Äthanol extrahiert. Man erhielt 1,02 Ci von 2-(Methylseleno)-äthylamin-Se75.

Kupplung von Östriol-6-CMO an 2-(Methylseleno)-äthylamin Se-75 Isobutylchlorformiat (3,8 mg in 0,38 cm³ trockenem Dioxan) und Tributylamin (5,2 mg in 0,26 cm³ trockenem Dioxan) wurden unter wasserfreien Bedingungen zu Östriol-6-carboxymethyloxim (10 mg im Vakuum getrocknet) zugegeben. Die Lösung wurde 25 min bei einer Temperatur von 12°C gerührt, um das gemischte Anhydrid herzustellen. Eine wäßrige Lösung (2 cm³) von 2-(Methylseleno)-äthylamin-Se75 (5OmCi spezifische Aktivität 18 mCi/mMol) wurde auf 10⁰C gekühlt und dann zu der gemischten Anhydridlösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wurde dann lyophilisiert und der Rückstand nach dem Lösen in Äthanol (0,25 cm³) gereinigt durch präparative Dünnschichtchromatographie (Merck Kieselgel 60 PF ₂₅₄, Eluiermittel: Ch'oroform, Äthanol 1 :1). Die Platten wurden autoradiographisch untersucht und die Komponente mit einem R_f-Wert von ungefähr 0,97 entfernt und in Äthanol extrahiert. Man erhielt 9 mCi von 2-(Methylseleno)-äthylamin-Se75-Konjugat von

östriol-6-carboxymethyloxim λ max 230, 263 mm (Äthanol).

Beispiel 9

Herstellung von 3-Methylselenodigoxigenin-Se75

Bestimmung von östriol unter Verwendung von

2-(Methylseleno)-äthylamin-Se75-Konjugat

von Östriol-6-CMO

In jedes Reagenzglas wurden 0,1 m Phosphatpuffer, enthaltend 5% Humanserum (pH 7,0, 200 μΐ), Antiserum, das in Kaninchen gebildet worden war gegen östriol-6-CMO-BSA und verdünnt 1 :200 in 0,1 m Phosphatpuffer, enthaltend 5% Humanserum, (200 μΠ und 2-(Methylseleno)-äthylamin-Se75-Konjugat von Östriol-6-CMO (300 pg, 16Ci/mMol) gegeben. Standardmengen von östriol (1,5; 3,1; 12,5 und 25 ng) in Humansenim wurden in jedes Reagenzglas gegeben und in ein Reagenzglas Puffer anstelle von Antiserum als Blindprobe. Der Inhalt der Reagenzgläser wurde vermischt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde Ammoniumsulfatlösung zugegeben (5,4 g (NH₄)JSO₄+10 ml H₂O; 500 μΐ) und nach dem Vermischen wurden die Lösungen zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und der Niederschlag im y-Zähler untersucht. Der Prozentsatz der Gesamtzählungen der an den Niederschlag gebundenen Verbindung wurden berechnet.

3-Tosyloxydigoxigenin-12-acetai (1 mg) und Kaliumselenocyanat-Se75 (10 mCi; spezifische Aktivität 16 Ci/ mMol) wurden in 1 ml Isopropylalkohol 1 h unter Stickstoffatmosphäre unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand zwischen Wasser und ίο Chloroform verteilt. Die Chloroformphase wurde abgetrennt und eingeengt. Das Produkt in der Chloroformlösung wurde gereinigt durch präparative Dünnschichtchromatographie (Merck Kieselgel 60 PF₂₅₄, Eluiermittel: Benzol, Äthylacetat 1 :1). Die Platten wurden autoradiographisch untersucht und die Komponente mit einem Rf-Wert von ungefähr 0,42 entfernt und in Äthanol extrahiert. Man erhielt 2,1 mCi von 3-Selenocyanatodigoxigenin-12-acetat-Se75. Es wurde sorgfältig darauf geachtet, eine Verunreinigung des radioaktiven Produktes mit einer nahe dabei laufenden inaktiven Komponenten mit einem Rf-Wert von ungefähr 0,39 (UV absorbierend) zu vermeiden. Das 3-Selenocyanatodigoxigenin-12-acetat-Se75 lieft als einzelne Komponente auf Merck Kieselgel F₂₅₄ (Benzol Athyl-acetat 1:1, R, 0,6; Äther, Chloroform 2:1, r[ 0,43). Eine inaktive Probe von 3-Selenocyanatodigoxigenin-12-acetat, die wie oben hergestellt worden war, gab ein IR-Spektrum (Chloroformlösung) ähnlich demjenigen von Dioxigenin-12-acetat mit Ausnahme der zusätzlichen Absorption bei 2145 cm-', die für die Selenocyanatgruppe charakteristisch ist.

S-Selenocyanatodigoxigenin-12-acetat-Se75 (2 mCi; spezifische Aktivität 16 Ci/mMol) und Kaliumcarbonat (10 mg) wurden über Nacht in 50%iger wäßriger Methanollösung gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft Zu dem Rückstand wurden 2 cm³ Äthanol, 1 mg Dithiothreitol und 0,15 cm³ Dimethylsulfat gegeben und das Gemisch 2 h unter Rückfluß erhitzt. Das Volumen der Lösung wurde dann im Vakuum eingeengt und das Produkt zwischen Äthylacetat und Wasser aufgeteilt. Die Äthylacetatschicht wurde entfernt und eingeengt und das Produkt durch präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt (Merck Kieselgel 60 PF₂₅₄, Eluiermittel: Äther, Chloroform 2 :1).

Die Platte wurde autoradiographisch untersucht und die Komponente mit einem Rf-Wert von ungefähr 0,25 entfernt und in Äthanol extrahiert Man erhielt 130 μθ von3-Methylselenodigoxigenin-Se75. 50

ng östriol % der gesamten Zählungen

zugegeben minus Blindprobe

0
1,5
3,1
6,3

12,5

25

45,9
37,5
35,6
32,0
29,2
24,7

Verdünnungskurve von 3-Methylselenodigoxigenin

Eine Antiserum-Verdünnungskurve von 3-Methylselenodigoxigenin-Se75 (spezifische Aktivität 16 Ci/mMol) in

gepufferter Salzlösung (0,15-m NaCl, 0,05-m KH₂PO₄ 0,1% NaN₃ und 0.1% BSA) wurde in einer Konzentration von 0,0228 η Mol/ml hergestellt Es wurden Verdünnungen von Antiserum hergestellt, das gegen Digoxin gebildet worden war in dem Besümmungspuf-

fer in Konzentrationen von 1/50, 1/100 1/200 1/400 1/500, 1/800, 1/1000. Reagenzgläser wurden doppelt angesetzt für die Gesamtaktivität, Blindproben und die folgenden Antiserumverdünnungen. Gesamtaktivität μΐ 75 Se-Verbindung und 250 μΐ Bestimmungspuffer·

Blindprobe 50 μΐ 75 Se-Verbindung und 150 μΐ Bestimmungspuffer; Antiserumverdünnungen 50 μΐ 75 Se-Verbindung, 100μ1 Puffer und 50 μΐ Antiserum. Die Reagenzgläser wurden 30 min inkubiert und anschlie-

709 617/382

9 10

ßcnd 100 μΙ Aktivkohle (0,65 g Norit OL in 50 ml Stimmung. Nach 10 min langer Inkubation wu Bestimmungspuffer und 1 g BSA) in jedes Reagenzglas Reagenzgläser zentrifugiert und eine 200 μΙ P gegeben mit Ausnahme derjenigen für die Gesamtbe- überstehenden Flüssigkeit gezählt.

	Mittlere	/ählunf.'cn.
	Zählungen	"/(. der ge-
		s.innen ge
		bundenen
		Substanz
Gesamt	21 400	100
Blindprobe	688	3,2
'/so Verdünnung	20 750	97,0
Vioo Verdünnung	17 224	80,6
'/200 Verdünnung	9 489	44,3
Άοο Verdünnung	5 744	26,8
7500 Verdünnung	4 659	21,8
'/800 Verdünnung	3 277	15,3
'/kkvi Verdünnung	2 602	12,2

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Steroiden durch Sättigungsanalyse, wobei man die zu bestimmende Verbindung und eine radioaktiv-markierte Form dieser Verbindung um ein spezifisches Reagens für die Bindung, das in einer Menge vorhanden ist, die nicht ausreicht, um mit der gesamten Verbindung und der markierten Form davon eine Bindung einzugehen, in Konkurrenz treten läßt, die gebundene Verbindung von der nichtgebundenen abtrennt und die radioaktive Konzentration in der gebundenen und/oder nichtgebundenen Verbindung mißt, dadurch gekennzeichnet, daß man als radioaktiv-markierte Form der Steroid-Verbindung eine mit Selen-75 markierte Verbindung verwendet.

2. Reagenz zur Verwendung im Verfahren nach Anspruch 1, bestehend aus einer markierten Steroid-Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß die Steroid-Verbindung mit Selen-75 markiert ist.