JP2010066212A

JP2010066212A - 測定装置及び観察対象の測定方法

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Publication number: JP2010066212A
Application number: JP2008234888A
Authority: JP
Inventors: Takanori Ichiki; 隆範一木; Hirobumi Shiono; 博文塩野
Original assignee: Nikon Corp; University of Tokyo NUC
Current assignee: Nikon Corp; University of Tokyo NUC
Priority date: 2008-09-12
Filing date: 2008-09-12
Publication date: 2010-03-25

Abstract

【課題】細胞やタンパク質などの分子を測定する際に得られる画像の画質の劣化を防止する。
【解決手段】観察対象を区画する非晶質のフッ素樹脂から形成された区画壁を有し、区画壁で囲まれる領域内に溶液が注入される構造体と、構造体と溶液との境界面にて全反射させるように、構造体に向けて光を照射する光源と、光源からの光が全反射したときに生じるエバネッセント光により照明された観察対象又は溶液中の物質からの光を集光する光学系と、光学系と共に区画壁を含む撮像視野を形成し、区画壁で囲まれる領域内に存在する観察対象又は溶液中の物質の画像を取得する撮像装置と、を備えたことを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、タンパク質などの分子や細胞などの観察対象を測定する測定装置及び観察対象の測定方法に関する。

現在、細胞などの観察対象を測定する方法として、例えば共焦点光を用いた測定手法や、エバネッセント光を用いた測定手法などが挙げられる。周知のように、エバネッセント光は、例えば屈折率の異なる界面を有することにより、照射光における全反射条件が生じたときに発生するものである。このエバネッセント光は、物体に照射されることで散乱や回折、或いは物体により蛍光を発するなどの相互作用が生じ、伝播光（観察光）に変化する。このエバネッセント光を用いた測定手法の場合には、ピントのあった部分に存在する単分子からの蛍光といった微弱な光でも背景光に邪魔されることなく観察できるという利点を有している。
特開平１０−２２１３３９号公報

しかしながら、エバネッセント光による測定手法を用いて、複数のウェルを備えたウェルプレートや培養容器などに貯留される溶液を観察する場合、ウェルを形成するガラスの屈折率と溶液の屈折率との違いから上述した観察光を屈折させてしまうことから、例えばタンパク質や細胞などを観察対象として撮像したときに、得られる画像の画質が劣化してしまうなどの悪影響を及ぼすという問題がある。

本発明は、細胞やタンパク質などの分子を測定する際に得られる画像の画質の劣化を防止することができるようにした測定装置及び観察対象の測定方法を提供することを目的とする。

第１の発明の測定装置は、観察対象を区画する非晶質のフッ素樹脂から形成された区画壁を有し、前記区画壁で囲まれる領域内に溶液が注入される構造体と、前記構造体と前記溶液との境界面にて全反射させるように、前記構造体に向けて光を照射する光源と、前記光源からの光が全反射したときに生じるエバネッセント光により照明された前記観察対象又は前記溶液中の物質からの光を集光する光学系と、前記光学系と共に前記区画壁を含む撮像視野を形成し、前記区画壁で囲まれる領域内に存在する前記観察対象又は前記溶液中の物質の画像を取得する撮像装置と、を備えたことを特徴とする。

第２の発明は、第１の発明において、前記構造体は、前記区画壁と前記区画壁が接合されるプレートとから構成されることを特徴とする。

第３の発明の観察対象の測定方法は、観察対象を区画する区画壁が非晶質のフッ素樹脂から形成され、前記区画壁で囲まれる領域内に溶液が注入される構造体と該溶液との境界面にて全反射させるように、前記構造体に向けて光を照射する照射工程と、前記照射工程により照射された光が全反射したときに生じるエバネッセント光により照明された前記観察対象又は前記溶液中の物質からの光を光電変換することで、前記区画壁で囲まれる領域内に存在する前記観察対象又は前記溶液中の物質の画像を取得する撮像工程と、を備えたことを特徴とする。

本発明によれば、構造体に設けられる区画領域に貯留される溶液中の測定対象物を測定する際に、区画領域を構成する区画壁により、伝播光を屈折させることがないので、得られる画像の画質の劣化を防止することができる。

図１は、本発明の測定装置の一例を示す顕微鏡の構成を示す図である。なお、以下では測定装置として顕微鏡を例に取り上げて説明するが、測定装置としては、顕微鏡の他に、例えばマイクロプレートリーダーや、センサーディッシュリーダーなどの測定装置であってもよい。

顕微鏡１０は、光源１１、ステージ１２、ステージ駆動部１３、対物レンズ１４、シフト機構１５、リレーレンズ１６、撮像装置１７、コントローラ１８、表示部１９及び操作部２０などを備えている。

光源１１は、照射光として、例えばレーザ光を照射するレーザ光源が挙げられる。この光源としては、上述したレーザ光源の他に、ランプなどの光源を用いてもよい。光源としてランプを用いる場合には、照射光を集光する集光レンズを設置すればよい。

ステージ１２は、後述する構造体３０を固定保持する。このステージ１２には開口１２ａが設けられており、この開口１２ａにプリズム２２が配置される。プリズム２２は、光源１１からの光を構造体３０の内部に入射させる。プリズム２２に入射される光源１１からの光の入射角度は、構造体３０の内部を伝播する際に構造体３０の上面又は下面にて全反射する角度となる。構造体３０の屈折率は構造体３０に設けられた各ウェルに注入される溶液の屈折率よりも大きいことから、構造体３０の内部を伝播する光は構造体３０の上面にて全反射される。この光の全反射の際に、全反射される近傍の領域でエバネッセント光が発生する。このエバネッセント光を利用して、構造体３０に固着された抗体や、ウェルに注入される溶液中の抗原などを測定する。つまり、抗体や溶液中の抗原などが観察対象となる。なお、エバネッセント光による抗体や抗原の照明時には、エバネッセント光が抗体や抗原との相互作用によって、蛍光や伝播光を生じるので、対物レンズ１４はこれら蛍光や伝播光を観察光として集光する。

ステージ１２は、上述した構造体３０を固定保持する。このステージ１２は、ステージ駆動部１３によって、対物レンズ１４の光軸（Ｌ）方向と、該対物レンズ１４の光軸（Ｌ）方向と直交する面上で移動可能となっている。対物レンズ１４は、上述した観察光を集光する。この対物レンズ１４は、シフト機構１５により、その光軸（Ｌ）方向に移動可能である。リレーレンズ１６は、対物レンズ１４により集光された観察光を撮像装置１７に結像する。撮像装置１７は、例えばＣＣＤやＣＭＯＳなどの二次元の撮像素子から構成される。

コントローラ１８は、顕微鏡１０の各部を制御する。操作部１９は、顕微鏡１０における観察条件の入力操作等の際に操作される。表示部２０は、例えばＬＣＤからなり、撮像装置１７によって撮像される画像や測定結果を表示する。

上述した顕微鏡１０で使用される構造体３０としては、例えば免疫アッセイが挙げられる。図２（ａ）に示すように、免疫アッセイ４０には、例えば透明なガラスやプラスチックなどの材質からなるプレート（以下、マイクロプレートと称す）４１が用いられる。このマイクロプレート４１の上面４１ａのうち、ハッチングで示す領域４２には、格子状の区画壁４５が設けられる。この区画壁４５をプレート４１の上面４１ａに接合することで、区画壁４５と、マイクロプレート４１の上面４１ａによって囲まれる領域がウェル４６となる（図２（ｂ）参照）。

マイクロプレート４１の上面４１ａに設けられる格子状の区画壁４５は、サイトップ（登録商標）と呼ばれる非晶質のフッ素樹脂から形成される。非晶質のフッ素樹脂は、可視光線の透過率が９５％を超える特性や、水の屈折率（１．３３）に非常に近似した屈折率（１．３４）であるという特性を有している。また、この他に、非晶質のフッ素樹脂は、サブミクロン単位の薄膜コーティングが可能であるという特性も有している。なお、矩形状の区画壁４５は、例えば非晶質のフッ化樹脂をマイクロプレート４１の上面にコーティングした後、コーティングされた非晶質のフッ化樹脂に対してプラズマエッチングやホットエンボス加工などを施すことで形成される。なお、本実施形態では、格子状の区画壁４５としているが、これに限定される必要はなく、ウェル４６の形状に合わせた区画壁を設ければよい。

このような形態のマイクロプレート４１を用いて免疫アッセイ４０を作成する場合には、格子状の区画壁４５とマイクロプレート４１の上面４１ａにより形成されるウェル４６のそれぞれに、タンパク質などの抗体５０がパターンニング等により固着される（図３（ａ）参照）。なお、抗体５０はウェル４６の底面４６ａに固着される。なお、図２においては、抗体５０をウェル４６の底面４６ａに固着している形態としているが、これに限定される必要はなく、抗原抗体反応を測定するのであれば、抗体５０の代わりに抗原をウェル４６の底面４６ａに固定すればよい。

このような免疫アッセイ４０は、例えばイライザ（ＥＬＩＳＡ）と呼ばれる、抗原抗体反応を利用し目的のタンパク質を検出する方法である。

このイライザ法の原理を以下に示す。まず、免疫アッセイ４０の各ウェル４６にサンプル液５１を滴下すると、サンプル液５１中の目的物質（抗原）５２が抗原抗体反応により抗体５０に結合される（図３（ｂ）参照）。その後、サンプル液５１を洗い流した後、酵素標識した第二の抗体５３を含む溶液５４を添加すると、第二の抗体５３が抗原抗体反応により、目的物質５２に結合される（図３（ｃ）参照）。その後、遊離する酵素標識した第二の抗体５３を含む溶液５４を洗い流し、発色基質を添加すると、サンドイッチ構造の量（すなわちサンプル中の目的物質量）に比例して発色反応が生じる。なお、上述したマイクロプレート４１を用いることで、各ウェル４６に滴下されるサンプル液５１の中の目的物質（抗原）５２の濃度を高くすることができるので、目的物質５２を高感度で測定することができる。

上述した顕微鏡１０においては、このイライザ法を行いながら、マイクロプレート４１の各ウェル４６の抗体５０及びサンプル液５１中の抗原５２を測定する。

まず、ステージ１２を所定位置に移動させた後、光源１１から照射光をステージ１２に向けて照射する。この照射光はプリズム２２に入射し、プリズム２２の内部を伝播する。プリズム２２の内部を伝播した照射光は、プリズム２２の内部から出射し、マイクロプレート４１に入射する。以下、サンプル液５１を滴下した直後の抗体５０、又はサンプル液５１の抗原５２を測定する場合について説明する。

マイクロプレート４１に入射した照射光は、マイクロプレート４１の上面にて全反射しながらマイクロプレート４１の内部を伝播していく。照射光がマイクロプレート４１の上面で全反射したときにエバネッセント光が生じ、各ウェル４６の抗体５０やサンプル液５１を照明する。

エバネッセント光が各ウェルの抗体５０やサンプル液５１内の物質（抗原を含む）に到達すると蛍光が生じる。対物レンズ１４は、その観察視野内に発生する蛍光を観察光として集光する。なお、対物レンズ１４により集光された観察光は、リレーレンズ１６を介して撮像装置１７に結像され、各ウェル４６の抗体５０やサンプル液５１中の抗原５２の画像（抗原抗体反応時の画像）を取得することができる。また、取得された画像を用いることで、サンプル液５１における抗原５２の濃度を測定することもできる。なお、サンプル液５１における抗原５２の濃度は滴下されるウェル４６毎に異なるが、区画壁４５がないマイクロプレート４１上に滴下した場合に比べて、抗原５２の濃度を高くすることができるので、抗原の濃度を高精度で測定することが可能となる。なお、第二の抗体５３を含む溶液５４を液化した場合や、発色基質を添加した場合も同様である。この顕微鏡１０においては吸光度計については触れていないが、吸光度計を備えている顕微鏡の場合には、発色基質を添加した場合に生じる発色物質の吸光度を測定することも可能である。

この免疫アッセイ４０を用いた測定においては、顕微鏡１０の対物レンズ１４の光学倍率やＦナンバーと、マイクロプレート４１に設けられる区画壁４５の高さとの関係において、対物レンズ１４の観察視野内にマイクロプレート４１に設けられる区画壁４５が入り込んでしまう場合がある。このような場合、区画壁４５における屈折率と、滴下されるサンプル液５１や溶液５４の屈折率が略同一であることから、エバネッセント光が区画壁４５に到達しても区画壁４５によって相互作用は生じることはないので、区画壁４５において蛍光を発することはなく、抗体５０や抗原５２などを照明するエバネッセント光を均一化することができる。また、抗体５０や抗原５２における相互作用によって発生する蛍光からなる観察光が区画壁４５に到達したときでも、観察光は屈折せずに区画壁４５の内部を伝播することから、抗体や抗原の濃度を高感度に測定することができる。また、測定時に得られる画像の劣化を防止することができる。

なお、構造体としては、上述した免疫アッセイの他に、ＤＮＡチップ、核酸などの細胞をアレイ状に固着した細胞アレイチップなどが挙げられる。ＤＮＡチップとは、周知のように、ＤＮＡの断片や合成オリゴヌクレオチドをガラス等のプレートに固着させたものであり、遺伝子の働き具合（発現）を測定したり、特定の遺伝子がゲノムに存在するかどうか、変異を起こしていないかどうかなどを調べるために設けられる。なお、このＤＮＡチップを用いた測定としては、例えば癌における遺伝子の発現を測定する、詳細には、癌細胞の中で働く遺伝子と正常細胞の中で働く遺伝子の種類や量を測定することが挙げられる。

また、ＤＮＡアレイチップは、例えばハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）にて使用される。ハイブリダイゼーションとは、核酸などの分子を相補的に複合させて人工的に複合体を形成させ、遺伝子の検出・同定・定量や、相同性の定量を測定することである。細胞アレイチップにおいても、例えばウェルに核酸を固着させたマイクロプレートを用いればよい。

本実施形態では、構造体としてマイクロプレートを例に取り上げているが、これに限定される必要はなく、例えば上面が開口された円筒形状の培養容器の底部上面に非晶質のフッ素樹脂からなる区画壁を形成することも可能である。また、この他に、例えばマイクロリアクタの流路内に非晶質のフッ素樹脂からなる区画壁を設けることも可能である。この場合も、マイクロリアクタに照射される照射光が区画壁によって乱されることがないことから、区画壁で囲まれる空間に固着される抗体を高感度に測定することが可能となる。

エバネッセント光を用いて観察を行う顕微鏡の一例を示す図である。マイクロプレートの全体、及び区画壁の構成を示す図である。イライザ法の手順の一例を示す図である。顕微鏡を用いた観察時のマイクロプレートの断面図である

符号の説明

１０…顕微鏡、１１…光源、１２…ステージ、１４…対物レンズ、１７…撮像装置、３０…構造体、４０…免疫アッセイ、４１…マイクロプレート、４５…区画壁、５０…抗体、５１…サンプル液、５２…抗原、５３…第２の抗体、５４…溶液

Claims

観察対象を区画する非晶質のフッ素樹脂から形成された区画壁を有し、前記区画壁で囲まれる領域内に溶液が注入される構造体と、
前記構造体と前記溶液との境界面にて全反射させるように、前記構造体に向けて光を照射する光源と、
前記光源からの光が全反射したときに生じるエバネッセント光により照明された前記観察対象又は前記溶液中の物質からの光を集光する光学系と、
前記光学系と共に前記区画壁を含む撮像視野を形成し、前記区画壁で囲まれる領域内に存在する前記観察対象又は前記溶液中の物質の画像を取得する撮像装置と、
を備えたことを特徴とする測定装置。
前記構造体は、前記区画壁と前記区画壁が接合されるプレートとから構成されることを特徴とする請求項１に記載の測定装置。
観察対象を区画する区画壁が非晶質のフッ素樹脂から形成され、前記区画壁で囲まれる領域内に溶液が注入される構造体と該溶液との境界面にて全反射させるように、前記構造体に向けて光を照射する照射工程と、
前記照射工程により照射された光が全反射したときに生じるエバネッセント光により照明された前記観察対象又は前記溶液中の物質からの光を光電変換することで、前記区画壁で囲まれる領域内に存在する前記観察対象又は前記溶液中の物質の画像を取得する撮像工程と、
を備えたことを特徴とする観察対象の測定方法。