JP2005140682A - 光学的測定装置及びそれを用いた特異的結合物の光学的測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、特異的結合物をＢ／Ｆ分離を行わず、高速で感度及び精度よく測定
しうる光学的測定装置及びそれを用いた特異的結合物の光学的測定方法を提供する。
【解決手段】 流体試料中の特異的結合物を光学的に測定する装置であって、蛍光標識又
は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと結合した被測定物質と、特異的に
結合して前記特異的結合物を構成しうる第１の特異的結合メンバーが、少なくとも一表面
に固定されている反応部と、出光側縁面を有する透明な導波路の一面に第一の空間層を介
して透明基材層が積層され、他面に第二の空間層を介して光吸収層が積層されており、前
記第一の空間層と第二の空間層は連通された、流体試料注入するための層であり、導波路
の屈折率が液体試料の屈折率より大きいことを特徴とする光学的測定装置。
【選択図】 図１０

Description

本発明は、光学的測定装置及びそれを用いた特異的結合物の光学的測定方法に関し、詳
細には、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光を反射させ
ながら伝播する導波路の表面において、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異
的結合メンバーと被測定物質を結合させ、更に、被測定物質と第１の特異的結合メンバー
と結合させた後、光線を照射して蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍
光又は散乱光を導波路に導入し、導波路を反射させながら伝播させ、導波路の出光側縁面
から出光した蛍光又は散乱光を測定して特異的結合物を測定し、ひいては流体試料中の被
測定物質を測定する光学的測定装置及光学的測定方法に関する。

従来から、光源からの光線を光導波路を通して全反射させながら伝播させ、抗原抗体反
応により光導波路の表面近傍に拘束された蛍光物質をエバネッセント波成分により励起し
、これにより生じる蛍光の強度を測定することにより間接的に免疫反応の程度を測定する
蛍光免疫測定装置の研究が行われている。

測定感度、測定精度の優れた蛍光免疫測定装置として、導入された励起光を全反射させ
ながら伝播させる光導波路の表面において抗原抗体反応を行なわせ、さらに蛍光物質で標
識された物質を反応させ、上記励起光のエバネッセント波成分により励起される蛍光物質
が発する蛍光を光導波路に導入し、全反射させながら伝播させ、光導波路から出射される
蛍光に基づいて免疫反応の程度を測定する蛍光免疫測定装置において、６５０ｎｍ近傍に
吸収のピークがある蛍光物質を用い、６３５ｎｍ近傍の波長の光を励起光として採用した
ことを特徴とする蛍光免疫測定装置が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
特開平７−６３７５６号公報

しかしながら、上記の蛍光免疫測定装置においては、照射する光線は特定波長のレーザ
光線を特定の角度（導波路内で全反射する角度）で照射しなければならず、白熱電球、キ
セノンランプ等の普通の光源を使用することができないので、装置が大型化し、コストが
高く且つ測定が困難であった。

又、異なる導波路を用いた特異的結合分析物の測定方法として、流体試料中の１種以上
の特異的結合分析物の存在又は量の検出方法であって、（ａ）（ｉ）流体試料よりも大き
い屈折率をもつ透明エレメントと、（ｉｉ）受光縁部と、（ｉｉｉ）エレメントの表面の
複数の部位に固定された少なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含む
反応表面（該反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定しない）とを備え
る導波路デバイス（ここで、前記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合
対を介して、少なくとも１種の分析物と特異的に結合することが可能である）を準備する
段階と、（ｂ）前記１種以上の分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の特異的
結合メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ（ここで、該第２の同系結
合対の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、サンドイッチアッセ
イの場合には前記１種以上の分析物と特異的に結合することが可能であり、競合アッセイ
の場合には前記第１の同系結合対の固定化した第１の特異的結合メンバーに結合すること
が可能である）、試料中の分析物の量に比例して複数の部位に結合した光散乱ラベル複合
体を形成する段階と、（ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の
受光縁部に照射し、全反応表面を同時に照射する段階と、（ｄ）散乱光が存在する場合に
は前記表面の各部位及び非部位部分から実質的に同時に散乱光を集光する段階と、（ｅ）
各部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度、もしくは（ｉｉ）別の部位の光散乱度
、又はその両者と比較し、各部位の光散乱を該部位の固定化特異的結合メンバーに特異的
な分析物の存在又は量と相関させる段階を含む前記方法が提案されている（例えば、特許
文献２参照。）。
特表平１０−５０６１９０号公報

上記方法では、光源として、可視、紫外及び近ＩＲスペクトルのエネルギーを含む、ほ
ぼ任意の電磁エネルギー源が可能であり、レーザ、発光ダイオード、フラッシュランプ、
アーク灯、白熱電球、蛍光放電灯等が記載されている。

しかし、導波路デバイスの受光縁部から透明エレメント内部に光線を照射するのであり
、透明エレメントの厚みは非常に薄いので、この厚みより幅の狭いスリットを通して光線
を照射しなければならず、反応表面まで届く光線の量が少なくなり、ノイズの影響を受け
易くなるという欠点があった。

又、導波路デバイスの受光縁部の面精度が低いと、全反射する光線のみならず、全反射
しない光線も反応表面まで届き、この光線が流体試料中に入光し、流体試料中に残存して
いる第２の同系結合対の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベルに到達し、散乱光が
発生するために測定精度が悪くなるという欠点があった。

更に、反応表面が広く、流体試料が広く存在すると、散乱光を測定する測定画像が大き
くなり、ノイズの影響が大きくなり、測定感度が低下するという欠点があった。

又、従来は、高感度、高精度の分析を行おうとするとＢ／Ｆ分離が必要であったが、Ｂ
／Ｆ分離の工程は煩雑な処理が必要であるため、高速で短時間で分析を行うことが出来な
かった。

本発明の目的は、上記欠点に鑑み、任意の光源を使用して被測定物質に光線を照射し、
蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光を導波路内に導入し
、導波路内を反射させながら伝播させると共に、全反射しない蛍光又は散乱光を除去し、
全反射した蛍光又は散乱光のみを、導波路の端縁面で測定することにより、特異的結合物
を、Ｂ／Ｆ分離を行わず、、高速で感度及び精度よく測定しうる光学的測定装置及びそれ
を用いた特異的結合物の光学的測定方法を提供することにある。

請求項１記載の光学的測定装置は、流体試料中の特異的結合物を光学的に測定する装置
であって、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと結合した被
測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物を構成しうる第１の特異的結合メンバー
が、少なくとも一表面に固定されている反応部と、出光側縁面を有する透明な導波路の一
面に第一の空間層を介して透明基材層が積層され、他面に第二の空間層を介して光吸収層
が積層されており、前記第一の空間層と第二の空間層は連通された、流体試料注入するた
めの層であり、導波路の屈折率が流体試料の屈折率より大きいことを特徴とする。

上記導波路は、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光が
全反射しながら伝播するのであるから、光学的に透明な材料からなるフィルム、シート状
物又は板状体であり、一側面が出光側縁面となされ、一表面が反応部となされている。

上記光学的に透明な材料としては、例えば、ガラス、石英、アクリル系樹脂、フッ素樹
脂、ポリカーボネート樹脂、芳香族ポリエステル樹脂、ポリアリレート樹脂、エポキシ樹
脂、シリコン樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリイミド樹脂及びそのフッ素化物等が挙げら
れ、ガラス、石英、アクリル系樹脂、ポリカーボネート樹脂及びポリスチレン系樹脂が好
ましい。

上記アクリル系樹脂としては、例えば、ポリメチルメタアクリレート（屈折率＝１．４
９０）、ポリベンジルメタクリレート（屈折率＝１．５６８）、ポリフェニルメタクリレ
ート（屈折率＝１．５７１）、ポリ１−フェニルエチルメタクリレート（屈折率＝１．５
４９）、ポリシクロヘキシルメタクリレート（屈折率＝１．５０７）、メチルメタアクリ
レート−ベンジルメタクリレート共重合体、メチルメタアクリレート−フェニルメタクリ
レート共重合体、メチルメタアクリレート−１，１，２−トリフルオロエチルメタクリレ
ート共重合体、メチルメタアクリレート−スチレン共重合体等が挙げられる。

導波路の屈折率は流体試料の屈折率より大きくなければならず、流体試料が水溶液の場
合、水の屈折率は１．３３であるから、導波路の屈折率は１．３３以上であり、好ましく
は、１．４９以上である。

導波路の厚みは、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光
の波長の１０〜１０００倍が好ましく、一般に５〜６００μｍが好ましく、より好ましく
は１５〜１００μｍである。

上記反応部は、導波路の少なくとも一表面に形成されているが、対向する他表面にも形
成されてもよい。

上記反応部には、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと結
合した被測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物を構成しうる第１の特異的結合
メンバーが固定されている。

上記第１の特異的結合メンバーは、測定すべき被測定物質により異なるが、例えば、酵
素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセプター、イオノフォア、プロトンポ
ンプ、生体膜、人工生体素子、ＤＮＡの分子、ＲＮＡの分子、タンパク質、糖鎖、糖タン
パク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた1 種もしくはこれらの混合物等が挙げ
られる。

上記第１の特異的結合メンバーを反応部に固定する方法は、従来公知の任意の方法が採
用されてよく、例えば、反応部表面に上記第１の特異的結合メンバーと共有結合しうる反
応基を有する合成樹脂の層を被覆し、上記第１の特異的結合メンバーと共有結合させる方
法、タンパク質等の上記第１の特異的結合メンバーが吸着しうる化合物層を反応部表面に
被覆し、上記第１の特異的結合メンバーを吸着させる方法等が挙げられる。

上記蛍光標識は、光線の照射を受けた際に光線を変換することにより蛍光を発生する物
質であり、例えば、光線の照射を受けた際に蛍光を発生する化合物、この蛍光を発生する
化合物を含有する合成樹脂粒子等が挙げられる。

上記蛍光を発生する化合物としては、例えば、フルオレインイソチオシアネート、フル
オレセイン、フルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、６−（（（４−（
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）４−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−５−イ
ンダセン−３−イル）フェノキシ）アセチル）アミノ）ヘキサン酸、スクシンイミジルエ
ステル、４−アセトアミド−４’−イソシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、
７−アミノ−４−メチルクマリン、7-アミノ-4- トリメチルクマリン、Ｎ−（４−アニリ
ノ−１−ナフチル）マレイミド、ダンシルクロライド、４’６−ジアミジノ−２−フェニ
ルインドール、５−（４，６−ジクロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン、４
，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、エオシンイソチオシ
アネート、エリトロシンＢ、フルオレサミン、フルオレセイン−５（６）−カルボキシア
ミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、５−イソチオシアネート（ｉｓ
ｏｔｈｉｏｓｙａｎａｎｔｅ）ジアセテート、４−メチルウンベリフェロン、ｏ−フタル
ジアルデヒド、ＱＦＩＴＣ、ローダミンＢイソチオシアネート、硫酸ローダミン１０１酸
クロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、２’，７’−ジフルオロフル
オレセイン、シアニン系色素、ローダミン、希土類金属錯体等が挙げられ、発光寿命の長
い希土類金属錯体が好適に使用される。

上記希土類金属錯体を構成する希土類金属としては、例えば、スカンジウム、イットリ
ウム、及び、ランタン、セリウム、プラセオジウム、ネオジム、プロメチウム、サマリウ
ム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウ
ム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム等のランタノイド族金属等が挙げられ、サマ
リウム、ユウロピウム、テルビウム及びジスプロシウムが好適に使用される。

上記希土類金属と共に希土類金属錯体を構成するリガンドとしては、希土類金属と反応
して蛍光を発生する希土類金属錯体を構成しうるものであれば、特に限定されず、例えば
、エチレンジアミン四酢酸類、４，７−ビス−（クロロスルフォフェニル）−１，１０−
フェナントロリン−２，９−ジカルボキシリックアシッド、４，４’−ビス−１”，１”
，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”
−イル）−クロロスルホ−ｏ−テルフェニル、ヘキサフルオロアセチルアセトン、トリフ
ェニルホスフィンオキシド、ジフェニルスルホキシド、１，１０−フェナントロリン等が
挙げられる。

上記蛍光を発生する化合物を含有する合成樹脂粒子は、蛍光を発生する化合物を流体試
料に溶解した場合に比較し、発生する蛍光の強度が流体試料中の共存物質によって低下さ
れることが少ないので好ましい。

上記蛍光を発生する化合物を合成樹脂粒子に含有させる方法は従来公知の任意の方法が
採用されてよく、例えば、蛍光を発生する化合物の存在下で重合性モノマーを乳化重合、
懸濁重合等の重合方法で重合する方法が挙げられる。

上記重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ｏ−ビニルト
ルエン、ｍ−ビニルトルエン、ｐ−ビニルトルエン等の芳香族ビニル化合物；メチル（メ
タ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、
ｉ−プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メ
タ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）ア
クリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート等のアクリレート類；（メタ）アクリ
ロニトリル、シアン化ビニリデン等のシアン化ビニル化合物；塩化ビニル、塩化ビニリデ
ン、フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン等のハロゲン化ビニル化
合物；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステルなどが挙げられる。

上記重合性モノマーは、これらの重合性モノマーを重合する際に一般に共重合されてい
る単官能性モノマーや多官能性モノマーが共重合されてよく、単官能性モノマーとしては
、例えば、（メタ）アクリル酸、無水マレイン酸、グリシジルアクリレート等が挙げられ
、多官能性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、（ポリ）エチレングリコール
ジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリ
メチロールプロパントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

上記合成樹脂粒子中の蛍光を発生する化合物の含有量は、少なくなると蛍光の発生量が
少なくなり測定感度が低下し、多くなると蛍光を発生する化合物を溶解しているのと同様
になるので、合成樹脂粒子中５〜８０重量％が好ましく、より好ましくは１５〜６０重量
％である。

上記合成樹脂粒子は大きくなるとさはなるべく小さいのが好ましく、１０μｍ以下が好
ましく、より好ましくは２０ｎｍ〜５００ｎｍであり、更に好ましくは３０ｎｍ〜２００
ｎｍである。

このような粒子径の小さい合成樹脂粒子を合成するには、重合性モノマーの微小液滴を
作製し重合すればよく、例えば、重合性モノマーと乳化剤、分散剤、重合開始剤等の必要
成分との混合液をホモジナイザー、マイクロミキサー、マイクロチャンネル等に供給して
微小液滴を作製し常法に従って重合すればよい。

上記光散乱標識は、光線の照射を受けた際に光線を散乱しうる化合物又は微粒子であり
、例えば、金，銀など金属のコロイド微粒子凝集体、ＣｄＳ、ＣｄＳｅなどのカルコゲナ
イト微粒子、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリ（メタ）アクリル樹脂など
のポリマー微粒子、シリカゲル、アルミナ、酸化チタンなどの無機酸化物微粒子、これら
の２種以上の組合せによるコアシェル微粒子等が挙げられる。又、上記ポリマー微粒子及
び無機酸化物微粒子は、染色されていてもよいし、蛍光分子や金属ナノ粒子が分散されて
いてもよい。

上記光散乱標識粒子の大きさは、特に限定されるものではないが、一般に１０ｎｍ〜１
０μｍであり、好ましくは５０ｎｍ〜５００ｎｍであり、更に好ましくは７０〜２００ｎ
ｍである。

上記第２の特異的結合メンバーは、測定すべき被測定物質に特異的に結合しうるもので
あり、第１の特異的結合メンバーと第２の特異的結合メンバーの間に被測定物質をサンド
ウィッチすることができるものである。

従って、第２の特異的結合メンバーとしては、被測定物質及び第１の特異的結合メンバ
ーに対応して異なるが、例えば、酵素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセ
プター、イオノフォア、プロトンポンプ、生体膜、人工生体素子、ＤＮＡの分子、ＲＮＡ
の分子、タンパク質、糖鎖、糖タンパク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた１
種もしくはこれらの混合物等が挙げられる。

従って、免疫測定方法の場合には、被測定物質が抗体又は抗原であり、第１の特異的結
合メンバーと第２の特異的結合メンバーとしては、それに特異的に反応する抗原又は抗体
が使用される。

反応部で発生した蛍光又は散乱光が導波路内を反射して導波路の出光側縁面まで伝播す
る間に、導波路内を全反射しない蛍光又は散乱光を除去するのであるから、全反射しない
蛍光又は散乱光が導波路内でなるべく多く反射するのが好ましい。

従って、上記反応部から出光側縁面までの距離は、蛍光又は散乱光が導波路内を全反射
して伝播する１往復の距離の２倍以上であることが好ましく、より好ましくは２０倍以上
である。

上記透明基材層は、導波路の一面に第一の空間層を介して積層されており、特異的結合
物を光学的に測定する際に、光源からの光線はこの層を透過して反応部に照射されるので
あり、光学的に透明な材料で形成される。

上記光学的に透明な材料としては、前述の導波路を形成するのに使用された光学的に透
明な材料が好適に使用される。

上記光吸収層は、導波路の他面に第二の空間層を介して積層されており、導波路から出
射してきた蛍光又は散乱光を吸光する層であり、吸光することにより、導波路内の全反射
しない蛍光又は散乱光をなくすのであるから、着色された、特に、黒色に着色された合成
樹脂層が好ましい。

上記合成樹脂としては、例えば、オレフィン系樹脂、塩化ビニル系樹脂、ポリスチレン
系樹脂、アクリル系樹脂、ＡＢＳ樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエ
ステル系樹脂、ポリアリレート系樹脂、エポキシ系樹脂、シリコン系樹脂、ポリイミド系
樹脂等の熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂及び光硬化性樹脂が挙げられる。

着色は、上記合成樹脂に着色剤を練りこんでもよいし、合成樹脂層の表面に着色剤層を
積層してもよく、該着色剤としては、例えば、アゾ系、フタロシアニン系、スレン系、染
料レーキ系等の有機系着色剤；カーボンブラック、酸化物系、クロム酸モリブデン系、硫
化物・セレン化物系、フェロシアン化物等の無機系着色剤が挙げられ、カーボンブラック
が好ましい。

上記第一の空間層及び第二の空間層は、流体試料を注入するための層であり、両層は流
体試料を一度に注入できるように連通されている。又、両層は、特異的結合物を光学的に
測定する際に、流体試料が注入され、導波路を伝播する蛍光又は散乱光のうち全反射しな
い蛍光又は散乱光が入光する層である。

上記第一の空間層及び第二の空間層の厚みは、特に限定されるものではないが、薄くな
ると水等の流体試料を導入しにくくなり、厚くなると導波路と光吸収層との積層が困難に
なるので、０．６〜２０００μｍが好ましい。

空間層の厚みが薄すぎるとエバネッセント波が光吸収層まで到達する恐れがあるため、
１０〜１５００μｍがより好ましく、１００〜１０００μｍが更に好ましい。 又、空間
層の厚みが１０μｍ程度以下の時は、光吸収層を流体試料の屈折率より大きくするのが好
ましい。

上記透明基材層は、反応部に対応する位置以外は光線が透過する必要はなく、むしろ導
波路から出射してくる光線を吸収するほうが好ましいので、透明基材層の外表面に、反応
部に対応する位置を除いて遮光層が積層されているのが好ましく、更に、遮光層が光吸収
性を有しているのが好ましい。

上記遮光層としては、遮光性を有していればよく、例えば、アルミニウム箔、アルミニ
ウム蒸着合成樹脂フィルム、着色合成樹脂フィルム、不透明の紙、不透明の布等が挙げら
れる。又、前述の光吸収層も遮光性及び光吸収性を有しているので好適に使用できる。

又、透明基材層には、流体試料を第一の空間層に供給するための連通孔が穿設されてい
るのが好ましい。

更に、反応部に照射された光線が反射され、再度反応部に照射されて、蛍光標識又は光
散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光の強度が向上するように、光吸収層
の第二の空間層側であって、反応部に対応する位置に光反射層が積層されているのが好ま
しい。

上記光反射層としては、光線が反射するものであれば、特に限定されず、例えば、鏡、
アルミニウムシート等が挙げられる。

次に、本発明の光学的測定装置を図面を参照して説明する。図１は、本発明の光学的測
定装置の一例を示す模式図であり、図２は、図１におけるＡ−Ａ断面図である。

図中１は透明な導波路であり、一表面に、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の
特異的結合メンバーと結合した被測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物を構成
しうる第１の特異的結合メンバー１１が固定されて反応部１２が形成され、反応部１２か
ら遠い側縁面が出光側縁面１３となされている。

導波路１の反応部１２側には、導波路１の端部と透明基材層２の端部が両面テープより
なるスペーサー３’、３’により接着され、導波路１と透明基材層２の間に第一の空間層
４が形成されている。

又、２１は、流体試料を空間層４に注入するための貫通孔であり、透明基材層２に穿設
されている。尚、出光側縁面１３側のスペーサー３’は、導波路１と接触する面積が少な
いほうが、測定に与える影響が少ないため、線接触となるようにするのが好ましい。

又、導波路１の反応部１２と反対側は、導波路１の端部と光吸収層６の端部が両面テー
プよりなるスペーサー３’、３’により接着され、導波路１と光吸収層６の間に第二の空
間層５が形成されている。

更に、透明基材層２と光吸収層６は第一の空間層４及び第二の空間層５に満たす液体試
料が漏れないようにスペーサー３、３等により容器状となるように封止されている（一部
図示せず。）。

又、液漏れ防止として導波路の出光側側縁と透明基材層２と光吸収層６を、光学的な影
響の少ないフィルム等で封止しても良い。

又、第一の空間層４と第二の空間層５は、図２に示したように両側部で連通されており
流体試料が流入する構造となっている。

光学的測定は、注入口２１から液体試料を注入し、第一の空間層４及び第二の空間層５
に液体試料を満たし、光源から反応部１２に光線を照射し、導波路１の出光側縁面１３か
ら出光した蛍光又は散乱光を出光側縁面１３の付近に設置した受光素子で測定することよ
り行われる。

上記光学的測定装置において、反応部１２に光源から光線を照射する際には、光源と反
応部１２の間にスリットを設置し、光線が反応部１２のみに照射されるようにするのが好
ましい。

図３は、本発明の光学的測定装置の異なる例を示す模式図であり、図４は図３の平面図
である。図３に示した光学的測定装置は、いわば、図１及び２で示した光学的測定装置の
縦型の光学的測定装置である。

図中１は透明な導波路であり、一表面の下方に、蛍光標識又は光散乱標識が結合された
第２の特異的結合メンバーと結合した被測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物
を構成しうる第１の特異的結合メンバー１１が固定されて反応部１２が形成され、反応部
１２から遠い上側縁面が出光側縁面１３となされている。

透明基材層２と光吸収層６は、端部が両面テープよりなるスペーサー３、３により接着
され、底面が底蓋体３１により貼付され容器状に形成されており、その中に導波路１が挿
入され、導波路１と透明基材層２の間に第一の空間層４が形成され、導波路１と光吸収層
６の間に第二の空間層５が形成されている。

そして、上端部の導波路１と透明基材層２の間、導波路１と光吸収層６の間及び導波路
１とスペーサー３との間が、液体試料の注入口２２となされている。又、第一の空間層４
と第二の空間層５は、図４に示したように両側部で連通されており流体試料が流入する構
造となっている。

光学的測定は、注入口２２から液体試料を注入し、第一の空間層４及び第二の空間層５
に液体試料を満たし、光源から反応部１２に光線を照射し、導波路１の出光側縁面１３か
ら出光した蛍光又は散乱光を出光側縁面１３の上部付近に設置した受光素子で測定するこ
とより行われる。

図５は、本発明の光学的測定装置の更に異なる例を示す模式図であり、図６は図５の平
面図であり、図７は図５におけるＢ−Ｂ断面図である。

図５に示した光学的測定装置は、透明基材層２の外表面に遮光層７が積層されている以
外は図１に示した光学的測定装置と同一である。遮光層７には、反応部１２に対応する位
置に光線入射孔７１が形成されると共に貫通孔２１に連通する貫通孔７２が形成されてい
る。

図８は、本発明の光学的測定装置の更に異なる例を示す模式図であり、図９は図８にお
けるＣ−Ｃ断面図である。

図中１は透明な導波路であり、両表面の対応する位置に、蛍光標識又は光散乱標識が結
合された第２の特異的結合メンバーと結合した被測定物質と、特異的に結合して前記特異
的結合物を構成しうる第１の特異的結合メンバー１１が固定されて反応部１２、１２が形
成され、反応部１２から遠い側縁面が出光側縁面１３となされている。

導波路１の一面には、導波路１の端部と透明基材層２の端部が両面テープよりなるスペ
ーサー３’、３’により接着され、導波路１と透明基材層２の間に第一の空間層４が形成
されている。２１は、流体試料を第一の空間層４に注入するための貫通孔であり、透明基
材層２に穿設されている。

又、透明基材層２の外表面に遮光層７が積層されている。遮光層７には、反応部１２に
対応する位置に光線入射孔７１が形成されると共に貫通孔２１に連通する貫通孔７２が形
成されている。

又、導波路１の他面には、導波路１の端部と光吸収層６の端部が両面テープからなるス
ペーサー３’、３’により接着され、導波路１と光吸収層６の間に第二の空間層５が形成
されている。又、光吸収層６には、反応部１２に対応する位置に反射層６１が積層されて
いる。

第一の空間層４と第二の空間層５は、導波路１に穿設された連通孔１４で連通されてい
る。連通孔１４の形状は、流体試料を通すことが可能であれば良く、例えば、円形、正方
形、長方形等が挙げられ、その数は１本でもよいし、２以上の複数本であってもよい。

尚、連通孔１４の位置は、反応部１２以外の位置であれば任意の位置で可能であるが、
透明基材層２に穿設されている貫通孔２１の真下に穿設されるのが好ましい。

請求項９記載の特異的結合物の光学的測定方法は、蛍光標識又は光散乱標識が結合され
た第２の特異的結合メンバーと、被測定物質を含む流体試料を、請求項１〜８項のいずれ
か１項に記載の光学的測定装置の第一の空間層と第二の空間層に供給し、被測定物質を介
して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと、反応部に固定
された第１の特異的結合メンバーとを結合させ、特異的結合物を形成した後、該特異的結
合物に光線を照射し、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱
光を導波路に導入し、導波路を反射しながら伝播し、出光側縁面から出光した蛍光又は散
乱光を受光素子で測定することを特徴とする。

次に、請求項９記載の特異的結合物の光学的測定方法を図面を参照して説明する。図１
０は、図５〜７に示した光学的測定装置をもちいて特異的結合物の光学的測定方法の１例
を示す模式図であり、図１１は、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合
メンバーと、被測定物質被測定物質と、第１の特異的結合メンバーが結合した特異的結合
物が反応部表面に固定されている状態を示す模式図である。

図中８は光源であり、遮光層７の光線入射孔７１の上方に設置されている。又、９は受
光素子であり、導波路１の出光側縁面１３の側方に設置されている。

上記特異的結合物の光学的測定方法において、最初の工程は、蛍光標識又は光散乱標識
が結合された第２の特異的結合メンバーと被測定物質１６を混合した流体試料１５を、透
明基材層２に穿設されている貫通孔２１から第一の空間層４及び第二の空間層５に供給す
る工程である。

第一の空間層４及び第二の空間層５に流体試料１５を供給すると、反応部１２において
、被測定物質を介して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバー
と、反応部１２に固定された第１の特異的結合メンバー１１とが結合し、特異的結合物１
９が形成される。

即ち、流体試料１５に含まれる被測定物質１６よりも多量の、蛍光標識又は光散乱標識
１８が結合された第２の特異的結合メンバー１７と、被測定物質１６を含む流体試料１５
を混合すると、被測定物質１６は、蛍光標識又は光散乱標識１８が結合された第２の特異
的結合メンバー１７と特異的に結合し、被測定物質１６の結合した第２の特異的結合メン
バー１７と被測定物質１６の結合していない第２の特異的結合メンバー１７とを含む流体
試料１５が得られる。

この流体試料１５を反応部１２に供給すると、第２の特異的結合メンバー１７と特異的
に結合している被測定物質１６は、反応部１２に固定された第１の特異的結合メンバー１
１とも特異的に結合し、蛍光標識又は光散乱標識１８が結合された第２の特異的結合メン
バー１７と被測定物質１６と第１の特異的結合メンバー１１が結合した特異的結合物１９
が形成される。

そして、第１の特異的結合メンバー１１は反応部１２に固定されているので、特異的結
合物１９は反応部１２に固定されている。又、過剰の蛍光標識又は光散乱標識１８が結合
された第２の特異的結合メンバー１７は流体試料１５中に浮遊している。

次に、特異的結合物１９に光線を照射し、蛍光標識又は光散乱標識１８により変換又は
散乱された蛍光又は散乱光を導波路１に導入し、導波路１を反射しながら伝播し、出光側
縁面１３から出光した蛍光又は散乱光を受光素子９で測定する。

光源８から矢印Ｄのように光線入射孔７１を通って反応部１２（流体試料１５）に光線
を照射すると、流体試料１５中の蛍光標識又は光散乱標識１８により変換又は散乱された
蛍光又は散乱光が発生する。

流体試料１５中を浮遊している第２の特異的結合メンバー１７に結合した蛍光標識又は
光散乱標識１８により変換又は散乱された蛍光又は散乱光は、光線Ｅで示したように深い
入射角を有している光線だけが導波路１内に入射する。

光線Ｅは導波路の１表面で全反射しない深い角度の光線であるから、光線Ｅは導波路１
を通り、導波路１の他表面から第二の空間層５内の流体試料１５に入射し、光吸収層６で
一部吸収されると共に一部反射される。

反射された光線Ｅは、再度，導波路１に入射し、導波路１の１表面から第一の空間層４
内の流体試料１５に入射し、遮光層７で反射される。反射された光線Ｅは更に導波路１に
入射する。光線Ｅは、上記反射及び光吸収が繰り返され、減衰してなくなってしまう。

一方、反応部１２に固定されている特異的結合物１９に含まれる蛍光標識又は光散乱標
識１８により変換又は散乱された蛍光又は散乱光も、浅い角度の入射角を有する光線と深
い角度入射角を有する光線があるが、深い角度入射角を有する光線は、上記光線Ｅと同様
に反射及び光吸収が繰り返され、減衰してなくなってしまう。

浅い角度の入射角を有する光線は、光線Ｆで示したように、導波路１を全反射しながら
伝播し、出光側縁面１３から出光するので、出光した蛍光又は散乱光を受光素子４で受光
し、電気的処理により測定する。又、出光した光線を、蛍光又は散乱光を選択的に透過す
るフィルターを介して受光してもよい。

上記光源としては、公知の任意の光源が使用可能であり、例えば、レーザー、発光ダイ
オード、フラッシュランプ、アーク灯、白熱電球、蛍光灯、キセノンランプ、水銀灯等が
挙げられ、光線も任意の光線が使用可能であり、例えば、可視光線、紫外線、赤外線等が
挙げられる。

上記受光素子としては、光線を感知しうる任意の計測装置が使用可能であるが、一般に
フォトダイオード、ＣＭＯＳカメラ、ＣＣＤカメラ等が好適に使用される。

本発明の光学的測定装置及びそれを用いた特異的結合物の光学的測定方法の構成は上述
の通りであるから、任意の光源を使用して容易に照射することができ、導波路に固定され
ていない浮遊した特異的結合物に存在する蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱
された蛍光又は散乱光は、導波路を伝播する際に減衰され光学測定装置まで到達しないの
で、Ｂ／Ｆ分離を行わず、特異的結合物を高速で、感度及び精度よく測定することができ
る。

又、導波路表面の反応部に固定された特異的結合物中の蛍光標識又は光散乱標識によっ
て変換又は散乱された蛍光又は分散光の入射角は浅いので、導波路を薄くすることができ
、出光側側縁面からの光線は明るくなり測定感度が優れ、更に、光学的測定装置は薄肉化
が可能となる。従って、流体試料中の被測定物質を高速で感度及び精度よく測定すること
ができる。

以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。

（実施例１）
ヒトヘモグロビンに対するモノクロール抗体とヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃに対する
モノクロール抗体の作製
ヒトヘモグロビンとヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃをフロイントコンプリートアジュバ
ントに充分に分散させた溶液（２０μｇ／ｍｌ）１００μｌをＢａｌｂ／ｃマウスに２週
間置きに４回免疫した。

免疫終了の２週間後に、免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓を摘出し、１０６個の脾
細胞を得た。得られた脾細胞をミエローマ細胞とＰＥＧ（ポリエチレングリコール）の存
在下で融合させ培養した。増殖した細胞の上澄みを採取しＥＬＩＳＡ法により各抗体の有
無を調査した。

各抗体が陽性の細胞を限界希釈法により試験し、各抗体を産生している細胞を確認した
。この細胞を大量に培養し、Ｂａｌｂ／ｃマウス腹腔に注射し、２週間後から３日おきに
腹水を採取してヒトヘモグロビンに対するモノクロール抗体とヒトグリコヘモグロビンＡ
１ｃに対するモノクロール抗体を得た。

蛍光合成樹脂粒子の作製
ガラス製重合器に、水８０重量部とドデシルスルホン酸ナトリウム１．５重量部を供給
し、攪拌してドデシルスルホン酸ナトリウムを溶解した後、スチレン２０重量部、希土類
金属錯体（ユウロピウムに配位したヘキサフルオロアセチルアセトン・ トリオクチルフ
ォスフィンオキシド配位子錯体）４重量部及びアゾビスイソブチロニトリル０，１５重量
部を供給し、冷却しながらホモジナイザーで高速分散し、乳化液を得た。

得られた乳化液をホモジナイザーで高速分散しながら、窒素置換し、温水で８０℃まで
昇温し、８０℃で８時間重合して、体積平均粒子径が１２０ｎｍの蛍光合成樹脂粒子を得
た。

抗ヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ抗体吸着蛍光合成樹脂粒子の作製
０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）に抗ヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ抗体を溶
解し、濃度が１ｍｇ／ｍｌの抗体溶液を得た。

上記の得られた蛍光合成樹脂粒子を０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）で３回洗
浄した後、蛍光合成樹脂粒子濃度が１．０重量％になるように０．０５Ｍグリシン緩衝液
（ｐＨ８．６）に分散し、得られた分散液１ｍｌに対し、得られた抗体溶液０．５ｍｌを
添加し、３５℃で１時間攪拌混合した。

次に、牛血清アルブミンの１．０重量％リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）を１ｍｌ添加
し、常温で１時間攪拌混合した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１時間）し、リン酸食
塩緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。この遠心分離及び洗浄を３回行った後、得られた抗
ヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ抗体吸着蛍光合成樹脂粒子に２ｍｌのリン酸食塩緩衝液（
ｐＨ７．２）を添加し、超音波ホジナイザーで攪拌し、抗ヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ
抗体吸着蛍光合成樹脂粒子の分散リン酸食塩緩衝液を得た。

反応部の作製
導波路１として、長さ１０ｍｍ、幅１ｍｍ、厚さ１００μｍの透明ポリメチルメタクリ
レートシートを使用し、ポリメチルメタクリレートシート（導波路１）の反応部１２の位
置を蒸留水で洗浄した後、ヒトヘモグロビンに対するモノクロール抗体及びヒトグリコヘ
モグロビンＡ１ｃに対するモノクロール抗体を、濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した緩衝液を、注射針で反応部１２表面に供給
し、３０℃で１時間静置した。

次に、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄した後、牛血清アルブミンの１
．０重量％リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）を供給し、３０℃で１時間静置することによ
り、上記モノクロール抗体で被覆されていない反応部１２表面を被覆した。

次いで、再度、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄した後、０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で被覆してポリメチルメタクリレートシート（導波路（Ａ）
）上に反応部１２を形成した。

光学的測定装置の作製
導波路１として、上記反応部１２が作製された透明ポリメチルメタクリレートシートを
使用し、透明基材層２として、長さ１０ｍｍ、幅２ｍｍ、厚さ１００μｍの透明ポリメチ
ルメタクリレートシートを使用し、光吸収層６及び遮光層７としてＡＢＳ樹脂とカーボン
ブラックよりなる、長さ１０ｍｍ、幅２ｍｍ、厚さ１００μｍの黒色ＡＢＳ樹脂系シート
を使用した。

図５〜７に示したように、黒色ＡＢＳ樹脂系シート（光吸収層６）の一面の周囲に、厚
さ０．５ｍｍ、幅０．３ｍｍの黒色ＡＢＳ樹脂系シートよりなるスペーサー３を貼付し、
その上にポリメチルメタクリレートシート（導波路１）を貼付し、第二の空間層５を形成
した。

次に、ポリメチルメタクリレートシート（導波路１）の上面の両端部に厚さ０．５ｍｍ
、幅０．３ｍｍの黒色ＡＢＳ樹脂系シートよりなるスペーサー３を貼付し、その上に直径
１ｍｍの円形の貫通孔２１が形成されているポリメチルメタクリレートシート（透明基材
層２）を貼付し第一の空間層４を形成した。

更に、ポリメチルメタクリレートシート（透明基材層２）上に直径１ｍｍの円形の光線
入射孔７１及び１辺１ｍｍの正方形の貫通孔７２が形成されている黒色ＡＢＳ樹脂系シー
ト（遮光層７）を貼付し、光学的測定装置を得た。

測定用血液試料の作製
被験者の血液を採取後、直ちに全血１ｍｌ当りフッ化ナトリウム（血液抗凝固剤）１０
ｍｇ添加し、次いで、血液３μｌを溶血試薬に添加し１５０倍に希釈して、希釈血液試料
を得た。

尚、溶血試薬は、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ社製、商品名「ＴｒｉｔｏｎＸ−１００」）を０．１重量％
と除去試薬としてテトラポリリン酸０．１重量％を溶解してなる０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）を使用した。

得られた血液試料をＡ１ｃ専用測定装置（液体クロマトグラフィ、京都第一科学社製、
商品名「Ｈｉ−ＡｕｔｏＡ１ｃＨＡ−８１２１」に供給し、ヒトグリコヘモグロビンＡ１
ｃ濃度を測定し、その結果に基づいて、血液試料に、更に、上記溶血試薬を添加しヒトグ
リコヘモグロビンＡ１ｃ濃度３％、５％、１０％及び１２％の測定用血液試料を作製した
。

測定
図８に示したように、得られた測定用血液試料に、過剰の抗ヒトグリコヘモグロビンＡ
１ｃ抗体吸着蛍光合成樹脂粒子の分散リン酸食塩緩衝液を供給、混合した後、５分間静置
し、得られた混合液を光学的測定装置の貫通孔７２及び２１から第一の空間層４及び第二
の空間層５を満たすように供給し、反応部１２に供給した。

光源８としてキセノンランプを使用して０．１Ｊ／Ｆｌａｓｈの光線を２０００回／秒
の間隔で１０００回光線入射孔７１を通して反応部１２に照射し、受光素子４としてフォ
トダイオードを使用し、導波路（Ａ）の出光側縁面１３から出光してきた波長６５０ｎｍ
付近の光線の強度を測定した。

得られた光線強度とヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ濃度をグラフにプロットしたところ
直線のグラフが得られ、上記光学的測定装置でヒトグリコヘモグロビンＡ１ｃ濃度を測定
することができることが分かった。

本発明の光学的測定装置の一例を示す模式図である。 図１におけるＡ−Ａ断面図である。 本発明の光学的測定装置の異なる例を示す模式図である。 図３の平面図である。 本発明の光学的測定装置の更に異なる例を示す模式図である。 図５の平面図である。 図５におけるＢ−Ｂ断面図である。 本発明の光学的測定装置の更に異なる例を示す模式図である。 図８におけるＣ−Ｃ断面図である。 図５に示した光学的測定装置をもちいて特異的結合物の光学的測定方法の１例を示す模式図である。 蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと、被測定物質と、第１の特異的結合メンバーが結合した特異的結合物が反応部表面に固定されている状態を示す模式図である。

符号の説明

１ 導波路
１１ 第１の特異的結合メンバー
１２ 反応部
１３ 出光側縁面
１４ 連通孔
１５ 流体試料
１６ 被測定物質
１７ 第２の特異的結合メンバー
１８ 蛍光標識又は光散乱標識
１９ 特異的結合物
２ 透明基材層
２１ 貫通孔
３、３’ スペーサー
４ 第一の空間層
５ 第二の空間層
６ 光吸収層
６１ 反射層
７ 遮光層
７１ 光線入射孔
７２ 貫通孔
８ 光源
９ 受光素子

Claims (12)

1. 流体試料中の特異的結合物を光学的に測定する装置であって、蛍光標識又は光散乱標識
   が結合された第２の特異的結合メンバーと結合した被測定物質と、特異的に結合して前記
   特異的結合物を構成しうる第１の特異的結合メンバーが、少なくとも一表面に固定されて
   いる反応部と、出光側縁面を有する透明な導波路の一面に第一の空間層を介して透明基材
   層が積層され、他面に第二の空間層を介して光吸収層が積層されており、前記第一の空間
   層と第二の空間層は連通された、流体試料注入するための層であり、導波路の屈折率が流
   体試料の屈折率より大きいことを特徴とする光学的測定装置。
2. 透明基材層に、流体試料を空間層に供給するための連通孔が穿設されていることを特徴
   とする請求項１記載の光学的測定装置。
3. 透明基材層の外表面に反応部に対応する位置を除いて遮光層が積層されていることを特
   徴とする請求項１又は２記載の光学的測定装置。
4. 遮光層が光吸収層であることを特徴とする請求項３記載の光学的測定装置。
5. 光吸収層の第二の空間層側であって、反応部に対応する位置に光反射層が積層されてい
   ることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
6. 導波路が、ガラス、石英、アクリル系樹脂、ポリカーボネート樹脂及びポリスチレン系
   樹脂よりなる群から選ばれた材料よりなることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項
   に記載の光学的測定装置。
7. 光吸収層が、合成樹脂と着色剤よりなる黒色の層であることを特徴とする請求項１〜６
   のいずれか１項に記載の光学的測定装置。
8. 導波路の出光側縁面から反応部までの距離が、蛍光又は散乱光が導波路内を全反射して
   伝播する１往復の距離の２倍以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に
   記載の光学的測定装置。
9. 蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の特異的結合メンバーと、被測定物質を含む
   流体試料を、請求項１〜８項のいずれか１項に記載の光学的測定装置の第一の空間層と第
   二の空間層に供給し、被測定物質を介して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第２の
   特異的結合メンバーと、反応部に固定された第１の特異的結合メンバーとを結合させ、特
   異的結合物を形成した後、該特異的結合物に光線を照射し、蛍光標識又は光散乱標識によ
   って変換又は散乱された蛍光又は散乱光を導波路に導入し、導波路を反射しながら伝播し
   、出光側縁面から出光した蛍光又は散乱光を受光素子で測定することを特徴とする特異的
   結合物の光学的測定方法。
10. 被測定物質が抗体又は抗原であり、第１の特異的結合メンバーと第２の特異的結合メン
    バーはそれに特異的に結合する抗原又は抗体であることを特徴とする請求項９記載の特異
    的結合物の光学的測定方法。
11. 蛍光標識が、希土類金属錯体であることを特徴とする請求項９又は１０記載の特異的結
    合物の光学的測定方法。
12. 蛍光標識が、蛍光を発生する化合物を含有する合成樹脂粒子であることを特徴とする請
    求項９、１０又は１１記載の特異的結合物の光学的測定方法。

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