JP2014066720A - 光導波路型センサチップ、光導波路型センサチップの製造方法、物質の測定方法、物質測定用キットおよび光導波路型センサ - Google Patents

Abstract

【課題】より少量の被測定検体量で、より短時間において、被測定検体の測定対象物質を定量測定することが可能な光導波路型センサを提供する。
【解決手段】測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路；および前記光導波路表面に分散し、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子；を備えることを特徴とする光導波路型センサ。
【選択図】図１

Description

本発明は、光導波路型センサチップ、光導波路型センサチップの製造方法、物質の測定方法、物質測定用キットおよび光導波路型センサに関する。

従来の抗原抗体反応を利用した免疫測定は、通常、被測定検体中のタンパク質等に対応する一次抗体をウエル状の基材表面に固定化する。ウエル内に各々所定量の被測定検体溶液、二次抗体液、発色試薬を順次滴下する。各溶液の滴下毎に所定の洗浄液をそれぞれ行なう。このような免疫測定は測定者が秤量しつつ加え、かつ排出するという複雑な手順で行われている。この免疫測定において、被測定検体の容量は少なくとも５μＬ〜２５μＬ程度必要である。

一方、本出願人が出願した特許文献１には必要最小の被測定検体の量が１μＬである上、被測定検体の容量が不正確でも被測定検体の測定対象物質の濃度測定が可能な濃度測定方法、センサチップが開示されている。

ＷＯ２００５／０２２１５５号

しかしながら、従来の免疫測定システムにおいては一次抗体と被測定検体との反応、被測定検体と二次抗体との反応にそれぞれ一時間程度を要する上に、既述のような複雑な手順を踏む必要があるため被測定検体の採取から測定結果を得るまでに数時間を要する課題がある。また、必要とされる被測定検体の量が多いため、例えばラット等の小動物を用いた血液検査では数種類の検査項目を１回行うのに１検体が犠牲となる。その結果、同一検体での経時変化を検査することが困難である。

本発明は、前述した特許文献１の発明をさらに改良し、より少量の被測定検体量で、より短時間において、被測定検体の測定対象物質を定量測定することが可能な光導波路型センサチップ、光導波路型センサチップの製造方法、物質の測定方法および物質測定用キット、光導波路型センサを提供するものである。

本発明の第１態様によると、平面光導波路；
平面光導波路の表面に設けられ、被測定検体溶液が導入される反応ホールを形成するセル壁；
前記反応ホール内の前記平面光導波路領域の表面の一部に固定化され、前記被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質；
前記反応ホール内の前記平面光導波路の領域に導入され、前記被測定検体溶液中の前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子；および
前記平面光導波路に前記反応ホールを挟むようにそれぞれ配置され、光の入射により前記反応ホール内の領域を含む前記平面光導波路で多重反射させるための入射側グレーティングおよび出射側グレーティング；
を備えることを特徴とする光導波路型センサチップが提供される。

本発明の第２態様によると、平面光導波路と、平面光導波路の表面に設けられ、被測定検体溶液が導入される反応ホールを形成するセル壁と、前記反応ホール内の前記平面光導波路領域の表面の一部に固定化され、前記被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質と、前記反応ホール内の前記平面光導波路領域に導入され、前記被測定検体溶液中の前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子と、前記平面光導波路に前記反応ホールを挟むようにそれぞれ配置され、光の入射により前記反応ホール内の領域を含む前記平面光導波路で多重反射させるための入射側グレーティングおよび出射側グレーティングとを備える光導波路型センサチップを用意すること；
前記センサチップの反応ホール内の前記平面光導波路表面に前記被測定検体溶液を滴下して前記平面光導波路表面の第１物質と前記被測定検体溶液中の測定対象物質との間で特異的に反応させると共に、前記測定対象物質と前記反応ホール内の前記平面光導波路領域に導入された前記微粒子の第２物質との間で特異的に反応させること；および
光を前記入射側グレーティングから入射し、前記反応ホール内の領域を含む前記平面光導波路で多重反射させ、前記出射側グレーティングから出射する間にエバネセント光を前記反応ホール内の領域を含む前記平面光導波路表面に発生し、前記反応ホール内の前記平面光導波路領域の表面に第１物質および測定対象物質を介して固定化された微粒子での前記エバネセント光の吸収または散乱によるエバネセント光の減衰に伴う前記出射側グレーティングからの光強度の低下を検出すること；
を含むことを特徴とする物質の測定方法が提供される。

本発明の第３態様によると、平面光導波路と、平面光導波路の表面に設けられ、被測定検体溶液が導入される反応ホールを形成するセル壁と、前記反応ホール内の前記平面光導波路領域の表面の一部に固定化され、前記被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質と、前記反応ホール内の前記平面光導波路領域に導入され、前記被測定検体溶液中の前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子と、前記平面光導波路に前記反応ホールを挟むようにそれぞれ配置され、光の入射により前記反応ホール内の領域を含む前記平面光導波路で多重反射させるための入射側グレーティングおよび出射側グレーティングとを備える光導波路型センサチップ；
前記センサチップの入射側グレーティングに光を入射させる光源；および
前記センサチップの出射側グレーティングから出射される光を受光する受光素子；
を具備することを特徴とする光導波路型センサが提供される。

本発明によれば、より少量の被測定検体量で、より短時間において、被測定検体の測定対象物質を定量測定することが可能な光導波路型センサチップ、光導波路型センサチップの製造方法および光導波路型センサを提供することができる。

また本発明によれば、より少量の被測定検体量で、より短時間において、被測定検体の測定対処物質を定量することが可能な物質の測定方法を提供することができる。

さらに本発明によれば、より少量の被測定検体量で、より短時間において、被測定検体の測定対処物質を定量測定することが可能な物質測定用キットを提供することができる。

第１実施形態に係る光導波路型センサチップを有する光導波路型センサを示す断面図である。 第１実施形態における被測定検体の測定対象物質の測定工程を示す概略図である。 第２実施形態に係る光導波路型センサチップを有する光導波路型センサを示す断面図である。 第２実施形態における物質の測定工程を示す概略図である。 第３実施形態に係る物質の測定方法に用いられる光導波路型センサチップを示す断面図である。 第３実施形態における物質の測定工程を示す概略図である。 第４実施形態における物質の測定工程を示す概略図である。 第５実施形態に係る物質測定用キットの光導波路型センサチップを示す断面図である。 第５実施形態における物質の測定工程を示す概略図である。 実施例１のインスリンの濃度測定における時間経過に伴うレーザ光強度の変化を示す特性図である。 実施例２のインスリンの濃度測定における時間経過に伴うレーザ光強度の変化を示す特性図である。 実施例３のインスリンの濃度測定における時間経過に伴うレーザ光強度の変化を示す特性図である。 実施例４のインスリンの濃度測定における時間経過に伴うレーザ光強度の変化を示す特性図である。

以下、本発明に係る実施の形態として、光導波路型センサ、光導波路型センサチップの製造方法、物質の測定方法、物質測定用キットおよび光導波路型センサを詳細に説明する。

（第１実施形態）
第１実施形態に係る光導波路型センサチップは、測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、この光導波路上に分散し、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子とを備えている。

ここで測定対象物質は、例えば血液、血清、血漿、生体試料、食品等の中に含まれる蛋白質、ペプチド、遺伝子等が挙げられる。具体的には、インスリン、カゼイン、β―ラクトグロブリン、オボアルブミン、カルシトニン、Ｃ−ペプチド、レプチン、β−２−ミクログロブリン、レチノール結合タンパク、α−１−ミクログロブリン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、トロポニン−Ｉ、クルカゴン様ペプチド、インスリン様ペプチド、腫瘍増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板成長因子、上皮増殖因子、コルチゾール、トリヨードサイロニン、サイロキシン等のハプテンホルモン、ジゴキシン、テオフィリン等の薬物、細菌、ウイルス等の感染性物質、肝炎抗体、ＩｇＥの他、そばの主要タンパク質複合体、落花生のＡｒａｈ２を含む可溶性タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、以下の第２実施形態から第５実施形態における測定対象物質も同様なものが用いられる。

光導波路は、例えば平面光導波路を用いることができる。この平面光導波路は、例えばフェノール樹脂、エポキシ樹脂のような熱硬化性樹脂または無アルカリガラスから形成することができる。詳細には、ここで用いる材料とは、所定の光の透過性を有する材料であって、特に、ポリスチレンを主たる構造とするエポキシ樹脂等であることが好ましい。平面光導波路への被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質の固定化は、例えばシランカップリング剤等により疎水化処理した表面上に前記物質の疎水性相互作用により固定化する。第１物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。

ここで「光導波路上に微粒子が分散される」とは、微粒子が光導波路表面に直接的または間接的に分散されることを意味する。「微粒子が光導波路表面に間接的に分散される」形態は、例えば微粒子が光導波路表面にブロッキング層を介して分散される形態が挙げられる。ブロッキング層は、例えばポリビニルアルコール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール、リン脂質ポリマー、ゼラチン、糖類（例えばスクロース、トレハロース）のような水溶性物質を含む。ブロッキング層は、さらにプロテーインヒビタを含んでもよい。

微粒子は、例えばポリスチレン製のラテックスビーズ（商品名）のような樹脂ビーズもしくは金コロイドのような金属コロイド、または酸化チタン粒子のような無機酸化物粒子を用いることができる。微粒子は、アルブミンのようなタンパク質、アガロースのような多糖類、シリカ粒子、カーボン粒子のような非金属粒子も用いることができる。特に、ラテックスビーズ、金属コロイドが好ましい。ラテックスビーズの中で、後述する光導波路を伝播させる光が赤色レーザの場合、青色ラテックスビーズが好ましい。

微粒子は、５０ｎｍ〜１０μｍの径を有することが好ましい。

第２物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。

次に、第１実施形態に係る光導波路型センサチップの製造方法を説明する。

まず、光導波路表面に測定対象物質と特異的に反応する第１物質を固定化する。つづいて、微粒子に被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質を例えば物理吸着、あるいはカルボキシル基やアミノ基等を介した化学結合により固定化する。ひきつづき、第２物質が固定化された微粒子を水溶性物質を含む生理食塩水に分散させてスラリを調製する。このスラリを光導波路上に塗布した後、乾燥して前記光導波路上に前記微粒子を分散させて光導波路型センサチップを製造する。

このような製造方法において、水溶性物質は例えばポリビニルアルコール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール、リン脂質ポリマー、ゼラチン、糖類（例えばスクロース、トレハロース）を用いることができる。また、乾燥は微粒子の分散性を向上するために凍結乾燥が好ましい。

第１実施形態に係る光導波路型センサチップを図１を参照して具体的に説明する。図１は、第１実施形態に係る光導波路型センサチップを示す断面図である。

ガラス基板１の主面の両端部には、入射側グレーティング２ａおよび出射側グレーティング２ｂが設けられている。これらのグレーティング２ａ，２ｂは、例えば酸化チタン（ＴｉＯ₂）、酸化錫（ＳｎＯ₂）、酸化亜鉛、ニオブ酸リチウム、ガリウム砒素（ＧａＡｓ）、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）、ポリイミド等から形成される。例えば熱硬化性樹脂からなる平面光導波路３は、グレーティング２ａ，２ｂを含む基板１主面に形成されている。低屈折率樹脂膜４は、平面光導波路３上に被覆されている。低屈折率樹脂は、例えば、市販されている旭硝子株式会社製のサイトップ（登録商標）のポリ（パーフルオロブテニルビニルエーテル）等を用いることができる。低屈折率樹脂膜４には、グレーティング２ａ，２ｂ間に位置する平面光導波路３の一部が露出するよう開口して例えば矩形状の反応ホール５を形成している。枠状のセル壁６は、平面光導波路３を露出させる反応ホール５を囲むように低屈折率樹脂膜４上に形成されている。

被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質１１は、反応ホール（測定域）５から露出する平面光導波路３表面に例えばシランカップリング剤により疎水化処理により固定化されている。被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質１２が固定化された微粒子１３は、前記物質１１が固定化された平面光導波路３表面に分散されている。この微粒子１３の分散は、例えば微粒子および水溶性物質を含むスラリを平面光導波路３に塗布、凍結乾燥することによりを形成される。

第１実施形態に係る光導波路型センサは、前述した光導波路型センサチップの入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に光を入射させるための光源（例えば赤色レーザダイオード）２１と、出射側グレーティング２ｂから出射される光を受光する受光素子（例えばフォトダイオード）２２を備えている。

次に、前述した光導波路型センサを用いて物質の測定方法を図２の（Ａ）〜（Ｃ）を参照して説明する。

まず、図２の（Ａ）に示す光導波路型センサチップを用意する。このセンサチップは、グレーティング２ａ，２ｂを有する基板１を備えている。平面光導波路３はグレーティング２ａ，２ｂを含む基板１主面に形成されている。低屈折率樹脂膜４は、平面光導波路３上に被覆され、グレーティング２ａ，２ｂ間に位置する平面光導波路３の一部が露出するよう開口して例えば矩形状の反応ホール５が形成されている。被測定検体の測定対象物質（例えば抗原）と特異的に反応する第１物質（例えば第１抗体）１１は反応ホール５に露出される平面光導波路３表面に固定化されている。被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質（例えば第２抗体）１２が固定化された複数の微粒子１３は、平面光導波路３上に分散されている。

次いで、反応ホール５内の前記微粒子１３の分散領域を含む平面光導波路３表面に被測定検体溶液を滴下する。このとき、滴下した被測定検体溶液中に平面光導波路３表面の第１抗体１１と微粒子１３の第２抗体１２と特異的に反応する抗原が存在しないと、図２の（Ｂ）に示すように微粒子１３の第２抗体１２は平面光導波路３表面の第１抗体１１と結合することなく被測定検体溶液１４に分散する。この状態で、赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させても、反応ホール５内の被測定検体溶液１４中の微粒子１３が分散しているため、微粒子１３がエバネッセント光領域に殆ど存在しなくなる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に殆ど関与しないため、エバネッセント光の強度の減衰が殆ど起きない。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が殆ど変化しない。

一方、滴下した被測定検体溶液１４中に抗原が存在すると、図２の（Ｃ）に示すように抗原１５は平面光導波路３表面の第１抗体１１と抗原抗体反応を生じて結合し、さらに微粒子１３の第２抗体１２は抗原１５と抗原抗体反応を生じて結合する。つまり、平面光導波路３表面の第１抗体１１と微粒子１３の第２抗体１２の間で抗原１５を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が平面光導波路３表面に対して固定化される。

前記被測定検体溶液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、微粒子１３が平面光導波路３表面に対して固定化されているため、微粒子１３がエバネッセント光領域に存在することになる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度の減衰が起きる。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化された微粒子１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。

フォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、平面光導波路３表面に対して固定化される微粒子１３の量、つまり抗原抗体反応に関与する被測定検体溶液１４中の抗原濃度に比例する。したがって、抗原濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、抗原濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中の抗原濃度を測定できる。

なお、前記濃度測定において微粒子を平面光導波路上に水溶性物質と共に分散させることによって、微粒子の分散性が向上する。また、被測定検体溶液を平面光導波路に滴下した時に微粒子と共存する水溶性物質が溶解して微粒子の移動を可能にし、被測定検体溶液中の測定対象物質と微粒子の第２物質との円滑な反応を達成できる。

以上、第１実施形態によれば、必要最小の被測定検体量が少量（例えば１０μＬ以下）で、被測定検体を測定域に滴下する１回の操作で被測定検体の測定対処物質の濃度を定量することが可能な光導波路型センサチップ、その製造方法および光導波路型センサを提供することができる。

また、第１実施形態によれば、必要最小の被測定検体量が少量（例えば１０μＬ以下）で、被測定検体を測定域に滴下する１回の操作で被測定検体の測定対処物質の濃度を定量することが可能な物質の測定方法を提供できる。

（第２実施形態）
第２実施形態に係る光導波路型センサチップは、測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、この光導波路と対向して配置された支持板と、この支持板の前記光導波路と対向する表面に分散され、前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子とを備える。

光導波路は、例えば平面光導波路を用いることができる。この平面光導波路は、第１実施形態で説明したのと同様、熱硬化性樹脂または無アルカリガラスから形成することができる。

平面光導波路への被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質は、第１実施形態で説明したのと同様な方法で固定化される。第１物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。

微粒子は、第１実施形態で説明したのと同様、例えばラテックスビーズのような樹脂ビーズもしくは金コロイドのような金属コロイド、または酸化チタン粒子のような無機酸化物粒子等を用いることができる。微粒子は、アルブミンのようなタンパク質、アガロースのような多糖類、シリカ粒子、カーボン粒子のような非金属粒子も用いることができる。特にラテックスビーズ、金属コロイドが好ましい。微粒子は、５０ｎｍ〜１０μｍの径を有することが好ましい。

第２物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。

次に、第２実施形態に係る光導波路型センサチップの製造方法を説明する。

まず、光導波路表面に測定対象物質と特異的に反応する第１物質を固定化する。つづいて、微粒子に被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質を例えば物理吸着、あるいはカルボキシル基やアミノ基等を介した化学結合により固定化する。ひきつづき、第２物質が固定化された微粒子を水溶性物質を含む生理食塩水に分散させてスラリを調製する。このスラリを支持板表面に塗布した後、乾燥して前記支持板上に前記微粒子を分散させる。その後、光導波路に支持板をその微粒子分散面が対向するように一定の距離をあけて配置することにより光導波路型センサチップを製造する。

このような製造方法において、水溶性物質は例えばポリビニルアルコール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール、リン脂質ポリマー、ゼラチン、糖類（例えばスクロース、トレハロース）を用いることができる。また、乾燥は微粒子の分散性を向上するために凍結乾燥が好ましい。

第２実施形態に係る光導波路型センサを図３を参照して具体的に説明する。図３は、第２実施形態に係る光導波路型センサチップを示す断面図である。

ガラス基板１の主面の両端部には、例えば酸化チタンからなる入射側グレーティング２ａおよび出射側グレーティング２ｂが設けられている。例えば熱硬化性樹脂からなる平面光導波路３は、グレーティング２ａ，２ｂを含む基板１主面に形成されている。低屈折率樹脂膜４は、平面光導波路３上に被覆されている。低屈折率樹脂膜４には、グレーティング２ａ，２ｂ間に位置する平面光導波路３の一部が露出するよう開口して例えば矩形状の反応ホール５を形成している。例えば合成樹脂からなる支持板７は、低屈折率樹脂膜４上に反応ホール５を覆うように形成されている。被測定検体溶液の滴下用穴（図示せず）は、支持板７表面から反応ホール５に向けて穿設されている。

被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質１１は、反応ホール（測定域）５に露出される平面光導波路３表面に例えばシランカップリング剤により疎水化処理により固定化されている。被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質１２が固定化された微粒子１３は、反応ホール５に露出され、平面光導波路３と対向する支持板７表面（下面）に分散されている。この微粒子１３の分散は、例えば微粒子および水溶性物質を含むスラリを前記支持板表面に塗布し、凍結乾燥することによりを形成される。

第２実施形態に係る光導波路型センサは、前述した光導波路型センサチップの入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に光を入射させるための光源（例えば赤色レーザダイオード）２１と、出射側グレーティング２ｂから出射される光を受光する受光素子（例えばフォトダイオード）２２を備えている。

次に、前述した光導波路型センサを用いて物質の測定方法を図４の（Ａ）〜（Ｃ）を参照して説明する。

まず、図４の（Ａ）に示す光導波路型センサチップを用意する。このセンサチップは、グレーティング２ａ，２ｂを有する基板１を備えている。平面光導波路３はグレーティング２ａ，２ｂを含む基板１主面に形成されている。低屈折率樹脂膜４は、平面光導波路３上に被覆され、グレーティング２ａ，２ｂ間に位置する平面光導波路３の一部が露出するよう開口して例えば矩形状の反応ホール５が形成されている。被測定検体の測定対象物質（例えば抗原）と特異的に反応する第１物質（例えば第１抗体）１１は反応ホール５に露出される平面光導波路３表面に固定化されている。支持板７は、低屈折率樹脂膜４上に反応ホール５を覆うように形成されている。被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質（例えば第２抗体）１２が固定化された複数の微粒子１３は、反応ホール５に露出される支持板７下面に分散されている。

次いで、反応ホール５内に被測定検体溶液を被測定検体溶液の滴下用穴（図示せず）を通して滴下する。このとき、滴下した被測定検体溶液中に平面光導波路３表面の第１抗体１１と微粒子１３の第２抗体１２と特異的に反応する抗原が存在しないと、図４の（Ｂ）に示すように微粒子１３の第２抗体１２は平面光導波路３表面の第１抗体１１と結合することなく、被測定検体溶液１４中に分散する。この状態で、赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させても、被測定検体溶液１４中に微粒子１３が分散するため、微粒子１３がエバネッセント光領域に殆ど存在しなくなる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に殆ど関与しないため、エバネッセント光の強度の減衰が殆ど起きない。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が殆ど変化しない。

一方、滴下した被測定検体溶液１４中に抗原が存在すると、図４の（Ｃ）に示すように抗原１５は平面光導波路３表面の第１抗体１１と抗原抗体反応を生じて結合し、さらに微粒子１３の第２抗体１２は抗原１５と抗原抗体反応を生じて結合する。つまり、平面光導波路３表面の第１抗体１１と微粒子１３の第２抗体１２の間で抗原１５を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が平面光導波路３表面に対して固定化される。

前記被測定検体溶液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、微粒子１３が平面光導波路３表面に対して固定化されているため、微粒子１３がエバネッセント光領域に存在することになる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度の減衰が起きる。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化された微粒子１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。

フォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、平面光導波路３表面に対して固定化される微粒子１３の量、つまり抗原抗体反応に関与する被測定検体溶液１４中の抗原濃度に比例する。したがって、抗原濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、抗原濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中の抗原濃度を測定できる。

なお、前記濃度測定において微粒子を平面光導波路上に水溶性物質と共に分散させることによって、微粒子の分散性が向上する。また、被測定検体溶液を平面光導波路に滴下した時に微粒子と共存する水溶性物質が溶解して微粒子の移動を可能にし、被測定検体溶液中の測定対象物質と微粒子の第２物質との円滑な反応を達成できる。

以上、第２実施形態によれば、必要最小の被測定検体量が少量（例えば１０μＬ以下）で、被測定検体を測定域に滴下する１回の操作で被測定検体の測定対処物質の濃度を定量することが可能な光導波路型センサチップ、その製造方法および光導波路型センサを提供することができる。

また、第２実施形態によれば、必要最小の被測定検体量が少量（例えば１０μＬ以下）で、被測定検体を測定域に滴下する１回の操作で被測定検体の測定対処物質の濃度を定量することが可能な物質の測定方法を提供できる。

（第３実施形態）
第３実施形態に係る物質の測定方法を以下に説明する。

最初に、測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路を備える光導波路型センサチップを用意する。つづいて、光導波路表面に被測定検体溶液を滴下して光導波路表面の第１物質と被測定検体溶液中の測定対象物質との間で特異的に反応させる。ひきつづき、光導波路表面を洗浄する。次いで、光導波路表面に前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を滴下して被測定検体溶液の測定対象物質と微粒子の第２物質との間で特異的に反応させる。その後、光導波路表面に第１物質および測定対象物質を介して固定化された微粒子による光学的変化を検出することにより被測定検体溶液中の測定対象物質の濃度を測定する。

光導波路は、例えば平面光導波路を用いることができる。この平面光導波路は、第１実施形態で説明したのと同様、熱硬化性樹脂または無アルカリガラスから形成することができる。平面光導波路への被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質は、第１実施形態で説明したのと同様な方法で固定化される。第１物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。

洗浄は、例えば緩衝液と界面活性剤等を組み合わせた溶液、界面活性剤を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝生理食塩水、グッドバッファー緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液等からなる洗浄液が用いて行うことができる。

微粒子は、第１実施形態で説明したのと同様、例えばラテックスビーズのような樹脂ビーズもしくは金コロイドのような金属コロイド、または酸化チタン粒子のような無機酸化物粒子等を用いることができる。微粒子は、アルブミンのようなタンパク質、アガロースのような多糖類、シリカ粒子、カーボン粒子のような非金属粒子も用いることができる。特に、ラテックスビーズ、金属コロイドが好ましい。微粒子は、５０ｎｍ〜１０μｍの径を有することが好ましい。

第２物質は、第１実施形態で説明したのと同様な方法で微粒子に固定化される。第２物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。

微粒子の分散液は、例えばリン酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸、酢酸、クエン酸、炭酸等を含む緩衝液あるいはグッドバッファーに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン界面活性剤を添加したもの、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を含む。

第３実施形態に係る物質の測定方法を図５に示す光導波路型センサチップおよび図６の（Ａ）〜（Ｃ）を参照して具体的に説明する。

まず、図５および図６の（Ａ）に示す光導波路型センサチップを用意する。このセンサチップは、第１実施形態で説明した図１の微粒子の分散層を持たない以外、同様な構造を有する。すなわち、グレーティング２ａ，２ｂを有する基板１を備えている。平面光導波路３はグレーティング２ａ，２ｂを含む基板１主面に形成されている。低屈折率樹脂膜４は、平面光導波路３上に被覆され、グレーティング２ａ，２ｂ間に位置する平面光導波路３の一部が露出するよう開口して例えば矩形状の反応ホール５が形成されている。被測定検体の測定対象物質（例えば抗原）と特異的に反応する第１物質（例えば第１抗体）１１は反応ホール５に露出される平面光導波路３表面に固定化されている。図５において、反応ホール５に位置する平面光導波路３でのエバネッセント光の変化を測定するために入射側グレーティング２ａに光を入射させるレーザ発振器（例えば赤色レーザダイオード）２１を設置し、出射側グレーティング２ｂから出射される光を受光する光電変換素子（フォトダイオード）２２を設置する。

次いで、反応ホール５内に被測定検体溶液を滴下する。このとき、図６の（Ｂ）に示すように滴下した被測定検体溶液中の抗原１５は、平面光導波路３表面の第１抗体１１と抗原抗体反応を生じて結合する。

次いで、洗浄処理して平面光導波路３表面の第１抗体１１と反応しない抗原１５を洗い流す。つづいて、測定対象物質である抗原と特異的に反応する第２物質（例えば第２抗体）が固定化された微粒子の分散液を反応ホール５内に滴下する。このとき、図６の（Ｃ）に示すように分散液１６中で平面光導波路３表面の第１抗体１１と抗原抗体反応した測定対象物質である抗原１５と微粒子１３の第２抗体１２とが抗原抗体反応して結合される。すなわち、平面光導波路３表面の第１抗体１１と微粒子１３の第２抗体１２の間で抗原１５を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が平面光導波路３表面に対して固定化される。

微粒子の分散液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、微粒子１３が平面光導波路３表面に対して固定化されているため、エバネッセント光領域に微粒子１３が存在することになる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度の減衰が起きる。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化された微粒子１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。

フォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、平面光導波路３表面に対して固定化される微粒子１３の量、つまり抗原抗体反応に関与する被測定検体溶液１４中の抗原濃度に比例する。したがって、抗原濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、抗原濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中の抗原濃度を測定できる。

以上、第３実施形態によれば必要最小の被測定検体量が少量（例えば１０μＬ以下）で、被測定検体溶液の測定域への滴下、洗浄および微粒子分散液の測定域への滴下の３回の操作で被測定検体の測定対処物質の濃度を定量することが可能な被測定検体の測定対象物の測定方法を提供することができる。

特に、第３実施形態では被測定検体溶液の測定域への滴下後に洗浄を行うため、被測定検体溶液の測定対象物質（例えば抗原）の濃度が高い場合に有効である。

（第４実施形態）
第４実施形態に係る物質の測定方法を以下に説明する。

最初に、測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路を備える光導波路型センサチップを用意する。予め、被測定検体溶液および被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子を例えばマイクロチューブのような容器内で混合し、微粒子の第２物質と被測定検体溶液の測定対象物質とを特異的に反応させる。つづいて、前記混合液を前記センサチップの光導波路表面に滴下して光導波路表面の第１物質と微粒子の第２物質に反応した被測定検体溶液の測定対象物質とを特異的に反応させる。次いで、光導波路表面に第１物質および測定対象物質を介して固定化された微粒子、つまり光導波路表面に固定化された微粒子、による光学的変化を検出することにより被測定検体溶液中の測定対象物質の濃度を測定する。

光導波路は、例えば平面光導波路を用いることができる。この平面光導波路は、第１実施形態で説明したのと同様、熱硬化性樹脂または無アルカリガラスから形成することができる。平面光導波路への被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質は、第１実施形態で説明したのと同様な方法で固定化される。第１物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。

微粒子は、第１実施形態で説明したのと同様、例えばラテックスビーズのような樹脂ビーズもしくは金コロイドのような金属コロイド、または酸化チタン粒子のような無機酸化物粒子等を用いることができ、特にラテックスビーズ、金属コロイドが好ましい。

微粒子は、５０ｎｍ〜１０μｍの径を有することが好ましい。

第２物質は、第１実施形態で説明したのと同様な方法で微粒子に固定化される。第２物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。

微粒子は、例えばリン酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸、酢酸、クエン酸、炭酸等を含む緩衝液あるいはグッドバッファーに、ウシ血清アルプミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン界面活性剤を添加したもの、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等に分散して微粒子の分散液を調製することができる。

被測定検体溶液および被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の混合において、微粒子は分散液の状態であっても、固体（例えば乾固物、凍結物または粉末）の状態であってもよい。具体的には、予め微粒子の分散液を調製して、この分散液と被測定検体溶液を例えばマイクロチューブのような容器内で混合してもよい。また、被測定検体溶液および第２物質が固定化された微粒子を例えばマイクロチューブのような容器内で混合するにあたり、容器内に水溶性物質を含む微粒子の分散液を先に入れ、乾燥、例えば凍結乾燥させて容器内面に微粒子を水溶性物質を介在して分散させ、その後容器内に被測定検体溶液を入れて混合してもよい。水溶性物質は例えばポリビニルアルコール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール、リン脂質ポリマー、ゼラチン、糖類（例えばスクロース、トレハロース）を用いることができる。

第４実施形態に係る測定方法を前述した図５に示す光導波路型センサチップおよび図７の（Ａ），（Ｂ）を参照して具体的に説明する。

まず、図５および図７の（Ａ）に示すように反応ホール５に露出した平面光導波路３表面に被測定検体の測定対象物質（例えば抗原）と特異的に反応する第１物質（例えば第１抗体）１１を固定化した光導波路型センサを用意する。

予め、被測定検体溶液および測定対象物質である抗原と特異的に反応する第２物質（例えば第２抗体）が固定化された微粒子の分散液を例えばマイクロチューブ内で混合し、被測定検体溶液の光源と微粒子の第２抗体とを抗原抗体反応を生じさせる。

次いで、反応ホール５内に前記混合液を滴下する。このとき、図７の（Ｂ）に示すよう混合液の既に第２抗体と抗原抗体反応した被測定検体溶液中の抗原１５は、平面光導波路３表面の第１抗体１１と抗原抗体反応を生じて結合する。すなわち、微粒子１３の第２抗体１２が予め結合された抗原１５は平面光導波路３表面の第１抗体１１に抗原抗体反応を生じる結合し、結果として微粒子１３が平面光導波路３表面に対して固定化される。

前記被測定検体溶液および微粒子の分散液の滴下直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング２ａから平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させると、微粒子１３が平面光導波路３表面に対して固定化されているため、エバネッセント光領域に微粒子１３が存在することになる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度の減衰が起きる。その結果、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化された微粒子１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。

フォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、平面光導波路３表面に対して固定化される微粒子１３の量、つまり抗原抗体反応に関与する被測定検体溶液１４中の抗原濃度に比例する。したがって、抗原濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、抗原濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中の抗原濃度を測定できる。

以上、第４実施形態によれば必要最小の被測定検体量が少量（例えば１０μＬ以下）で、被測定検体溶液および微粒子分散液を測定域に滴下の１回の操作で被測定検体の測定対処物質の濃度を定量することが可能な被測定検体の測定対象物の測定方法を提供することができる。

なお、前述した第４実施形態において光導波路表面に滴下される被測定検体溶液および微粒子の分散液は予め混合する代わりに、被測定検体溶液および微粒子の分散液を光導波路表面に同時に滴下してもよい。

前述した第４実施形態において、被測定検体溶液および微粒子の分散液は光導波路表面に混合後に滴下したが、被測定検体溶液を滴下後に微粒子の分散液を滴下する順序、微粒子の分散液を滴下後に被測定検体溶液を滴下する順序、にしてもよい。このような順序での物質の測定方法でも、第４実施形態と同様、必要最小の被測定検体量が少量（例えば１０μＬ以下）でも被測定検体の測定対処物質の濃度を定量することができる。

（第５実施形態）
第５実施形態に係る物質測定用キットを以下に説明する。

物質測定用キットは、光導波路型センサチップと、被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を収容した包装体とを組み合わせて構成される。光導波路型センサチップは、被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質が表面に固定化された光導波路と、この光導波路上に配置され、光導波路に対向して測定域を形成するための凹部を有し、かつこの測定域と連通する導入孔および排出孔が開口されたキャップとを備える。

平面光導波路への被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質は、第１実施形態で説明したのと同様な方法で固定化される。第１物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。

包装体に収容される微粒子は、第１実施形態で説明したのと同様、例えばスチレン製のラテックスビーズのような樹脂ビーズもしくは金コロイドのような金属コロイド、または酸化チタン粒子のような無機酸化物粒子等を用いることができる。微粒子は、アルブミンのようなタンパク質、アガロースのような多糖類、シリカ粒子、カーボン粒子のような非金属粒子も用いることができる。特に、ラテックスビーズ、金属コロイドが好ましい。微粒子は、５０ｎｍ〜１０μｍの径を有することが好ましい。

第２物質は、第１実施形態で説明したのと同様な方法で微粒子に固定化される。第２物質は、例えば被測定検体の測定対象物質が抗原の場合、抗体を用いることができる。

微粒子の分散液は、例えばリン酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸、酢酸、クエン酸、炭酸等を含む緩衝液あるいはグッドバッファーに、ウシ血清アルプミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン界面活性剤を添加したもの、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を含む。

包装体は、例えばポリエチレン膜またはポリエチレンとポリエチレンテレフタレートの積層膜から作ることができる。また、包装体はマイクロチューブ、プラスチックボトル、ガラス瓶を用いることができる。

第５実施形態に係る物質測定用キットを図８の（ａ），（ｂ）を参照して具体的に説明する。図８の（ａ）は、光導波路型センサチップを示す平面図、同図（ｂ）は同図（ａ）の断面図である。

ガラス基板３１の主面の両端部には、例えば酸化チタンからなる入射側グレーティング３２ａおよび出射側グレーティング３２ｂが設けられている。例えば熱硬化性樹脂からなる平面光導波路３３は、グレーティング３２ａ，３２ｂを含む基板３１主面に形成されている。例えばアクリル樹脂のような樹脂から作られるキャップ３４は、平面光導波路３３の主面および側面を覆うように配置されている。なお、ここでは、キャップ３４の材料に、所定の低屈折率を有する他の樹脂等を代用することも可能である。キャップ３４には、平面光導波路３３表面との間で例えば矩形状の測定域３５を形成するための矩形凹部３６を有する。また、キャップ３４にはその表面から測定域３５に至る導入孔３７および排出孔３８が開口されている。被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第１物質１１は、測定域３５に露出される平面光導波路３３表面に例えばシランカップリング剤により疎水化処理により固定化されている。このような平面光導波路３３、キャップ３４等により光導波路型センサチップを構成している。

被測定検体の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液は、例えばポリエチレン製の包装体（図示せず）に収容されて、前述の光導波路型センサチップと組み合わされて測定用のキットを構成している。

次に、前述したキットを使用して物質の測定方法を図９の（Ａ）〜（Ｃ）を参照して説明する。なお、測定域に露出する平面光導波路でのエバネッセント光の変化を測定するために入射側グレーティング３２ａに光を入射させるレーザ発振器（例えば赤色レーザダイオード）２１を設置し、出射側グレーティング３２ｂから出射される光を受光する光電変換素子（フォトダイオード）２２を設置する。

まず、図８および図９の（Ａ）に示すように測定域３５に露出される平面光導波路３３表面に被測定検体の測定対象物質（例えば抗原）と特異的に反応する第１物質（例えば第１抗体）１１を固定化した光導波路型センサチップを用意する。

次いで、測定域３５内に被測定検体溶液を導入孔３７を通して滴下する。このとき、図９の（Ｂ）に示すように滴下した被測定検体溶液１４中の抗原１５は、平面光導波路３３表面の第１抗体１１と抗原抗体反応を生じて結合する。

次いで、包装体中の微粒子の分散液をキャップ３４の導入孔３７を通して測定域３５内の平面光導波路３３表面に導入すると共に、被測定検体溶液を排出孔３８を通して外部に排出する。この間、被測定検体液中の未反応の抗原は分散液とともに洗い流される。同時に、図９の（Ｃ）に示すように分散液１６中の微粒子１３の第２抗体１２が平面光導波路３３表面の第１抗体１１と抗原抗体反応した測定対象物質である抗原１５と抗原抗体反応して結合される。すなわち、平面光導波路３３表面の第１抗体１１と微粒子１３の第２抗体１２の間で抗原１５を介して抗原抗体反応を生じるために、微粒子１３が平面光導波路３３表面に対して固定化される。

前記微粒子の分散液の導入直後に赤色レーザダイオード２１から赤色レーザ光を入射側グレーティング３２ａから平面光導波路３３に入射させ、その平面光導波路３３を伝播させて表面（測定域３５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させた場合、分散液１６中で微粒子１３が平面光導波路３３表面に対して固定化されるため、エバネッセント光領域に微粒子１３が存在することになる。すなわち、微粒子１３がエバネッセント光の吸収や散乱に関与するため、エバネッセント光の強度の減衰が起きる。その結果、出射側グレーティング３２ｂから出射される赤色レーザ光をフォトダイオード２２で受光した際、そのレーザ光強度が固定化された微粒子１３の影響によって時間の経過に伴って低下する。

フォトダイオード２２で受光したレーザ光強度の低下率は、平面光導波路３３表面に対して固定化される微粒子１３の量、つまり抗原抗体反応に関与する被測定検体溶液１４中の抗原濃度に比例する。したがって、抗原濃度が既知の被測定検体溶液において時間の経過に伴うレーザ光強度の低下曲線を作成し、この曲線の所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、抗原濃度とレーザ光強度の低下率との関係を示す検量線を予め作成する。前記方法で測定した時間とレーザ光強度の低下曲線から所定の時間でのレーザ光強度の低下率を求め、このレーザ光強度の低下率を前記検量線と照合させることにより、被測定検体溶液中の抗原濃度を測定できる。

以上、第５実施形態の物質測定用キットによれば、光導波路と測定域への被測定検体溶液の滴下および微粒子の分散液の導入・排出が可能な構造の光導波路型センサチップ並びに微粒子の分散液を収容した包装体を組み合わせて構成するため、必要最小の被測定検体量が少量（例えば１０μＬ以下）で、被測定検体溶液の測定域への滴下および微粒子の分散液の測定域への導入・排出の２回の操作で被測定検体の測定対処物質の濃度を定量することができる。

特に、物質測定用キットの使用による被測定検体の測定対象物の測定方法おいて、被測定検体溶液の測定域への滴下後に微粒子の分散液の測定域への導入・排出を行うため、被測定検体溶液の測定対象物質（例えば抗原）の濃度が高い場合にも有効である。

以下、本発明の実施例を前述した図面を参照して詳細に説明する。

（実施例１）
屈折率１．５２の無アルカリガラス基板１に屈折率が２．２〜２．４の酸化チタンをスパッタリングして厚さ５０ｎｍの酸化チタン膜を成膜した後、リソグラフィーとドライエッチングによりガラス基板１上にグレーティング２ａ，２ｂを形成した。つづいて、グレーティング２ａ，２ｂを含むガラス基板１上にエポキシ樹脂溶液をスピンコートした後、焼成することにより厚さ約３０μｍの平面光導波路３を形成した。焼成後の平面光導波路３の屈折率は１．５６であった。ひきつづき、平面光導波路３上に低屈折率樹脂で、市販されている旭硝子株式会社製のサイトップ（登録商標）のポリ（パーフルオロブテニルビニルエーテル）をスクリーン印刷することにより矩形状の反応ホール（測定域）５が開口された低屈折率樹脂４を形成した。

次いで、反応ホール５から露出する平面光導波路３表面をシランカップリング剤により疎水化し、そこへ抗インスリン抗体１１を疎水性相互作用により固定化した。その後、低屈折率樹脂４上に枠状のセル壁６を反応ホール５を囲うように形成した。

また、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にブロッキングワン（ナカライテスク株式会社製）を２．５倍に希釈されるように添加して溶液を調製した。つづいて、この溶液に抗インスリン抗体が固定化された平均粒径７６０ｎｍの青色ラテックスビーズを分散してビーズ分散濃度が４重量％のビーズ分散液を調製した。なお、ブロッキングワンは、非特異吸着を抑制するためのブロッキング剤で、４〜８重量％のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１〜２重量％のアルブミン、２〜６重量％のカゼイン、１０重量％以下の高分子化合物、１重量％以下の防腐剤および約重量３％の４Ｍ−水酸化ナトリウム溶液を含む水溶液である。

この抗インスリン抗体が固定化されたビーズ分散液を前記反応ホール５に１０μＬ滴下し、−８０℃で予備凍結した後、約１日凍結乾燥することによりビーズが予め配された図１に示す光導波路型センサチップを製造した。この凍結乾燥時には、前記組成のビーズ分散液に二糖類であるトレハロースを３重量％、界面活性剤であるＴｗｅｅｎを０．１重量％添加した。これらの成分は、ビーズ分散液の再分散性の向上を目的として添加した。

得られたセンサチップの反応ホール内に被測定検体溶液である濃度１．６ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液をそれぞれ１０μＬ滴下し抗原抗体反応を行った。被測定検体溶液の滴下直後に赤色ＬＥＤ２１から波長６５５ｎｍの赤色光を入射側グレーティング２ａを通して平面光導波路３に入射させ、その平面光導波路３を伝播させて表面（反応ホール５での露出表面）付近にエバネッセント光を発生させ、出射側グレーティング２ｂから出射される赤色光をフォトダイオード２２で受光し、その光強度を測定した。すなわち、時間経過に伴う光強度の変化を測定した。

６．４ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液については、同様な操作を３回（合計４回）行って、時間経過に伴う光強度の変化を測定した。これらの結果を図１０に示す。

図１０において被測定検体溶液の滴下直後の光強度を１００％とし、その時間経過での光強度の変化を示す。図１０には、濃度１．６ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液の結果をＳ１、濃度６．４ｎｇ／ｍＬの４つのインスリン溶液の結果をＳ２−１，Ｓ２−２，Ｓ２−３，Ｓ２−４、として示す。また、被測定検体溶液としてインスリンの希釈溶媒のみ（ブランク）を用いて同様な操作を行って、時間経過に伴うレーザ光強度の変化を測定した結果を図１０にＢとして示す。

図１０から明らかなように所定時間におけるレーザ光強度の低下率が被測定検体溶液中のインスリン濃度と相関することがわかる。また、インスリン濃度が同一（６．４ｎｇ／ｍＬ）の４つの被測定検体溶液において、所定時間におけるレーザ光強度の低下率が近似し、再現性のよい濃度測定が可能であることがわかる。

（実施例２）
屈折率１．５２の無アルカリガラス基板１に屈折率が２．２〜２．４の酸化チタンをスパッタリングして厚さ５０ｎｍの酸化チタン膜を成膜した後、リソグラフィーとドライエッチングによりガラス基板１上にグレーティング２ａ，２ｂを形成した。つづいて、グレーティング２ａ，２ｂを含むガラス基板１上にエポキシ樹脂溶液をスピンコートした後、焼成することにより厚さ約３０μｍの平面光導波路３を形成した。焼成後の平面光導波路３の屈折率は１．５６であった。ひきつづき、平面光導波路３上に低屈折率樹脂で、市販されている旭硝子株式会社製のサイトップ（登録商標）のポリ（パーフルオロブテニルビニルエーテル）をスクリーン印刷することにより矩形状の反応ホール（測定域）５が開口された低屈折率樹脂４を形成して図５に示す光導波路型センサチップを製造した。

得られた光導波路型センサチップの反応ホールに被測定検体溶液である濃度１．６および６．４ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液をそれぞれ１０μＬ滴下し、３７℃で１０分間抗原抗体反応を行った。つづいて、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）からなる洗浄バッファ液で、反応ホール内の余剰のインスリンを洗浄した。洗浄後の反応ホールに実施例１と同様なビーズ分散液を２０μL滴下した。ビーズ分散液滴下直後から実施例１と同様に赤色ＬＥＤ２１およびフォトダイオード２２を用いて光強度の変化を測定した。

６．４ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液については、同様な操作を３回（合計４回）行って、時間経過に伴う光強度の変化を測定した。被測定検体溶液の滴下直後の光強度を１００％とし、その時間経過での光強度の変化を図１１に示す。図１１には、濃度１．６ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液の結果をＳ１、濃度６．４ｎｇ／ｍＬの４つのインスリン溶液の結果をＳ２−１，Ｓ２−２，Ｓ２−３，Ｓ２−４、として示す。また、被測定検体溶液としてインスリンの希釈溶媒のみ（ブランク）を用いて同様な操作を行って、時間経過に伴うレーザ光強度の変化を測定した結果を図１１にＢとして示す。

図１１から明らかなように所定時間におけるレーザ光強度の低下率が被測定検体溶液中のインスリン濃度と相関することがわかる。また、インスリン濃度が同一（６．４ｎｇ／ｍＬ）の４つの被測定検体溶液において、所定時間におけるレーザ光強度の低下率が近似し、再現性のよい濃度測定が可能であることがわかる。

（実施例３）
実施例２と同様な光導波路型センサチップの反応ホールに実施例１と同様なビーズ分散液を１０μL滴下し、その直後に被測定検体溶液である濃度１．６ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液をそれぞれ１０μＬ滴下してピペッティングにより攪拌した。攪拌直後から実施例１と同様に赤色ＬＥＤ２１およびフォトダイオード２２を用いて光強度の変化を測定した。

６．４ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液については、同様な操作を３回（合計４回）行って、時間経過に伴う光強度の変化を測定した。被測定検体溶液の滴下直後の光強度を１００％とし、その時間経過での光強度の変化を図１２に示す。図１２には、濃度１．６ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液の結果をＳ１、濃度６．４ｎｇ／ｍＬの４つのインスリン溶液の結果をＳ２−１，Ｓ２−２，Ｓ２−３，Ｓ２−４、として示す。また、被測定検体溶液としてインスリンの希釈溶媒のみ（ブランク）を用いて同様な操作を行って、時間経過に伴うレーザ光強度の変化を測定した結果を図１２にＢとして示す。

図１２から明らかなように所定時間におけるレーザ光強度の低下率が被測定検体溶液中のインスリン濃度と相関することがわかる。また、インスリン濃度が同一（６．４ｎｇ／ｍＬ）の４つの被測定検体溶液において、所定時間におけるレーザ光強度の低下率が近似し、再現性のよい濃度測定が可能であることがわかる。

なお、実施例３においてビーズ分散液とインスリン溶液の滴下の順番を逆にても、同時に滴下しても、実施例３と同様にレーザ光強度の低下率が被測定検体溶液中のインスリン濃度と相関することを確認した。

（実施例４）
予め、実施例１と同様なビーズ分散液をマイクロチューブに５０μＬ入れて凍結乾燥させた。この凍結乾燥時には、実施例１と同様に前記ビーズ分散液に二糖類であるトレハロースを３重量％、界面活性剤であるＴｗｅｅｎを０．１重量％添加した。つついて、マイクロチューブに被測定検体溶液である濃度１．６ｎｇ／ｍＬおよび６．４ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液をそれぞれ５０μＬ滴下、混合して抗原抗体反応を行った。次いで、マイクロチューブ内の混合液２０μＬを実施例２と同様な図５に示す光導波路型センサチップの反応ホールに滴下し、滴下直後から実施例１と同様に赤色ＬＥＤ２１およびフォトダイオード２２を用いて光強度の変化を測定した。

６．４ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液については、同様な操作を３回（合計４回）行って、時間経過に伴う光強度の変化を測定した。被測定検体溶液の滴下直後の光強度を１００％とし、その時間経過での光強度の変化を図１３に示す。図１３には、濃度１．６ｎｇ／ｍＬのインスリン溶液の結果をＳ１、濃度６．４ｎｇ／ｍＬの４つのインスリン溶液の結果をＳ２−１，Ｓ２−２，Ｓ２−３，Ｓ２−４、として示す。また、被測定検体溶液としてインスリンの希釈溶媒のみ（ブランク）を用いて同様な操作を行って、時間経過に伴うレーザ光強度の変化を測定した結果を図１３にＢとして示す。

図１３から明らかなように所定時間におけるレーザ光強度の低下率が被測定検体溶液中のインスリン濃度と相関することがわかる。また、インスリン濃度が同一（６．４ｎｇ／ｍＬ）の４つの被測定検体溶液において、所定時間におけるレーザ光強度の低下率が近似し、再現性のよい濃度測定が可能であることがわかる。

１，３１…ガラス基板、２ａ，２ｂ，３２ａ，３２ｂ…グレーティング、３，３３…平面光導波路、５…反応ホール、１１…第１物質、１２…第２物質、１３…微粒子、１５…測定対象物質、３４…キャップ、３５…測定域、３７…導入孔、３８…排出孔。

本発明の第１態様によると、平面光導波路；
前記平面光導波路表面に配置され、前記平面光導波路表面との間で測定域を形成するための凹部を有するキャップ；
前記測定域内の前記平面光導波路表面の一部に固定化され、被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質；
前記キャップに前記測定域と連通するように開口され、前記被測定検体溶液および前記被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を前記測定域に導入するための導入孔；
前記キャップに前記測定域と連通するように開口された排出孔；および
前記平面光導波路に前記測定域を挟むようにそれぞれ配置され、光の入射により前記測定域を含む前記平面光導波路で多重反射させるための入射側グレーティングおよび出射側グレーティング；
を備える光導波路型センサチップが提供される。

本発明の第２態様によると、前記第１態様に記載の光導波路型センサチップを用意すること、
被測定検体溶液を前記光導波路型センサチップのキャップの導入孔を通して測定域内の平面光導波路表面に滴下し、前記測定域内の前記平面光導波路表面に固定化された第１物質と前記被測定検体溶液中の測定対象物質との間で特異的に反応させること；
前記被測定検体溶液の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を前記キャップの導入孔を通して前記測定域内の前記平面光導波路表面に導入し、前記第１物質と特異的に反応された前記被測定検体溶液中の測定対象物質と前記微粒子の第２物質との間で特異的に反応させること；および
光を入射側グレーティングから入射し、前記測定域を含む前記平面光導波路で多重反射させ、出射側グレーティングから出射する間にエバネセント光を前記測定域を含む前記平面光導波路表面に発生させ、前記測定域内の前記平面光導波路領域表面に前記第１物質および前記測定対象物質を介して固定化された微粒子での前記エバネセント光の吸収または散乱による前記エバネセント光の減衰に伴う前記出射側グレーティングからの光強度の低下を検出すること；
を含むことを特徴とする物質の測定方法が提供される。

本発明の第３態様によると、平面光導波路と、前記平面光導波路表面に配置され、前記平面光導波路表面との間で測定域を形成するための凹部を有するキャップと、前記測定域内の前記平面光導波路表面の一部に固定化され、被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質と、前記キャップに前記測定域と連通するように開口され、前記被測定検体溶液および前記被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を前記測定域に導入するための導入孔と、前記キャップに前記測定域と連通するように開口された排出孔と、前記平面光導波路に前記測定域を挟むようにそれぞれ配置され、光の入射により前記測定域を含む前記平面光導波路で多重反射させるための入射側グレーティングおよび出射側グレーティングとを備える光導波路型センサチップ；
前記センサチップの入射側グレーティングに光を入射させる光源；および
前記センサチップの出射側グレーティングから出射される光を受光する受光素子；
を具備することを特徴とする光導波路型センサが提供される。
本発明の第４態様によると、平面光導波路と、前記平面光導波路表面に配置され、前記平面光導波路表面との間で測定域を形成するための凹部を有するキャップと、前記測定域内の前記平面光導波路表面の一部に固定化され、被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質と、前記キャップに前記測定域と連通するように開口され、前記被測定検体溶液および前記被測定検体溶液の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を前記測定域に導入するための導入孔と、前記キャップに前記測定域と連通するように開口された排出孔と、前記平面光導波路に前記測定域を挟むようにそれぞれ配置され、光の入射により前記測定域を含む前記平面光導波路で多重反射させるための入射側グレーティングおよび出射側グレーティングとを備える光導波路型センサチップ；および
前記被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子の分散液を収容した包装体；
を組み合わせたことを特徴とする物質測定用キットが提供される。
本発明の第５態様によると、前記第４態様に記載の物質測定用キットの使用により物質を測定する方法であって、
被測定検体溶液を光導波路型センサチップのキャップの導入孔を通して測定域内の平面光導波路表面に滴下し、前記測定域内の前記平面光導波路表面の一部に固定化された第１物質と被測定検体溶液中の測定対象物質との間で特異的に反応させること；
包装体内の微粒子の分散液を前記キャップの導入孔を通して前記測定域内の前記平面光導波路表面に導入し、前記第１物質と特異的に反応された前記被測定検体溶液中の測定対象物質と前記微粒子の第２物質との間で特異的に反応させること；および
光を入射側グレーティングから入射し、前記測定域を含む前記平面光導波路で多重反射させ、出射側グレーティングから出射する間にエバネセント光を前記測定域を含む前記平面光導波路表面に発生させ、前記測定域内の前記平面光導波路領域表面に前記第１物質および前記測定対象物質を介して固定化された微粒子での前記エバネセント光の吸収または散乱による前記エバネセント光の減衰に伴う前記出射側グレーティングからの光強度の低下を検出すること；
を含むことを特徴とする物質の測定方法が提供される。

Claims (12)

1. 平面光導波路；
   平面光導波路の表面に設けられ、被測定検体溶液が導入される反応ホールを形成するセル壁；
   前記反応ホール内の前記平面光導波路領域の表面の一部に固定化され、前記被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質；
   前記反応ホール内の前記平面光導波路の領域に導入され、前記被測定検体溶液中の前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子；および
   前記平面光導波路に前記反応ホールを挟むようにそれぞれ配置され、光の入射により前記反応ホール内の領域を含む前記平面光導波路で多重反射させるための入射側グレーティングおよび出射側グレーティング；
   を備えることを特徴とする光導波路型センサチップ。
2. 前記平面光導波路は、板状のガラスであることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサチップ。
3. 前記平面光導波路は、厚さ３〜３００μmの有機系樹脂膜であることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサチップ。
4. 前記微粒子は、樹脂ビーズであることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサチップ。
5. 前記微粒子は、金属コロイドであることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサチップ。
6. 前記測定対象物質が抗原で、前記平面光導波路表面および前記微粒子に固定化された前記測定対象物質と特異的に反応する第１、第２の物質がそれぞれ抗体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の光導波路型センサチップ。
7. 前記平面光導波路は、表面にブロッキング層がさらに形成されることを特徴とする請求項１記載の光導波路型センサチップ。
8. 平面光導波路と、平面光導波路の表面に設けられ、被測定検体溶液が導入される反応ホールを形成するセル壁と、前記反応ホール内の前記平面光導波路領域の表面の一部に固定化され、前記被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質と、前記反応ホール内の前記平面光導波路領域に導入され、前記被測定検体溶液中の前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子と、前記平面光導波路に前記反応ホールを挟むようにそれぞれ配置され、光の入射により前記反応ホール内の領域を含む前記平面光導波路で多重反射させるための入射側グレーティングおよび出射側グレーティングとを備える光導波路型センサチップを用意すること；
   前記センサチップの反応ホール内の前記平面光導波路表面に前記被測定検体溶液を滴下して前記平面光導波路表面の第１物質と前記被測定検体溶液中の測定対象物質との間で特異的に反応させると共に、前記測定対象物質と前記反応ホール内の前記平面光導波路領域に導入された前記微粒子の第２物質との間で特異的に反応させること；および
   光を前記入射側グレーティングから入射し、前記反応ホール内の領域を含む前記平面光導波路で多重反射させ、前記出射側グレーティングから出射する間にエバネセント光を前記反応ホール内の領域を含む前記平面光導波路表面に発生し、前記反応ホール内の前記平面光導波路領域の表面に第１物質および測定対象物質を介して固定化された微粒子での前記エバネセント光の吸収または散乱によるエバネセント光の減衰に伴う前記出射側グレーティングからの光強度の低下を検出すること；
   を含むことを特徴とする物質の測定方法。
9. 前記反応ホール内の前記平面光導波路表面に前記被測定検体溶液を滴下して前記平面光導波路表面の第１物質と前記被測定検体溶液中の測定対象物質との間で特異的に反応させた後、前記反応ホール内の前記平面光導波路表面を洗浄し、引続き前記反応ホール内の前記平面光導波路領域に前記微粒子を分散液として導入することを特徴とする請求項８記載の物質の測定方法。
10. 前記被測定検体溶液は、前記微粒子と予め混合し、この混合物を前記センサチップの反応ホール内の前記平面光導波路表面に滴下することを特徴とする請求項８記載の物質の測定方法。
11. 前記被測定検体溶液の測定対象物質が抗原で、この測定対象物質と特異的に反応する前記第１、第２の物質が抗体であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の物質の測定方法。
12. 平面光導波路と、平面光導波路の表面に設けられ、被測定検体溶液が導入される反応ホールを形成するセル壁と、前記反応ホール内の前記平面光導波路領域の表面の一部に固定化され、前記被測定検体溶液中の測定対象物質と特異的に反応する第１物質と、前記反応ホール内の前記平面光導波路領域に導入され、前記被測定検体溶液中の前記測定対象物質と特異的に反応する第２物質が固定化された微粒子と、前記平面光導波路に前記反応ホールを挟むようにそれぞれ配置され、光の入射により前記反応ホール内の領域を含む前記平面光導波路で多重反射させるための入射側グレーティングおよび出射側グレーティングとを備える光導波路型センサチップ；
    前記センサチップの入射側グレーティングに光を入射させる光源；および
    前記センサチップの出射側グレーティングから出射される光を受光する受光素子；
    を具備することを特徴とする光導波路型センサ。

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