JPH10506190A - 光散乱により特異的結合事象を検出するための光導波路法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 導波路結合アッセイ方法は、エバネッセント波の侵入深さ内で導波路に特異的に結合したラベルにより光を散乱させ、導波路に導びいて光の散乱を検出する。導波路は透明プラスチック又はガラスであり得、結合は典型的にはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション又は免疫的捕獲により行われる。光散乱ラベルはコロイド金属又は非金属を含み、金、セレン及びラテックスを含む。染料又は濃縮粒子から構成される吸光メンバーを使用して信号を強化させてもよい。リアルタイム結合及び解離を視覚的又は、ＣＣＤカメラ及びフレームグラバーソフトウェア等によるビデオ撮像によりモニターすることができる。１塩基といった少数のハイブリダイゼーションミスマッチをリアルタイム融解曲線により区別することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 光散乱により特異的結合事象を検出するための光導波路法 発明の技術分野 本発明は数種の分野、特に特異的結合パートナー相互作用、エバネッセント導 波路(waveguide)及び光散乱に関する。より特定的には、本発明は特異的結合力 により導波路のエバネッセント波の侵入深さ内に保持された粒状ラベルにより散 乱を生じる光散乱技術により、１種以上の特異的結合分析物(specific binding analytes)、特にＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを検出する方法に関する。発明の背景 内部全反射（total internal reflection：「ＴＩＲ」）は当該技術分野で公 知であり、図１により説明される。ＴＩＲは、高密度媒体１２（即ち高いほうの 屈折率Ｎ₁をもつ）を通って高密度媒体と低密度媒体１６（即ち低いほうの屈折 率Ｎ₂をもつ）の間の界面１４にぶつかる光１０が式：θ_C＝arcsin（Ｎ₂／Ｎ₁） により定義される臨界角θ_Cよりも大きい角度θ_Rで界面にぶつかる場合に高密度 媒体１２の内側で全反射されるという原理に基づいて作用する。これらの条件下 では「エ バネッセント波」として知られる電磁波形が発生する。図１Ｂに示すように、高 密度媒体内の光に伴う電場は界面に垂直な定常正弦波１８を形成する。エバネッ セント波は低密度媒体１６に侵入するが、そのエネルギーＥは２０に示すように 界面からの距離Ｚの関数として指数関数的に消散する。「侵入深さ」（図１Ａに ２２で示すｄ_p）として知られるパラメーターは、エバネッセント波エネルギー が界面でのエネルギー値の０．３６８倍まで低下するような界面からの距離とし て定義される［Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，７ ４：２５３−２６５（１９８４）は、ｄ_pをＥ＝（ｅ^-1）・Ｅ_Oのときの深さとし て定義している］。侵入深さは次のように計算される。 d_p＝(λ/N₁)／[2π｛sin²θ_R - (N₂/N₁)²｝^1/2] 侵入深さを増加させる傾向のある因子は、入射角θ_Rの増加、２つの媒体の屈 折率の接近（即ちＮ₂／Ｎ₁→１）、及び波長λの増加である。例えば石英ＴＩＲ エレメント（Ｎ₁＝１．４６）を水性媒体（Ｎ₂＝１．３４）に入れると、臨界角 θ_Cは６６°（＝ａｒｃｓｉｎ ０．９１７８）である。５００ｎｍの光がθ_R＝ ７０°（即ち臨界角よりも大）で界面にぶつかる ならば、ｄ_pは約２７０ｎｍである。 侵入深さ内で、低密度媒体（典型的には反応溶液）中のエバネッセント波は試 料中に蛍光を励起し得る。この現象は当該技術分野でイムノアッセイに関して利 用されている（Ｈａｒｒｉｃｋら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４５：６８７（１９ ７３））。ＴＩＲ蛍光をイムノアッセイに利用する装置及び方法は、当該技術分 野ではＨｉｒｓｃｈｆｉｅｌｄの米国特許第４，４４７，５６４号、４，５７７ ，１０９号及び４，６５４，５３２号、ＨｉｒｓｈｆｉｅｌｄとＢｌｏｃｋの米 国特許第４，７１６，１２１号及び第４，５８２，８０９号並びにＷＯ９３／２ ０２４０号として公開された米国特許出願第０７／８６３，５５３号（Ａｂｂｏ ｔｔ Ｌａｂｓ）に記載されており、これらの全開示内容は参考資料として本明 細書の一部とする。免疫特異的物質を該エレメントの表面に付着させ、低密度媒 体中で蛍光標識特異的結合パートナーと反応させる。特異的結合の結果、蛍光ラ ベルは侵入深さ内で結合する。（シフトした波長で）発光した蛍光はＴＩＲエレ メントにトンネル効果で戻り（tunnel back）、（異なる波長で）定常正弦波と 同一経路に沿ってＴＩＲの内部を伝播し、エレメントの出力で検出される。 ＴＩＲは散乱内部全反射率（Scattered Total Internal Reflectance：「ＳＴ ＩＲ」）と呼ばれる技術でも光散乱検出に関連して使用されている。例えばＳｃ ｈｕｔｔらの米国特許第４，９７９，８２１号及び５，０１７，００９号並びに ＷＯ９４／００７６３号（Ａｋｚｏ Ｎ．Ｖ．）参照。この技術によると、光ビ ームを適切な角度でＴＩＲエレメントの表面を走査すると、光エネルギーはエバ ネッセント波を除いて完全に反射する。赤血球、コロイド金又はラテックス等の 粒子を侵入深さ内に特異的に結合して光を散乱させ、散乱光は光検出手段により 検出される。ＷＯ９４／００７６３号は、（１）より広いダイナミックレンジに 達するために異なる濃度の同一結合メンバー又は（２）多重フォーマットで種々 の分析物を試験するために異なる結合メンバーのいずれかである特異的結合メン バーの数箇所に光ビームを走査することも記載している。多重部位に光ビームを 走査し、各部位での散乱光を集めるのは非常に時間消費的な方法である。 Ｃａｒｔｅｒらの米国特許第４，６０８，３４４号では、ＴＩＲエレメントと して光導波路を使用している。１態様では、多重結合部位を導波路に特定線又は 格子状に配置し、散乱光の 回折格子パターンを形成している。この方法は、その後、特定順序の散乱光のみ を検出することにより、表面欠陥及び／又は塵粒子等の不純物により生じる散乱 を最小限にしている（図１４及び１７〜１９欄参照）。 Ｃａｒｔｅｒ及びＳＴＩＲ装置の実用は、溶液中の粒子から散乱する深刻なバ ックグラウンド散乱により著しく制限される。このバックグラウンドは分析物に 関連する結合粒子の検出感度を制限する。性能不良は、高いバックグラウンドレ ベルにわたって少量の信号を判別できる高度エレクトロニクス及びオプティクス （optics）によって補われた。しかし、エレクトロニクス及びオプティクスが複 雑なため、非常に高価なシステムになっている。 最後に、Ａｔｔｒｉｄｇｅらの米国特許第５，１９２，５０２号は、試料流体 を収容するキャビティを規定する平行なプレートを含む装置を教示している。一 方のプレートは導波路として使用され、他方には吸光材料層が被覆してある。 他の興味深い背景技術としては、Ｄｒｍａｎａｃらの米国特許第５，２０２， ２３１号の開示が挙げられ、同特許にはハイブリダイゼーションによる配列決定 （ＳＢＨ）として知られる 新規な核酸配列情報生成法が記載されている。この方法によると、既知配列のオ リゴヌクレオチドのアレー（array）が結合した固相を試料からの標識化ＤＮＡ とハイブリダイズさせる。従って、１回のハイブリダイゼーション実験でＤＮＡ 分子上の多数の異なる部位を試験することができる。デュシェーヌ筋ジストロフ ィー又は嚢胞性線維症等の数種のヒト遺伝的症状の診断には、疾患状態に関連す る突然変異を正確且つ費用効果的に判定できるような分解能のＳＢＨ型システム が必要であると思われる。ＳＢＨ法のある特定利用例では、高密度二次元アレー に固定化した多数のオリゴヌクレオチドを使用している。このような装置は「Ｄ ＮＡチップ」と呼ばれ、エレクトロニクス産業で製造されている高密度回路と似 ている。未知ＤＮＡの試料をチップに適用し、ハイブリダイゼーションのパター ンを決定及び分析し、配列情報を得る。ＷＯ９２／１０５８８及びＷＯ９２／１ ００９２（Ａｆｆｙｍａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎ．Ｖ．）にも同様の 開示があり、更にこのようなチップを製造するための写真平版法も開示されてい る。 ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションに影響するので、ストリン ジェンシーを正確に制御できるならば、良好 な区別と特異性が得られる。例えば、融解曲線はＤＮＡチップシステムに付加的 寸法を与えることができ、ＳＢＨテクノロジーの実施に問題となる密接に関連す る配列を良好に区別することができよう。温度を変化させてチップハイブリダイ ゼーションパターンをリアルタイムでモニターできるならば、特にＧＣ含量の変 動幅が大きい場合に非常に有用であろう。Ｌｉｖｓｈｉｔｓら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏ ｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．＆ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ，１１：７８３−７９５（１９９４） は、放射性又は蛍光ラベルを使用してゲル固定化ＤＮＡのシステムで完全及び不 完全ハイブリダイゼーションの判別を可能にしたＤＮＡ配列決定法を記載してい る。ゲルを５℃毎に１分間洗浄し、不完全にハイブリダイズしたＤＮＡに関連す るラベルを除去している。著者らは、他の表面よりも固定化能と判別能が高いと いう理由でゲルが有利であったと主張している。しかし、表面から過剰のラベル を洗浄する必要があり、測定値を得るために全表面を走査するのに比較的長時間 を要することが重大な制約となっている。例えば、１個のＤＮＡチップアレー全 体を読み取るために１分を要し、温度の増分毎に１分間の洗浄が必要であるなら ば、３０から７０℃まで（例えば１℃毎の）高分 解能融解曲線を得るには１時間が必要である。チップ上の全スポットが測定され るまで各増分温度に１分間温度を一定に保たなければならない。 参考資料として本明細書の一部とする本願と同一名義の１９９３年１０月２１ 日付け同時係属米国出願第０８／１４０，３８３号、発明の名称「標的リガンド の検出装置及び方法」の開示も注目される。この出願は、単一固相上の空間的に 分離した多重位置に配置した特異的結合標的リガンドを撮像及び検出するために 電荷結合デバイス「ＣＣＤ」カメラ及び画像処理ソフトウェアを使用することを 記載している。発明の要約 Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔがヒトゲノムの完全な配列決定で 直面した１つの問題は、ＤＮＡ配列データの獲得速度を２桁増加することである 。本願は、好適態様として、ＤＮＡアレーを含む支持体上の多重捕獲部位で光散 乱ラベルのリアルタイム結合又は融解を測定できる二次元光導波路を使用した検 出方法に関する。この結果、ビデオ録画が可能な迅速さでハイブリダイゼーショ ンデータを集めることができる。本方法は、エバネッセント波の散乱を利用し、 侵入深さ内に閉じ込 められたラベルのみが信号を発生するようにしたものである。散乱光の撮像(ima ging)により、アレー全体を同時に調べることができる。ハイブリダイゼーショ ン特異性は慣用システム及びオートラジオグラフィーで得られるのと等価である 。融解曲線は同一配列組み合わせの液相融解曲線に一致し、１塩基対といった僅 少差を容易に区別できる。希釈の制限により約０．４ｎＭ程度の低濃度の標的の 検出が立証され、これは現在最良の蛍光システムに匹敵する。この方法は配列変 動を迅速で費用効果的に検出する強力なツールを提供すると期待される。 即ち、１態様において本発明は流体試料中の１種以上の特異的結合分析物の存 在又は量の検出方法に関し、該方法は、 （ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光 縁部（light receiving edge）と、（iii）エレメントの表面の複数の部位に固 定された少なくとも１個の同系結合対（cognate binding pair）の第１の特異的 結合メンバーを含む反応表面（反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバ ーを固定しない）とを備える導波路デバイス（ここで、前記第１の特異的結合メ ンバーは、所望により中間同系結合対を介して、少なくとも１種の分析物と特異 的に結合することが可 能である）を準備する段階と、 （ｂ）前記１種以上の分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の特異的 結合メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ（ここで、該第２ の同系結合対の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、サ ンドイッチアッセイの場合には前記１種以上の分析物と特異的に結合することが 可能であり、競合アッセイの場合には前記第１の同系結合対の固定化した第１の 特異的結合メンバーに結合することが可能である）、試料中の分析物の量に比例 して複数の部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成する段階と、 （ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照 射し、全反応表面を同時に照射する段階と、 （ｄ）散乱光が存在する場合には前記表面の各部位及び非部位部分から実質的に 同時に散乱光を集光する段階と、 （ｅ）各部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度、もしくは（ii）別の部 位の光散乱度、又はその両者と比較し、各部位の光散乱を該部位の固定化特異的 結合メンバーに特異的な分析物の存在又は量と相関させる段階を含む。 上記方法によると、単一導波路に多重部位が存在し、導波路 を一度に照射し、同時に全部位からの散乱を光検出器又は視覚により集める。 別の態様において、本発明は流体試料中の少なくとも１種の特異的結合分析物 の存在又は近似量を視覚的に検出するための方法に関し、該方法は、 （ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光 縁部と、（iii）エレメントの表面の少なくとも１個の試験部位に固定された少 なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含む反応表面（反応表 面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定しない）とを備える導波路デ バイス（ここで、前記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対 を介して、前記分析物と特異的に結合することが可能である）を準備する段階と 、 （ｂ）前記分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の第１の特異的結合 メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ（ここで、該第２の同 系結合対の第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、 サンドイッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であ り、競合アッセイの場合には前記固定化した第１の 特異的結合メンバーに結合することが可能である）、試料中の分析物の量に比例 して部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成する段階と、 （ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照 射する段階と、 （ｄ）反応表面の光散乱を視覚的に検査し、試験部位の光散乱度を（ｉ）非部位 部分の光散乱度、もしくは（ii）別の部位の光散乱度、又はその両者と比較し、 上記部位の散乱を前記分析物の存在又は量と相関させる段階を含む。 本方法は多重部位に制限されず、視覚検出を必要としない。 同様に多重部位に制限されない別の態様は、速度読取(rate-read)法を使用す る散乱の測定である。即ち、本態様では本発明は、 （ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光 縁部と、（iii）エレメントの表面の１部位に固定された少なくとも１個の同系 結合対の第１の特異的結合メンバーを含む反応表面（反応表面の他の非部位部分 には特異的結合メンバーを固定しない）とを備える導波路デバイス（ここで、前 記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結 合対を介して、前記分析物と特異的に結合することが可能である）を準備する段 階と、 （ｂ）前記分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の第１の特異的結合 メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ（ここで、該第２の同 系結合対の第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、 サンドイッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であ り、競合アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合す ることが可能である）、試料中の分析物の量に比例して前記部位に結合した光散 乱ラベル複合体を形成する段階と、 （ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照 射し、全反応表面を同時に照射する段階と、 （ｄ）散乱光が存在する場合には光検出装置を使用して第１の時刻ｔ₁で前記表 面の前記部位及び非部位部分から実質的に同時に散乱光を集光する段階と、 （ｅ）段階（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも１回繰り返し、散乱光が存在する場合 には第２の時刻ｔ₂で前記部位及び非部位部分から散乱光を集光する段階と、 （ｆ）時刻ｔ₁における前記部位の光散乱度を時刻ｔ₂における前記部位の光散乱 度と比較し、該部位の光散乱を特異的分析物の存在又は量と相関させ、光散乱の 経時的差により、前記部位に存在する分析物の量を表す動的情報を提供する段階 を含む。 本態様は単一又は多重部位のどちらにも適用できるが、経時的に微小な信号変 動が現れる可能性があるので、視覚検出はできないと思われる。経時読取は連続 して行ってもよいし、不連続でもよい。連続読取では、時間進行の初期傾きから 初期速度を決定することができる。 本発明の特に有用な適用例はリアルタイムオリゴヌクレオチド融解試験である 。従って、別の態様において本発明は未知核酸のセグメントのヌクレオチド配列 を決定するか、又は２種の密接に関連するヌクレオチド配列を区別するための方 法に関し、該方法は、 （ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光 縁部と、（iii）オリゴヌクレオチドを固定した複数の部位を含む反応表面（前 記部位は未知核酸とハイブリダイズするための種々の配列をもつオリゴヌクレオ チドのアレーを構成するようにし、前記エレメントの表面の他の非部位部 分にはオリゴヌクレオチドを固定しない）とを備える導波路デバイスを準備する 段階と、 （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で反応表面を前記未知核酸（前記未知核酸 は、所望により直接又は中間同系結合対を介して、光散乱ラベルで標識されてい る）と接触させ、未知核酸の配列に相補的な反応表面の部位に結合する光散乱ラ ベル複合体を形成する段階と、 （ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照 射し、全反応表面を同時に照射する段階と、 （ｄ）散乱光が存在する場合には前記表面の各部位及び非部位部分から実質的に 同時に散乱光を集光する段階と、 （ｅ）各部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度又は（ii）別の部位の光 散乱度と比較する段階とを含み、 （ｆ）さらに、導波路デバイスの反応表面でストリンジェンシー条件を増分的に (incrementally)増加し、該部位からの結合核酸の解離を開始させ、各増分毎に 段階（ｄ）及び（ｅ）を繰り返す段階を含み、それによって、解離特性の差によ り、オリゴヌクレオチドと未知の核酸との間の１塩基対の差を完全な一致から区 別できるようにする。 最後に、二次元導波路又は同時照射にも制限されない態様において、本発明は バックグラウンドを低減した改善された光散乱法にも関する。即ち、本発明は同 様に流体試料中の特異的結合分析物の存在又は量の検出方法であって、該方法は 、 （ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明ＴＩＲエレメントと、（ii ）受光縁部と、（iii）エレメントの表面の少なくとも１個の部位に固定された 少なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含む反応表面（反応 表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定しない）とを備える導波路 デバイス（ここで、前記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合 対を介して、前記分析物と特異的に結合することが可能である）を準備する段階 と、 （ｂ）（ｉ）前記分析物を含む疑いのある試料及び（ii）第２の同系結合対の第 １の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベル（ここで、該第２の同系結合対 の第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、サンドイ ッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であり、競合 アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合することが 可能である）と反応表面を接触させ て、試料中の分析物の量に比例して前記部位に結合した光散乱ラベル複合体を形 成し、並びに（iii）少なくとも１５の有効Ｏ．Ｄ．を与えるに十分な吸光メン バーの溶液と反応表面を接触させる段階と、 （ｃ）エレメントの内部で内部全反射を生じるのに有効な光をＴＩＲエレメント の受光縁部に照射する段階と、 （ｄ）散乱光を検出し、部位の光散乱度を非部位部分の光散乱度と比較し、吸光 材料に吸収させることによりバックグラウンド散乱を最小限にする段階を含む。 上記全態様において、特異的結合分析物はオリゴヌクレオチド又は核酸であり 得る。ほとんどの態様で分析物は抗原又は抗体でもよい。全態様は多重部位をも つことが好ましいが、態様によってはその必要はない。「多重」又は「複数の」 部位の数は２といった少数でもよいし、数千と多数でもよい。 上記態様の各々において、導波路エレメントはガラスプレート等の平坦な表面 を備え得る。各態様において、第２のプレートをエレメントに結合し、プレート 間に毛管チャネルを形成してもよい。反応表面は、反応表面全体に試薬を流す反 応容器としてチャネルを利用できるようにチャネルに対面すべき である。また、各態様において表面にカゼイン等の準可溶性（metasoluble）タ ンパク質を被覆することが好ましい。このコーティングは非特異的結合部位をブ ロックし、表面全体に液体を流し易くするように機能する。 どの場合も光散乱ラベル（ＬＳＬ）はコロイド金もしくはセレン等のコロイド 粒子でもよいし、微小ラテックス粒子でもよい。全態様において反応表面で溶液 中に吸光メンバー（ＬＡＭ）を使用することも可能である。こうすると、その光 源の非常に近傍で散乱するバックグラウンドを低減できるという利点がある。Ｌ ＡＭは溶液のＯ．Ｄ．を少なくとも１５まで増加し、暗いバックグラウンドを提 供し、これに対して該部位の散乱は明領域として示される。図面の簡単な説明 図１は当該技術分野で公知の内部全反射（「ＴＩＲ」）の原理を示し、これに ついては発明の背景の項に詳細に説明した。図１は、左側に界面における光の反 射を示し、右側に界面からの距離Ｚの関数として電界エネルギーＥのプロットを 示す。 図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃはそれぞれ本発明の１実施態様によるデバイスの斜視図 、側面図及び横断面図である。 図３はオリゴヌクレオチドを導波路表面に固定し、エバネッセント波侵入深さ 内でコロイドセレン光散乱粒子を結合したビオチン部分を含む相補的オリゴヌク レオチドを捕獲する本発明の１実施態様の概略図である。 図４〜７、８Ａ及び９〜１２は実施例に詳述するような導波路の実際のビデオ 画像の印刷表示である。ビデオ画像は８ビットフレームグラバー(frame grabber )に供給して情報をディジタル化した。ディジタル化ファイルを製図アプリケー ションにインポートし、高解像度プリンターで印刷した。 図８Ｂ及び８ＣはＤＮＡ解離又は融解曲線である。各温度毎に実施例５で該当 温度について生成した平均強度データをプロットした。発明の詳細な説明 以下、本発明の種々の態様をより詳細に説明する。ＴＩＲエレメント及び導波路デバイス 内部全反射（「ＴＩＲ」）とエバネッセント波の物理的原理については発明の 背景の項に記載した。本明細書で使用する「ＴＩＲエレメント」なる用語は、内 部全反射が可能な界面を提供する任意の透明材料を意味する。該エレメントは例 えばキ ュベット、ロッド又はプレートであり得る。ＴＩＲエレメントのエバネッセント 波は１又は複数の内部全反射点のみに存在し得る。他方、「導波路」とは、光が 多重点で内部全反射し、全表面又はほぼ全表面に実質的に均質なエバネッセント 波を形成するような二次元ＴＩＲエレメントを意味する。二次元導波路の構造は 平面状でも曲線状でもよい。簡単にするために、平面導波路を好適実施態様とし て説明する。 本発明の１好適実施態様において、ＴＩＲエレメントは二次元導波路である。 図２Ａ〜２Ｃは、導波路デバイス３０が平面導波路エレメント３２と平行な平面 プレート３４を含む好適実施態様を示す。従って、導波路エレメントは平行な表 面３６及び３８と受光縁部４０をもつ。同様に、プレート３４は平行な表面４２ 及び４４をもつ。導波路エレメント３２とプレート３４は、エレメント表面３８ とプレート表面４２が狭いチャネル４６を規定するように相互に離間して平行に 固定されている。エレメントとプレートは、エレメントとプレートの縁部に沿っ て付着した両面テープから構成される接着手段４８等の任意の慣用手段により相 互に固定することができる。チャネル４６は、流体試料を毛管移送できるように 狭いほうが好ましい。例えば、 高さを約１ｍｍ未満、好ましくは約０．１ｍｍ未満にすべきである。 エレメント３２はガラス、石英、プラスチック（例えばポリカーボネート、ア クリル又はポリスチレン）等の光学的に透明な材料から製造すべきである。導波 路の屈折率は、内部全反射を生じるために当該技術分野で公知の通り、試料流体 の屈折率よりも大きくなければならない。試料が水溶液の場合には、屈折率ｎは 約１．３３であるので、導波路は典型的には＞１．３５、通常は約１．５以上の 屈折率をもつ。導波路はプラスチック又はガラスの部品であり得、例えば標準ガ ラス顕微鏡スライド又はカバースリップを使用することができる。 プレート３４も同様の材料から構成することができる。図２Ａ及び２Ｂに示す ように、導波路エレメント３２の受光端４０は光源５４から発生する迷光の影響 を最小限にするようにマスク５２の狭いスリット５０に配置される。迷光の最小 化は後述するように吸光材を使用することによっても改善される。 入射光ビームを発生する光源５４は可視、紫外及び近ＩＲスペクトルのエネル ギーを含むほぼ任意の電磁エネルギー源であり得る。従って、「光」なる用語は 非常に広義の意味であり、 視覚検出される態様を除いて可視範囲に限定されない。非可視波長は当該技術分 野で周知のように特定波長に最適化された検出器により検出される。光は単色光 でも多色光でもよく、コリメート光（collimated light）でも非コリメート光で もよく、偏光でも非偏光でもよい。好適光源はレーザー、発光ダイオード、フラ ッシュランプ、アーク灯、白熱電球及び蛍光放電灯などである。導波路エレメン トを照射するために使用される光源は低ワット数ヘリウム−ネオンレーザーであ り得る。下記実施例１に記載するような携帯使い捨てデバイスでは、光源はポケ ットフラッシュライトに使用されるような電池式小型白熱電球であり得る。好ま しくは、光源は光源の強度を変化させるための電位差計手段を含む。あるいは、 強度を適切なレベルに調節するためにフィルター及び／又はレンズを利用しても よい。 光散乱度を測定するための検出手段については追って詳述するが、要約すると 計器と視覚手段がある。本発明の重要な特徴の１つは、導波路全体の全域で起る 光散乱現象を観察者の目と脳又はＣＣＤカメラを含む光検出装置によりほぼ同時 にモニターできることであり、ＣＣＤカメラで形成した画像はコンピューターで ディジタル化及び処理する。いずれの場合も、ただ１ つの多機能反応表面を使用し、エバネッセント波により同時に照射する。反応表面 本発明によると、導波路エレメントの片面に少なくとも１個の部位から構成さ れる反応表面が形成される。実施態様によっては試験部位が単一でもよいが、本 発明では複数のこのような部位を使用するのが最良であり、ここでは多重部位デ バイスについて説明する。多重試験部位は同一又は異なる特異的結合メンバーを 含み得る。「部位」（“ｓｉｔｕｓ”，複数形“ｓｉｔｅｓ”）とは、分析物に 特異的な結合メンバーが固定される境界領域（delimited area）として定義され 、該境界領域の外側には表面の非部位部分も存在すると解される。固定化された 特異的結合メンバーを本明細書では「捕獲メンバー」又は「捕獲ＳＢＭ」と呼ぶ 。好ましくは、部位は小さいスポット又は点であり、非部位部分は部位を包囲し ている。当然のことながら、他の多数の部位寸法及び構造が可能であり、本発明 の範囲に含まれる。部位は線又はバーとして構成してもよいし、文字又は数字、 円形、矩形又は三角形でもよいし、例えばコンピューターアイコン又はクリップ アートコレクションで一般に 使用される任意の図形等の他の任意の図形でもよい。 部位の面積（寸法）は標識した分析物と光散乱粒子を捕獲できるように十分な 特異的結合メンバーを固定するに十分な大きさであればよい。これは、後述する ように部位の密度に多少依存する。例えば、直径１５０μｍといった小さい部位 面積の使用に成功している（実施例７及び図１０参照）。反応表面上の多数の部 位を配置して高「部位密度」にする場合にはこのような小さい面積が好ましい。 寸法の実際の下限は直径約１μｍである。視覚検出では、拡大せずに検出できる ように十分広い面積が望ましく、例えば少なくとも約１〜約５０ｍｍ²であり、 １ｃｍ²以上でもよい。製造コストと使用者の便利さを考えなければ寸法の上限 はなく、任意の所望の部位寸法又は形状を使用できる。 多重部位デバイスは各部位に同一又は異なるＳＢＭを含み得る。同一の場合に は、複数の部位は反復情報を提供するように類似の濃度にしてもよいし、標準に 対する半定量又は較正を提供するようにＳＢＭの濃度を変化させてもよい。ＳＢ Ｍが異なる場合には、数個の分析物を同時に多重検出するためにデバイスを利用 することができる。異なるＳＢＭの特殊な場合では、 １個以上の部位を正の対照として使用できる。当然のことながら、多数の部位を もつデバイスでは上記の全組み合わせ（例えば多重化半定量的測定）が可能であ る。 多重部位デバイスでは、部位は任意の好都合なパターン又はアレーに配置でき る。部位間の間隔は後述する検出システムの解像度と、部位を形成するために使 用する製法に依存する。製造能力に依存して検出解像度が高けれは高いほど、部 位を接近できる。固定化捕獲ＳＢＭは、これらのメンバーの各々と流体試料中の 対応する結合メンバー及び／又は光散乱標識化メンバーとの個々の反応を別の部 位の反応から、近傍の固定化結合対メンバー及びその関連光散乱粒子により実質 的に干渉されることなく区別できるように相互に十分に分離すべきである。好ま しくは、非部位部分が全ての各部位を明白に分離する。非常に単純なアレーはデ カルト格子であるが、線、パターン及び他の図形として多重部位を構成してもよ い。多重部位反応表面において、多くの場合は１個以上の部位が正の対照、負の 対照、一連の較正標準又はこれらの任意の組み合わせを表す。 １好適部位形態は十字形であり、従って、正の結果の場合に「＋」記号となる 。この形態の１変形では、十字形の縦線のみ が分析物結合部位であり、＋の横線は分析物の存在から独立したラベルに特異的 な結合剤を含む。このような形態はＢｒｏｗｎらの米国特許第５，００８，０８ ０号、発明の名称「固相分析装置及び該装置の使用方法」に記載されている。こ の変形例の形態は分析物の有無に関係なくマイナス「−」記号を発生し、分析物 が存在する場合にはプラス「＋」記号を発生することによりアッセイの検証とし て機能する。「＋／−」検証形態以外に、引用特許に開示されているようにこの 変形例の他の形状も可能である。 図２Ａ〜２Ｃの２面デバイスでは、チャネル４８に向き合う導波路エレメント ３４の表面３８に反応表面６０を形成するのが好ましい。図２Ｃ参照。こうする と、反応表面全域に毛管流を可能にすることにより、試料及び／又は光散乱ラベ ル試薬と反応表面の部位との接触を助長できる。チャネルの一端に紙等の吸収性 又は吸湿性材料を使用することにより流れを強化することができる。しかし、当 然のことながら２面デバイスは１実施態様に過ぎない。単一の二次元導波路エレ メントも使用することができ、片面を反応表面で覆う。しかし、試料及び光散乱 ラベル試薬との接触を助長するために、反応表面を上向きにす る必要はない。その場合には、所望によりミラーを使用してエバネッセント波内 の光の散乱を下側から観察すればよい。特異的結合メンバー及び反応表面への固定 本発明の方法では、まず１個以上の捕獲メンバーを光導波路の表面に固定して 反応表面を形成する。特異的結合メンバー（「ＳＢＭ」）は同系結合対（cognat e binding pair）の一方のメンバーである。「同系結合対」とは、一般にイオン 吸引、水素結合、ファン・デル・ワールスカ、疎水性相互作用等の非共有結合相 互作用を介して相互に特異的に結合する任意のリガンド−レセプター組み合わせ である。同系対及び相互作用の例は当該技術分野で周知であり、非限定的な例と しては、抗体又はＦａｂフラグメントとその抗原、ハプテン又はエピトープとの 間の免疫相互作用；タンパク質（例えばホルモン又は酵素）とそのレセプター（ 例えばアビジン又はストレプトアビジンとビオチン）、又は炭水化物とレクチン との間の生化学的相互作用；金属とキレート剤との間等の化学的相互作用；及び 相補的核酸鎖間の核酸塩基対合が挙げられる。最近報告された特異的結合メンバ ーは、ＢｕｃｈａｒｄｔらのＷＯ９２／２０７０２号及びＷＯ９２／２０７０３ 号と、Ｆｌａｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６２：１６４７，（１９９３）に記載されているペプチド核酸類似体即ち「Ｐ ＮＡ」であり、核酸又は他のＰＮＡと同系結合対を形成する。核酸は２’−デオ キシリボ核酸（ＤＮＡ）及び、安定性が許容できるときには、リボ核酸（ＲＮＡ ）を含むことが理解されよう。 抗体ＳＢＭの製造は旧来から周知の技術であるので、詳述には及ばない。要約 すると、免疫計画に従って動物を所望のハプテンで免疫又は攻撃する。多くの場 合には、ＢＳＡ等の担体分子にハプテンを結合して認識を助長する。適切な時間 後、動物から採血して抗体を抽出する。あるいは、腹水液から抗体を採取しても よい。所望により今日の慣用法であるＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔ ｕｒｅ ，２５６，４９５（１９７５）の方法を使用すると、高度に特異的なモノ クローナル抗体を製造することができる。抗体は結合反応に使用され得る多数の アミノ、カルボキシル及びスルフヒドリル基をもつ。 オリゴヌクレオチドＳＢＭの合成も常套方法であり、ＡＢＩ４８０等の自動合 成器を使用する。これらの装置は約７５〜１００塩基までの長さのほぼ任意の所 望の配列のオリゴヌクレオチドを製造できる。所望により、公知クローニング技 術又は 短いセグメントを合成してアセンブリすることにより、もっと長いポリヌクレオ チドも製造できる。所望により、結合に備えて末端アミン又は他の反応基でオリ ゴヌクレオチドを修飾してもよい。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａ ｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，１（３）：１６５−１８７（１９９０）には、多少 古くなったが依然として有用な結合化学の報告が記載されている。 ＳＢＭは当該技術分野で公知の化学結合手段を介して導波路に共有結合するこ とができる。添加した(applied)ＳＢＭと後で所定の条件下で安定な共有結合を 形成する種々の化学的反応基で反応表面を直接誘導体化してもよい。あるいは、 添加したＳＢＭと後で共有結合を形成する、デキストラン又はＰＥＧ等の化学的 誘導体化ポリマーで反応表面をまず被覆してもよい。ある種の洗剤を反応表面に 被覆し、インシトゥで誘導体化してＳＢＭと反応させてもよい。例えば、ガラス 及び石英導波路は、リンカーを介して特異的結合メンバーと結合することができ る反応性ヒドロキシル及びシロキシ基に活性化可能な基を含む。このようなリン カーとしては例えば公知ホモ及びヘテロ二官能価リンカーが挙げられる。 当然のことながら、結合メンバーの特異的結合性を失わないようにＳＢＭを反 応表面に結合することが好ましい。例えば、米国特許第５，１９１，０６６号（ Ｂｉｅｎｉａｒｚら）に教示されているように抗体はそのＦｃ部分を介して結合 することができ、オリゴヌクレオチドは末端アミン又は他の官能基を介して結合 することができる。Ｒｕｔｈの米国特許第４，９４８，８８２号により教示さて いるようなリンカーアームを塩基部分の「立体耐性」部分に配置すると、ハイブ リダイゼーション能を失わずに固相との結合を助長することができる。更に別の 方法では、物理的吸着により反応表面をストレプトアビジンで被覆した後、ビオ チン標識化結合対メンバーと反応させ、十分な特徴をもつ生物学的反応表面を形 成することもできる。 より最近では、ＷＯ９２／１００９２号（Ａｆｆｙｍａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｉｅｓ，Ｎ．Ｖ．； Ｆｏｄｏｒら）に写真平版法を使用して固体支持体上で オリゴヌクレオチドを直接合成する方法が記載されている。 出願人らが驚いたことには、捕獲ＳＢＭは反応表面に共有結合する必要がない 。ＳＢＭはタンパク質コーティング層を使用して表面に吸着又は結合することが できる。捕獲ＳＢＭ（例え ばＤＮＡ）及びラベルＳＢＭ（例えば抗体）を適切に固定する種々の非共有結合 力がＤＮＡハイブリダイゼーション力よりも安定であるという知見は多少予想外 であった。しかし、これは条件の偶然の選択も一因であり、即ちＤＮＡの融点を 比較的低くできるイオン強度を選択したためである（実施例参照）。（イオン強 度を増加することにより）ＤＮＡデュプレクスが鎖内でもはや弱い結合でなくな るような点まで融点を上昇させることも可能である。 反応表面上の捕獲ＳＢＭの密度（単位面積当たりの量）はシステムの感度と正 の相関がある。オリゴヌクレオチドＳＢＭを使用すると、本明細書に記載するス ポット法により１μｍ²当たり約５０００個のＤＮＡ分子に達することができる 。他のチップ製造法、例えば上記写真平版法では他の密度が得られる。核酸ＳＢ Ｍの推定理論最大密度は約２５０，０００分子／μｍ²である。しかし、この密 度のチップに達せられると考えられず、達したとしても立体的制約により最適性 能は得られないと思われる。最良の感度に対する最適な密度に達するには、拡散 動的要件と立体要件を考慮しながら、単位面積当たりの結合部位の数の最大化と このような部位への接近の最大化の兼ね合い が必要である。 捕獲ＳＢＭを反応表面に加えるには任意の慣用手段により実施できる。例えば 、マイクロピペット又はマイクロ毛管をマニュアルで使用して反応表面に捕獲メ ンバーをスポットしてもよい。しかし、簡便性、再現性及び費用節約のためには この方法を自動化することが好ましい。常套スクリーニング適用等の大規模試験 でアッセイを使用する場合には特に機械化添加(mechanized application)が望ま しい。自動添加法としては例えば容量形ポンプ、Ｘ−Ｙポジショニングテーブル 、及び／又はインクジェット噴霧もしくは印刷システム等が挙げられる。 適宜、ＳＢＭを最初に溶液に加えて試料を反応表面に付着し易くしてもよい。 この目的に適した溶液は、乾燥後にＳＢＭが実質的にその特異性（即ち特異的結 合性）を維持し、エレメントの屈折性を有意に妨げないという一般要件だけを満 たせばよい。溶液の付着量は溶液中のＳＢＭの濃度に依存する。理想的には、小 液滴（約２μｌ）が所望量のＳＢＭを含むように、約０．５〜５００μＭの濃度 範囲の溶液を調製する。典型的には、低濃度のＳＢＭを繰り返し添加し、ＳＢＭ を浪費しないようにすることが好ましい。近傍部位に重複して添加しないように 注 意しながら十分なＳＢＭが得られるまでこれを繰り返す。所望により、特異的結 合性を妨げないものという条件で架橋剤を加えて捕獲部位のＳＢＭの量を増加し てもよい。 ＳＢＭを反応表面の１個以上の部位に堆積した後、メンバーを乾燥させて反応 表面に固定させる。好適乾燥方法は蒸発であり、室温（約２５℃）で実施するこ とができる。所望により、捕獲メンバーが対応する結合対メンバーと特異的に相 互作用する能力を有意に妨げないという条件で、高温で蒸発させてもよい。例え ば、固定化捕獲ＳＢＭがタンパク質である場合には、非変性温度を使用すべきで ある。 捕獲ＳＢＭを反応表面に固定するのに加え、試験しようとする流体試料中の分 析物結合メンバーと反応表面の非特異的相互作用を阻止するように反応表面を処 理するのが好ましい。反応表面にタンパク質ＳＢＭ（例えば抗原、抗体又はＰＮ Ａ）を固定する場合には、ブロッキング剤はＳＢＭの固定後に添加すべきである 。適切なタンパク質ブロッキング剤はカゼイン、ゼイン及びウシ血清アルブミン （ＢＳＡ）である。他のブロッキング剤としては洗剤や長鎖水溶性ポリマーも利 用できる。ブロッキング剤は水溶液又は緩衝水溶液として反応表面に添加すると 好都合である。ブロッキング溶液は第１の捕獲ＳＢＭの固定後の任意の時間に反 応表面に添加することができる。核酸ＳＢＭの場合には、ブロッキング剤はＳＢ Ｍの固定前に添加してもよいし、固定後に添加してもよい。適切なブロッキング 剤としては、上述のものや、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１ 〜５倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液は０．０２％Ｆｉｃｏ ｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン及び０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡからなる） が挙げられる。 カゼインはＤＮＡと抗体ＳＢＭの両者に好適なブロッキング剤であることがわ かっており、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（カタロ グ番号Ｃ−３４００）から市販されている。カゼインは「準可溶性(mela-solubl e)」タンパク質（例えば参考資料として本明細書の一部とするＣｈｉｎｇらの米 国特許第５，１２０，６４３号参照）として知られる類のタンパク質に属し、可 溶性を高めるためには化学的処理が必要である。このような処理は酸又はアルカ リ処理を含み、無傷のタンパク質の分解及び／又は部分的加水分解を生じると考 えられる。他の準可溶性タンパク質としては、ゼイン（Ｓｉｇｍａカタログ番号 Ｚ−３６２５）と非アルブミン卵白 タンパク質（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ−５２５３）が挙げられる。カゼインは 約２３，６００（ウシβカゼイン）の分子量をもつ乳タンパク質であるが、本明 細書で「カゼイン」又は「アルカリ処理」カゼインという場合には、いずれも米 国特許第５，１２０，６４３号の実施例１に記載されているアルカリ処理により 得られる部分加水分解混合物を意味する。こうして処理したカゼインの電気泳動 ゲル（２０％ポリアクリルアミドＴＢＥ）は、このマーカーよりも下の拡散バン ドを示し、主に１５，０００未満の分子量をもつフラグメントの混合物であるこ とを示す。 ブロッキング剤、特にカゼインは実施例に記載する「シーティング(sheeting) 」作用を助長する疎水性を表面に与えると予想される。「シーティング」は表面 に加えた水が多数の小液滴よりもむしろ１つの凝集液滴としてエレメントに与え られるときに生じる。しかし、コーティングの均質性はその疎水性よりも重要で あると考えられる。実施例１のようにチャネルデバイスに形成したエレメントは 好ましいことにこのようなシーティング作用を示す。これはチャネル内の流動及 び拡散を助長すると考えられる。 第１の特異的結合メンバーは所望により付加的な同系対を介して分析物に特異 的であり得ると理解すべきである。例えば、オリゴヌクレオチドＳＢＭをビオチ ン化し、ビオチン−アビジン同系結合対を介して反応表面に結合することができ る。このような結合はＨａｎｓｅｎによりＥＰ ０ １３９ ４８９号（Ｏｒｔ ｈｏ）に記載されている。同様に、Ｓｔａｂｉｎｓｋｙにより米国特許第４，７ ５１，１７７号（Ａｍｇｅｎ）に開示されているようにメディエータープローブ を介してオリゴヌクレオチドを反応表面に結合することもできる。中間同系結合 対を使用する場合には、（反応表面の）界面から光散乱ラベルまでの合計距離が 侵入深さをさほど上回らないように注意しなければならない。この点で、免疫グ ロブリン抗体の直径は約５ｎｍであり、ＤＮＡ２０量体（βヘリックス形）の長 さは約６．８ｎｍであると推定されている。従って、典型的な２００〜３００ｎ ｍの侵入深内に多重同系対の為の余地が残される（発明の背景の項参照）。同系 結合相互作用は、用途によっては高温も含み得る後続反応条件に耐えなければな らないことも理解すべきである。オリゴヌクレオチドが長いほど又はＧＣ含量が 高いほど安定であり、この場合には好ましい。光散乱ラベル 本発明の別の重要な要素は光散乱ラベル又は粒子（「ＬＳＬ」）である。ＬＳ Ｌは入射光を弾性的に散乱、即ち光エネルギーを実質的に吸収せずに散乱させる 分子又は材料であり、多くの場合には粒子である。ＬＳＬの例としてはコロイド 金属及び非金属ラベル（例えばコロイド金又はセレン）、赤血球、並びにラテッ クス、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリカーボネート又は類似の材 料から製造された染色プラスチック粒子が挙げられる。このような粒状ラベルの 寸法は１０ｎｍ〜１０μｍ、典型的には５０〜５００ｎｍ、好ましくは７０〜２ ００ｎｍである。粒子が大きいほど光散乱効果は大きいが、これは結合及びバル ク溶液粒子の両者について言えることであるので、バックグラウンドも粒度と共 に増加する。適切な粒子ＬＳＬはＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ ｃ．，Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ，米国から市販されている。 本発明では、ＬＳＬを第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーに結合す る。第２の特異的結合対メンバーを「ラベルＳＢＭ」と呼び、ＬＳＬとラベルＳ ＢＭの複合体を「ラベル結合体」又は単に「結合体」と呼ぶ。ラベルＳＢＭの性 質及び特 異性はアッセイのフォーマットに依存する。競合アッセイフォーマットでは、ラ ベルＳＢＭは分析物の類似体であり、分析物と競合して捕獲ＳＢＭに特異的に結 合する。直接サンドイッチアッセイフォーマットでは、ラベルＳＢＭは分析物上 の第２のエピトープに特異的である。このため、分析物を捕獲ＳＢＭとラベルＳ ＢＭの間に「サンドイッチ」することができる。間接サンドイッチアッセイフォ ーマットでは、ラベルＳＢＭは分析物に結合した部位又はリポーター基に特異的 である。例えば、抗原分析物が捕獲されたら、ビオチン化抗体を使用して分析物 を「サンドイッチ」し、ビオチン特異的ラベルＳＢＭを使用する。この間接サン ドイッチフォーマットは核酸にも有用である。この場合には、捕獲ＳＢＭは標的 に相補的なオリゴヌクレオチドであり、標的は特異的結合リポーター分子（例え ば、典型的にはＬＣＲ又はＰＣＲ等の増幅法により取り込まれたビオチン又はハ プテン）を含み、ラベルＳＢＭはリポーター基に特異的となるように選択される 。 当然のことながら、ラベルＳＢＭは捕獲ＳＢＭの場合と同様に中間同系対を介 してそのそれぞれのパートナー（フォーマットに依存して分析物又は第１のＳＢ Ｍ）に特異的であり得る。 例えば、分析物がハプテンリポーター基をもつ増幅産物等のオリゴヌクレオチド である場合には、サンドイッチアッセイフォーマットは抗ハプテン抗体に結合し たＬＳＬを含む。従って、ラベルＳＢＭはハプテン−抗ハプテン同系結合対を介 して分析物に特異的である。核酸中間同系対の１例はＳｃｈｎｅｉｄｅｒら，米 国特許第４，８８２，２６９号（プリンストン大学）に記載されている。ラベル ＳＢＭでも捕獲ＳＢＭと同様に界面からの距離と同系対の安定性を考慮すべきで ある。 アッセイフォーマットに関係なく、ラベルＳＢＭは光散乱ラベルに結合して結 合体を形成しなければならない。捕獲ＳＢＭと同様に、ラベルＳＢＭもＬＳＬに 共有結合していてもよいが、必ずしもその必要はない。粒状ＬＳＬにラベルＳＢ Ｍを物理的に吸着させてもよい。この場合には、例えば洗浄段階又は他の流体流 動によりＬＳＬを実質的に損失せずに後続反応条件に耐えるに十分な強さに結合 すればよい。 ＬＳＬとラベルＳＢＭを結合するのに適した共有結合法は多数のものが文献に 記載されている。例えば、標準合成化学によりアミノ基をラベルＳＢＭに導入す ることができる（例えば Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｅ Ｗｏｏ ｄｌａｎｄｓ，ＴＸ，米国の市販品）。アミン修飾ＳＢＭに共有結合するために ＬＳＬを活性化する化学物質の非限定的な例は臭化シアン、Ｎ−ヒドロキシスク シンイミド又はカルボジイミドである。Ｗ．Ｈ．Ｓｃｏｕｔｅｎ著ＡＦＦＩＮＩ ＴＹ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ，１９８１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ及びＷ．Ｈ．Ｓｃｏｕｔｅｎ著ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＢＩＯＣＨＥ ＭＩＳＴＲＹ，ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＡＮＤ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＡＳＰＥ ＣＴｓ，１９８３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓにはこのような活性化 技術が記載されている。場合により、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び カルボジイミドを用いる場合にはＬＳＬは表面カルボキシル基を含まなければな らず、臭化シアンで活性化する場合にはＬＳＬは表面ヒドロキシル基を含まなけ ればならない。周知のヘテロ及びホモ二官能価リンカーもこのような共有結合に 利用することができる。ＬＳＬとして使用するのに適した化学基及び直径をもつ ＬＳＬ粒子は数種の商業源から得られる（例えばＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ，米国）。結合特異性を改善するた めにストリンジェントな条件が必要なシステムではラベルＳＢＭのＬＳＬへの非 共有結合吸着が妨げられる恐れがあるので、このようなシステムではＬＳＬをラ ベルＳＢＭに共有結合すると有利であると思われる。吸光材料 本発明の１好適態様では、試料とラベル結合体の混合物に吸光材料（「ＬＡＭ 」）を加える。ＬＡＭは迷光が光散乱反応に干渉しないようにすることを目的と する。迷光は主に反射界面の微視的欠陥と、侵入深さに移動し且つ結合していな い粒子によるエバネッセント波の散乱によって生じる。ＬＡＭはバルク溶液に分 散すると、（従来技術のように）不透明層を形成するために同一材料を表面に被 覆する場合よりもこのような迷光の効果を良好に吸収及び最小化する。ＬＡＭは 少なくとも１５、好ましくは＞１００、最も好ましくは３００以上の最終有効光 学密度（「Ｏ．Ｄ．」）を提供すべきである。「有効」Ｏ．Ｄは入射光の波長を 考慮し、単色光の波長のＯ．Ｄ．と多色光の最も主要な波長のＯ．Ｄ．である。 適切なＬＡＭとしては結合体自体と多数の吸光染料が挙げられる。吸光染料は 、理想的には光源の波長に対応する波長で電磁スペクトルからエネルギーを吸収 する任意の化合物である。当該技術分野で公知の通り、染料は一般に、例えばア ゾ染料、ジアゾ染料、トリアジン染料、食品着色剤又は生物染料等の分類の染料 のように共役複素環構造から構成される。特定染料としては、クーマシーブリリ アントブルーＲ−２５０染料（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃ Ａ）、リアクティブレッド２（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ブロモフェノールブルー（Ｓｉｇｍａ）、キシレ ンシアノール（Ｓｉｇｍａ）及びフェノールフタレイン（Ｓｉｇｍａ）が挙げら れる。Ｆｌｏｙｄ Ｊ．Ｇｒｅｅｎ著Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｈａｎｄｂ ｏｏｋ ｏｆ Ｓｔａｉｎｓ，Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ，Ａｌ ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅ ｅ，ＷＩ）刊には、他の染料の多くのデータが記載されている。これらのデータ に基づき、光源により発生される波長に一致するように適当な吸光性をもつ染料 を選択することができる。 これらのＬＡＭはＬＳＬへのラベルＳＢＭの吸収を妨げず、又は固定化ラベル ＳＢＭの特異性を妨げないものが好ましい。例えば、ラベルＳＢＭがペプチド、 ポリペプチド又はタンパク質である場合には、ＬＡＭはペプチド、ポリペプチド 又はタンパク質を変性しないことが好ましい。同様に、ラベルＳＢＭがヌクレオ チド配列である場合には、ＬＡＭはヌクレオチド配列を変性しないことが好まし い。吸光性に基づいて選択した染料を実験により評価し、染料が導波路アッセイ の実施に必要な特異的結合事象を妨げないようにすることができる。 驚くべきことに、結合体自体もＬＡＭとして機能し得る。必要濃度を上回るラ ベル結合体、例えば少なくとも１５、好ましくは＞３００、最も好ましくは＞５ ００の有効Ｏ．Ｄ．を提供するような濃度を使用しても検出を改善できることが 判明した。結合体の濃縮方法としては、実施例２及び３に記載するようなアフィ ニティー精製又は遠心分離が挙げられる。染料を濃縮結合体と併用してもよいが 、高濃度の結合体は通常は単独で十分であることが判明した。ラベルの添加量を 増して信号対雑音レベルを改善するこの現象は、診断アッセイでは実質的に前代 未聞であり、一般の考えに全く反するものである。 ＬＡＭは本発明の選択的態様であるが、その使用により、より高濃度のラベル 結合体、より高強度の光及びより大きいラベル粒子を使用できるようになり、こ れらはいずれも吸光材料を含まないシステムよりも性能を著しく改善する。ＬＡ Ｍを使用する効果の増大は、公知の従来技術の方法よりも迷光の光源に著しく近 い点で迷光を除去するためであると推測される。反応表面に対向する導波路表面 にコーティングしても、この表面に到達する迷光しか吸収することができない。 溶液中の迷光は依然として望ましくない散乱を生じ得る。使用方法 本発明によるアッセイ方法は上記のようなＴＩＲエレメント又は導波路を利用 し、競合アッセイフォーマット及び直接又は間接サンドイッチアッセイフォーマ ットを含む。図３は間接サンドイッチフォーマットを示す。 まず最初に、少なくとも１個の捕獲ＳＢＭを界面６４で反応表面の１個以上の 部位に固定したＴＩＲエレメント又は導波路６２を上述のように作成する。捕獲 ＳＢＭは分析物に特異的である。図３ではＳＢＭは捕獲オリゴヌクレオチド（６ ６に示す）であり、配列５’−ＡＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＡＣＧＡ（配列番 号３）をもち、界面６４に固定されている。非部位部分により空間的に分離され た別個の部位に多数のＳＢＭを固定すると好ましい。 サンドイッチフォーマットでは、次に分析物の存在又は量を試験しようとする 流体試料を反応表面上の捕獲ＳＢＭと接触させる。この方法段階の唯一の一般要 件は、空間的に分離して固定したＳＢＭに試料を直接接触させて分析物と捕獲Ｓ ＢＭを結合させることである。本発明の方法では、反応表面と接触させた後に流 体試料を温和に混合することも好ましいが、必ずしもその必要はない。このよう な混合は流体試料と固定化ＳＢＭの緊密な接触を確保するのに役立つ。混合する 代わりに、反応表面に試料流体の毛管流を流しても分析物と捕獲ＳＢＭとの良好 な接触及び結合を助長できる。 次に、結合条件下でラベル結合体も反応表面と接触させる。ラベル結合体は分 析物（又は分析物に結合したリポーター基）と結合して反応表面又はその近傍に 光散乱特異的結合複合体を形成する。サンドイッチフォーマットでは、場合によ り反応表面を試料又は結合体のいずれかと接触させる前に試料と結合体を混合し てもよいし、上記２段階法を使用してもよい。所望に より、ＬＡＭを使用して結合体又は試料−結合体混合物に加えることにより方法 を実施してもよい。 図３によるとラベル結合体は抗ビオチン抗体７０を固定した光散乱コロイドセ レン粒子６８から構成される。分析物は７２に示すオリゴヌクレオチド５’−Ｔ ＣＧＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴ（配列番号１２）であり、ビオチン（「Ｂｉ」） リポーター基７４で標識されている。オリゴヌクレオチドの相補性とビオチンに 対する抗体特異性により、ＬＳＬは導波路の侵入深さ７６内に保持される。 このようなリポーター基を試料核酸に組込む方法は多くのものが知られている 。例えば、ＰＣＲやＬＣＲ等の方法を使用し、プライマーにリポーターを担持さ せて試料を増幅してもよい。あるいは、リポーターを個々のヌクレオチドトリホ スファートに結合した後、試料から作成したエクステンション産物に組込んでも よい。この組込み法はＰＣＲでもＧａｐ ＬＣＲとして知られるＬＣＲ変法でも 実施される。 次に、内部全反射を生じるようにエレメントを照射する。ＴＩＲの光源及び物 理的原理については既に述べた通りである。図３ではエバネッセント波の散乱を ７８に示す。迷光を少なく するためにスリットを使用すると好ましい。光散乱特異的結合複合体が形成され た部位では、光の散乱は非部位部分の暗いバックグラウンドに対して明るい領域 として観察される（例えば図４〜８Ａ及び９〜１２参照）。部位が明るければ明 るいほどその部位には多量のＬＳＬが結合しており、多量の分析物が存在する。 この方法を使用し、グレートーン（gray tones）をコンピューターに読み込ませ 、カリブレーターを使用して各部位に存在する分析物の量を推定することにより 定量又は半定量することができる。競合フォーマットでは、ＴＩＲデバイスと反 応表面は上記と同様である。他方、ＬＳＬは捕獲ＳＢＭに関して試料分析物と競 合する分析物類似体である。従って、スポットの明度は分析物の量に反比例する 。このフォーマットでは、試料と結合体のいずれか一方を反応表面と接触させる 前に相互に混合しなければならない。サンドイッチフォーマットと全く同様に競 合フォーマットでもＬＡＭが有用である。 「前縁(leading edge)」又は「シャドウイング」などと種々の呼称で知られて いる現象は本発明では問題とならないことを指摘すべきである。この現象は下流 部位のラベルの結合が上流部位の結合よりも弱いクロマトグラフィー流装置で見 られる。 実施態様によっては流路を使用することもあるが、ＬＳＬの結合を制御する要素 が主に拡散であってクロマトグラフィーではないことがこの現象が回避される主 因である。 従来技術のように光ビームを個々の部位に逐次当ててエバネッセント波の小さ い発生地点を形成することにより本発明のデバイスを使用することも可能である が、導波路全体を一度に照射し、反応表面全体の全域にエバネッセント波エネル ギーを形成するほうが断然好ましい。このように反応表面全体を同時に照射する と、全部位を同時に試験及び比較することができ、従って、従来可能であったよ りも著しく迅速に検出することができる。本発明のシステムの主要な利点の１つ は、リアルタイム結合及び／又は解離の動的変化を観察することができ、約数秒 、好適実施態様では例えば１〜２０秒以内に可視信号を発生できることである。 導波路反応表面全体を一度に観察（及び／又は検出）でき、全体を同時に照射す ることができるので、入射光を照射するため又は散乱光を検出するために各部位 を走査する必要がなく、部位のＬＳＬの蓄積をリアルタイムで観察することがで きる。 ＴＩＲに関する従来の教示に対してこの知見は多少予想外で ある。典型的には、ＴＩＲエレメントの検出器は光がエレメントから出てくるに つれて集光できるようにエレメントの出口に配置される。エレメントから出る光 は結合事象により変化したと常に考えられていた。実際に、結合事象による光の このような変化なしに出口光を用いる検出は不可能であった。従って、光は結合 事象により何らかの方法で変化すると予想される。このため、光が第２の結合部 位にあたったときに同様に挙動すると保証することができず、従って、このよう な教示の下では多重部位エレメントを共通光源により同時に照射することはでき ないと考えられていた。本発明は、（光源に関して）下流部位の内部全反射光が 上流部位の結合現象によって干渉されないことを意外にも見出した。 更に、種々の条件が変化するにつれて結合の程度又は範囲をリアルタイムでモ ニターすることができる。例えば、ＳＢＭが鎖対合を形成できるようにしたオリ ゴヌクレオチドであり、変化する条件がストリンジェンシーである場合には、核 酸の鎖の解離（その結果、ＬＳＬが遊離してバルク溶液に移動し、エバネッセン ト波エネルギーを散乱できなくなる）は部位の明点の損失として実際に観察する ことができる。当該技術分野で公知 の通り、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは温度やイオン強度等の パラメーターを変化させることにより制御することができる。温度が増加すると ストリンジェンシーは増加し、デュプレクスは不安定になる。この方法には慣用 加熱ブロックを使用することができ、上記好適２プレートデバイスを加熱ブロッ クに載せるだけでよい。溶液相の融点と良好な対応を示すオリゴヌクレオチドの 融解温度（Ｔｍ）が得られる。水で希釈するなどして有効カチオン濃度を低下さ せてもストリンジェンシーは増加する。従って、本発明の導波路及び方法は、オ リゴヌクレオチド融解温度のリアルタイムモニターメカニズムを提供する。こう してストリンジェンシーを制御することにより、たった１塩基でもミスマッチを 含む鎖から完全に相補的な鎖を区別することができる。このようなシステムは遺 伝子配列決定及び診断に極めて有用である。 オリゴヌクレオチド対の代わりに抗体とハプテンを使用することにより、抗体 −ハプテン相互作用に影響する条件変化も同様に評価することができる。例えば 、温度が増加するとタンパク質結合因子（例えば抗体）が変性し、その結果、結 合能が失われる。本発明を使用すると、タンパク質のこの変性をリアル タイムでモニターすることができる。留意すべき点として、分析物と捕獲ＳＢＭ との結合がモニターされる解離事象であるように、ＳＢＭを導波路表面に保持す るか又はＬＳＬをラベルＳＢＭに結合するのに使用する全ての同系結合対はこの ような条件の変化に耐えられることが好ましい。 着目すべき点として、本発明の別の利点は、検出を可能にするために捕獲部位 から試薬及び試料（例えば結合体−試料溶液）を洗い流す必要がないことである 。蛍光及び放射性ラベルを用いる場合には、望ましくない信号を防ぐために未結 合ラベルを表面から除去しなければならない。しかし、本発明の未結合ＬＳＬは 一般に侵入深さから拡散し、物理的に除去しなくても信号を発生しなくなる。表 面から未結合成分を洗浄する必要がないため、アッセイを実施可能な速度が著し く増す。 融解温度測定の独自の反転では、本発明のデバイス及び方法を校正温度計とし て使用して導波路の正確な温度をモニターするか、又は製造品質管理として使用 して熱伝達の均質性をモニターすることができる。温度計としては、既知増分で 増加する融解温度をもつ一連のオリゴヌクレオチド対を反応表面上の一連の部位 に配置する。温度が増加するにつれ、まず最低融解温 度の対が解離し、次いで融解温度の順に後続対が解離する。反応表面の温度は、 これらの校正オリゴヌクレオチドの融解温度を知ることにより測定することがで きる。オリゴヌクレオチド対を既知融解温度の順に直線アレーに配置するならば 、「階段様(ladder-like)」効果が得られる。 更に、導波路全体を同一融解温度のオリゴヌクレオチドで被覆するならば、品 質管理環境で熱伝達の均質性を評価することができる。加熱が均質であるならば 全部位で同時に解離が生じる筈である。このようなチップを使用して加熱ブロッ クが「熱点」又は「冷点」を生じる変化を示すか否かを判定することができる。散乱光の検出 上記に言及したように、散乱光は視覚的又は光電手段により検出することがで きる。視覚検出の場合には、観察者の目と脳が特定部位の散乱の有無を決定する 画像処理段階を実施する。部位が周囲のバックグラウンドよりも明るい場合に散 乱が観察される（例えば実施例に関連する図参照）。部位の数が少ない場合、恐 らく１２以下の場合には、処理段階はほぼ同時に実施することができる。部位数 が多い（数百以上）場合には、光電 検出システムが望ましい。 光電検出システムは、部位の光強度により変調される電気信号を使用する任意 のシステムを含む。他えば、フォトダイオード、電荷結合デバイス、フォトトラ ンジスター、フォトレジスター及び光電子増倍管が適切な光電検出デバイスであ る。反応表面上の部位のアレーに対応するようなアレー状に検出器を配置し、一 部の検出器は非部位部分に対応するように配置すると好ましい。しかし、電荷結 合デバイス（ＣＣＤ）カメラを市販フレームグラビング（frame grabbing）及び 画像処理ソフトウェアと組み合わせるなどして反応表面をディジタル表示すると 一層好ましい。 ＣＣＤカメラ、フレームグラバーカード（frame grabber cards）、コンピュ ーター及び画像処理ソフトウェアのいくつかの使用例は、参考資料として本明細 書の一部とする本願と同一名義の１９９３年１０月２１日付け同時係属米国出願 第０８／１４０，８３８号に記載されている。要約すると、ＣＣＤカメラ又はビ デオカメラは全部位及び非部位部分を含む反応表面全体の画像を形成し、この画 像をコンピューターのフレームグラバーカードに供給する。画像は、数値を各画 素に割り当てる ことによってフレームグラバーによりディジタル情報に変換される。ディジタル システムはバイナリー（例えば明＝１及び暗＝０）でもよいが、８ビットグレー スケール（gray scale）のほうが好ましく、ゼロ（０）が黒画像を表し、２５５ が白画像を表し、中間の値が各画素の種々のグレーの色相を表すように数値を各 画素に割り当てる。 ディジタル情報はモニターに表示してもよいし、その後の操作に備えてＲＡＭ 又は任意の記憶装置に記憶してもよい。２種の操作について述べる。まず第１に 、ディジタル化データファイルをソフトウェア製図アプリケーションに変換及び インポートすることができる。こうすると、図４〜７、８Ａ及び９〜１２を作成 するために実施例で生成したビデオ画像で行ったように、記録の（archival）目 的で画像を印刷することができる。適切な製図アプリケーションはＰｕｂｌｉｓ ｈｅｒｓ ＰａｉｎｔＢｒｕｓｈソフトウェア（ＺＳｏｆｔ Ｃｏｒｐ．，Ａｔ ｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ）であり、この他にも多くのソフトウェアパッケー ジが「生」、ＴＩＦＦ、ＧＩＦ、ＰＣＸ、ＢＭＰ、ＲＬＥ及び他の多くを含む多 種のファイルフォーマットでファイルインポートを受理又は変換する。印刷及び 記録の 操作では、画像の正しく忠実な表示が得られるように変換及びインポーテーショ ンはデータの内容を変えるべきでない。 第２に、画像処理ソフトウェアを使用してディジタル情報を分析し、各部位の 境界又は輪郭と各部位の強度の平均又は代表値を決定することができる。強度は 部位に存在するＬＳＬの量と正の相関があり、ＬＳＬの存在量はこのような部位 における分析物結合メンバーの量と（アッセイフォーマットに依存して負又は正 の）相関がある。このようなデータ操作は実施例２及び５に実証し、図８Ｂ及び ８Ｃが得られた。 同一部位の多重画像を蓄積し、経時的に分析することもできる。反復画像につ いては導波路又はＴＩＲエレメントを多重回数照射するか、又はより一般には画 像が各所望時刻に形成されるまで単に照明を維持する。第１の時刻ｔ₁の光散乱 を第２の時刻ｔ₂の散乱に比較することにより、動的情報が得られる。光散乱量 の増減の時間依存性（即ち速度）は任意の所要の反応時点の反応による合計散乱 量よりも流体試料中に存在する結合対メンバーのレベルを正確に表すことができ るので、この動的情報はアッセイが定量を目的とする場合に特に有用である。更 に、多重画像を使用すると、検出された散乱光の増加が時間に 関する既知関数となるようなデータセットが得られる。反応表面の所与の領域か らの散乱光の強度の経時的変化率を測定することにより、反応速度が得られる。 反応動力学を使用することにより、速度を試料溶液中の分析物濃度の定量値に相 関させる。当然のことながら、３回以上データを集めてもよく、一般には多くの データ点を獲得するほど動的即ち速度情報の信頼性は増す。 反応動力学の代わりに別の方法も使用できる。この方法では、散乱光強度を時 間に対して積分する。この積分により得られた面積は溶液中の分析物の濃度に相 関する。 以下、詳細な実施例により本発明の種々の態様を示す。実施例は例示の目的に 過ぎず、発明を制限するものではない。 実施例 実施例１．染料ＬＡＭを使用したｈＣＧイムノアッセイ Ａ．導波路への捕獲ＳＢＭの結合 本実施例で使用した導波路はＣｏｒｎｉｎｇから市販されている抗体被覆標準 ガラスカバースリップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．；カタログ＃２，２２ｍｍ平 方）であった。少量（約２μｌ）の抗体溶液（例えばアフィニティー精製ヤギポ リクローナ ル抗−βｈＣＧ，１０ｍＭリン酸塩，ｐＨ７．４，１２０ｍＭ ＮａＣｌ）をほ ぼ円形の規定領域に付着させることにより、ガラス導波路に反応表面を形成した 。ストック抗体濃度は３．３ｍｇ／ｍｌであり、直接使用するか、又は塗布前に 抗体を１％スクロース（水に溶解した１％重量／容量［ｗ／ｖ］スクロース）に １：１０に希釈した。いずれの場合も、導波路の表面に保持できるタンパク質の 量よりも過剰の抗体を付着させ、この過剰の抗体を水洗して乾燥した。 抗体を導波路に固定後、ガラス表面を０．０５％アルカリ処理カゼイン水溶液 で処理し、ガラス表面と流体試料中の物質との非特異的相互作用を阻止した。表 面を覆うに十分な容量の０．０５％カゼイン溶液を室温で１〜５分間インキュベ ートした後、洗壜を使用してガラスを水洗した。カゼインは物理的吸着によって 表面を被覆し、その結果、「シーティング作用(sheeting action)」を示す表面 が形成された。即ち水流を慎重に当てることによりチップ表面の全水が重力流に より除去された。 Ｂ．デバイスの組み立て アッセイ試薬を収容するデバイスは、図２Ａ〜２Ｃに示すよ うな２枚のガラスカバースリップから構成した。一方のカバースリップ（導波路 ）には結合捕獲ＳＢＭを収容し、別のガラスカバースリップは試料−結合体溶液 を保持するチャネルを形成するようにした。２枚のカバースリップをずらして両 面テープ（Ａｒｃａｒｅ ７７１０Ｂ，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ Ｒｏｃｋ，Ｐｅｎｎ）で張り合わせ、幅１６ｍｍ及び厚 さ約７５μｍ（両面テープの厚さ）のチャネルを形成した。形成されたチャネル は容量約２５μｌを保持する。 Ｃ．導波路の照射 次に約２ｍｍのスリット開口部（aperture）を備える１５０ワット白熱電球か らなる光源で導波路を照射した。導波路を光源スリットに挿入し、導波路の厚さ ２ｍｍの受光縁部に光が当たるようにした（図２Ａ参照）。導波路はマスクに対 して約４５°となるようにスリットに挿入したが、入射光の角度を最適化したり 、臨界角未満でエレメントに当たる光を除去するようにはしなかった。 Ｄ．試料、光散乱結合体、吸光染料の添加 次に、試料、光散乱結合体及び吸光染料を含む溶液を反応表 面に加えて捕獲部位を覆った。結合体は、コロイドセレン粒子（Ｙｏｓｔらの米 国特許第４，９５４，４５２号）を使用して次のように調製した。セレンコロイ ド（５４６ｎｍの吸収最大波長で３２Ｏ．Ｄ．濃度）１ｍｌをモノクローナル抗 αｈＣＧ抗体（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）２．５μｌ及び２０％ＢＳＡ（２０ｇ／ １００ｍｌ水溶液）３０μｌと１０秒間混合した。次にセレン結合体１０μｌを ｈＣＧカリブレーター（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの製品ｈＣＧ −Ｕｒｉｎｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ；カタログ＃ ３Ａ２８−０２））４０μｌに加えた。最後に青色ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ食品着色 染料（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｈｕｎｔ Ｖａｌｌｅｙ，ＭＤ）２〜３μｌをこの 混合物に加え、６３０ｎｍで１４０〜２００の最終Ｏ．Ｄ．とした。 Ｅ．光散乱信号の検出 エバネッセント光波と光散乱ラベルとの相互作用により誘導される散乱光は視 覚的又は標準ビデオ分析システムにより検出することができる。視覚検出の場合 には、信号は約１分以内に観察され、５分以内に非常によく見えるようになる。 この視覚信号を標準８ビットＣＣＤ（電荷結合デバイス）カメラ （Ｃｏｈｕモデル４８１５ Ｃｏｈｕ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ） で記録した。Ｃｏｍｐａｃ ＤｅｓｋＰｒｏ ３８６／２０ｅ（Ｃｏｍｐａｑ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）でフレー ムグラバー（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ ｄ，ＰＣ ＶＩＳＩＯＮ ｐｌｕｓ Ｆｒａｍｅ Ｇｒａｂｂｅｒ Ｂｏａｒｄ ；Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ）を使用して画像のディジタル表示を生成した。ディ ジタル化画像データファイルをＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＰａｉｎｔＢｒｕｓｈソ フトウェア（ＺＳｏｆｔ Ｃｏｒｐ．，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ）に変 換及びインポートし、３００ｄｐｉ解像度プリンターで画像を印刷した。印刷画 像を図４に示す。実施例２．改善ｈＣＧ導波路アッセイ Ａ．アッセイ構成 セレン結合体を次のように３０倍に濃縮した以外は実施例１に記載した通りに アッセイを実施した。５４６ｎＭ光で３２Ｏ．Ｄ．のセレンコロイド１０ｍｌを 抗ｈＣＧ抗体（１ｍｇ／ｍｌ、実施例１に記載）２５μｌ及び２０％ＢＳＡ（実 施例１参照）３００μｌと混合した。得られた溶液を２本の６ｍｌ容量遠心 管に入れ、遠心機モデルＣｅｎｔｒａ−４Ｂ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅ ｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｅｄｈａｍ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＡ） を使用して５，０００Ｒ．Ｐ．Ｍ．で１０分間遠心分離し、セレン結合体をペレ ット化した。淡黄色の上清約９．６６ｍｌを除去すると、撹乱されずに濃赤色の セレンペレットが残った。セレン結合体ペレットを残りの上清０．３３ｍｌに再 懸濁して合わせた。ｈＣＧ「試料」は、それぞれ２５０、５０及び０ｍＩＵ／ｍ ｌのｈＣＧを含有するＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したｈ ＣＧ−Ｕｒｉｎｅ高陽性、低陽性及びゼロ対照（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ ；カタログ＃３Ａ２８−０２）であった。更に、非特異的結合を阻止するブロッ キング剤として１０％カゼイン（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１５０ｍ Ｍ ＮａＣｌ，１０％ｗ／ｖカゼイン）０．５ｍｌを最終カゼイン濃度０．９％ となるように対照の各々に加えた。導波路は、部位が手書き「＋」記号となるよ うにポリクローナル抗ｈＣＧ抗体をガラス毛管でガラス表面に添加した以外は、 実施例１に記載したように構成した。 等量の３０倍濃縮セレン結合体（上記）と試料を混合し、す ぐに導波路に適用した。この場合は、結合体−試料混合物の光学密度（約４６５ Ｏ．Ｄ．）が非常に高いので、バックグラウンド散乱を阻止するために食品着色 染料を加える必要がなかった。更に高濃度結合体は、驚くべきことにバックグラ ウンド散乱を増加することなく導波路信号発生の感度と速度を増加した。０ｍＩ Ｕ／ｍｌ試料では容易に感知可能な信号は得られず、２５ｍＩＵ／ｍｌ試料（最 終濃度）では約３０秒で可視信号が得られ、１２５ｍＩＵ／ｍｌ試料（最終濃度 ）では５秒以内に信号が得られた。図５は実施例１−Ｄに記載するように撮像、 ディジタル化及び印刷したものであり、高陽性ｈＣＧ試料（１２５ｍＩＵ／ｍｌ ）では１秒で微かな「プラス」信号が認められる。時刻＝０は導波路チャネルの 結合体溶液充填を示し、時刻＝１秒はほぼ瞬時の可視プラス信号の初期形成を示 し、時刻＝５及び２０秒は明白な可視プラス信号を示す。 Ｂ．感度測定 抗体溶液（実施例１参照、ポリクローナル抗ｈＣＧ抗体１ｍｇ／ｍｌ）の単一 スポットを導波路に加えて反応表面に単一部位を形成した以外は上記と同様に導 波路チップを作成した。このシステムの感度を推定するために、０ｍＩＵ／ｍｌ の試料 ６個と３１ｍＵＩ／ｍｌの試料５個を用いて実験を繰り返した（公称ｈＣＧ濃度 であり、実測は行わなかった）。試料と結合体を１分間混合し、導波路チャネル に加え、信号生成から１分後にフレームグラバーとＣＣＤビデオカメラを使用し てディジタルビデオ画像を獲得した。ディジタル画像は０（暗）〜２５５（白） の一連の８ビットグレースケール値から構成される。従って、ディジタルファイ ルは一連のこのような数値から構成され、各数値は画像の特定の単一画素位置に 対応する。 得られたディジタル化データをＩｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（ Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）で 分析し、ほぼ信号スポットの寸法の円形領域を使用して画像データの数値グレー スケール値を測定した。円形測定領域内のディジタル値を平均した。即ち円内の 各値を加算し、得られた和をこのような値の個数で割った。捕獲部位と信号部位 に隣接する代表的なバックグラウンド非部位部分についてこのような値を得た。 信号からバックグラウンドを引いた差を測定値とした。この実験で得られたデー タを表２．１に示す。 ０ｍＩＵ／ｍｌ実験の平均純(net)信号は６．６±０．７ｍＩＵ／ｍｌであり 、３１ｍＩＵ／ｍｌ実験では２９．２±７．８ｍＩＵ／ｍｌである。従って、線 形補間(interpolation)によると、１グレーレベル＝１．４ｍＩＵ／ｍｌであり 、０ｍＩＵ／ｍｌ純信号を２標準偏差上回る純信号値、即ち１．４、は約２ｍＩ Ｕ／ｍｌの感度推定値をもたらす。実施例３．甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）イムノアッセイ Ａ．固相への捕獲試薬の結合 濃度０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌのアフィニティー精製ポリ クローナル抗αＴＳＨ抗体から構成される少量（約２μｌ）の抗体溶液を加える ことにより導波路のガラス表面に抗体捕獲部位を形成した以外は、実施例１に記 載した通りに導波路を作成した。抗体溶液は１％スクロースを含有する。抗体を 乾燥させて固定させ、ガラス表面に吸着させ、ＨＰＬＣ水で濯ぎ、強制空気風乾 した。固定後、ガラス表面を≦１分間０．０５％アルカリ処理カゼイン（１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．８，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で処理し、反応表面と流 体試料中の物質との非特異的相互作用を阻止し、チャネル内の流れを助長した。 過剰のカゼインを「シーティング作用」でＨＰＬＣ水でスライドから濯ぎ流した 。残留液体を強制風乾した。 実施例１に記載したように使い捨てデバイスを組み立て、実施例１に記載した ように光源のスリット開口部に挿入した。 Ｂ．試料及び濃縮光散乱結合体の添加 次に、試料と光散乱結合体を含む溶液を反応表面に加えて捕獲部位を覆った。 光散乱結合体は第２の抗体（モノクローナル抗βＴＳＨ；１０μｇ／ｍｌ）を１ ６Ｏ．Ｄ．（５４６の吸収最大波長）まで希釈した実施例１のセレンコロイドで 標識することにより調製した。１０秒間混合後、０．６％ＢＳＡを加え て結合を阻止し、８０００ｒｐｍで３〜５分間遠心して濃縮した。結合体を元の 容量の１／２０に再懸濁した。次に、最終カゼイン濃度２．５％となるように１ ０％アルカリ処理カゼイン（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．８，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）７．５μｌと混合したセレン結合体７．５μｌから構成した試料緩衝 液１５μｌをＴＳＨ試料１５μｌと混合した。ＴＳＨ試料はＡｂｂｏｔｔ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの市販品（カタログ＃Ａ３Ａ６２−０１）であり、Ａ＝０ 、Ｂ＝０．５、Ｃ＝２、Ｄ＝１０、Ｅ＝４０及びＦ＝１００μＩＵ／ｍｌのＴＳ ＨレベルをもつＩＭｘ（登録商標）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｈＴＳＨア ッセイカリブレーターＡ−Ｆであった。これらのカリブレーターを試料緩衝液で １：１に希釈して使用し、カリブレーターの濃度として記載した濃度の２分の１ の最終濃度とした。 Ｃ．光散乱信号の検出 エバネッセント光波と光散乱ラベルとの相互作用により誘導される散乱光を視 覚的及び標準ビデオ分析システムにより検出した（例えば実施例１参照）。視覚 検出の場合には、約１分で信号が観察された。図６は実施例１−Ｄに記載したよ うに撮像、 ディジタル化及び印刷した。図６に示すように、１分でバックグラウンドを上回 る信号が明白に観察される。視覚検出によるシステムの推定感度は０．２５μＩ Ｕ／ｍｌ ＴＳＨである。０．１２５μＩＵ／ｍｌ ＴＳＨの信号は目視ではゼ ロよりも高いことがかろうじて識別できる。実施例４．ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ Ａ．ＤＮＡ導波路作成 １ｃｍ平方のガラス基板から嚢胞性線維症を生じるヒト遺伝子突然変異の検出 用ＤＮＡ導波路を作成した。反応表面に多重捕獲部位を提供するようにオリゴヌ クレオチドをガラスに固定した。特に、９個の異なるオリゴヌクレオチドＣＡＴ ０１〜ＣＡＴ０９（配列番号１〜９）を導波路のガラス表面に加え、ＣＡＴ＃が 標準プッシュホン電話機と同一番号により占められる位置に対応するように３× ３アレーパターンを形成した。ＤＮＡスポットは直径約２ｍｍで約２ｍｍの間隔 とした。ＣＡＴ０１〜ＣＡＴ０９（配列番号１〜９）の配列及び突然変異部位を 表４．１に示す。 ヒト遺伝子突然変異は標準表記法により示す。例えば、Δ５０８は嚢胞性線維 症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターポリペプチド（Ｊ．Ｚｉｅ ｌｅｎｓｋｉら，Ｇｅｎoｍｉｃｓ １０：２１４−２２８，１９９１）の５０ ８位における３塩基対の欠失を示す。「ＷＴ」はこの位置が野生型又は正常配列 であることを示す。オリゴヌクレオチド の３’末端にアミノ基が存在すると導波路の表面にＤＮＡを固定し易くなるが、 そのメカニズムは現在分かっていない。ＤＮＡ溶液はＳｙｎｔｈｅｃｅｌｌ（Ｃ ｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）により調製し、ＰＢＳ（リン酸緩衝塩類，ｐＨ７．４） 緩衝液で１：２０に希釈し、直径約１ｍｍのドリルビット(drill bit)の鈍端を 使用して導波路のガラス表面に添加した。ＤＮＡを清浄なガラス表面又は予め０ ．０５％カゼインを被覆しておいた表面に固定したが、ハイブリダイゼーション 結果は区別できなかった。導波路のガラス表面に加えたＤＮＡの最終濃度は高い ほうではＣＡＴ０２の１４μＭから低いほうのＣＡＴ０８の０．９μＭまでであ り、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌから入手した出発材料の濃度と比較することにより決 定した。塗布後、ＤＮＡ溶液を室温でチップ上で乾燥させるか、又は約３５％〜 ８０％の相対湿度の湿潤な日に５０〜７０℃に設定したインキュベーターに入れ て乾燥するまで（約１０分間）放置した。この手順により、上記３×３アレーに ９個の「スポット」又はハイブリダイゼーション捕獲部位が形成された。 Ｂ．ハイブリダイゼーション ＤＮＡ導波路性能を評価するために、３’末端にビオチンラ ベルを使用してＳｙｎｔｈｅｃｅｌｌにより９個の追加のオリゴヌクレオチドＣ ＡＴ２１Ｂ−ＣＡＴ２９Ｂ（配列番号１０〜１８）を合成した。試験ＤＮＡオリ ゴヌクレオチドの配列を表４．２に示す。 オリゴヌクレオチドはＣＡＴ２１Ｂ（配列番号１０）がＣＡＴ０１（配列番号 １）に相補的であり、ＣＡＴ２２Ｂ（配列番 号１１）がＣＡＴ０２（配列番号２）に相補的であり、以下同様にＣＡＴ０９（ 配列番号９）に相補的なＣＡＴ２９Ｂ（配列番号１８）まで設計及び命名した。 濃度は高いほうのＣＡＴ２５Ｂ（配列番号１４）の４７３ｍＭから低いほうのＣ ＡＴ２７Ｂ（配列番号１６）の１５１ｍＭまでとした。９個のＤＮＡ試料の各々 をハイブリダイゼーション緩衝液（１％カゼイン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７ ．４，１５ｍＭ ＮａＣｌ）１ｍｌに１μｌの割合で希釈し、９個の異なるＤＮ Ａ導波路の各々に１個ずつ加え、室温（約２３℃）で５分間インキュベートした 。洗壜を使用してＤＮＡ導波路の表面をＰＢＳで洗浄した後、ハイブリダイゼー ションの検出までＰＢＳ下に保存した。 Ｃ．ハイブリダイゼーションの検出 ９個の異なるビオチン標識ＤＮＡのハイブリダイゼーションをセレン抗ビオチ ン結合体から散乱した光により導波路内で検出した。セレン結合体は抗ビオチン （ポリクローナルウサギ抗ビオチン抗体、ＰＢＳ中１．１３ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ７ ．４、米国特許出願第０８／１９６，８８５号に対応するＭｕｓｈａｈｗａｒら のＥＰ０ １６０ ９００ Ｂ１号参照）２．５μｌを実施例１からのセレンコ ロイド（３２Ｏ．Ｄ．濃度）１Ｍｌ に加えた後、ウシ血清アルブミン（２０％Ｗ／Ｖ溶液となるように水に溶解した 粉末ＢＳＡ）３０μｌを加えることにより調製した。結合体溶液５０μｌをＤＮ Ａ導波路の表面に加え、導波路の側面に光を当ててセレンと種々のＤＮＡ捕獲部 位との結合を観察した。１分以内に多数の部位でポジティブハイブリダイゼーシ ョンが見えた。ＤＮＡ導波路をＰＢＳで洗浄して過剰のセレン結合体を除去し、 導波路励起光散乱を生じるように照射し、Ｃｏｈｕモデル４８１５ＣＣＤカメラ を使用して撮像した。画像を実施例１−Ｄに記載したようにディジタル化及び印 刷し、図７に示す。導波路を使用すると１回の画像測定でＤＮＡハイブリダイゼ ーションの完全なパターンが検出され、導波路に加えたオリゴヌクレオチドのＤ ＮＡ配列を決定することができた。ＣＡＴ２１Ｂ（配列番号１０）及びＣＡＴ２ ２Ｂ（配列番号１１）（図７の最初から２こま）の場合には、これらのオリゴヌ クレオチドとそれぞれＣＡＴ０１（配列番号１）及びＣＡＴ０２（配列番号２） 以外のＤＮＡ捕獲部位との配列相同が僅かであったため、ハイブリダイゼーショ ンパターンは比較的単純であった。他方、ＣＡＴ２３Ｂ〜ＣＡＴ２９Ｂ（配列番 号１２〜１８）の場合には、有意な配列相同の結果、結合パタ ーンは複雑になった。実施例５．リアルタイムＤＮＡ融解 Ａ．ＤＮＡ導波路作成 ＣＡＴ０３（配列番号３）及びＣＡＴ０４（配列番号４，ＰＢＳに１：２０に 希釈）を含有するオリゴヌクレオチド溶液１μｌを導波路カバースリップ（実施 例１と同様に０．０５％カゼインで被覆）に加えた後、室温で乾燥することによ り、２個のＤＮＡ捕獲スポットを含む導波路を作成した。２個のスポットから過 剰のＤＮＡを水で濯いだ後、チップを室温で乾燥した。２個のスポットを含むＤ ＮＡ導波路を別のガラスカバースリップと結合し、実施例１に記載したようなア ッセイ試薬を収容するための使い捨てデバイスを形成した。 Ｂ．ハイブリダイゼーション及び検出 １％カゼイン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４、１５ｍＭ ＮａＣｌの１ｍ ｌ中に１μｌを希釈することにより、ＣＡＴ２３Ｂ（配列番号１２）又はＣＡＴ ２４Ｂ（配列番号１３）の溶液を調製した。溶液を毛管流により使い捨て導波路 のチャネルに導入し、室温で５分間ハイブリダイズさせた。セレン結合体（実施 例４）を導入することによりＤＮＡ溶液をチャネルか ら排出させ、導波路を光源において検出を行った。数秒以内にＤＮＡ捕獲部位に ２個の明スポットが現れ、ハイブリダイゼーションが生じたことを示した。ＣＡ Ｔ２３Ｂ（配列番号１２）とＣＡＴ０４（配列番号４）の間の差は１塩基対しか なかったので、ＣＡＴ２３Ｂ（配列番号１２）とＣＡＴ０３（配列番号３）の間 のハイブリダイゼーションもＣＡＴ２３Ｂ（配列番号１２）とＣＡＴ０４（配列 番号４）の間のハイブリダイゼーションと同様に予想された。低温（即ち室温） 及び高塩（１５ｍＭ ＮａＣｌ）条件では、ハイブリダイゼーション法で１塩基 ミスマッチを区別するのに十分な識別力がなかった。 Ｃ．リアルタイム融解 室温ハイブリダイゼーションパターンの観察後、加熱ブロックをチャネルの非 導波路側（即ち使い捨てデバイスのチャネルを形成するために使用した第２のガ ラスカバースリップ）に配置することにより、ＤＮＡ導波路の温度を増加した。 導波路表面にＣＣＤカメラとビデオカセットレコーダー（ＶＣＲ）の焦点を合わ せてハイブリダイゼーションパターンに及ぼす熱の効果をリアルタイムで記録し た。導波路の下の（即ち使い捨てデバイスのチャネルを形成するために使用した 第２のガラスカバ ースリップと接触している）加熱ブロックの温度を熱電対で測定した。ディジタ ル温度読出し（Ｗａｔｌｏｗシリーズ９６５温度制御器、Ｗａｔｌｏｗ Ｃｏｎ ｔｒｏｌｓ，Ｗｉｎｏｎａ，ＭＮ）をＣＣＤカメラで撮像することにより記録し た。温度が増加するにつれてＤＮＡ部位の強度はＤＮＡ融解から予想されるよう に低下した。更に、ミスマッチでハイブリダイズしたＤＮＡを含むＤＮＡ部位の ほうが正確なマッチしたＤＮＡを含む部位よりも低温で融解する。その結果、正 確なマッチしたハイブリダイゼーションと１塩基ミスマッチハイブリダイゼーシ ョンを区別することができ、従って１塩基突然変異を検出することができた。ビ デオ画像形態のデータを１℃増分毎に集め、上記と同様にフレームグラバーを使 用してディジタル化した。図８Ａは５℃間隔のデータの印刷表示であり、約５０ ℃までにミスマッチスポットは消え始めるが完全にマッチした対は約６０℃まで 見えていることを示す。捕獲部位の強度を実施例２と同様に測定し、各温度の平 均スポット強度を計算した。図８ＢはＣＡＴ２３Ｂ（配列番号１２）の融解曲線 プロットであり、図８ＣはＣＡＴ２４Ｂ（配列番号１３）の融解曲線プロットで ある。融解温度は最上部プラトーと最下部プラトーの中間点と して推定される。実施例６．ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ感度 導波路に加えるＤＮＡの濃度の低下に伴って散乱信号強度を観察することによ り、導波路ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイの感度を推定した。各々ＰＢ Ｓで１：２０に希釈したＣＡＴ０１（配列番号１）及びＣＡＴ０３（配列番号３ ）０．５μｌを加えることにより、４個の同一のＤＮＡ導波路を作成した。この 手順を２回繰り返し、（向かって）左上及び右下角にＣＡＴ０１（配列番号１） を配置し、（向かって）右上及び左下角にＣＡＴ０３（配列番号３）を配置した ２×２アレーを形成した。ＤＮＡスポットを７０℃のオーブンで１５分間乾燥し 、過剰のＤＮＡを洗い流さずに第２のカバースリップを固定し、実施例１と同様 にチャネルを形成した。ＣＡＴ２３Ｂ ＤＮＡ（配列番号１２）をハイブリダイ ゼーション緩衝液（１％カゼイン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１５ｍＭ ＮａＣｌ）で３９．６ｎＭ、４ｎＭ及び０．４ｎＭの濃度に希釈した。第４の ＤＮＡ濃度（０ｎＭ）としてハイブリダイゼーション緩衝液単独を使用した。各 ＤＮＡ溶液３０μｌを４個の導波路デバイスの１個に導入した。ＤＮＡ溶液を使 い捨て導波路の一端の 開口部（open gap）に加え、次いで毛管作用によりチャネルに充填させた。溶液 を室温で１０分間インキュベートし、ハイブリダイゼーションを生じさせた。次 に、セレン抗ビオチン結合体（実施例４）３０μｌをチャネルの一端に加え、チ ャネルの他端にペーパータオルを当ててＤＮＡ溶液を除去し、その代わりにチャ ネルに結合体溶液を充填した。チャネルに結合体溶液を充填しながらＤＮＡ導波 路を照射することによりハイブリダイゼーションを検出した。セレン結合体の結 合から１分後に、３０フレーム／秒でＣｏｈｕ ＣＣＤカメラを使用して導波路 信号のディジタル画像を獲得した。４個のチップの各々のインポート及び印刷画 像を図９に示す。ＣＡＴ０３（配列番号３）部位のみに信号が存在することによ り特異的ハイブリダイゼーションが判明した。０ｎＭ試料のチップにはどの部位 にも信号は観察されず、ＣＡＴ０１（配列番号１）部位からはどの濃度でも信号 は観察されなかった。実験で使用したＤＮＡの最低濃度である０．４ｎＭ ＣＡ Ｔ０３はこれらの条件下で導波路により検出され、感度の近似測定値に相当する 。典型的比較として、Ｐｅａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ，９１：５０２２−５０２６，１９９４は１／３０秒でなく数分 の読取り時間でレーザー走査システムを用いた１０ｎＭ濃度の蛍光標識ＤＮＡの 検出を報告している。実施例７．高部位密度ＤＮＡ導波路の検出 単一オリゴヌクレオチドＣＡＴ０１（配列番号１）を複数回加えることにより 、高部位密度（部位当たりのＤＮＡの量とは区別し、部位数／チップとして定義 される）ＤＮＡ導波路を作成した。Ａｓｙｍｔｅｋ Ａｕｔｏｍｏｖｅ １０２ ＸＹＺ Ｔａｂｌｅ（Ａｓｙｍｔｅｋ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をプログラ ムし、直径１５０μｍのピンをＣＡＴ０１ ＤＮＡの溶液（ＣＡＴ０１を１：２ ０にＰＢＳで希釈）に浸漬させた後、ピンをカゼイン被覆した１ｃｍ平方のガラ ス導波路の表面に接触させた。このプロセスを３２３回繰り返し、直径１５０μ ｍで３００μｍ間隔のＤＮＡスポットの１８×１８アレーを形成した（１８×１ ８アレーは３２４スポットをもつはずであるが、プログラミングエラーにより１ 個のスポットの場所がなくなり、アレーの（向かって）右上部分が「ホール」に なったため、３２３スポットとなった）。アレー全体は１ｃｍ平方導波路の中心 に各辺約５．１ｍｍの正方形（２６ｍｍ²）を占有した。 得られた導波路を乾 燥し、水洗し、ハイブリダイゼーション に備えて再び乾燥した。１％カゼイン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１５ ｍＭ ＮａＣｌで１：１０００に希釈したＣＡＴ２１Ｂ（配列番号１０）の溶液 を導波路の表面に加え、アレー全体を室温で５分間覆うことによりハイブリダイ ゼーションを行った。ＰＢＳを用いてＤＮＡ溶液を導波路の表面から濯ぎ落とし た後、導波路の表面をセレン抗ビオチン結合体（実施例４）で覆って導波路を照 射することによりハイブリダイゼーションを検出した。ＣＡＴ２１Ｂ ＤＮＡ（ 配列番号１０）とＤＮＡアレーのハイブリダイゼーションは約３０〜６０秒で視 覚的に観察できた。チップをＰＢＳ皿に入れて過剰の結合体溶液を洗い流した。 上記と同様にフレームグラバーを使用してビデオ画像をディジタル化することに よりハイブリダイゼーションパターンを記録した。画像データの印刷表示を図１ ０に示す。図から明らかなように、導波路検出は全３２３個のハイブリダイゼー ション部位を同時に測定及び区別することができた。実施例８．ハイブリダイズしたＤＮＡの低イオン強度による解離 導波路検出の別の利点は再利用性である。この場合には、表面に固定したＤＮ Ａを傷つけずに導波路の表面にハイブリダイ ズした試料ＤＮＡをチップから剥離しなければならない。本実施例は、再生プロ セスをモニターするために導波路を利用できることを立証する。 ２２ｍｍ平方＃２ガラスカバースリップを使用して実施例４に記載したように オリゴヌクレオチドＣＡＴ０１〜ＣＡＴ０９（配列番号１〜９）を３×３アレー 状に配置した嚢胞性線維症ＤＮＡ導波路を作成した。シリコーン接着剤（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）を使用して第２のカバースリップを 導波路に固定することにより流路を形成し、対向する対角線の角に２個の管部品 を取り付けて入口及び出口とした。カバースリップは実施例１に記載したように ずらせ、導波路として機能する上部カバースリップに光が入射できるようにした 。ＣＡＴ０３（配列番号３）に完全に相補的なＣＡＴ２３Ｂ（配列番号１２）を ハイブリダイゼーション緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１２ｍＭ ＮａＣｌ中１％カゼイン）に溶解した溶液を注射器で流路に手作業で注入し、流 れを止めて１分間ハイブリダイゼーションを行った。次に、セレン抗ビオチン結 合体（実施例４）をチャネルに注入してＤＮＡ溶液に置換し、流れを止め、（上 述のように）結合体の存在下で導波 路照射によりハイブリダイゼーションを検出した。次いでＰＢＳを注入してチャ ネルを洗浄し、結合体溶液に置換した。最後に、チャネルに純水を注入すること により、ハイブリダイズしたＤＮＡ−セレン抗ビオチン結合体複合体を導波路の 表面から解離させた。水は、ＮａＣｌを希釈してイオン強度を低下させることに よりストリンジェンシー条件を増す。捕獲部位からのＤＮＡとセレンの解離はリ アルタイムで観察され、ビデオカメラ及びＶＣＲを使用して記録した。解離プロ セスの種々の時点でビデオ画像をフレームグラバーにより捕獲し、上述のように ディジタル化及び印刷し、結果を図１１に示す。流路内の過剰の気泡により、右 上の２×２アレーのみを示し、例えば４部位は番号２（ＣＡＴ０２、配列番号２ ）、３（ＣＡＴ０３、配列番号３）、５（ＣＡＴ０５、配列番号５）及び６（Ｃ ＡＴ０６、配列番号６）に対応する。図から明らかなように、解離プロセスは低 イオン強度媒体の初期導入から、実質的に全導波路信号がＤＮＡチップから最終 的に取り出されるまで追跡された。従って、導波路はオペレーターに再利用のた めにＤＮＡ導波路の再生プロセスをモニターさせることができた。特に、再生に 関するリアルタイム情報を使用して再生時間を制御し、診断用途 における処理時間を改善することができる。実施例９．ＤＮＡの多重抗体試験 共通のビオチンＳＢＭと、３個のオリゴヌクレオチド産物の各々に固有の異な る「捕獲」ＳＢＭを使用して、ビハプテン化(bi-haptenated)ＤＮＡ産物の多重 抗体試験を行った。このようなビハプテン化オリゴヌクレオチドはＷＯ９３／２ ０２２７号（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）として公開された１９９２年３月３１日 付け米国特許出願第０７／８６０，７０２号に開示されているように多重リガー ゼ鎖反応により得られる生成物を表す。抗フルオレセイン、抗アダマンタン及び 抗キノリンモノクローナル抗体を Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃２ガラス顕微鏡カバース リップに固定することにより導波路を作成した。抗アダマンタン抗体は１９９１ 年１２月１７日付け米国特許出願第８０８，５０８号及びＰＣＴ／ＵＳ９３／０ ５５３４号に開示されている。抗キノリン抗体は１９９２年３月２７日付け米国 特許出願第０７／８５８，８２０号及びＷＯ９３／２００９４号に開示されてい る。これらの全文献は参考資料として本明細書の一部とする。 抗体は水で１：１０に希釈し、約０．５μｌを導波路に加え、 図１２ａに示すように、右上頂点に抗フルオレセイン（スポット＃１）、左に抗 アダマンタン（スポット＃２）及び右下に抗キノリン（スポット＃３）を配置し た３個の空間的に分離したスポットを形成した。第２のガラススライドを導波路 に固定して（実施例１と同様に）チャネルを形成した。３’末端にビオチンを含 み、５’末端にフルオレセイン、アダマンタン又はキノリンのいずれかを含む合 成１本鎖ＤＮＡを１％カゼイン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１５ｍＭ ＮａＣｌの５０μｌに３μｌの割合で希釈した。最終ＤＮＡ濃度は約１００ｎＭ であった。ＤＮＡ配列を表９．１に示す。 得られた溶液を等容量の抗ビオチンセレン結合体（実施例４）と混合し、毛管 作用により導波路チャネルに導入した。図１２ ｂ〜１２ｄは単一標識化種を含むＤＮＡ溶液を使用した結果を示す。図１２ｂで は配列番号２１を使用し、図１２ｃでは配列番号１９を使用し、図１２ｄでは配 列番号２０を使用した。図１２ｅではキノリン−ビオチンＤＮＡとフルオレセイ ン−ビオチンＤＮＡの混合物を使用した結果、２個の適当な捕獲部位（スポット １及び３）に検出可能な信号が得られた。従って、導波路システムは混合物中の 複数の分析物を同時に検出することができた。 以上、実施例により本発明の数種の特定実施態様を説明したが、本発明はこれ らの特定実施例に制限されるものではない。発明の保護範囲は請求の範囲により 定義される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゴードン，ジユリアン アメリカ合衆国、イリノイ・60044、レイ ク・ブラフ、イースト・シエリダン・ロー ド・307 (72)発明者 ホイジヤー，ジヨアネル・ブイ アメリカ合衆国、イリノイ・60004、アー リントン・ハイツ、ウエスト・リリアン・ アベニユー・111

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．流体試料中の１種以上の特異的結合分析物の存在又は量の検出方法であって 、 （ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光 縁部と、（iii）エレメントの表面の複数の部位に固定された少なくとも１個の 同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含む反応表面（該反応表面の他の非部 位部分には特異的結合メンバーを固定しない）とを備える導波路デバイス（ここ で、前記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、少 なくとも１種の分析物と特異的に結合することが可能である）を準備する段階と 、 （ｂ）前記１種以上の分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の特異的 結合メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ（ここで、該第２ の同系結合対の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、サ ンドイッチアッセイの場合には前記１種以上の分析物と特異的に結合することが 可能であり、競合アッセイの場合には前記第１の同系結合対の固定化した第１の 特異的結合メンバーに結合すること が可能である）、試料中の分析物の量に比例して複数の部位に結合した光散乱ラ ベル複合体を形成する段階と、 （ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照 射し、全反応表面を同時に照射する段階と、 （ｄ）散乱光が存在する場合には前記表面の各部位及び非部位部分から実質的に 同時に散乱光を集光する段階と、 （ｅ）各部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度、もしくは（ii）別の部 位の光散乱度、又はその両者と比較し、各部位の光散乱を該部位の固定化特異的 結合メンバーに特異的な分析物の存在又は量と相関させる段階を含む前記方法。 ２．前記エレメントが種々の濃度の同一の固定化した第１の特異的結合メンバー を各々含む多重部位を含み、ある部位の光散乱度を別の部位の光散乱度と比較す ることを更に含む請求項１に記載の方法。 ３．チャネル内に反応表面が形成されるような二次元毛管チャネルを形成するよ うに前記第１のエレメントに結合された第２の透明エレメントを更に含む請求項 １に記載の方法。 ４．固定化した第１の特異的結合メンバーから分析物の解離を開始するように導 波路デバイスの反応表面の条件を変更する 追加の段階を段階（ｅ）の後に含み、上記変更条件下で段階（ｃ）、（ｄ）及び （ｅ）を繰り返す請求項１に記載の方法。 ５．流体試料中の少なくとも１種の特異的結合分析物の存在又は近似量を視覚的 に検出するための方法であって、 （ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光 縁部と、（iii）エレメントの表面の少なくとも１個の試験部位に固定された少 なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含む反応表面（該反応 表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定しない）とを備える導波路 デバイス（ここで、前記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合 対を介して、前記分析物と特異的に結合することが可能である）を準備する段階 と、 （ｂ）前記分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の第１の特異的結合 メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ（ここで、該第２の同 系結合対の第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、 サンドイッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であ り、競合アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合す ることが可能である）、試料中の分 析物の量に比例して部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成する段階と、 （ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照 射する段階と、 （ｄ）反応表面の光散乱を視覚的に検査し、試験部位の光散乱度を（ｉ）非部位 部分の光散乱度、もしくは（ii）別の部位の光散乱度、又はその両者と比較し、 上記部位の散乱を前記分析物の存在又は量と相関させる段階を含む前記方法。 ６．前記エレメントが複数の試験部位を含み、前記複数の試験部位が異なる濃度 の同一の固定化した第１の特異的結合メンバーを各々含むか、又は前記複数の試 験部位が別個の固定化した第１の特異的結合メンバーを各々含む請求項５に記載 の方法。 ７．チャネル内に反応表面が形成されるような二次元毛管チャネルを形成するよ うに前記第１のエレメントに結合された第２の透明エレメントを更に含む請求項 ５に記載の方法。 ８．固定化した第１の特異的結合メンバーから分析物の解離を開始するように導 波路デバイスの反応表面の条件を変更する追加の段階を段階（ｄ）の後に含み、 上記変更条件下で段階（ｃ）及び（ｄ）を繰り返す請求項５に記載の方法。 ９．流体試料中の少なくとも１種の特異的結合分析物の存在又は量を検出するた めの方法であって、 （ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光 縁部と、（iii）エレメントの表面の１部位に固定された少なくとも１個の同系 結合対の第１の特異的結合メンバーを含む反応表面（該反応表面の他の非部位部 分には特異的結合メンバーを固定しない）とを備える導波路デバイス（ここで、 前記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、前記分 析物と特異的に結合することが可能である）を準備する段階と、 （ｂ）前記分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の第１の特異的結合 メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ（ここで、該第２の同 系結合対の第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、 サンドイッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であ り、競合アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合す ることが可能である）、試料中の分析物の量に比例して前記部位に結合した光散 乱ラベル複合体を形成する段階と、 （ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照 射し、全反応表面を同時に照射する段階と、 （ｄ）散乱光が存在する場合には光検出装置を使用して第１の時刻ｔ₁で前記表 面の前記部位及び非部位部分から実質的に同時に散乱光を集光する段階と、 （ｅ）段階（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも１回繰り返し、散乱光が存在する場合 には第２の時刻ｔ₂で前記部位及び非部位部分から散乱光を集光する段階と、 （ｆ）時刻ｔ₁における前記部位の光散乱度を時刻ｔ₂における前記部位の光散乱 度と比較し、該部位の光散乱を特異的分析物の存在又は量と相関させ、光散乱の 経時的差により、前記部位に存在する分析物の量を表す動的情報を提供する段階 を含む前記方法。 １０．前記エレメントが複数の試験部位を含み、各部位が別の部位の固定化特異 的結合メンバーと同一又は異なる固定化特異的結合メンバーを含む請求項９に記 載の方法。 １１．チャネル内に反応表面が形成されるような二次元毛管チャネルを形成する ように前記第１のエレメントに結合された第２の透明エレメントを更に含む請求 項９に記載の方法。 １２．固定化した第１の特異的結合メンバーから分析物の解離を開始するように 導波路デバイスの反応表面の条件を変更する追加の段階を段階（ｆ）の後に含み 、上記変更条件下で段階（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）を繰り返す請求項９に記載の 方法。 １３．未知核酸のセグメントのヌクレオチド配列を決定するか、又は２種の密接 に関連するヌクレオチド配列を区別するための方法であって、 （ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもっ透明エレメントと、（ii）受光 縁部と、（iii）オリゴヌクレオチドを固定した複数の部位を含む反応表面（前 記部位は未知核酸とハイブリダイズするための種々の配列をもつオリゴヌクレオ チドのアレーを構成するようにし、前記エレメントの表面の他の非部位部分には オリゴヌクレオチドを固定しない）とを備える導波路デバイスを準備する段階と 、 （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で反応表面を前記未知核酸（前記未知核酸 は、所望により直接又は中間同系結合対を介して、光散乱ラベルで標識されてい る）と接触させ、未知核酸の配列に相補的な反応表面の部位に結合する光散乱ラ ベル複合体を形成する段階と、 （ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照 射し、全反応表面を同時に照射する段階と、 （ｄ）散乱光が存在する場合には前記表面の各部位及び非部位部分から実質的に 同時に散乱光を集光する段階と、 （ｅ）各部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度又は（ii）別の部位の光 散乱度と比較する段階とを含み、 （ｆ）更に、導波路デバイスの反応表面でストリンジェンシー条件を増分的に増 加し、該部位からの結合核酸の解離を開始させ、各増分毎に段階（ｄ）及び（ｅ ）を繰り返す段階を含み、それによって、解離特性の差により、オリゴヌクレオ チドと未知の核酸との間の１塩基対の差を完全な一致から区別できるようにする 前記方法。 １４．チャネル内に反応表面が形成されるような二次元毛管チャネルを形成する ように前記第１のエレメントに結合された第２の透明エレメントを更に含む請求 項１３に記載の方法。 １５．流体試料中の特異的結合分析物の存在又は量の検出方法であって、 （ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明ＴＩＲエレメントと、（ii ）受光縁部と、（iii）エレメントの表面の少 なくとも１個の部位に固定された少なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結 合メンバーを含む反応表面（該反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバ ーを固定しない）とを備える導波路デバイス（ここで、前記第１の特異的結合メ ンバーは、所望により中間同系結合対を介して、前記分析物と特異的に結合する ことが可能である）を準備する段階と、 （ｂ）（ｉ）前記分析物を含む疑いのある試料及び（ii）第２の同系結合対の第 １の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベル（ここで、該第２の同系結合対 の第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、サンドイ ッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であり、競合 アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合することが 可能である）と反応表面を接触させて、試料中の分析物の量に比例して前記部位 に結合した光散乱ラベル複合体を形成し、並びに（iii）少なくとも１５の有効 Ｏ．Ｄ．を与えるに十分な吸光メンバーの溶液と反応表面を接触させる段階と、 （ｃ）エレメントの内部で内部全反射を生じるのに有効な光をＴＩＲエレメント の受光縁部に照射する段階と、 （ｄ）散乱光を検出し、部位の光散乱度を非部位部分の光散乱度と比較し、吸光 材料に吸収させることによりバックグラウンド散乱を最小限にする段階を含む前 記方法。