ES2221930T3

ES2221930T3 - Procedimiento que utiliza un guia de ondas optico para detectar acontecimientos de union especifica por difusion de la luz.

Info

Publication number: ES2221930T3
Application number: ES95933864T
Authority: ES
Inventors: Donald I. Stimpson; Julian Gordon; Joanell V. Hoijer
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-20
Publication date: 2005-01-16
Anticipated expiration: 2015-09-20
Also published as: CA2197321A1; CA2197321C; US5599668A; EP0783683B1; ATE498123T1; DE69532855T2; DE69532855D1; JPH10506190A; AU3636295A; WO1996009532A1; ATE263967T1; EP1441217B1; ES2358508T3; DE69536137D1; EP1441217A3; US5843651A; JP3608665B2; EP0783683A1; EP1441217A2

Abstract

UN METODO DE ENSAYO DE LA UNION DE UNA GUIA DE ONDA LLEVA CONSIGO LA DETECCION DE LA DIFUSION DE LA LUZ DIRIGIDA EN LA GUIA DE ONDA. LA DIFUSION ES EL RESULTADO DE ETIQUETAS DE DIFUSION ESPECIFICAMENTE UNIDAS CON LA GUIA DE ONDA DENTRO DE LA PROFUNDIDAD DE PENETRACION DE UNA ONDA EVANESCENTE .LA GUIA DE ONDA PUEDE SER DE PLASTICO O VIDRIO TRANSPARENTE Y LA UNION SE HACE COMUNMENTE POR HIBRIDACION DE OLIGONUCLEOTIDOS O CAPTURA INMUNOLOGICA. LAS ETIQUETAS DE DIFUSION DE LA LUZ INCLUYEN METALES O NO METALES COLOIDALES, ENTRE LOS QUE SE INCLUYEN ORO, SELENIO Y LATEX. UN ELEMENTO DE ABSORCION DE LA LUZ CONSISTENTE EN UN TINTE O UNAS PARTICULAS CONCENTRADAS SE PUEDE UTILIZAR TAMBIEN PARA AUMENTAR LA SEÑAL. LA UNION A TIEMPO REAL Y LA DISOCIACION PUEDEN SER CONTROLADAS VISUALMENTE O POR UN DISPOSITIVO DE FORMACION DE IMAGENES DE VIDEO, COMO POR EJEMPLO, UNA CAMARA CCD Y UN PROGRAMA INFORMATICO DE AGARRE DEL ARMAZON. LOS DESEMPAREJAMIENTOS EN LA HIBRIDACION DE TAN SOLO UNA BASE PUEDEN SER DISTINGUIDOS POR CURVAS DE FUSION A TIEMPO REAL.

Description

Procedimiento que utiliza un guía de ondas óptico para detectar acontecimientos de unión especifica por difusión de la luz.

Campo de la invención

La invención se refiere a varios campos, especialmente a interacciones asociadas de unión específica, guías de ondas evanescentes y dispersión de luz. Más en concreto, la invención se refiere a un proceso de detectar uno o varios analitos de unión específica, especialmente ADN u oligonucleótidos, mediante técnicas de dispersión de luz, produciéndose la dispersión por un marcador particulado mantenido por fuerzas de unión específica dentro de la profundidad de penetración de la onda evanescente de una guía de ondas.

Antecedentes de la invención

La reflexión interna total ("RIT") es conocida en la técnica y se describe con referencia a la figura 1. La RIT opera según el principio de que la luz 10 que avanza en un medio más denso 12 (es decir, que tiene el índice de refracción más alto, N_{1}) y que choca con la interfaz 14 entre el medio más denso y un medio más raro 16 (es decir, que tiene el índice de refracción más bajo, N_{2}) es reflejada totalmente dentro del medio más denso 12 si choca con la interfaz en un ángulo, \theta_{R}, mayor que el ángulo crítico, \theta_{C}, donde el ángulo crítico se define por la ecuación:

\theta_{C} = arcosen \ (N_{2}/N_{1})

En estas condiciones, se genera una forma de onda electromagnética denominada una "onda evanescente". Como se representa en la figura 1B, el campo eléctrico asociado con la luz en el medio más denso forma una onda sinusoidal estacionaria 18 normal a la interfaz. La onda evanescente penetra en el medio más raro 16, pero su energía E se disipa exponencialmente en función de la distancia Z desde la interfaz, como se representa en 20. Un parámetro denominado "profundidad de penetración" (d_{p}- representada en la figura 1A en 22) se define como la distancia desde la interfaz a la que la energía de onda evanescente ha caído a 0,368 veces el valor de energía en la interfaz. [Véase, Sutherland y colaboradores, J. Immunol. Meth., 74:253-265 (1984) que define d_{p} como la profundidad donde E = (e^{-1})\cdotE_{0}. La profundidad de penetración se calcula como sigue:

d_{p} = \frac{\lambda/N_{1}}{2\pi\{sen^{2}\theta_{R}-(N_{2}/N_{1})^{2}\}^{1/2}}

Los factores que tienden a incrementar la profundidad de penetración son: ángulo de incidencia creciente, \theta_{R}; índices de refracción de emparejamiento estrecho de los dos medios (es decir, N_{2}/N_{1} \rightarrow 1); y longitud de onda creciente, \lambda. Por ejemplo, si se coloca un elemento RIT de cuarzo (N_{1} = 1,46) en un medio acuoso (N_{2} = 1,34), el ángulo crítico, \theta_{C}, es 66º (= arcosen 0,9178). Si impacta luz a 500 nm en la interfaz a \theta_{R} = 70º (es decir, mayor que el ángulo crítico), la d_{p} es aproximadamente 270 nm.

Dentro de la profundidad de penetración, la onda evanescente en el medio más raro (típicamente, una solución de reacción) puede excitar fluorescencia en la muestra. Este fenómeno se ha usado en la técnica con respecto a inmunoensayos por Harrick y colaboradores, Anal. Chem., 45:687 (1973). Dispositivos y métodos que utilizan fluorescencia RIT para inmunoensayos se han descrito en la técnica por Hirschfield, Patentes de Estados Unidos 4.447.564, 4.577.109 y 4.654.532; Hirschfield y Block, Patentes de Estados Unidos números 4.716.121 y 4.582.809, y número de serie de Estados Unidos 07/863.553 publicada como WO 93/20240 (Abbott Labs), que se incorporan aquí por referencia. Se adhiere un agente inmunoespecífico a la superficie del elemento y deja reaccionar con compañeros de unión específica marcados con fluorescencia en el medio más raro. La unión específica da lugar a que los marcadores fluorescentes se unan dentro de la profundidad de penetración. La fluorescencia emitida (a la longitud de onda desplazada) vuelve al elemento RIT, se propaga dentro del elemento RIT a lo largo del mismo recorrido que la onda sinusoidal estacionaria (pero a una longitud de onda diferente) y se detecta en la salida del elemento.

También se ha usado RIT en unión con la detección de dispersión de luz en una técnica denominada Reflectancia Interna Total Dispersada ("RITD"). Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 4.979.821 y 5.017.009 de Schutt y otros y WO 94/00763 (Akzo N. V.). Según esta técnica, se explora un haz de luz a través de la superficie de un elemento RIT en un ángulo adecuado y la energía luminosa es reflejada totalmente a excepción de la onda evanescente. Las partículas, tal como glóbulos rojos, oro coloidal o látex, específicamente unidas dentro de la profundidad de penetración dispersarán la luz y la luz dispersada es detectada por unos medios de fotodetección. WO 94/00763 también describe explorar el haz de luz a través de varios lugares de elementos de unión específica que son (1) el mismo elemento de unión a concentración variable para lograr un rango dinámico más amplio, o (2) elementos de unión diferentes para comprobar diferentes analitos en un formato múltiplex. Explorar el haz de luz a través de lugares múltiples y recoger luz dispersada en cada uno es un proceso muy lento.

En la Patente de Estados Unidos 4.608.344 de Carter y otros se emplea una guía de ondas óptica como el elemento RIT. En una variación, se disponen múltiples lugares de unión en la guía de ondas en líneas o rejillas específicas para crear una red de figuras de difracción de la luz dispersada. Observando después solamente órdenes específicos de luz dispersada, esta técnica minimiza la dispersión producida por imperfecciones superficiales y/o impurezas tal como partículas de polvo, (véase la figura 14 y las columnas 17-19).

El uso práctico de los dispositivos de Carter y RITD está gravemente limitado por la seria dispersión de fondo de las partículas en solución. Este fondo limita la sensibilidad de la detección de las partículas unidas asociadas con el analito. El pobre rendimiento se compensaba con electrónica y óptica sofisticadas que podían discriminar la cantidad pequeña de señal sobre los altos niveles de fondo. La complejidad electrónica y óptica da lugar a sistemas muy caros.

Finalmente, la Patente de Estados Unidos 5.192.502 de Attridge y otros describe un dispositivo incluyendo placas paralelas que definen una cavidad para recibir un fluido de muestra. Una placa sirve como una guía de ondas y la otra está recubierta con una capa de un material fotoabsorbente.

Otros antecedentes de interés de la invención incluyen la descripción de Drmanac y otros, Patente de Estados Unidos 5.202.231, que describe una nueva técnica para la generación de información de secuencia de ácido nucleico denominada secuenciación por hibridación (SBH). Según esta técnica, una fase sólido conteniendo unida a ella una serie de oligonucleótidos de secuencia conocida se puede hibridizar con ADN marcado de una muestra. Así, un solo experimento de hibridación permite examinar gran número de lugares diferentes en una molécula de ADN. El diagnóstico de varias patologías genéticas humanas, tal como la distrofia muscular de Duchenne o la fibrosis quística, requerirán igualmente el poder de resolución de un sistema tipo SBH para determinar la mutación asociada con el estado de enfermedad con exactitud y a un costo razonable. Una implementación particular del método SBH usa gran número de oligonucleótidos inmovilizados en una matriz bidimensional de alta densidad. Tal dispositivo se ha denominado un "chip de ADN" análogo a los circuitos de alta densidad producidos por la industria electrónica. Se aplica una muestra de ADN no conocido al chip, y la configuración de hibridación se determina y analiza para obtener información de secuencia. WO 92/10588 y WO 92/10092 (Affymax Technologies N.V.) contienen descripciones similares, así como un método fotolitográfico para fabricar tales chips.

Puesto que las condiciones rigurosas afectan a la hibridación, se puede obtener diferenciación y especificidad finas si la rigurosidad puede ser controlada con exactitud. Así, las curvas de fusión podrían proporcionar una dimensión adicional al sistema de chips de ADN y permitir una mejor diferenciación de secuencias estrechamente relacionadas, un problema en la implementación de la tecnología SBH. La capacidad de cambiar la temperatura y supervisar, en tiempo real, las configuraciones de hibridación de chip sería de gran utilidad, en particular donde hay una amplia variación en el contenido de GC. Livshits y colaboradores, J. Biomol. Struct. & Dynamics, 11:783-795 (1994) describen una técnica de secuenciación de ADN donde la discriminación de hibridaciones perfectas e imperfectas era posible en un sistema de ADN inmovilizado con gel usando marcadores radioactivos o fluorescentes. El gel se sometió a lavados durante un minuto cada 5ºC para quitar el marcador asociado con ADN hibridizado de forma imperfecta. Los autores afirman que el gel es ventajoso debido a una mayor capacidad de inmovilización y mayor potencia de discriminación que otras superficies. Sin embargo, la necesidad de lavar el marcador excedente de la superficie, así como el tiempo relativamente largo para explorar toda la superficie para obtener una medición, imponen limitaciones significativas. Por ejemplo, si se requiere un minuto para leer una matriz completa de chips de ADN y se necesita un lavado durante un minuto a cada temperatura incremental, una curva de fusión de alta resolución (por ejemplo cada 1ºC) de 30 a 70ºC requeriría una hora. La temperatura tendría que mantenerse constante durante un minuto a cada temperatura incremental hasta que se midan todos los puntos en el
chip.

También es interesante la descripción de la solicitud número de serie de Estados Unidos 08/140.383, en condominio, en tramitación, presentada el 21 de octubre de 1993 y titulada aparato y método para detectar un ligando Diana, incorporada aquí por referencia. Esta solicitud describe el uso de una cámara de dispositivo de acoplamiento de carga "CCD" y software de manejo de imágenes para formar imágenes y detectar ligandos diana de unión específica dispuestos en múltiples lugares espacialmente separados en una sola fase sólido.

Resumen de la invención

En la secuenciación completa del genoma humano, el Proyecto del Genoma Humano afronta el reto de incrementar en dos órdenes de magnitud la velocidad de adquisición de datos de la secuencia de ADN. La presente solicitud describe, como una realización preferida, un método de detección que utiliza una guía de ondas óptica bidimensional que permite la medición la unión en tiempo real o fusión de un marcador de dispersión de luz en múltiples lugares de captura en un soporte incluyendo una matriz de ADN. Esto permite la recogida de datos de hibridación tan rápidamente como los permite una grabación vídeo. Los métodos se basan en la dispersión de la onda evanescente, por lo que solamente el marcador confinado dentro de la profundidad de penetración genera señal. La formación de imágenes de la luz dispersada permite la interrogación de toda la matriz simultáneamente. La especificidad de hibridación es equivalente a la obtenida con un sistema convencional y autorradiografía. Las curvas de fusión son consistentes con las curvas de fusión de fase líquido para las combinaciones de la misma secuencia, y las diferencias de tan sólo un único par de bases son fácilmente distinguibles. La limitación de la dilución estableció la detección de dianas a concentraciones de sólo aproximadamente 0,4 nM, que es comparable a los mejores sistemas actuales a base de fluorescencia. Se hace notar que esta metodología proporcionará una herramienta potente para la detección rápida y rentable de variaciones de la secuencia.

Así, en un aspecto, la presente invención es un método para detectar la presencia o cantidad de uno o varios analitos de unión específica en una muestra de fluido, incluyendo el método:

(a) proporcionar un dispositivo de guía de ondas, incluyendo el dispositivo de guía de ondas (i) un elemento transparente que tiene un índice de refracción mayor que el de la muestra de fluido; (ii) un borde receptor de luz; y (iii) una superficie reactiva incluyendo un primer elemento de unión específica de al menos un par de unión análoga inmovilizado en una pluralidad de lugares en la superficie del elemento, no teniendo otras porciones no lugar de la superficie reactiva ningún elemento de unión específica inmovilizado encima; donde dicho primer elemento de unión específica, mediante pares de unión análoga intermedios, si se desea, es capaz de unir específicamente al menos un
analito;

(b) poner la superficie reactiva en contacto con una muestra sospechosa de contener dicho uno o varios analitos y con un marcador de dispersión de luz unido a un elemento de unión específica de un segundo par de unión análoga que, mediante pares de unión análoga intermedios, si se desea, es capaz de unir específicamente dicho uno o varios analitos, en el caso de un ensayo intercalado, o el primer elemento de unión específica inmovilizado de dicho primer par de unión análoga, en el caso de un ensayo competitivo; formando por ello complejos marcadores de dispersión de luz unidos a la pluralidad de lugares en proporción a la cantidad de analito en la muestra;

(c) iluminar el borde receptor de luz de la guía de ondas con luz efectiva para crear reflexión interna total dentro de la guía de ondas, iluminando por lo tanto simultáneamente toda la superficie reactiva;

(d) recoger de forma sustancialmente simultánea luz dispersada, si la hay, de cada lugar y de porciones no lugar de dicha superficie;

(e) comparar el grado de dispersión de luz en cada lugar con (i) el grado de dispersión de luz en una porción no lugar, o (ii) el grado de dispersión de luz en otro lugar, o ambos, por lo que la dispersión de luz en cada lugar se correlaciona con la presencia o cantidad del analito para el que es específico el elemento de unión específica inmovilizado en dicho lugar.

Según el método anterior, hay lugares múltiples en una sola guía de ondas; la guía de ondas se ilumina de una vez y la dispersión de todos los lugares es recogida al instante, por fotodetectores o visualmente.

En un aspecto separado, la invención es un método para detectar visualmente la presencia o cantidad aproximada de al menos un analito de unión específica en una muestra de fluido, incluyendo el método:

(a) proporcionar un dispositivo de guía de ondas, incluyendo el dispositivo de guía de ondas (i) un elemento transparente que tiene un índice de refracción mayor que el de la muestra de fluido; (ii) un borde receptor de luz; y (iii) una superficie reactiva incluyendo un primer elemento de unión específica de al menos un par de unión análoga inmovilizado en al menos un lugar de prueba en la superficie del elemento, no teniendo otras porciones no lugar de la superficie reactiva ningún elemento de unión específica inmovilizado encima; donde dicho primer elemento de unión específica, mediante pares de unión análoga intermedios, si se desea, es capaz de unir específicamente dicho analito;

(b) poner la superficie reactiva en contacto con la muestra sospechosa de contener dicho analito y con un marcador de dispersión de luz unido a un primer elemento de unión específica de un segundo par de unión análoga que, mediante pares de unión análoga intermedios si se desea, es capaz de unir específicamente dicho analito, en el caso de un ensayo intercalado, o el primer elemento de unión específica inmovilizado, en el caso de un ensayo competitivo; formando por ello complejos marcadores de dispersión de luz unidos al lugar en proporción a la cantidad del analito en la
muestra;

(c) iluminar el borde receptor de luz de la guía de ondas con luz efectiva para crear reflexión interna total dentro de la guía de ondas;

(d) examinar visualmente la superficie reactiva para dispersión de luz y comparar el grado de dispersión de luz en el lugar de prueba con (i) el grado de dispersión de luz en una porción no lugar, o (ii) el grado de dispersión de luz en otro lugar, o ambos, por lo que la dispersión en el lugar se correlaciona con la presencia o cantidad de dicho analito.

Este método no se limita a lugares múltiples, sino que requiere detección visual.

Otro aspecto, también sin limitación a lugares múltiples, es una determinación de dispersión usando una técnica de lectura rápida. Así, en este aspecto la invención incluye:

(a) proporcionar un dispositivo de guía de ondas, incluyendo el dispositivo de guía de ondas (i) un elemento transparente que tiene un índice de refracción mayor que el de la muestra de fluido; (ii) un borde receptor de luz; y (iii) una superficie reactiva incluyendo un primer elemento de unión específica de al menos un par de unión análoga inmovilizado en un lugar en la superficie del elemento, no teniendo otras porciones no lugar de la superficie reactiva ningún elemento de unión específica inmovilizado encima; donde dicho primer elemento de unión específica, mediante pares de unión análoga intermedios si se desea, es capaz de unir específicamente dicho analito;

(b) poner la superficie reactiva en contacto con la muestra sospechosa de contener dicho analito y con un marcador de dispersión de luz unido a un primer elemento de unión específica de un segundo par de unión análoga que, mediante pares de unión análoga intermedios si se desea, es capaz de unir específicamente dicho analito, en el caso de un ensayo intercalado, o el primer elemento de unión específica inmovilizado, en el caso de un ensayo competitivo; formando por ello complejos marcadores de dispersión de luz unidos a dicho lugar en proporción a la cantidad de analito en la muestra;

(d) recoger de forma sustancialmente simultánea luz dispersada, si la hay, de dicho lugar y de porciones no lugar de dicha superficie en un primer tiempo, t_{1}, usando un dispositivo fotodetector;

(e) repetir los pasos (c) y (d) al menos una vez para recoger luz dispersada, si la hay, de dichas porciones lugar y no lugar en un segundo tiempo, t_{2}; y

(f) comparar el grado de dispersión de luz en dicho lugar en el tiempo t_{1} con el grado de dispersión de luz en dicho lugar en el tiempo t_{2}, por lo que la dispersión de luz en el lugar se correlaciona con la presencia o cantidad del analito específico, y la diferencia con el tiempo en la dispersión de luz proporciona información cinética indicativa de la cantidad de analito presente en dicho lugar.

Este aspecto se puede aplicar a lugares únicos o múltiples, pero es improbable que la detección visual sea posible puesto que pueden aparecer variaciones sutiles de la señal con el tiempo. Se puede hacer lecturas temporizadas de forma continua o discreta. En lectura continua, las velocidades iniciales se pueden determinar a partir de la pendiente inicial del transcurso de tiempo.

Una aplicación especialmente útil de la invención es en estudios de fusión de oligonucleótidos en tiempo real. Por consiguiente, en otro aspecto la invención se refiere a un método para determinar la secuencia de nucleótidos de segmento de ácido nucleico desconocido o para distinguir dos secuencias de nucleótidos estrechamente relacionadas, incluyendo el método:

(a) proporcionar un dispositivo de guía de ondas, incluyendo el dispositivo de guía de ondas (i) un elemento transparente que tiene un índice de refracción mayor que el de la muestra de fluido; (ii) un borde receptor de luz; y (iii) una superficie reactiva incluyendo una pluralidad de lugares que tienen oligonucleótido inmovilizado encima, definiendo dichos lugares una serie de oligonucleótidos que tienen secuencias diferentes para hibridación con el ácido nucleico desconocido, no teniendo otras porciones no lugar de la superficie de dicho elemento oligonucleótidos inmovilizados encima;

(b) poner la superficie reactiva bajo condiciones de hibridación en contacto con dicho ácido nucleico desconocido donde dicho ácido nucleico desconocido, directamente o mediante pares de unión análoga intermedios si se desea, está marcado con un marcador de dispersión de luz; formando por ello complejos marcadores de dispersión de luz unidos a los lugares de la superficie reactiva que son complementarios a la secuencia del ácido nucleico desconocido;

(e) comparar el grado de dispersión de luz en cada lugar con (i) el grado de dispersión de luz en una porción no lugar; o (ii) el grado de dispersión de luz en otro lugar; y

(f) incluyendo además incrementalmente aumentar las condiciones rigurosas a la superficie reactiva del dispositivo de guía de ondas para iniciar disociación de ácido nucleico unido de los lugares y repetir los pasos (d) y (e) en cada incremento;

por lo que las diferencias únicas de par de base entre los oligonucleótidos y el ácido nucleico no conocido se pueden distinguir de los emparejamientos perfectos por las diferencias de las propiedades de disociación.

Finalmente, en un aspecto no restringido a guías de ondas bidimensionales o incluso a iluminación simultánea, la invención también se refiere a un método mejorado para dispersión de luz que da fondos reducidos. Así, la invención también es un método para detectar la presencia o cantidad de un analito de unión específica en una muestra de fluido, incluyendo el método:

(a) proporcionar un dispositivo RIT, incluyendo el dispositivo (i) un elemento RIT transparente que tiene un índice de refracción mayor que el de la muestra de fluido; (ii) un borde receptor de luz; y (iii) una superficie reactiva incluyendo un primer elemento de unión específica de al menos un par de unión análoga inmovilizado en al menos un lugar en la superficie del elemento, no teniendo otras porciones no lugar de la superficie reactiva ningún elemento de unión específica inmovilizado encima; donde dicho primer elemento de unión específica, mediante pares de unión análoga intermedios si se desea, es capaz de unir específicamente dicho analito;

(b) poner la superficie reactiva en contacto con (i) la muestra sospechosa de contener dicho analito; (ii) un marcador de dispersión de luz unido a un primer elemento de unión específica de un segundo par de unión análoga que, mediante pares de unión análoga intermedios si se desea, es capaz de unir específicamente dicho analito, en el caso de un ensayo intercalado, o el primer elemento de unión específica inmovilizado, en el caso de un ensayo competitivo, formando por ello complejos marcadores de dispersión de luz unidos a dicho lugar en proporción a la cantidad de analito en la muestra; y (iii) una solución de un elemento absorbedor de luz suficiente para impartir una DO efectiva de al menos 15;

(c) iluminar el borde receptor de luz del elemento RIT con luz efectiva para crear reflexión interna total dentro del elemento;

(d) detectar la luz dispersada y comparar el grado de dispersión de luz en el lugar con el grado de dispersión de luz en una porción no lugar, por lo que la dispersión de fondo se minimiza por la absorbancia por el material fotoabsorbente.

En todos los aspectos anteriores, el analito de unión específica puede ser un oligonucleótido o ácido nucleico. También puede ser un antígeno o anticuerpo en la mayoría de los aspectos. Aunque todos los aspectos tienen preferiblemente lugares múltiples, algunos aspectos no lo requieren. El número de "múltiples" o una "pluralidad" de lugares puede ser de sólo dos o hasta varios miles.

En cada uno de los aspectos anteriores, el elemento de guía de ondas puede incluir una superficie plana, tal como una placa de vidrio. En cada aspecto, es posible proporcionar una segunda placa que está fijada al elemento para formar un canal capilar entremedio. La superficie de reacción deberá mirar al canal de manera que el canal se pueda usar como un recipiente de reacción para que fluyan reactivos sobre la superficie reactiva. Además, se prefiere en cada aspecto recubrir la superficie con una proteína metasoluble tal como caseína. Este recubrimiento sirve para bloquear lugares de unión no específica y para facilitar el flujo de líquidos sobre la superficie.

El marcador de dispersión de luz (LSL) en todos los casos pueden ser partículas coloidales, tal como oro o selenio coloidal o diminutas partículas de látex. También es posible en todas las realizaciones utilizar un elemento absorbente líquido (LAM) en la solución en la superficie de reacción. Esto tiene la ventaja de reducir la dispersión de fondo muy cerca de su fuente. El LAM incrementa la DO de la solución a al menos 15 y proporciona un fondo oscuro contra el que la dispersión en los lugares aparece como una zona brillante.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra los principios de la reflectancia interna total ("RIT") como es conocido en la técnica, y se describe con más detalle en la sección de los antecedentes. A la izquierda, la figura 1 muestra la reflexión de luz en una interfaz y, a la derecha, un gráfico de la energía de campo eléctrico E en función de la distancia Z de la interfaz.

Las figuras 2A, 2B y 2C son, respectivamente, vistas en perspectiva, lateral y en sección transversal de un dispositivo según una realización de la invención. La figura 2C es una vista en sección transversal ampliada tomada a lo largo de la línea C-C de la figura 2B.

La figura 3 es una representación diagramática de una realización de la invención donde un oligonucleótido se inmoviliza en la superficie de la guía de ondas y, dentro de la profundidad de penetración de la onda evanescente, captura un oligonucleótido complementario que lleva un radical biotina al que se une una partícula de dispersión de luz de selenio coloidal.

Las figuras 4-7, 8A, y 9-12 son representaciones impresas de las imágenes vídeo reales tomadas de las guías de ondas como se describe con más detalle en los ejemplos. Las imágenes vídeo se alimentaron a una tarjeta de captura de imágenes de 8 bits que digitalizó la información. El archivo digitalizado se importó a una aplicación gráfica desde la que se imprimió en una impresora de alta resolución.

Las figuras 8B y 8C son curvas de fusión o de disociación de ADN. A cada temperatura se representan los datos de intensidad media generados en el ejemplo 5 para dicha temperatura.

Descripción detallada de la invención

Los varios aspectos de la presente invención se describirán ahora con más detalle.

Elementos RIT y dispositivos de guía de ondas

Los principios físicos de la reflexión interna total ("RIT") y las ondas evanescentes se exponen en la sección de los antecedentes. En el sentido en que se usa aquí, "elemento RIT" se refiere a cualquier material transparente que proporcione una interfaz capaz de reflexión interna total. El elemento puede ser, por ejemplo, una cubeta, una varilla o una placa. La onda evanescente de un elemento RIT puede existir solamente en el punto o puntos de reflexión interna total. En contraposición, una "guía de ondas" se refiere a un elemento RIT bidimensional de tal manera que la luz es reflejada totalmente internamente en múltiples puntos, creando por ello una onda evanescente que es sustancialmente uniforme a través de toda o casi toda la superficie. Una guía de ondas bidimensional puede ser de configuración plana o curvilínea. Por razones de sencillez, se describe una guía de ondas plana como la realización preferida.

En una realización preferida de la presente invención el elemento RIT es una guía de ondas bidimensional. Las figuras 2A-2C ilustran una realización preferida, donde un dispositivo de guía de ondas 30 incluye un elemento de guía de ondas plana 32 y una placa plana paralela 34. El elemento de guía de ondas tiene así superficies paralelas 36 y 38 así como un borde receptor de luz 40. Igualmente, la placa 34 tiene superficies paralelas 42 y 44. El elemento de guía de ondas 32 y la placa 34 se mantienen juntos de forma paralela espaciada, de tal manera que las superficies 38 del elemento y la superficie 42 de la placa definan un canal estrecho 46. El elemento y placa se pueden mantener juntos por cualesquiera medios convenientes, incluyendo medios adhesivos 48 que constan de cinta adhesiva doble dispuesta a lo largo de los bordes del elemento y la placa. El canal 46 es preferiblemente bastante pequeño para permitir la transferencia capilar de una muestra de fluido a su través. Por ejemplo, la altura deberá ser de menos de aproximadamente 1 mm, preferiblemente menos de aproximadamente 0,1 mm.

El elemento 32 deberá hacerse de un material ópticamente transparente tal como vidrio, cuarzo, plástico, tal como policarbonato, acrílico o poliestireno. El índice de refracción de la guía de ondas debe ser mayor que el índice de refracción del fluido de muestra, como es conocido en la materia, para efectuar reflectancia interna total. Para una solución acuosa de muestra, el índice de refracción, n, es aproximadamente 1,33, de modo que la guía de ondas tiene típicamente un índice de refracción superior a 1,35, generalmente de aproximadamente 1,5 o más. La guía de ondas puede ser una pieza de plástico o vidrio, por ejemplo, se puede usar un portaobjetos o cubreobjetos de microscopio de vidrio estándar.

La placa 34 se puede construir de materiales similares. Como se ve en las figuras 2A y 2B, el extremo receptor de luz 40 del elemento de guía de ondas 32 está dispuesto en una hendidura estrecha 50 de una máscara 52 para minimizar los efectos de la luz parásita que se origina en la fuente de luz 54. La minimización de luz parásita también es mejor utilizando materiales absorbentes de luz como se explica a continuación.

La fuente de luz 54 para generar el haz de luz incidente puede ser casi cualquier fuente de energía electromagnética, incluyendo energía en los espectros visible, ultravioleta e IR cercano. El término "luz" se interpreta así de forma bastante amplia y no se limita a la banda visible, excepto en las realizaciones que son detectadas visualmente. Las longitudes de onda no visibles son detectadas por detectores optimizados para la longitud de onda particular, como es conocido en la materia. La luz puede ser monocroma o polícroma, colimada o no colimada, polarizada o no polarizada. Las fuentes de luz preferidas incluyen láseres, diodos fotoemisores, lámparas flash, lámparas de arco, lámparas incandescentes y lámparas de descarga fluorescentes. La fuente de luz usada para iluminar el elemento de guía de ondas puede ser un láser de helio-neón de vatiaje bajo. Para una luz portátil desechable tal como la descrita en el ejemplo 1 siguiente, la fuente de luz puede ser una bombilla pequeña de luz incandescente alimentada por una batería, tal como la utilizada en una lámpara de bolsillo. Preferiblemente, la fuente de luz incluye medios de potenciómetro para variar la intensidad de la fuente de luz. Alternativamente, se puede emplear filtros y/o lentes para regular la intensidad a un nivel adecuado.

Los medios de detección para determinar el grado de dispersión de luz se describen con detalle a continuación, pero incluyen brevemente medios tanto instrumentales como visuales. Una característica importante de la invención es que los eventos de dispersión de luz a través de toda la guía de ondas se pueden verificar de forma esencialmente simultánea, ya sea mediante la vista y el cerebro de un observador o por dispositivos de fotodetección, incluyendo cámaras CCD que forman imágenes que se digitalizan y procesan utilizando ordenadores. En cada caso solamente se utiliza una sola superficie reactiva multifuncional que es iluminada simultáneamente por la onda evanescente.

Superficies reactivas

Según la invención, se forma una superficie reactiva que consta de al menos un lugar en un lado del elemento de guía de ondas. Aunque algunas realizaciones pueden tener solamente un único lugar de prueba, la invención utiliza mejor una pluralidad de tales lugares, y aquí se describirá dispositivos de lugares múltiples. Los múltiples lugares de prueba pueden contener los mismos o diferentes lugares de unión específica. Un "lugar" (plural = "lugares" aquí) se define como el área delimitada en la que se inmoviliza un elemento de unión específica para un analito, entendiéndose que también existirán porciones no lugar de la superficie fuera del área delimitada. El elemento de unión específica inmovilizado se denomina aquí un "elemento de captura" o "SBM de captura". Preferiblemente, el lugar es una mancha pequeña o punto y las porciones no lugar rodean el lugar. Naturalmente, otros muchos tamaños y configuraciones de lugar son posibles y caen dentro de la invención. Un lugar también puede estar configurado como una línea o barra; como una letra o número; como un círculo, rectángulo o triángulo; o como cualquier otro gráfico tal como, por ejemplo, cualquier gráfico empleado típicamente en colecciones de iconos o gráficos de ordenador.

El área (tamaño) de un lugar tiene que ser suficientemente grande solamente para inmovilizar suficiente elemento de unión específica para permitir la captura del analito marcado y la partícula de dispersión de luz. Esto depende en parte de la densidad del lugar, como se explica a continuación. Por ejemplo, se han usado con éxito zonas de lugar de tan sólo 150 \mum de diámetro (véase el ejemplo 7 y la figura 10). Tales zonas pequeñas se prefieren cuando se coloquen muchos lugares en una superficie reactiva, produciendo un "lugar de alta densidad ". El límite inferior práctico del tamaño es aproximadamente 1 \mum de diámetro. Para detección visual, se desean zonas suficientemente grandes a detectar sin ampliación; por ejemplo, al menos de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mm^{2}; de hasta 1 cm^{2} o incluso más grandes. No hay límite superior de tamaño a excepción de lo que dicten los costos de fabricación y la conveniencia del usuario; es adecuado cualquier tamaño o forma de lugar deseado.

Múltiples dispositivos de lugar pueden contener los mismos o diferentes SBMs en cada lugar. Si son los mismos, la pluralidad de lugares puede tener concentraciones similares y por lo tanto ofrecer información replicada o pueden tener concentraciones variables del SBM, ofreciendo por lo tanto semicuantificación o calibración contra un estándar. Si los SBMs son diferentes, el dispositivo se puede utilizar para detecciones múltiplex de varios analitos simultáneamente. En un caso especial de diferentes SBMs, uno o varios lugares pueden servir como un control positivo. Naturalmente, son posibles combinaciones de todo lo anterior (por ejemplo, determinaciones semicuantitativas multiplexadas) en dispositivos con muchos lugares.

Para dispositivos de lugares múltiples, los lugares se pueden disponer en cualquier configuración o serie conveniente. La espaciación entre lugares dependerá de la resolución del sistema de detección, descrito más adelante, y el proceso de fabricación usado para crear el lugar. Con sujeción a la capacidad de fabricación, cuanto más alta sea la resolución de detección, más próximos pueden estar los lugares. Deberá haber suficiente separación de los SBMs de captura inmovilizados para que la reacción de cada uno de estos elementos individualmente con el elemento de unión correspondiente en una muestra de fluido y/o un elemento marcado con dispersión de luz pueda ser diferenciado de una reacción en otro lugar sin interferencia sustancial debido a elementos de par de unión inmovilizados próximos y sus partículas de dispersión de luz asociadas. Preferiblemente, una porción no lugar separa claramente todo y cada lugar. Una matriz muy simple es una rejilla cartesiana, pero los lugares múltiples se pueden configurar como líneas, configuraciones así como otros gráficos. En superficies de reacción de lugares múltiples uno o varios lugares representarán frecuentemente un control positivo, un control negativo, una serie de estándares de calibración o una combinación de cualquiera de estos.

Una configuración de lugar preferida es la forma de una cruz, que da lugar a un símbolo "más" en caso de un resultado positivo. En una variación de esto, solamente la porción vertical o porciones de la cruz son lugar de unión de analito, aunque el aspecto horizontal del signo más contiene un aglutinante específico para marcador que es independiente de la presencia de analito. Tal configuración se describe en la Patente de Estados Unidos 5.008.080, "Dispositivo analítico de fase sólido y método de utilizarlo", de Brown y otros. Las configuraciones de esta variación operan como una verificación del ensayo produciendo un símbolo menos "-" si el analito está presente como si no, y producen un símbolo más "+" cuando está presente analito. Además de la configuración de verificación "más/menos", también son posibles otras formas de esta variación, como se describe en la patente citada.

En el dispositivo de dos planos de las figuras 2A-2C, la superficie reactiva 60 se forma preferiblemente en la superficie 38 del elemento de guía de ondas 34 que mira al canal 48. Véase la figura 2C. Esto facilita el contacto de la muestra y/o el reactivo marcador de dispersión de luz con el lugar de la superficie reactiva permitiendo el flujo capilar a través de la superficie reactiva. El flujo se puede mejorar utilizando un material absorbente o bíbulo tal como papel en un extremo del canal. Naturalmente, el dispositivo de dos planos es solamente una realización. También se puede utilizar un solo elemento bidimensional de guía de ondas, revistiéndose la superficie de reacción en un lado. Sin embargo, puede ser necesario que esté orientado con la superficie de reacción en una dirección mirando hacia arriba para facilitar el contacto con la muestra y reactivo marcador de dispersión de luz. La dispersión de luz en la onda evanescente puede ser observada posteriormente desde el lado inferior, usando un espejo, si se desea.

Elementos de unión específica e inmovilización en la superficie reactiva

En el proceso de la invención, primero se inmovilizan uno o varios elementos de captura sobre la superficie de una guía de ondas óptica para formar una superficie reactiva. Un elemento de unión específica ("SBM") es cualquier elemento de un par de unión análoga. Un "par de unión análoga" es cualquier combinación ligando-receptor que se unirán específicamente uno a otro, en general mediante interacciones no covalentes tal como atracciones iónicas, enlace de hidrógeno, fuerzas Van der Waals, interacciones hidrófobas y análogos. Las interacciones y pares análogos ejemplares son conocidos en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación: interacciones inmunológicas entre un anticuerpo o fragmento Fab y su antígeno, hapteno o epitopo; interacciones bioquímicas entre una proteína (por ejemplo, hormona o enzima) y su receptor (por ejemplo, avidina o estreptavidina y biotina), o entre un hidrato de carbono y una lectina; interacciones químicas, tal como entre un metal y un agente quelante; y apareamiento de bases de ácido nucleico entre hebras de ácido nucleico complementarias. Un elemento de unión específica recientemente referido es el análogo de ácido nucleico peptídico, o "PNA", descrito en WO 92/20702 y WO 92/20703, ambas de Buchardt, y otros, y en Flam, Science, 262: 1647, (1993), que forma un par de unión análoga con ácidos nucleicos u otros PNAs. El ácido nucleico se entenderá de manera que incluya ácido 2'-deoxirribonucleico (ADN) así como ácido ribonucleico (RNA) cuando lo permita la estabilidad.

La preparación de SBMs de anticuerpo es una técnica antigua y bien conocida y no es necesario describirla con detalle. Brevemente, un animal es inmunizado o retado con el hapteno deseado según un programa de inmunización. Frecuentemente, el hapteno está acoplado a una molécula portadora tal como BSA para mejorar el reconocimiento. Después de un período de tiempo adecuado, se toma sangre del animal y se extraen anticuerpos. Alternativamente, el anticuerpo se puede obtener a partir de líquido ascítico. Si se desea, se puede preparar anticuerpos monoclonales altamente específicos usando las técnicas ahora convencionales de Kohler y Milstein, Nature, 256, 495 (1975). Los anticuerpos tienen numerosos grupos amino, carboxilo y sulfhidrilo que podrían utilizarse para reacciones de acoplamiento.

La síntesis de SBMs de oligonucleótido también es una rutina buena, utilizando sintetizadores automatizados tal como el ABI 480. Estos instrumentos preparan oligonucleótidos a partir virtualmente de cualquier secuencia deseada en longitudes de hasta aproximadamente 75-100 bases. Se puede preparar polinucleótidos más largos, si se desea, por técnicas de clonación conocidas o por síntesis de segmentos más cortos y su montaje. Si se desea, los oligonucleótidos se pueden modificar con aminas terminales u otros grupos reactivos para acoplamiento. Una recensión algo trasnochada, pero todavía útil, de las químicas de acoplamiento se halla en Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1(3): 165-187 (1990).

Los SBMs se pueden unir covalentemente a la guía de ondas mediante medios de acoplamiento químicos conocidos en la técnica. La superficie reactiva se puede derivar directamente con varios grupos químicamente reactivos que después, en determinadas condiciones, forman enlaces covalentes estables con el SBM aplicado. Alternativamente, la superficie reactiva se puede recubrir primero con polímeros derivados químicamente, tal como dextrano o PEG, que después forman enlaces covalentes con los SBMs aplicados. También se puede recubrir algunos tipos de detergentes en la superficie reactiva, y posteriormente derivar, in situ, y reaccionar con SBMs. Por ejemplo, las guías de ondas de vidrio y cuarzo contienen grupos que se pueden activar a grupos hidroxilo y siloxi reactivos, que se pueden acoplar a elementos de unión específica mediante enlazadores. Tales enlazadores incluyen, por ejemplo, enlazadores homo- y hetero-bifuncionales conocidos.

Naturalmente, es preferible enlazar SBMs a la superficie reactiva de tal manera que las propiedades de unión específica del elemento de unión no se pierdan. Por ejemplo, los anticuerpos pueden estar acoplados mediante su porción Fc como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.191.066 (Bieniarz y otros); y los oligonucleótidos pueden estar acoplados mediante aminas terminales u otros grupos funcionales. Los brazos enlazadores descritos en la Patente de Estados Unidos 4.948.882 de Ruth se pueden colocar en posiciones "estéricamente tolerantes" de radicales base para facilitar el acoplamiento a fases sólido sin pérdida de capacidades de hibridación. En otro método, la superficie reactiva se puede recubrir con estreptavidina mediante adsorción física, reaccionando posteriormente con un elemento de pares de unión marcado con biotina para crear una superficie biológicamente reactiva, bien caracterizada.

Más recientemente, WO 92/10092 (Affymax Technologies, N. V.; Fodor y otros) describieron un método de síntesis de oligonucleótidos directamente sobre un soporte sólido usando técnicas de fotolitografía.

Para sorpresa de los solicitantes, el SBM de captura no tiene que estar unido covalentemente en la superficie reactiva. Los SBMs pueden ser adsorbidos o complejados en la superficie usando capas de recubrimiento proteínico. Fue una cierta sorpresa la observación de que las varias fuerzas no covalentes que mantienen en posición el SBM de captura (por ejemplo, ADN) y SBM marcador (por ejemplo, anticuerpo) son menos inestables que las fuerzas de hibridación de ADN. Sin embargo, esto se debe en parte a la elección fortuita de las condiciones, a saber, fuerza iónica que permite temperaturas relativamente bajas de fusión de ADN (véanse los ejemplos). Es posible incrementar la temperatura de fusión (incrementando la fuerza iónica) en un punto donde el duplex ADN ya no es el enlace débil en la cadena.

La densidad (cantidad por unidad de área) del SBM de captura en la superficie reactiva se correlaciona positivamente con la sensibilidad del sistema. Usando SBMs de oligonucleótido, se puede lograr aproximadamente 5000 moléculas de ADN por \mum cuadrado mediante los métodos de moteado descritos en la presente memoria. Otros métodos de construcción de chips, por ejemplo, las técnicas fotolitográficas mencionadas anteriormente, pueden producir otras densidades. La densidad máxima teórica estimada para SBMs de ácido nucleico es aproximadamente 250.000 moléculas por \mum cuadrado. Es improbable, sin embargo, que se pueda alcanzar chips de esta densidad o que proporcionen rendimiento óptimo en vista de las restricciones estéricas impuestas. La densidad óptima para mejor sensibilidad implica un compromiso entre maximizar el número de lugares de unión por unidad de área, y maximizar el acceso a tales lugares teniendo presentes los requisitos de la cinética de difusión y consideraciones estéricas.

La aplicación del SBM de captura sobre la superficie reactiva se puede llevar a cabo por cualesquiera medios convenientes. Por ejemplo, se puede recurrir convenientemente al uso manual de micropipetas o tubos microcapilares para manchar el elemento de captura sobre la superficie reactiva. Se prefiere, sin embargo, automatizar este proceso por razones de conveniencia, reproducibilidad y ahorro de costos. La aplicación mecanizada es especialmente deseable cuando el ensayo se utiliza en análisis a gran escala, tal como aplicaciones de examen rutinario. Los métodos de aplicación automáticos incluyen, por ejemplo, bombas de desplazamiento positivo, tablas de posición X-Y, y/o sistemas de pulverización o impresión por chorro de tinta y análogos.

Cuando sea apropiado, los SBMs se pueden poner primero en una solución para facilitar el proceso de depositar las muestras sobre la superficie reactiva. Las soluciones adecuadas para ello tienen solamente el requisito general de que, al secado, el SBM retiene sustancialmente su especificidad (es decir, sus propiedades de unión específica), y no interfiere considerablemente con las propiedades refractivas del elemento. El volumen de solución a depositar depende de la concentración de SBM en la solución. Idealmente, las soluciones se preparan en un rango de concentración de aproximadamente 0,5 a 500 \muM, de manera que una gota pequeña (de aproximadamente 2 \mul) contenga la cantidad deseada de SBM. Típicamente, se prefieren las aplicaciones repetidas de SBMs a concentraciones más bajas de modo que no se desperdicie SBM. Esto se repite hasta que esté presente suficiente SBM, teniendo cuidado de no extender la aplicación a lugares próximos. Si se desea, se puede incluir un agente entrecruzante para incrementar la cantidad de SBM en el lugar de captura, a condición de que el agente entrecruzante no interfiera con las propiedades de unión específica.

Después de haber depositado el SBM en uno o varios lugares de la superficie reactiva, el elemento se puede secar y por lo tanto inmovilizarse en la superficie reactiva. La evaporación es el método de secado preferido, y se puede realizar a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC). Cuando se desee, la evaporación se puede realizar a temperatura elevada, a condición de que la temperatura no inhiba considerablemente la capacidad de que los elementos de captura interactúen específicamente con sus elementos de par de unión correspondientes. Por ejemplo, donde el SBM de captura inmovilizado es una proteína, se deberá emplear temperaturas no desnaturalizantes.

Además de la inmovilización del SBM de captura en la superficie reactiva, la superficie reactiva se trata preferiblemente para bloquear interacciones no específicas entre la superficie reactiva y elementos de unión de analito en una muestra de fluido que se ha de verificar. En el caso de un SBM proteínico (por ejemplo, antígeno, anticuerpo o PNA) en la superficie reactiva, el material bloqueante se deberá aplicar después de la inmovilización del SBM. Materiales bloqueantes proteínicos adecuados son caseína, ceína y albúmina sérica bovina (BSA). Otros bloqueadores pueden ser detergentes y polímeros de cadena larga solubles en agua. El material bloqueante se puede aplicar convenientemente a la superficie reactiva como una solución acuosa o acuosa tamponada. La solución bloqueante se puede aplicar a la superficie reactiva en cualquier momento después de inmovilizar los primeros SBMs de captura. En el caso de un SBM de ácido nucleico, el material bloqueante se puede aplicar antes o después de la inmovilización del SBM. Los bloqueadores adecuados incluyen los descritos anteriormente así como 0,5% dodecilsulfato sódico (SDS) y 1X a 5X solución de Denhardt (1X Denhardt es (0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirrolidona y 0,2 mg/ml BSA).

Se ha hallado que la caseína es un material bloqueante preferido para ADN y SBMs de anticuerpo y se puede adquirir de Sigma Chemical, St Louis, MO, (nº de catálogo C-3400). La caseína pertenece a un clase de proteínas denominada proteínas "meta-solubles" (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.120.643 de Ching y otros, incorporada aquí por referencia) que requieren tratamiento químico para hacerlas más solubles. Tales tratamientos incluyen tratamiento ácido o alcalino y se considera que realizan clivaje y/o hidrólisis parcial de la proteína intacta. Otras proteínas metasolubles incluyen ceína (nº de catálogo de Sigma Z-3625 y una proteína de clara de huevo no albúmina (nº de catálogo de Sigma A-5253). La caseína es una proteína de la leche que tiene un peso molecular de aproximadamente 23.600 (beta-caseína bovina), pero en el sentido en que se usa aquí, "caseína" o caseína "de tratamiento alcalino" se refieren a una mezcla parcialmente hidrolizada que resulta del tratamiento alcalino como se describe en el ejemplo 1 de la Patente de Estados Unidos 5.120.643. Un gel de electroforesis (20% poliacrilamida TBE) de la caseína así tratada muestra una mezcla de fragmentos que tienen predominantemente un peso molecular inferior a 15.000, como muestra una banda difusa por debajo de este marcador.

Es posible que los bloqueadores, en particular la caseína, impartan una naturaleza hidrófoba a la superficie que facilita la acción "lámina" descrita en los ejemplos. Se produce "lámina" cuando el agua aplicada a la superficie puede ser quitada del elemento en una gota cohesionada en vez de múltiples gotitas pequeñas. Sin embargo, se estima que la uniformidad del recubrimiento es más importante que su hidrofobicidad. Los elementos que se convierten en dispositivos de canal como en el ejemplo 1 exhiben preferiblemente tal acción lámina. Se considera que esto facilita el flujo y la difusión dentro del canal.

Se deberá entender que el primer elemento de unión específica puede ser específico para el analito mediante la intermediación de pares análogos adicionales, si se desea. Por ejemplo, un SBM de oligonucleótido podría ser biotinilado y unido a la superficie reactiva mediante un par de unión análoga biotina-avidina. Tal unión la describe Hansen en EP 0 139 489 (Ortho). Igualmente, se podría unir un oligonucleótido a la superficie reactiva mediante una sonda mediadora como describe Stabinsky en la Patente de Estados Unidos 4.751.177 (Amgen). Al utilizar pares de unión análogos intermediarios, hay que tener presente que la distancia total de la interfaz (en la superficie reactiva) al marcador de dispersión de luz no deberá exceder mucho de la profundidad de penetración. A este respecto, se ha estimado que el diámetro de un anticuerpo de inmunoglobulina es aproximadamente 5 nm y que la longitud de ADN 20-mer (en forma de \beta-hélice) es aproximadamente 6,8 nm. Esto deja espacio para múltiples pares análogos en una profundidad de penetración típica de 200-300 nm (véase los antecedentes). También se deberá entender que las interacciones de unión análogas deben resistir las condiciones de reacción siguientes que, para algunas aplicaciones, pueden incluir temperaturas elevadas. Los oligonucleótidos más largos o los que tienen un contenido de GC más alto son más estables y se prefieren en este caso.

Marcadores de dispersión de luz

Otro componente importante de la presente invención es el marcador o partícula de dispersión de luz ("LSL"). Un LSL es una molécula o un material, frecuentemente una partícula, que hace que la luz incidente se disperse elásticamente, es decir, sustancialmente sin absorber la energía luminosa. Los LSLs ejemplares incluyen marcadores de metal coloidal y no metal tal como oro o selenio coloidal; glóbulos rojos; y partículas plásticas coloreadas hechas de látex, poliestireno, polimetilacrilato, policarbonato o materiales similares. El tamaño de tales marcadores particulados es del orden de 10 nm a 10 \mum, típicamente de 50 a 500 nm, y preferiblemente de 70 a 200 nm. Cuanto más grande es la partícula, mayor es el efecto de dispersión de luz, pero esto es verdad tanto de partículas unidas como en solución volumétrica, de modo que el fondo también aumente con el tamaño de partícula. Se puede adquirir LSLs de partícula adecuados de Bangs Laboratories, Inc., Carmel, IN, Estados Unidos de América.

En la presente invención, el LSL se une al primer elemento de unión específica de un segundo par de unión análoga. El segundo elemento del par de unión específica se puede denominar un "marcador SBM" y el complejo de LSL y SBM marcador se denomina "conjugado marcador" o sólo "conjugado". La naturaleza y especificidad del SBM marcador depende del formato del ensayo. Para un formato de ensayo competitivo, el SBM marcador es un análogo del analito y se une específicamente con el SBM de captura en competición con el analito. Para un formato de ensayo intercalado directo, el SBM marcador es específico para un segundo epitopo en el analito. Esto permite que el analito esté "intercalado" entre el SBM de captura y el SBM marcador. En un formato de ensayo intercalado indirecto, el SBM marcador es específico para un lugar o grupo informador que está asociado con el analito. Por ejemplo, una vez capturado un analito antigénico, se puede usar un anticuerpo biotinilado para "intercalar" el analito, y se utiliza SBM marcador específico de biotina. Este formato intercalado indirecto también es útil para ácidos nucleicos. En este caso el SBM de captura es un oligonucleótido complementario de la diana y la diana contiene una molécula informadora de unión específica (por ejemplo, biotina o un hapteno, incorporado típicamente mediante un procedimiento de amplificación tal como LCR o PCR) y el SBM marcador se elige de manera que sea específico para el grupo informador.

Naturalmente, el SBM marcador puede ser específico para su compañero respectivo (analito o primer SBM, dependiendo del formato) mediante pares análogos intermediarios, como era el caso del SBM de captura. Por ejemplo, si el analito es un oligonucleótido tal como un producto de amplificación que soporta un grupo hapteno informador, un formato de ensayo intercalado podría incluir un LSL conjugado a un anticuerpo de antihapteno. Así, el SBM marcador es específico para el analito mediante el par de unión análoga hapteno-antihapteno. Un ejemplo de un par análogo intermediario de ácido nucleico lo describen Schneider y otros, US 4.882.269 (Princeton University). Se deberán tener presentes las mismas consideraciones de distancia de la interfaz y estabilidad de los pares análogos para SBMs marcadores así como SBMs de captura.

Independientemente del formato de ensayo, el SBM marcador debe unirse al marcador de dispersión de luz para formar el conjugado. Como con SBMs de captura, el SBM marcador puede estar unido covalentemente al LSL, pero esto no es esencial. También es adecuada la adsorción física del SBM marcador sobre LSLs particulados. En tal caso, la unión solamente tiene que ser suficientemente fuerte para resistir las condiciones de reacción siguientes sin pérdida sustancial de LSL, por ejemplo de los pasos de lavado u otro flujo de fluido.

Hay en la literatura gran número de estrategias de unión covalente adecuadas para acoplar el LSL y el SBM marcador. Por ejemplo, se puede introducir un grupo amino en un SBM marcador mediante sustancias químicas de síntesis estándar (tal como la que se puede adquirir de Genosys Biotechnologies, Inc. The Woodlands, TX, ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA. Las sustancias químicas para activar un LSL para acoplamiento covalente a un SBM amina modificado incluyen, aunque sin limitación, bromuro de cianógeno, N-hidroxisuccinimida o carbodiimida. AFFINITY CHROMATOGRAPHY de W. H. Scouten, 1981, John Wiley & Sons, y SOLID PHASE BIOCHEMISTRY, ANALYTICAL AND SYNTHETIC ASPECTS de W.H. Scouten, 1983, John Wiley & Sons) describen tales técnicas de activación. En algunos casos, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida y carbodiimida, el LSL debe contener grupos carboxilo superficiales; para activación por bromuro de cianógeno el LSL debe contener grupos hidroxilo superficiales. También se podría emplear enlazadores hetero- y homo-bifuncionales conocidos en tales conjugaciones covalentes. Se puede obtener partículas LSL con los grupos químicos y diámetro apropiados para uso como LSL de varias fuentes comerciales (por ejemplo, Bangs Laboratories, Inc., Carmel, IN, Estados Unidos de América). El acoplamiento covalente de LSL al SBM marcador puede proporcionar ventajas en sistemas donde se requieren condiciones rigurosas para mejorar la especificidad de unión porque tales condiciones pueden interferir con la adsorción no covalente de SBM marcador a un LSL.

Materiales de absorción de luz

En un aspecto preferido de la invención, se añade un material fotoabsorbente ("LAM") a la mezcla de muestra y conjugado marcador. El LAM está diseñado para evitar que la luz parásita interfiera en la reacción de dispersión de luz. La luz parásita surge primariamente de imperfecciones microscópicas en la interfaz reflectante y de la dispersión de la onda evanescente por partículas que migran, pero no están unidas, a la profundidad de penetración. El LAM, cuando está dispersado en la solución volumétrica, absorbe y minimiza el efecto de dicha luz parásita mejor que cuando tal material se reviste sobre una superficie para formar una capa opaca (como en la técnica anterior). El LAM deberá aportar una densidad óptica efectiva final ("DO") de al menos 15; preferiblemente más de 100; muy preferiblemente 300 o más. Una DO "efectiva" tiene en cuenta la longitud de onda de la luz incidente y es la DO a la longitud de onda de la luz monocromática y la DO a la longitud de onda más prevalente de la luz polícroma.

Los LAMs adecuados incluyen el conjugado propiamente dicho así como numerosos colorantes fotoabsorbentes. Colorantes fotoabsorbentes son cualesquiera compuestos que absorben energía del espectro electromagnético, idealmente una(s) longitud(es) de onda que corresponde(n) a la(s) longitud(es) de onda de la fuente de luz. Como es conocido en la materia, los colorantes, en general, constan de estructuras heterocíclicas conjugadas, de las que son un ejemplo las clases siguientes de colorantes: colorantes azo, colorantes diazo, colorantes de triazina, colorantes para alimentos o tintes biológicos. Los colorantes específicos incluyen: Coomasie Brilliant Blue R-250 Dye (Biorad Labs, Richmond, CA); Reactive Red 2 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), azul de bromofenol (Sigma); xileno cianol (Sigma); y fenolftaleína (Sigma). Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators de Floyd J. Green, publicado por Aldrich Chemical Company, Inc., (Milwaukee, WI) proporciona gran cantidad de datos relativos a otros colorantes. Con estos datos, se puede seleccionar colorantes con las propiedades apropiadas de absorción de luz de manera que coincidan con las longitudes de onda emitidas por la fuente de luz.

Preferiblemente, estos LAMs no interfieren con la absorción de SBM marcador sobre el LSL, o con la especificidad del SBM marcador inmovilizado. Por ejemplo, si el SBM marcador es un péptido, polipéptido o proteína, el LAM no desnaturaliza preferiblemente el péptido, polipéptido o proteína. Igualmente, si el SBM marcador es una secuencia de nucleótidos, el LAM no desnaturaliza preferiblemente la secuencia de nucleótidos. Una vez seleccionados en base a las propiedades de absorción de luz, los colorantes se pueden evaluar empíricamente para garantizar que el colorante no interfiera con los eventos de unión específica requeridos para implementación del ensayo de guía de ondas.

Inesperadamente, el conjugado propiamente dicho también puede servir como un LAM. Se ha hallado que el uso de concentraciones de conjugado marcador más altas que las necesarias, por ejemplo, concentraciones que proporcionan una DO efectiva de al menos 15, preferiblemente más de 300, muy preferiblemente más de 500, también mejoran la detección. Los métodos de concentrar un conjugado incluyen purificación por afinidad o centrifugación como se describe en los ejemplos 2 y 3. Aunque se puede usar colorantes en unión con conjugado concentrado, se ha hallado que las altas concentraciones de conjugados solos son generalmente suficientes. Este fenómeno de añadir más marcador para mejorar los niveles de señal a ruido es virtualmente desconocido en ensayos de diagnóstico y es muy contrario a las ideas actuales.

Aunque los LAMs son una característica opcional de la invención, su uso da lugar a la capacidad de utilizar concentraciones más altas de conjugado marcador, intensidades de luz más altas y partículas marcadoras más grandes, todo lo cual mejora en gran medida el rendimiento sobre los sistemas que no contienen un material fotoabsorbente. El efecto mejorado de usar un LAM se debe presumiblemente a la eliminación de luz parásita en un punto mucho más próximo a su fuente que cualquier método conocido de la técnica anterior. Los recubrimientos en la superficie de la guía de ondas enfrente de la superficie de reacción solamente pueden absorber la luz parásita que llega a esta superficie. La luz parásita en la solución todavía puede producir libremente dispersión indeseada.

Métodos de uso

Los métodos de ensayo según la invención emplean elementos RIT o guías de ondas como se ha descrito anteriormente e incluyen formatos de ensayo competitivo e intercalado directo e indirecto. Un formato intercalado indirecto se ilustra en la figura 3.

En primer lugar, se prepara, como se ha explicado anteriormente, un elemento RIT o guía de ondas 62, que tiene al menos un SBM de captura inmovilizado en uno o varios lugares en la superficie reactiva en la interfaz 64. El SBM de captura es específico para el analito. En la figura 3, el SBM es un oligonucleótido de captura, representado en 66, tiene la secuencia 5'-AGTGGAGGTCAACGA (ID DE SEC. Nº 3) y está inmovilizado en la interfaz 64. Preferiblemente, hay múltiples SBMs inmovilizados en distintos lugares que están separados espacialmente por porciones no lugar.

En un formato intercalado, la muestra de fluido se pone posteriormente en la que verificar la presencia o cantidad de analito en contacto con el SBM de captura en la superficie reactiva. El único requisito general de este paso de proceso es que la muestra esté en contacto directo con el SBMs inmovilizados espacialmente separados para efectuar la unión entre el analito y el SBM de captura. También se prefiere una mezcla suave de la muestra de fluido después de ponerla en contacto con la superficie reactiva en el proceso de la presente invención, pero no se requiere. Dicha mezcla puede contribuir a garantizar el contacto estrecho entre la muestra de fluido y el SBM inmovilizado. En lugar de mezcla, un flujo capilar de fluido de muestra a través de la superficie reactiva también promueve el buen contacto y la unión de analito al SBM de captura.

Posteriormente, también se pone un conjugado marcador en contacto con la superficie reactiva bajo condiciones de unión. El conjugado marcador se une al analito (o a un grupo informador unido al analito) para formar un complejo de unión específica de dispersión de luz en o cerca de la superficie reactiva. En el formato intercalado la muestra y el conjugado se puede mezclar opcionalmente antes de poner la superficie reactiva en contacto con cualquier componente, o se puede usar el proceso de dos pasos descrito. Si se desea, los métodos se pueden llevar a la práctica usando un LAM, que se añadiría al conjugado o a la mezcla de muestra-conjugado.

Con referencia a la figura 3, el conjugado marcador consta de la partícula de selenio coloidal de dispersión de luz 68 en la que se inmovilizan anticuerpos antibiotina 70. El analito es el oligonucleótido mostrado en 72 5'-TCGTTGACCTCCACT (ID DE SEC. Nº 12) que se ha marcado con un grupo informador de biotina ("Bi") 74. La complementariedad de los oligonucleótidos y la especificidad del anticuerpo para biotina mantienen el LSL dentro de la profundidad de penetración 76 de la guía de ondas.

Se conocen numerosos métodos para incorporar tal grupo informador al ácido nucleico de muestra. Por ejemplo, la muestra podría ser amplificada usando una técnica tal como PCR o LCR, donde las imprimaciones pueden soportar el informador. Alternativamente, los informadores pueden estar acoplados a trifosfatos de nucleótido individuales que después se incorporan en productos de extensión hechos a partir de la muestra. Este método de incorporación funcionará con PCR y también con la variación de LCR denominada Gap LCR.

El elemento se ilumina después de manera que efectúe reflexión interna total. Ya se han descrito las fuentes de luz y los principios físicos de RIT. En la figura 3, la dispersión de la onda evanescente se ilustra en 78. Se usa preferiblemente una hendidura para reducir la luz parásita. En los lugares donde se han formado complejos de unión específica de dispersión de luz, la dispersión de luz se observa como zonas más claras contra el fondo más oscuro de las porciones no lugar (véase, por ejemplo, las figuras 4-8A y 9-12). Cuanto más brillante aparece el lugar, más LSL se une y más analito está presente en dicho lugar. El método se puede usar para cuantificar o semicuantificar leyendo los tonos grises en un ordenador y, usando calibradores, estimando la cantidad de analito presente en cada lugar.

En un formato competitivo, el dispositivo RIT y la superficie reactiva son como antes. Sin embargo, el LSL es un análogo de analito que compite con el analito de muestra para el SBM de captura. Así, el brillo del punto está relacionado inversamente con la cantidad de analito. En este formato, la muestra y el conjugado se deben mezclar antes de contactar cualquiera de ellos con la superficie reactiva. Un LAM es útil para formatos competitivos, como en los formatos intercalados.

Se deberá señalar que no se observa que el fenómeno denominado de varias formas "borde delantero" o "ensombrecimiento" sea un problema en la presente invención. Este fenómeno se observa en dispositivos de flujo cromatográfico donde la unión de marcador en lugares situados hacia abajo es inferior a la unión en lugares situados hacia arriba. Este fenómeno se evita principalmente porque los factores que controlan la unión de LSL son predominantemente difusión, no cromatografía, aunque algunas realizaciones utilizan un canal de flujo.

Aunque es posible usar el dispositivo de la invención dirigiendo secuencialmente un haz de luz a lugares individuales y creando pequeños lugares de generación de ondas evanescentes como en la técnica anterior, se prefiere claramente iluminar enseguida toda la guía de ondas, creando por ello energía de onda evanescente a través de toda la superficie reactiva. Esta iluminación simultánea de toda la superficie reactiva es lo que permite el examen y la comparación simultáneos de todos los lugares, y por lo tanto permite una detección mucho más rápida de lo que antes era posible. Una ventaja principal de los sistemas de la invención es que permiten observar la unión y/o la cinética de disociación en tiempo real y permiten el desarrollo de una señal visible en cuestión de segundos, por ejemplo de 1 a 20 segundos, en la realización preferida. Toda la superficie de la guía de ondas reactiva se puede ver (y/o detectar) de una vez y toda se ilumina simultáneamente, de modo que la acumulación de LSL en un lugar se puede observar en tiempo real puesto que no hay necesidad de explorar cada lugar para iluminación con luz incidente o para la detección de la luz dispersada.

Esta conclusión es algo sorprendente en vista de las ideas anteriores con respecto a RIT. Típicamente, los detectores de elementos RIT están situados en la salida del elemento para recoger la luz cuando sale del elemento. Siempre se ha supuesto que la luz que sale del elemento fue alterada por el evento de unión. En efecto, las detecciones que usan luz salida no serían posibles sin tal modificación de la luz por los eventos de unión. Así, se espera que la luz cambie de alguna forma por el evento de unión. En vista de esto, no se podría garantizar que la luz se comporte de la misma forma al encontrar un segundo lugar de unión y las ideas desalientan así múltiples elementos de lugar simultáneamente iluminados por una fuente de luz común. La presente invención halla inesperadamente que en la luz reflejada internamente en un lugar situado hacia abajo (con referencia a la fuente de luz) no interfieren eventos de unión en un lugar situado hacia arriba.

Además, el grado o la cantidad de unión se puede verificar en tiempo real cuando se cambian varias condiciones. Por ejemplo, donde los SBMs son oligonucleótidos que pueden formar apareamiento de hebras y la condición cambiante es la rigurosidad, la disociación de las hebras de ácido nucleico (que da lugar a liberación del LSL a la solución volumétrica donde no puede dispersar energía de ondas evanescentes) se puede observar realmente como una pérdida del punto brillante en el lugar. Como es conocido en la materia, la rigurosidad de hibridación se puede controlar variando parámetros como la temperatura y la fuerza iónica. Aumentar la temperatura aumenta la rigurosidad y desestabiliza el duplex. Se puede usar bloques de calentamiento convencionales para esta técnica y el dispositivo biplaca preferido antes descrito puede descansar simplemente en el bloque de calentamiento. Se puede obtener temperaturas de fusión de oligonucleótidos (Tm) que exhiben buena correspondencia con las temperaturas de fusión de fase solución. También se incrementa la rigurosidad disminuyendo la concentración efectiva de cationes, tal como por dilución con agua. Así, la guía de ondas y los métodos de la presente invención proporcionan un mecanismo para supervisión en tiempo real de las temperaturas de fusión de oligonucleótidos. Controlando la rigurosidad de esta manera, se puede distinguir una hebra perfectamente complementaria de otra que contenga incluso una discordancia de una sola base. Tal sistema encontrará gran utilidad en secuenciación de genes y en diagnóstico.

Los cambios de condición que afectan a las interacciones anticuerpo-hapteno se pueden evaluar de forma similar, sustituyendo el anticuerpo y los haptenos por los pares de oligonucleótidos. Por ejemplo, aumentar la temperatura desnaturalizará los agentes de unión de proteína (por ejemplo, anticuerpos), dando lugar así a pérdida de capacidad de unión. Esta desnaturalización de proteína se puede verificar en tiempo real usando la invención. Se deberá recordar que los pares de unión análogos utilizados para mantener el SBM en la superficie de la guía de ondas, o al unir el LSL al SBM marcador, deberán resistir preferiblemente tales condiciones alteradas de manera que la unión del analito al SBM de captura sea el evento de disociación supervisado.

Se deberá observar que una ventaja adicional de la presente invención es que los reactivos y la muestra, por ejemplo, la solución de conjugado-muestra, no se tiene que lavar del lugar de captura para permitir la detección. Con marcadores fluorescentes y radioactivos, el marcador no unido se debe quitar de la superficie para evitar una señal indeseada. Sin embargo, los LSLs no unidos en la presente invención se difunden en general lejos de la profundidad de penetración y dejan de dar señales incluso sin extracción física. La eliminación de la necesidad de lavar componentes no unidos de la superficie contribuye considerablemente a la velocidad con la que se puede realizar un ensayo.

En una inversión única de las determinaciones de temperatura de fusión, el dispositivo y el método de la invención se pueden utilizar como un termómetro calibrado para supervisar las temperaturas precisas de una guía de ondas, o como un control de calidad de fabricación para supervisar la uniformidad de la transferencia de calor. Como un termómetro, se pone una serie de pares de oligonucleótidos de temperaturas de fusión incrementales conocidas en una serie de lugares en la superficie reactiva. A medida que se incrementa la temperatura, el par con la temperatura de fusión más baja se disociará primero, seguido de los pares siguientes en orden de sus temperaturas de fusión. La temperatura de la superficie reactiva se puede determinar conociendo las temperaturas de fusión de estos oligonucleótidos calibradores. Se obtiene un efecto "parecido a escalera" si los pares de oligonucleótidos se depositan en una matriz lineal en orden de sus temperaturas de fusión conocidas.

Además, la uniformidad de la transferencia de calor se puede evaluar en un entorno de control de calidad si toda la guía de ondas se cubre con oligonucleótidos de idénticas temperaturas de fusión. La disociación se deberá producir al instante en todos los lugares si el calentamiento es uniforme. Tal chip se puede usar para determinar si el bloque de calentamiento exhibe variaciones que conducen a "puntos calientes" o "puntos fríos".

Detección de luz dispersada

Como se ha indicado anteriormente, la luz dispersada se puede detectar visualmente o por medios fotoeléctricos. Para detección visual, el ojo y el cerebro de un observador realizan los pasos de tratamiento de imágenes que dan lugar a la determinación de dispersión o no en un lugar particular. Se observa dispersión cuando el lugar aparece más brillante que el fondo circundante (véase, por ejemplo, las figuras asociadas con los ejemplos). Si el número de lugares es pequeño, tal vez una docena o menos, los pasos de tratamiento se pueden efectuar de forma esencialmente simultánea. Si el número de lugares es grande (unos pocos cientos o más), se desean sistemas fotoeléctricos de detección.

Los sistemas fotoeléctricos de detección incluyen cualquier sistema que utilice una señal eléctrica que se modula por la intensidad luminosa en el lugar. Por ejemplo, fotodiodos, dispositivos de acoplamiento de carga, fototransistores, fotorresistencias y fotomultiplicadores son dispositivos fotoeléctricos de detección adecuados. Preferiblemente, los detectores están dispuestos en una red correspondiente a la matriz de lugares en la superficie reactiva, correspondiendo algunos detectores a porciones no lugar. Sin embargo, más preferidas son las representaciones digitales de la superficie reactiva tal como las realizadas por una cámara de dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) en combinación con la captura de imágenes y el software de tratamiento de imágenes disponibles.

Algunos ejemplos del uso de cámaras CCD, tarjetas de captura de imágenes, ordenadores y software de tratamiento de imágenes se hallan en la solicitud de Estados Unidos, en tramitación, en condominio, número de serie 08/140.838, presentada el 21 de octubre de 1993, que se incorpora aquí por referencia. Brevemente, la cámara CCD o cámara de vídeo forma una imagen de toda la superficie reactiva, incluyendo todas las porciones lugar y no lugar, y alimenta esta imagen a una tarjeta de captura de imágenes de un ordenador. La tarjeta de captura de imágenes convierte la imagen en información digital asignando un valor numérico a cada pixel. El sistema digital puede ser binario (por ejemplo, brillante = 1 y oscuro = 0), pero se prefiere una escala de grises de 8 bits, donde se asigna un valor numérico a cada pixel de tal manera que un cero (0) represente una imagen negra, y doscientos cincuenta y cinco (255) represente una imagen blanca, representando los valores intermedios varios tonos de grises en cada pixel.

La información digital se puede visualizar en un monitor, o almacenar en RAM o cualquier dispositivo de almacenamiento para manipulación adicional. Se puede mencionar dos tipos de manipulación. Primero: el archivo de datos digitalizados se puede convertir e importar a una aplicación gráfica de software. Esto permitirá imprimir la imagen a efectos de archivo, como se hizo con las imágenes vídeo generadas en los ejemplos para producir las figuras 4-7, 8A y 9-12. Una aplicación gráfica adecuada es Publishers PaintBrush software (ZSoft Corp., Atlanta, Georgia); aunque otros muchos paquetes de software aceptarán o convertirán los archivos importados a una amplia variedad de formatos de archivo, incluyendo "sin tratar", TIFF, GIF, PCX, BMP, RLE, y otros muchos. Para manipulaciones de impresión y archivo las conversiones e importaciones no deberán alterar el contenido de los datos de manera que se obtenga una representación verdadera y fiel de la imagen.

En segundo lugar, se puede usar software de tratamiento de imágenes para analizar la información digital y determinar los límites o contornos de cada lugar, y el valor de intensidad medio o representativo en cada lugar. La intensidad se correlaciona positivamente con la cantidad de LSL presente en el lugar, y la cantidad de LSL presente se correlaciona (negativa o positivamente, dependiendo del formato de ensayo) con la cantidad de elemento analito de unión en dicho lugar. Este tipo de manipulación de datos es evidente en los ejemplos 2 y 5 y las figuras 8B y 8C.

Se puede acumular y analizar en el tiempo múltiples imágenes del mismo lugar. Para imágenes repetitivas, la guía de ondas o elemento RIT se ilumina múltiples veces o, más probablemente, la lámpara permanece simplemente encendida hasta que se forman imágenes en cada tiempo deseado. Comparando la dispersión de luz en el primer tiempo t_{1} con la dispersión en el segundo tiempo t_{2}, se puede obtener información cinética. Esta información cinética es especialmente valiosa cuando se pretende que el ensayo sea cuantitativo, puesto que la dependencia del tiempo (es decir, velocidad) del aumento o disminución de la cantidad de dispersión de luz puede ser más exactamente indicativa de los niveles de los elementos de par de unión presentes en la muestra de fluido que la cantidad total de dispersión por la reacción en cualquier punto de reacción dado en el tiempo. Además, el uso de múltiples imágenes puede proporcionar un conjunto de datos sobre el que el aumento de la luz dispersada detectada es de una función conocida con respecto a tiempo. Medir la velocidad de cambio de la intensidad de la luz dispersada desde una región dada de la superficie reactiva en función del tiempo proporciona una velocidad de reacción. Utilizando cinética de reacción, la velocidad se correlaciona con una medida cuantitativa de concentración de analito en la solución de muestra. Naturalmente, se puede recoger datos en más de dos tiempos; en general, cuantos más puntos de datos se obtengan, más fiable es la información cinética o de velocidad.

Se puede usar un método alternativo en lugar de cinética de reacción. En este método se integra la intensidad de la luz dispersada en función del tiempo. El área obtenida por esta integración se correlaciona con la concentración del analito en solución.

Ahora se mostrará varias realizaciones de la invención a modo de ejemplo detallado. Los ejemplos son ilustrativos solamente y no tienen la finalidad de limitar la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Inmunoensayo de hCG usando LAM colorante A. Unión de SBM de captura a la guía de ondas

La guía de ondas usada aquí era un cubreobjetos de vidrio estándar recubierto conanticuerpo comercializado por Corning (Corning, N.Y.; catálogo #2, 22 mm cuadrado). La superficie reactiva se creó en la guía de ondas de vidrio aplicando una cantidad pequeña (aproximadamente 2 \mul) de una solución de anticuerpo (por ejemplo, anti-\betahCG policlonal de cabra purificada por afinidad, 10 mM fosfato, pH 7,4, 120 mM NaCl) a una zona aproximadamente circular delimitada. La concentración de anticuerpo era 3,3 mg/ml y se podía usar directamente o el anticuerpo se podía diluir 1:10 a 1% sacarosa (1% en peso por volumen [p/v] sacarosa disuelta en agua) antes de la aplicación. En cualquier caso, se aplicó anticuerpo excedente con relación a la cantidad de proteína que se podría retener en la superficie de la guía de ondas, y este anticuerpo excedente se lavó con agua y dejó secar.

Después de la inmovilización del anticuerpo a la guía de ondas, la superficie de vidrio se trató con 0,05% caseína de tratamiento alcalino en agua para bloquear las interacciones no específicas entre la superficie de vidrio y el material en la muestra de fluido. Se incubó un volumen suficiente de la solución de caseína de 0,05% para cubrir la superficie a temperatura ambiente durante 1-5 minutos y posteriormente el vidrio se lavó con agua usando una botella de lavado. La caseína recubrió la superficie por adsorción física y dio lugar a una superficie que mostró "acción lámina", es decir, mediante aplicación esmerada de la corriente de agua, toda el agua de la superficie de chip se extrajo por flujo de gravedad.

B. Montaje del dispositivo

Un dispositivo para alojar los reactivos de ensayo constaba de dos cubreobjetos de vidrio como se representa en las figuras 2A-2C. Un cubreobjetos (la guía de ondas) contenía el SBM de captura unido y otro cubreobjetos de vidrio creó el canal para mantener la solución de muestra-conjugado. Los dos cubreobjetos se descentraron y mantuvieron juntos por cinta adhesiva de dos caras (Arcare 7710B, Adhesives Research Inc., Glen Rock, Penn) para formar un canal de 16 mm de ancho y de aproximadamente 75 \mum de grosor (el grosor de la cinta de doble cara). El canal creado contiene aproximadamente 25 \mul en volumen.

C. Iluminación de la guía de ondas

La guía de ondas se iluminó después con una fuente de luz incluyendo una bombilla incandescente de 150 vatios con una hendidura de aproximadamente 2 mm. La guía de ondas se introdujo en la hendidura de la fuente de luz de manera que la luz brillase en el borde receptor de luz de 2 mm de grosor de la guía de ondas (véase la figura 2A). Aunque la guía de ondas se introdujo en la hendidura a aproximadamente 45º con relación a la máscara, no se intentó optimizar el ángulo de luz incidente o eliminar la luz que chocaba en el elemento a un ángulo inferior al crítico.

D. Adición de muestra, conjugado de dispersión de luz, colorante fotoabsorbente

A continuación, se añadió una solución conteniendo muestra, un conjugado de dispersión de luz, y un colorante fotoabsorbente a la superficie reactiva de tal manera que se cubriese el lugar de captura. El conjugado se preparó usando una partícula de selenio coloidal (Patente de Estados Unidos número 4.954.452 de Yost y otros) como sigue: se mezcló 1 ml de selenio coloidal (32 concentración DO, a la longitud de onda de absorción máxima de 546 nm) durante 10 segundos con 2,51 \mul de anticuerpo anti-\alphahCG monoclonal (1 mg/ml, en PBS) y 30 \mul de 20% BSA (20 g/100 ml disuelto en agua). Después se añadió 10 \mul del conjugado de selenio a 40 \mul de calibrador de hCG (hCG-Urine Controls de Abbott Laboratories (Abbott Park, IL; catálogo #3A28-02)). Finalmente, se añadió a esta mezcla 2 a 3 \mul de colorante azul para alimentos McCormick (McCormick, Hunt Valley, MD), obteniendo una DO final de 140-200 a 630 nm.

E. Detección de la señal de luz dispersada

La luz dispersada derivada de la interacción de la onda de luz evanescente con el marcador de dispersión de luz se puede detectar visualmente, o por medio de un sistema de análisis vídeo estándar. En el caso de detección visual, se observó una señal en aproximadamente 1 minuto y resulta muy visible en un período de 5 minutos. Esta señal visual se registró usando una cámara CCD (dispositivo de acoplamiento de carga) estándar de 8 bits (Cohu modelo 4815 Cohu, Inc., San Diego, CA). Se creó una representación digital de la imagen usando una tarjeta de captura de imágenes (Imaging Technology Incorporated, PC VISION plus Frame Grabber Board; Woburn, Mass) en un Compac DeskPro 386/20e (Compaq Computer Corporation, Houston, TX). El archivo de datos de la imagen digitalizada se convirtió e importó a Publishers PaintBrush software (ZSoft Corp., Atlanta, Georgia) cuya imagen se imprimió en una impresora de 300 dpi de resolución. La imagen impresa se muestra como la figura 4.

Ejemplo 2 Ensayo mejorado de guía de ondas de hCG A. Configuración del ensayo

El ensayo se realizó como se describe en el ejemplo 1; sin embargo, el conjugado de selenio se concentró en un factor de 30X como sigue. Se mezcló 10 ml de selenio coloidal, 32 DO a 546 nM luz, con 25 \mul de anticuerpo anti-hCG (1 mg/ml; descrito en el ejemplo 1) y 300 \mul de 20% BSA (véase el ejemplo 1). La solución resultante se puso en dos tubos centrífugos de 6 ml de capacidad y centrifugó usando una centrífuga modelo Centra-4B (International Equipment Company, Needham Heights, MA) a 5.000 rpm durante 10 minutos para aglomerar el conjugado de selenio. Se extrajo aproximadamente 9,66 ml del supernadante, de color amarillo paja, para no perturbar el pelet de selenio, de color rojo intenso. Los pelets de conjugado de selenio se resuspendieron y combinaron en los 0,33 ml restantes de supernadante. Las "muestras" hCG eran los controles hCG-Urina positivo alto, positivo bajo y cero obtenidos de Abbott Laboratories (Abbott Park, IL; catálogo #3A28-02) que contenían, respectivamente, 250, 50 y 0 mIU/ml hCG. Además, se añadió 0,5 ml de caseína a 10% (100 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% p/v caseína) a cada uno de los controles como un agente bloqueante para evitar la unión no específica, concentración de caseína final 0,9%. Las guías de ondas se construyeron como se describe en el ejemplo 1, a excepción de que el anticuerpo anti-hCG policlonal se aplicó a la superficie de vidrio con un capilar de vidrio de tal manera que el lugar fuese un símbolo "más" trazado a mano.

Se mezclaron y aplicaron inmediatamente a la guía de ondas volúmenes iguales de conjugado de selenio concentrado 30X (descrito anteriormente) y muestra. En este caso, la densidad óptica de la mezcla de conjugado-muestra (aproximadamente 465 DO) era tan grande que no hubo que añadir el colorante para alimentos para evitar la dispersión de fondo. Además, la alta concentración de conjugado incrementó tanto la sensibilidad como la velocidad del desarrollo de señal de la guía de ondas, inesperadamente sin un aumento de la dispersión de fondo. La muestra de 0 mIU/ml no dio señal apreciable, la muestra de 25 mIU/ml (concentración final) dio una señal visible en aproximadamente 30 segundos y la muestra de 125 mIU/ml (concentración final) dio una señal en 5 segundos o menos. La figura 5, representada gráficamente, digitalizada e impresa como en el ejemplo 1-D, muestra una señal "más" tenue a 1 segundo para la muestra hCG positiva alta (125 mIU/ml). Tiempo = 0 muestra el canal de la guía de ondas que se llena con la solución de conjugado; Tiempo = 1 segundo muestra la formación inicial, casi instantánea de una señal más visible; y Tiempo = 5 y 20 segundos muestra una señal más claramente visible.

B. Determinación de la sensibilidad

Se hicieron chips de guía de ondas como antes; sin embargo, se aplicó un solo punto de solución de anticuerpo (véase el ejemplo 1; anticuerpo anti-hCG policlonal a 1 mg/ml) a la guía de ondas para formar un solo lugar en la superficie reactiva. Para estimar la sensibilidad en este sistema, el experimento se repitió con 6 muestras a 0 mIU/ml y 5 muestras a 31 mIU/ml (concentraciones nominales de hCG, no se realizaron mediciones reales). Las muestras y el conjugado se mezclaron durante 1 minuto, aplicaron al canal de la guía de ondas y se obtuvo una imagen vídeo digital después de 1 minuto de la generación de la señal usando una tarjeta de captura de imágenes y una cámara CCD vídeo. Las imágenes digitales constan de una serie de valores de escala de grises de 8 bits, que van desde 0 (oscuro) a 255 (blanco). El archivo digital consta así de una serie de tales números y cada número corresponde a una posición de pixel particular y única de la imagen.

Los datos digitalizados resultantes se analizaron usando Image Pro Plus software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) por lo que se utilizó un área circular, aproximadamente el tamaño de un punto de señal para medir los valores numéricos de la escala de grises de los datos de imagen. Los valores digitales dentro del área circular de medición se promediaron, es decir, se sumó cada valor dentro del círculo y la suma resultante se dividió por el número de tales valores. Tales valores se obtuvieron para el lugar de captura y para un fondo representativo, porción no lugar junto al lugar de señal. La diferencia, señal menos fondo, constituyó el valor medido. Los datos obtenidos para este experimento se exponen en la Tabla 2.1:

TABLA 2.1

0 mIU/ml	31 mIU/ml
Señal	Fondo	Señal	Señal	Fondo	Señal
		neta			neta
50,9	44,8	6,1	69,6	50,2	19,4
51,6	44,6	7,1	78,4	54,7	23,7
50,6	44,1	6,4	112,4	77,0	35,6
64,1	58,6	5,6	102,3	64,2	38,1
66,2	58,7	7,5	105,7	76,0	29,7
54,8	48,0	6,8
media: 6,6 \pm 0,7	media: 29,2 \pm 7,8

La señal neta media para el experimento de 0 mIU/ml es 6,6 0 \pm 0,7 mIU/ml y para el experimento de 31 mIU/ml, 29,2 \pm 7,8 mIU/ml. Por lo tanto, por interpolación lineal, 1 nivel gris = 1,4 mIU/ml y un valor de señal neta igual a 2 desviaciones estándar por encima de la señal neta de 0 mIU/ml, es decir 1,4, produce una estimación de sensibilidad de aproximadamente 2 mIU/ml.

Ejemplo 3 Inmunoensayo de la hormona estimulante del tiroides (TSH) A. Unir reactivo de captura a la fase sólido

Se preparó una guía de ondas como se describe en el ejemplo 1, a excepción de que el lugar de captura de anticuerpo se creó en la superficie de vidrio de la guía de ondas aplicando una cantidad pequeña (aproximadamente 2 \mul) de una solución de anticuerpo compuesto de anticuerpo anti-\alphaTSH policlonal purificado por afinidad a una concentración de 0,25 a 0,5 mg/ml. La solución de anticuerpo contiene 1% sacarosa. El anticuerpo se dejó secar y por lo tanto se inmovilizó y adsorbió sobre la superficie de vidrio, enjuagó con agua HPLC y aire forzado seco. Después de la inmovilización, la superficie de vidrio se trata durante \leq1 minuto con caseína de tratamiento alcalino a 0,05% (100 mM Tris, pH 7,8, 150 mM NaCl) para bloquear las interacciones no específicas entre la superficie reactiva y el material en la muestra de fluido; y para promover flujo a través del canal. La caseína excedente se enjuaga del portaobjetos con agua HPLC en una "acción lámina". El líquido restante se seca por aire forzado.

El desechable se montó como se describe en el ejemplo 1 y se colocó en la hendidura de la fuente de luz como se describe en el ejemplo 1.

B. Adición de muestra y conjugado de dispersión de luz concentrado

A continuación, se añadió una solución conteniendo muestra y un conjugado de dispersión de luz a la superficie reactiva de tal manera que se cubriese el lugar de captura. Se preparó conjugado de dispersión de luz marcando un segundo anticuerpo (anti-\betaTSH monoclonal; 10 \mug/ml) con selenio coloidal del ejemplo 1 diluido a 16 DO (longitud de onda de absorción máxima de 546). Después de mezclar durante 10 segundos, la conjugación se bloqueó con 0,6% BSA y giró a 8000 rpm durante 3-5 minutos para concentración. El conjugado se resuspendió en 1/20 de su volumen original. Posteriormente, se mezcló 15 \mul de solución tampón muestra, que consistía de 7,5 \mul de selenio conjugado mezclado con 7,5 \mul de caseína de tratamiento alcalino a 10% (100 mM Tris, pH 7,8, 150 mM NaCl) obteniendo una concentración de caseína final de 2,5%, con 151 \mul de muestra de TSH. Las muestras de TSH eran los calibradores de ensayo IMx® Ultrasensitive hTSH A-F obtenido comercialmente de Abbott Laboratories (catálogo #A3A62-01) y que tienen los niveles TSH siguientes: A = 0, B = 0,5, C = 2, D = 10, E = 40, y F = 100 \muIU/mI. Estos calibradores se utilizaron a una dilución 1:1 con la solución tampón muestra, obteniendo una concentración final la mitad de la indicada como la concentración del calibrador.

C. Detección de la señal de luz dispersada

La luz dispersada derivada de la interacción de la onda de luz evanescente con el marcador de dispersión de luz se detectó visualmente y por medio de un sistema de análisis vídeo estándar (véase por ejemplo, el ejemplo 1). En el caso de detección visual, se observó una señal en aproximadamente 1 minuto. La figura 6 se representó gráficamente, digitalizó e imprimió como en el ejemplo 1-D. Como se representa en la figura 6, se observa claramente una señal encima del fondo en un minuto. La sensibilidad estimada del sistema con detección visual es 0,25 \muIU/ml TSH. La señal a 0,125 \muIU/ml TSH es visible a simple vista y distinguible por encima de cero.

Ejemplo 4 Ensayo de hibridación de ADN A. Construcción de la guía de ondas de ADN

Se construyeron guías de ondas de ADN para la detección de mutaciones genéticas humanas que producen fibrosis quística a partir de sustratos de vidrio de 1 cm cuadrado. Se inmovilizaron oligonucleótidos en el vidrio para proporcionar múltiples lugares de captura en la superficie reactiva. En particular, se aplicaron a la superficie de vidrio de la guía de ondas nueve oligonucleótidos diferentes, designados CAT01 a CAT09 (ID DE SEC. Números 1-9) para formar una configuración de matriz de 3\times3 de modo que CAT# correspondiese a la posición ocupada por el mismo número en un teléfono de tonos estándar. Los puntos de ADN tenían aproximadamente 2 mm de diámetro y estaban separados 2 mm aproximadamente. La secuencia y el lugar de mutación de CAT01 a CAT09 (ID DE SEC. Números 1-9) se muestran en la Tabla 4.1.

TABLA 4.1

1

Las mutaciones genéticas humanas se indican por notación estándar. Por ejemplo, \Delta 508 indica una delección de 3 pares de bases en la posición 508 del polipéptido regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (J. Zielenski y otros, Genomics 10:214-228, 1991). "WT" indica la secuencia de tipo ordinario o normal en esta posición. La presencia del grupo amino en el extremo 3' del oligonucleótido facilita la inmovilización del ADN a la superficie de la guía de ondas, sin embargo, el mecanismo no se conoce actualmente. Las soluciones de ADN las preparó Synthecell (Columbia, MD) y se diluyeron 1:20 a PBS (salina fosfato tamponada, pH 7,4) buffer y aplicaron a la superficie de vidrio de la guía de ondas usando el extremo romo de una broca aproximadamente de 1 mm de diámetro. Se inmovilizó ADN en una superficie de vidrio limpia o en una superficie de vidrio previamente recubierta con caseína a 0,05%; los resultados de la hibridación eran indistinguibles. Las concentraciones finales del ADN aplicado a la superficie de vidrio de la guía de ondas oscilaban entre un valor alto de 14 \muM para CAT02 a otro bajo de 0,9 \muM para CAT08 y se determinaron por comparación con la concentración de material inicial recibida de Synthecell. Después de la aplicación, las soluciones de ADN se dejaron secar en el chip a temperatura ambiente o, en días húmedos entre aproximadamente 35% y 80% de humedad relativa, en una incubadora a 50-70ºC hasta que se secaron (aproximadamente 10 minutos). Este procedimiento formó nueve "puntos" o lugares de captura de hibridación en la matriz de 3\times3 descrita anteriormente.

B. Hibridación

Para evaluar el rendimiento de la guía de ondas de ADN, Synthecell sintetizó nueve oligonucleótidos adicionales, CAT21B a CAT29B (ID DE SEC. Números 10-18) con un marcador de biotina en el extremo 3'. Las secuencias de oligonucleótidos de ADN de prueba se enumeran en la Tabla 4.2.

TABLA 4.2

2

Los oligonucleótidos se diseñaron y nombraron de tal manera que CAT21B (ID DE SEC. Nº 10) es complementario de CAT01 (ID DE SEC. Nº 1), CAT22B (ID DE SEC. Nº 11) es complementario de CAT02 (ID DE SEC. Nº 2), etc a CAT29 (ID DE SEC. Nº 18) que es complementario de CAT09 (ID DE SEC. Nº 9). Las concentraciones variaron de una alta de 473 mM para CAT25B (ID DE SEC. Nº 14) a otra baja de 151 mM para CAT27B (ID DE SEC. Nº 16). Cada una de las nueve muestras de ADN se diluyó 1 \mul a 1 ml de solución tampón de hibridación (1% caseína, 10 mM Tris pH 7,4, 15 mM NaCl), y se aplicó otra diferente a cada una de las nueve guías de ondas de ADN diferentes e incubó a temperatura ambiente (aproximadamente 23ºC) durante 5 minutos. La superficie de las guías de ondas de ADN se lavó con PBS usando una botella de lavado y después se almacenaron bajo PBS hasta la detección de hibridación.

C. Detección de hibridación

La hibridación de los nueve ADNs diferentes marcados con biotina se detectó en la guía de ondas por la luz dispersada de un conjugado de selenio antibiotina. El conjugado de selenio se preparó mediante adición de 2,5 \mul de antibiotina (anticuerpo antibiotina policlonal de conejo, 1,13 mg/ml en PBS, pH 7,4, véase EP 0 160 900 B1 de Mushahwar y otros, correspondiente a la número de serie de Estados Unidos 08/196.885) a 1 ml de selenio coloidal (concentración de DO 32) del ejemplo 1, seguido de adición de 30 \mul de albúmina sérica bovina (BSA en polvo disuelto en agua para obtener una solución de 20% p/v). Se aplicó 50 \mul de la solución de conjugado a la superficie de la guía de ondas de ADN y se dirigió luz al lado de la guía de ondas para observar la unión de selenio a los varios lugares de captura de ADN. En muchos lugares se pudo ver hibridación positiva en 1 minuto. Las guías de ondas de ADN se lavaron con PBS para quitar el selenio conjugado excedente, se iluminaron para efectuar dispersión de luz excitada por guía de ondas, y formaron imágenes usando una cámara CCD Cohu modelo 4815. La imagen se digitalizó e imprimió como en el ejemplo 1-D, y se representa en la figura 7. Toda la configuración de la hibridación de ADN se detectó usando la guía de ondas en una sola medición de imagen y permitió la determinación de la secuencia de ADN del oligo aplicado a la guía de ondas. En el caso de CAT21B (ID DE SEC. Nº 10) y CAT22B (ID DE SEC. Nº 11) (primeros dos bloques de la figura 7), la configuración de hibridación era relativamente simple porque había homología de secuencia despreciable de estos oligonucleótidos con lugares de captura de ADN distintos de CAT01 (ID DE SEC. Nº 1) y CAT02 (ID DE SEC. Nº 2), respectivamente. En el caso de CAT23B-CAT29B (ID DE SEC. Números 12-18), sin embargo, una homología de secuencia significativa da lugar a una configuración de unión más complicada.

Ejemplo 5 Fusión de ADN en tiempo real A. Construcción de la guía de ondas de ADN

Se hicieron guías de ondas conteniendo dos puntos de captura de ADN aplicando 1 \mul de una solución de oligonucleótido conteniendo CAT03 (ID DE SEC. Nº 3) y CAT04 (ID DE SEC. Nº 4; 1:20 dilución a PBS) al cubreobjetos de la guía de ondas (recubierto con caseína a 0,05% como en el ejemplo 1) seguido de secado a temperatura ambiente. El ADN excedente se enjuagó de los dos puntos con agua y después los chips se secaron a temperatura ambiente. La guía de ondas de ADN con dos puntos se unió a otros cubreobjetos de vidrio para formar un desechable para alojar los reactivos de ensayo como en el ejemplo 1.

B. Hibridación y detección

Se preparó una solución de CAT23B (ID DE SEC. Nº 12) o CAT24B (ID DE SEC. Nº 13) diluyendo 1 \mul a 1 ml de caseína a 1%, 10 mM Tris, pH 7,4, 15 mM NaCl. La solución se introdujo en el canal del desechable de la guía de ondas por flujo capilar y se permitió hibridación durante un período de 5 minutos a temperatura ambiente. La solución de ADN se desplazó del canal por introducción de un conjugado de selenio (ejemplo 4) y la guía de ondas se colocó en la fuente de luz para efectuar detección. En segundos, aparecieron dos puntos brillantes en los lugares de captura de ADN indicando que se había producido hibridación. Se esperaba hibridación entre CAT23B (ID DE SEC. Nº 12) y CAT03 (ID DE SEC. Nº 3) como la hibridación entre CAT23B (ID DE SEC. Nº 12) y CAT04 (ID DE SEC. Nº 4) porque la diferencia entre CAT23B (ID DE SEC. Nº 12) y CAT04 (ID DE SEC. Nº 4) era solamente un solo par de bases. En condiciones de baja temperatura (es decir, temperatura ambiente) y alto contenido de sal (15 mM NaCl), no había suficiente discriminación en el proceso de hibridación para distinguir un mal emparejamiento de base única.

C. Fusión en tiempo real

Después de la observación de la configuración de hibridación a temperatura ambiente, la temperatura de la guía de ondas de ADN se incrementó usando un bloque de calentamiento aplicado al lado no de guía de ondas del canal (es decir, el segundo cubreobjetos de vidrio usado para crear el canal del desechable). El efecto del calor en la configuración de hibridación se registró en tiempo real usando una cámara CCD y una grabadora vídeo (VCR) enfocada a la superficie de la guía de ondas. La temperatura del bloque de calentamiento bajo la guía de ondas (es decir, en contacto con el segundo cubreobjetos de vidrio usado para crear el canal del desechable) se midió usando un termopar. Se registró una lectura de temperatura digital (Watlow, controlador de temperatura serie 965, Watlow Controls, Winona, MN) formando imágenes con la cámara CCD. A medida que aumentaba la temperatura, la intensidad de los lugares ADN disminuía como era de esperar por la fusión de ADN. Además, los lugares de ADN conteniendo el ADN hibridizado mal emparejado se fundían a temperaturas inferiores a los lugares que contenían ADN de emparejamiento exacto. Como resultado, era posible distinguir entre emparejamiento exacto e hibridación de sin emparejamiento de base única y permitir por ello detección de mutaciones de base única. Los datos, en forma de imágenes vídeo, se recogieron a cada incremento de 1ºC y se digitalizaron usando la tarjeta de captura de imágenes como antes. La figura 8A es la representación impresa de los datos a intervalos de 5ºC, que muestra que a aproximadamente 50ºC los puntos mal emparejados comienzan a desvanecer pero los pares perfectamente emparejados permanecen visibles hasta aproximadamente 60ºC. La intensidad de los lugares de captura se midió como en el ejemplo 2 y la intensidad media de puntos se calculó para cada temperatura. La figura 8B es un gráfico de curvas de fusión para CAT23B (ID DE SEC. Nº 12) y la figura 8C es un gráfico de curvas de fusión para CAT24B (ID DE SEC. Nº 13). Las temperaturas de fusión se estiman como el punto a mitad de camino entre las mesetas superior e inferior.

Ejemplo 6 Sensibilidad del ensayo de hibridación de ADN

La sensibilidad del ensayo de hibridación de ADN con guía de ondas se estimó observando la intensidad de señal de dispersión cuando se redujo la concentración de ADNaplicado a la guía de ondas. Se hicieron cuatro guías de ondas de ADN idénticas aplicando 0,5 \mul de CAT01 (ID DE SEC. Nº 1) y CAT03 (ID DE SEC. Nº 3), que se diluyeron por separado 1:20 en PBS. Este procedimiento se repitió 2 veces para formar una matriz de 2 \times 2 con CAT01 (ID DE SEC. Nº 1) en las esquinas superior izquierda e inferior derecha (según se ve) y con CAT03 (ID DE SEC. Nº 3) en las esquinas superior derecha e inferior izquierda (según se ve). Los puntos de ADN se secaron en un horno a 70ºC durante 15 minutos y, sin lavar el ADN excedente, se fijó un segundo cubreobjetos para formar un canal como en el ejemplo 1. Se diluyó CAT23B ADN (ID DE SEC. Nº 12) en solución tampón de hibridación (1% caseína, 10 mM Tris, pH 7,4, 15 mM NaCl) obteniendo concentraciones de 39,6 nM, 4 nM y 0,4 nM. La solución tampón de hibridación solamente se utilizó como la cuarta concentración de ADN (0 nM). Se introdujo 30 \mul de cada solución de ADN en uno de los cuatro dispositivos de guía de ondas. La solución de ADN se aplicó al intervalo abierto en un extremo del desechable de la guía de ondas y posteriormente se llenó el canal por acción capilar. Las soluciones se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos para que pudiese producirse hibridación. Posteriormente, se aplicó 30 \mul de conjugado de selenio antibiotina (ejemplo 4) a un extremo del canal y se aplicó una toalla de papel al extremo opuesto del canal para quitar la solución de ADN y, por desplazamiento, llenar el canal con solución de conjugado. La hibridación se detectó por iluminación de la guía de ondas de ADN mientras que el canal se llenó de solución de conjugado. Después de un minuto de unión del conjugado de selenio, se adquirió una imagen digital de la señal de la guía de ondas usando una cámara CCD Cohu a 30 cuadros por segundo. La imagen importada e impresa de cada uno de los cuatro chips se representa en la figura 9. Se indicó hibridación específica por la presencia de señal solamente en los lugares de CAT03 (ID DE SEC. Nº 3). No había señal de ningún lugar en el chip con 0 nM de muestra ni señal de los lugares de CAT01 (ID DE SEC. Nº 1) a cualquier concentración. La concentración más baja de ADN utilizada en el experimento, 0,4 nM CAT03, se detectó por la guía de ondas bajo estas condiciones y representa una medida aproximada de la sensibilidad. Como una comparación típica, Pease y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 5022-5026, 1994 refieren detectar una concentración de 10 nM de ADN marcado con fluorescente en unión con un sistema de exploración por láser en un tiempo de lectura de minutos en lugar de 1/30 de un segundo.

Ejemplo 7 Detección de la guía de ondas de ADN de alta densidad de lugares

Se creó una guía de ondas de ADN de alta densidad de lugares (definida como el número de lugares/chip, en contraposición a la cantidad de ADN por lugar) por aplicaciones múltiples de un solo oligonucleótido, CAT01 (ID DE SEC. Nº 1). Se programó una Asymtek Automove 102 XYZ Table (Asymtek, Carlsbad, CA) para sumergir una varilla de 150 \mum de diámetro en una solución de CAT01 ADN (1:20 dilución de CAT01 a PBS) y que después la varilla tocase la superficie de una guía de ondas de vidrio, de 1 cm cuadrado, recubierta con caseína. El proceso se repitió 323 veces para formar una matriz de 18 \times 18 de puntos de ADN de 150 \mum de diámetro espaciados 300 \mum (la matriz de 18 \times 18 debería tener 324 puntos; sin embargo, un error de programación omitió la colocación de un punto dando lugar a un "agujero" en la porción superior derecha (según se ve) de la matriz y, por lo tanto, 323 puntos). Toda la matriz ocupó un cuadrado de aproximadamente 5,1 mm por lado, (26 mm^{2}) en el centro de la guía de ondas de 1 centímetro cuadrado.

Las guías de ondas resultantes se secaron, lavaron con agua y secaron de nuevo como preparación para la hibridación. La hibridación se realizó colocando una solución de CAT21B (ID DE SEC. Nº 10) diluida 1:1000 en 1% caseína, 10 mM Tris, pH 7,4, 15 mM NaCl en la superficie de la guía de ondas para cubrir toda la matriz durante 5 minutos a temperatura ambiente. La solución de ADN se enjuagó de la superficie de la guía de ondas usando PBS y después se detectó hibridación cubriendo la superficie de la guía de ondas con conjugado de selenio antibiotina (ejemplo 4) e iluminando la guía de ondas. La hibridación del CAT21B ADN (ID DE SEC. Nº 10) en la matriz de ADN se podría observar visualmente en aproximadamente 30-60 segundos. La solución de conjugado excedente se lavó colocando el chip en un plato de PBS. La configuración de hibridación se registró por digitalización de una imagen vídeo usando una tarjeta de captura de imágenes como antes. Una representación impresa de los datos de imagen se representa en la figura 10. Como se puede ver, la detección de la guía de ondas permitió la medición simultánea y diferenciación de los 323 lugares de hibridación.

Ejemplo 8 Disociación de ADN hibridizado por fuerza iónica baja

Otra ventaja de la detección de guía de ondas es la reutilizabilidad. En este caso la muestra de ADN hibridizada a una superficie de la guía de ondas debe ser quitada del chip sin dañar el ADN fijado a la superficie. Este ejemplo demuestra la utilidad de la guía de ondas para supervisar el proceso de regeneración.

Se construyeron guías de ondas de ADN de fibrosis quística que llevaban oligonucleótidos CAT01 a CAT09 (ID DE SEC. Números 1-9) en una matriz de 3 \times 3 como se describe en el ejemplo 4 usando un cubreobjetos de vidrio nº 2 de 22 mm cuadrado. Se formó un canal de flujo fijando un segundo cubreobjetos a la guía de ondas usando adhesivo de silicona (Dow Corning, Midland, MI) y dos piezas de tubo en esquinas diagonales opuestas para proporcionar una entrada y salida. Los cubreobjetos se desviaron como se describe en el ejemplo 1 para permitir la inyección de luz al cubreobjetos superior que funcionó como la guía de ondas. Una solución de CAT23B ((ID DE SEC. Nº 12) que es perfectamente complementaria de CAT03 (ID DE SEC. Nº 3)) en solución tampón de hibridación (1% caseína en 10 mM Tris, pH 7,4.12 mM NaCl) se bombeó manualmente al canal de flujo usando una jeringa; se paró el flujo y se realizó hibridación durante 1 minuto. Después, se bombeó una solución de conjugado de selenio antibiotina (ejemplo 4) al canal desplazando la solución de ADN; se paró el flujo; y la hibridación se detectó por iluminación de la guía de ondas en presencia de conjugado (como antes). Posteriormente, se lavó el canal por bombeo en PBS para desplazar la solución de conjugado. Finalmente, el complejo de ADN hibridizado-conjugado de selenio antibiotina se disoció de la superficie de la guía de ondas bombeando agua pura al canal. El agua aumenta las condiciones rigurosas diluyendo el NaCl para disminuir la fuerza iónica. La disociación del ADN y selenio de los lugares de captura se observó en tiempo real y se grabó usando una cámara de vídeo y un VCR. En varios momentos del proceso de disociación, la imagen vídeo se capturó usando una tarjeta de captura de imágenes, digitalizó e imprimió como antes, y los resultados se muestran en la figura 11. A causa de las excesivas burbujas de aire en la cámara de flujo, solamente se representa la matriz superior derecha 2\times2; por ejemplo, cuatro lugares correspondientes a los números 2 (CAT02, ID DE SEC. Nº 2), 3 (CAT03, ID DE SEC. Nº 3), 5 (CAT05, ID DE SEC. Nº 5) y 6 (CAT06, ID DE SEC. Nº 6). Como se puede ver, el proceso de disociación fue seguido de la introducción inicial de medio de baja fuerza iónica a la extracción final de sustancialmente toda la señal de la guía de ondas del chip ADN. Por lo tanto, la guía de ondas permitió al operador supervisar el proceso de regeneración de la guía de ondas de ADN para reutilización. En particular, se puede usar información en tiempo real en la regeneración para controlar el tiempo de regeneración y mejorar por ello los tiempos de procesado en una aplicación de diagnóstico.

Ejemplo 9 Prueba de anticuerpo múltiplex para ADN

Se creó una prueba de anticuerpo múltiplex para productos de ADN bi-haptenados usando un SBM de biotina común y un SBM de "captura" diferente único para cada uno de los 3 productos de oligonucleótido. Tales oligonucleótidos bi-haptenados son representativos de productos obtenidos por una reacción múltiplex en cadena de ligasa como se describe en la número de serie de Estados Unidos 07/860.702 presentada el 31/3/92, publicada como WO 93/20227 (Abbott Labs). La guía de ondas se construyó inmovilizando anticuerpos monoclonales de antifluoresceína, antiadamantano, y antiquinolina en un cubreobjetos de microscopio de vidrio Coming #2. Se describen anticuerpos de antiadamantano en la número de serie de Estados Unidos 808.508 presentada el 17/12/91 y en PCT/US93/05534. Se describen anticuerpos de antiquinolina en la número de serie de Estados Unidos 07/858.820 presentada el 27/3/92, publicada como WO 93/20094. Todos estos documentos se incorporan aquí por referencia.

Los anticuerpos se diluyeron 1:10 en agua y se aplicó aproximadamente 0,5 \mul a la guía de ondas, formando 3 puntos separados espacialmente como se representa en la figura 12a con antifluoresceína en el vértice superior derecho (punto #1), antiadamantano a la izquierda (punto #2) y antiquinolina en la parte inferior derecha (punto #3). Se aplicó un segundo portaobjetos a la guía de ondas para formar un canal (como en el ejemplo 1). ADN sintético de hebra única conteniendo una biotina en el extremo 3' y fluoresceína, adamantano o quinolina en el extremo 5' se diluyó en 3 \mul a 50 \mul de 1% caseína, 10 mM Tris, pH 7,4.15 mM NaCl. Las concentraciones de ADN finales eran aproximadamente 100 nM. Las secuencias de ADN se muestran en la Tabla 9.1.

TABLA 9.1

3

Las soluciones resultantes se mezclaron con iguales volúmenes de conjugado de selenio antibiotina (ejemplo 4) e introdujeron en el canal de la guía de ondas por acción capilar. Las figuras 12b a 12d muestran los resultados usando soluciones de ADN conteniendo una sola especie marcada. Se utiliza ID DE SEC. Nº 21 en la figura 12b, se utiliza ID DE SEC. Nº 19 en la figura 12c, y se utiliza ID DE SEC. Nº 20 en la figura 12d. En la figura 12e, una mezcla de ADN quinolina-biotina y ADN fluoresceína-biotina dio lugar a señales detectables en los dos lugares de captura apropiados (puntos 1 y 3). Por lo tanto, el sistema de guía de ondas permitió la detección simultánea de múltiples analitos en una mezcla.

El ejemplo anterior describe varias realizaciones específicas de la invención, pero la invención no se limita a estos ejemplos específicos. Más bien, la invención a proteger se define por las reivindicaciones anexas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Donald I. Stimpson

\hskip3,9cm

Julian Gordon

\hskip3,9cm

Joanell V. Hoijer

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO DE GUÍA DE ONDAS ÓPTICA POR DISPERSIÓN DE LUZ PARA DETECTAR EVENTOS DE UNIÓN ESPECÍFICOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Abbott Laboratories

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: One Abbott Park Road

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Abbott Park

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Illinois

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CP: 60064-3500

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: MS Word/Wordperfect

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN SOBRE ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Thomas D. Brainard

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 32.459

\vskip0.500000\baselineskip

(C): EXPEDIENTE NÚMERO: 5603.US.01

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 708/937-4884

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 708/938-2623

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' amina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATCATCTTT GGTGT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' amina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATATCATTG GTGTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' amina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTGGAGGTC AACGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' amina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTGGAGATC AACGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' amina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTCAACGA GCAAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' amina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGTCAATGA GCAAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' amina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGATCAA TGACC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' amina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGATCAA CGAGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' amina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGCTCAA TGAGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACACCAAAGA TGATA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACACCAATG ATATT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGTTGACCT CCACT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGTTGATCT CCACT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGCTCGTT GACCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGCTCATT GACCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCATTGAT CTCCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCGTTGAT CTCCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

GCTCATTGAC, CTCCA

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 5' biotina (B)

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' fluoresceína hapteno

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACACGGAC ACGGACACGG ACAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 5' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' quinolina hapteno

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACACGGAC ACGGACACGG ACAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC Nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 5' biotina

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3' adamantano haptenO

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID DE SEC Nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACACGGAC ACGGACACGG ACAC

\hfill

Claims

1. Un método para detectar la presencia o cantidad de uno o varios analitos de unión específica en una muestra de fluido, incluyendo el método:

(a) proporcionar un dispositivo de guía de ondas, incluyendo el dispositivo de guía de ondas (i) un elemento transparente que tiene un índice de refracción mayor que el de la muestra de fluido; (ii) un borde receptor de luz; y (iii) una superficie reactiva incluyendo un primer elemento de unión específica de al menos un par de unión análoga inmovilizado en una pluralidad de lugares en la superficie del elemento, no teniendo otras porciones no lugar de la superficie reactiva ningún elemento de unión específica inmovilizado encima; donde dicho primer elemento de unión específica, mediante pares de unión análoga intermedios si se desea, es capaz de unir específicamente al menos un analito;

(b) poner la superficie reactiva en contacto con una muestra sospechosa de contener dicho uno o varios analitos y con un marcador de dispersión de luz unido a un elemento de unión específica de un segundo par de unión análoga que, mediante pares de unión análoga intermedios si se desea, es capaz de unir específicamente dicho uno o varios analitos, en el caso de un ensayo intercalado, o el primer elemento de unión específica inmovilizado de dicho primer par de unión análoga, en el caso de un ensayo competitivo; formando por ello complejos marcadores de dispersión de luz unidos a la pluralidad de lugares en proporción a la cantidad de analito en la muestra;

(c) iluminar el borde receptor de luz de la guía de ondas con luz efectiva para crear reflexión interna total dentro de la guía de ondas, iluminando por lo tanto simultáneamente sustancialmente toda la superficie reactiva;

(d) recoger de forma sustancialmente simultánea luz dispersada detectable visiblemente, si la hay, de cada lugar de dicha superficie;

(e) comparar el grado de dispersión de luz en cada lugar con (i) no teniendo el grado de dispersión de luz en una porción no lugar de la superficie reactiva ningún elemento de unión específica inmovilizado encima, o (ii) el grado de dispersión de luz en otro lugar, o ambos, por lo que la dispersión de luz en cada lugar se correlaciona con la presencia o cantidad del analito para el que es específico el elemento de unión específica inmovilizado en dicho
lugar.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicho método incluye además un segundo elemento transparente conectado a dicho primer elemento para formar un canal capilar bidimensional entremedio, de tal manera que la superficie reactiva se forme en el canal.

3. El método de la reivindicación 1, incluyendo un paso adicional, después del paso (e), de alterar las condiciones en la superficie reactiva del dispositivo de guía de ondas para iniciar la disociación del analito del primer elemento de unión específica inmovilizado, y repetir los pasos (c), (d) y (e) en las condiciones alteradas.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicho paso (d) incluye examinar visualmente la superficie reactiva para ver si hay dispersión de luz.

5. El método de la reivindicación 1, donde dicha luz dispersada recogida en el paso (d) se realiza en un primer tiempo, t_{1}; e

incluyendo además repetir dichos pasos (c) y (d) al menos una vez para recoger luz dispersada, si la hay, de dichas porciones lugar y no lugar en un segundo tiempo, t_{2};

donde dicha comparación en el paso (e) incluye comparar el grado de dispersión de luz en el tiempo t_{1} con el grado de dispersión de luz en el tiempo t_{2}, y la diferencia con el tiempo en la dispersión de luz proporciona información cinética indicativa de la cantidad de analito presente en dicho lugar.

6. El método de la reivindicación 1, donde:

dicho método tiene la finalidad de determinar la secuencia de nucleótidos de un segmento de ácido nucleico desconocido o de distinguir dos secuencias de nucleótidos estrechamente relacionadas;

dicho analito es un ácido nucleico y dicho elemento de unión es una serie de oligonucleótidos que tienen secuencias diferentes para hibridación con el ácido nucleico;

el contacto de paso (b) se produce bajo condiciones de hibridación donde dicho ácido nucleico está marcado con un marcador de dispersión de luz formando por ello complejos marcadores de dispersión de luz unidos en los lugares de la superficie reactiva que tiene un oligonucleótido, complementario de la secuencia del ácido nucleico desconocido; e

incluyendo además aumentar incrementalmente las condiciones rigurosas en la superficie reactiva del dispositivo de guía de ondas para iniciar la disociación de ácido nucleico unido de los lugares y repetir los pasos (d) y (e)en cada incremento;

por lo que las diferencias de un solo par de bases entre los oligonucleótidos y el ácido nucleico se pueden distinguir de emparejamientos perfectos por las diferencias de las propiedades de disociación.

7. El método de la reivindicación 1, donde:

dicho paso (b) incluye poner la superficie reactiva en contacto con una solución de un elemento absorbedor de luz lo suficiente para impartir una DO efectiva de al menos 15; y durante dicho paso (d), la dispersión de fondo se minimiza por la absorbancia por parte del material fotoabsorbente.

8. El método de la reivindicación 1, donde dichos elementos de unión específica son al menos uno de anticuerpos o antígenos.