JP2008191054A

JP2008191054A - 蛍光測定装置

Info

Publication number: JP2008191054A
Application number: JP2007027136A
Authority: JP
Inventors: Koji Sakurai; 孝司櫻井; Susumu Terakawa; 進寺川; Hideo Mogami; 秀夫最上
Original assignee: Hamamatsu University School of Medicine NUC
Current assignee: Hamamatsu University School of Medicine NUC
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2007-02-06
Publication date: 2008-08-21
Anticipated expiration: 2027-02-06
Also published as: JP5002813B2

Abstract

【課題】励起光のエバネセント波で励起された測定対象物の複数箇所の部分から生じる蛍光を略同一タイミングで検出する。
【解決手段】蛍光測定装置1は、板状部材10、第１励起光源部20、励起光学系30、検出用レンズ41〜43、光ファイバ51〜53、ｆθレンズ61、ミラー62、ビームスプリッタ63及び検出部70等を備える。測定対象物8を複数の区画に区分するための隔壁13が板状部材10の第１主面11上に設けられている。検出用レンズ41〜43は、板状部材10の第２主面12の側に設けられ、励起光のエバネセント波により励起された測定対象物8で発生する蛍光を入力して結像する。光ファイバ51〜53は、検出用レンズにより結像された蛍光を第１端面から第２端面へ伝送する。ミラー62は、反射面の方位が可変であり、光ファイバ51〜53のうち選択された光ファイバの第２端面から出力されてｆθレンズ61によりコリメートされた光を所定方向へ反射させる。
【選択図】図１

Description

本発明は、励起光のエバネセント波により測定対象物を励起して該測定対象物で発生する蛍光を測定する装置に関するものである。

励起光のエバネセント波により測定対象物を励起して該測定対象物で発生する蛍光を測定する装置として、非特許文献１に記載されたものが知られている。この蛍光測定装置では、蛍光標識された測定対象物が透明体の一主面上に配置され、その透明体の内部から主面に励起光が入射されて該励起光が主面で全反射され、この全反射により透明体の主面の上に励起光のエバネセント波が生じる。そして、この励起光のエバネセント波により、透明体の主面の付近にある測定対象物の部分が選択的に励起され、その励起された部分から蛍光が発生する。このようにして発生した蛍光が対物レンズを介して検出されることで、透明体の主面の付近にある測定対象物の部分が選択的に観察され得る。なお、測定対象物は例えば生細胞である。
Daniel Axelrod, "Total Internal Reflection FluorescenceMicroscopy in Cell Biology", Traffic 2001, Vol.2, pp.764-774 (2001).

ところで、従来の蛍光測定装置では、透明体の主面上に配置された測定対象物の複数箇所の部分を観察しようとすると、その測定対象物を載せた状態で透明体を移動させる必要がある。しかし、そのような移動に時間を要することから、測定対象物の複数箇所の部分それぞれの観察タイミングが異なってしまい、測定対象物の複数箇所の部分の間で対比観察することが困難となる。

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、励起光のエバネセント波で励起された測定対象物の複数箇所の部分から生じる蛍光を略同一タイミングで検出することができる蛍光測定装置を提供することを目的とする。

本発明に係る蛍光測定装置は、(1) 互いに対向する第１主面および第２主面を有し、第１主面上に測定対象物が配置される板状部材と、(2) 励起光を出力する第１励起光源部と、(3) 第１励起光源部から出力された励起光を板状部材内に導き、板状部材の第１主面と第２主面との間で励起光を繰り返し全反射させて、板状部材の第１主面の複数箇所それぞれにおける励起光の全反射により励起光のエバネセント波を生じさせる励起光学系と、(4) 板状部材の第１主面における全反射箇所に対応して板状部材の第２主面の側に設けられ、励起光のエバネセント波により励起された測定対象物で発生する蛍光を入力して結像する複数の検出用レンズと、(5) 複数の検出用レンズそれぞれに対応して設けられ、各々の第１端面が検出用レンズによる蛍光の結像位置に配置され、各々の第２端面が共通平面上に配置されている複数の光ファイバと、(6) 複数の光ファイバそれぞれの第２端面から出力される光を入力し、その光をコリメートして出力する走査光学系と、(7) 反射面の方位が可変であり、複数の光ファイバのうち選択された光ファイバの第２端面から出力されて走査光学系によりコリメートされた光を所定方向へ反射させるミラーと、(8) ミラーにより所定方向へ反射された光を検出する検出部と、を備えることを特徴とする。

この蛍光測定装置では、第１励起光源部から出力された励起光は、励起光学系により板状部材内に導かれ、板状部材の第１主面と第２主面との間で繰り返し全反射する。板状部材の第１主面の複数箇所それぞれにおける励起光の全反射により励起光のエバネセント波が生じる。板状部材の第１主面上に配置された測定対象物では、励起光のエバネセント波により励起されて、蛍光が発生する。その蛍光は、板状部材の第１主面における全反射箇所に対応して板状部材の第２主面の側に設けられた検出用レンズを経て、光ファイバの第１端面に入力されて、光ファイバの第２端面から出力される。各光ファイバの第２端面から出力される光は、走査光学系によりコリメートされ、反射面の方位が可変であるミラーにより反射される。このとき、ミラーの反射面の方位が適宜に調整されることにより、複数の光ファイバのうち選択された光ファイバの第２端面から出力されて走査光学系によりコリメートされた蛍光が、ミラーにより所定方向へ反射されて、検出部により検出される。したがって、ミラーの反射面の方位が順次に変更されることにより、板状部材の第１主面における複数の全反射箇所それぞれにおいて測定対象物で発生した蛍光は検出部により順次に検出される。なお、走査光学系としては、広い範囲で走査が可能であるのが好ましく、レンズ等で構成され、特にｆθレンズで構成されるのが好適である。

本発明に係る蛍光測定装置では、複数の光ファイバそれぞれはイメージングファイバであり、検出部は該イメージングファイバにより伝送された光の像を撮像するのが好適である。複数の光ファイバそれぞれは、１つのコアを有するものであってもよいが、複数のコアを有するイメージングファイバであるのが好ましい。後者の場合には、蛍光のイメージを伝送することができる。

本発明に係る蛍光測定装置は、板状部材の第１主面上に測定対象物を複数の区画に区分するための隔壁が設けられ、これら複数の区画それぞれにおいて第１主面における励起光の全反射箇所が存在するのが好適である。この場合には、複数の区画それぞれにおいて測定対象物や観察条件などを互いに異なるものとすることができる。

本発明に係る蛍光測定装置は、励起光を出力する第２励起光源部と、ミラーにより所定方向へ反射された光を検出部へ導き、第２励起光源部から出力される励起光を所定方向に沿ってミラーへ入射させるビームスプリッタと、を更に備えるのが好適である。この場合には、第２励起光源部から出力された励起光は、ビームスプリッタを経て、光ファイバの第２端面に入力されて第１端面から出力され、検出用レンズにより測定対象物に集光照射される。第１励起光源部から出力される励起光のエバネセント波による励起だけでなく、第２励起光源部から出力される励起光の集光照射による励起も可能である。

本発明に係る蛍光測定装置では、励起光学系は、第１励起光源部から出力された励起光を板状部材の第１主面に平行な方向に拡幅して、その励起光を板状部材内に導き、検出用レンズは、板状部材の第１主面における各全反射箇所に対して複数個設けられているのが好適である。この場合には、第１励起光源部から出力された励起光は、励起光学系により、板状部材の第１主面に平行な方向に拡幅されて、板状部材内に導かれる。板状部材の第１主面における各全反射箇所に対して複数個の検出用レンズが設けられていることから、１つの全反射箇所に対して複数箇所の蛍光観察が可能となる。

本発明に係る蛍光測定装置では、第１励起光源部は、複数波長の励起光を出力し、励起光学系は、第１励起光源部から出力された複数波長の励起光を板状部材内に導き、検出用レンズは、板状部材の第１主面における複数波長の励起光ぞれぞれの全反射箇所に対応して設けられているのが好適である。この場合には、第１励起光源部から出力された複数波長の励起光は、励起光学系により板状部材内に導かれる。板状部材の第１主面における複数波長の励起光ぞれぞれの全反射箇所に対応して検出用レンズが設けられていることから、各波長の励起光の全反射箇所に対して蛍光観察が可能になる。

本発明に係る蛍光測定装置では、第１励起光源部は、断続的に励起光を出力し、検出部は、第１励起光源部から励起光が出力されているときに測定対象物で発生する蛍光を検出し、第１励起光源部から励起光が出力されていないときに測定対象物で発生する他の光を検出するのが好適である。この場合には、第１励起光源部から励起光が出力されているときに、測定対象物で発生する蛍光が検出部により検出される。第１励起光源部から励起光が出力されていないときに、測定対象物で発生する他の光が検出される。ここで、他の光とは、第１励起光源部から出力される励起光のエバネセント波により励起されて生じる蛍光とは異なる光であって、例えば、照明光照射に伴う透過光や散乱光、他の手段による励起光照射に伴う蛍光、化学発光、等である。

本発明によれば、励起光のエバネセント波で励起された測定対象物の複数箇所の部分から生じる蛍光を略同一タイミングで検出することができる。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一または同等の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

図１は、本実施形態に係る蛍光測定装置１の構成図である。この図に示される蛍光測定装置１は、板状部材１０、第１励起光源部２０、励起光学系３０、検出用レンズ４１〜４３、光ファイバ５１〜５３、ｆθレンズ６１、ミラー６２、ビームスプリッタ６３、検出部７０および第２励起光源部８０を備える。

板状部材１０は、自家蛍光が生じ難い透明な材料（例えば石英ガラス）からなり、互いに平行な第１主面１１および第２主面１２を有する平板である。板状部材１０の第１主面１１上に、測定対象物８を複数の区画に区分するための隔壁１３が設けられている。測定対象物８は、一般に顕微鏡観察の対象となる標本であって、例えば、蛍光色素で蛍光標識された生細胞であり、隔壁１３により区分された各区画において溶液９に浸漬されていて第１主面１１近傍に位置している。第１励起光源部２０は、測定対象物８に含まれる蛍光色素を励起し得る波長の励起光を出力するものであり、好適にはレーザ光源を含む。

励起光学系３０は、第１励起光源部２０から出力された励起光を板状部材１０内に導き、板状部材１０の第１主面１１と第２主面１２との間で励起光を繰り返し全反射させて、板状部材１０の第１主面１１の複数箇所それぞれにおける全反射により励起光のエバネセント波を生じさせる。

励起光学系３０は、レンズ系３１、プリズム３２およびプリズム３３を含む。これらレンズ系３１、プリズム３２およびプリズム３３それぞれは、自家蛍光が生じ難い透明な材料（例えば石英ガラス）からなる。レンズ系３１は、第１励起光源部２０から出力された励起光を入力し、その励起光のビーム断面形状を整形してプリズム３２へ出力する。例えば、レンズ系３１は、第１励起光源部２０から出力された励起光を板状部材１０の第１主面１１に平行な方向に拡幅して出力する。

プリズム３２は、レンズ系３１から出力された励起光を板状部材１０内に導く。プリズム３２は、入射面３２１，反射面３２２および出射面３２３を有している。プリズム３２は、レンズ系３１から出力された励起光を入射面３２１に入力し、その入力した励起光を反射面３２２で反射させ、その反射させた励起光を出射面３２３から出力して、その出力した励起光を板状部材１０の第２主面１２から板状部材１０内に導く。これにより、プリズム３２は、板状部材１０の第１主面１１と第２主面１２との間で励起光を繰り返し全反射させて、板状部材１０の第１主面１１の複数箇所それぞれにおける全反射により励起光のエバネセント波を生じさせる。

プリズム３２の入射面３２１および出射面３２３それぞれには、励起光波長における反射率を低減するための低反射膜が形成されているのが好ましい。プリズム３２の反射面３２２には、励起光波長における反射率を高くするための高反射膜が形成されているのが好ましい。板状部材１０の第２主面１２とプリズム３２の出射面３２３とは互いに密着しているのが好ましく、また、板状部材１０およびプリズム３２それぞれの材料と同程度の屈折率を有するマッチングオイルが両者の間に充填されているのが好ましい。また、板状部材１０とプリズム３２とが一体化されているのも好ましい。このようにすることにより、プリズム３２は、レンズ系３１から出力された励起光を板状部材１０内に高効率に導くことができる。特に、板状部材１０とプリズム３２とが一体化されている場合には、両者のずれに因るドリフトが生じないという効果もある。

プリズム３３は、板状部材１０の第１主面１１と第２主面１２との間で繰り返し全反射した後の励起光を外部へ出力する。プリズム３３は、入射面３３１および出射面３３２を有している。プリズム３３は、板状部材１０の第２主面１２から入射面３３１に励起光を入力し、その励起光を出射面３３２から外部へ出力する。

プリズム３３の入射面３３１および出射面３３２それぞれには、励起光波長における反射率を低減するための低反射膜が形成されているのが好ましい。板状部材１０の第２主面１２とプリズム３３の入射面３３１とは互いに密着しているのが好ましく、また、板状部材１０およびプリズム３３それぞれの材料と同程度の屈折率を有するマッチングオイルが両者の間に充填されているのが好ましい。また、板状部材１０とプリズム３３とが一体化されているのも好ましい。このようにすることにより、プリズム３３は、板状部材１０の第２主面１２から出力された励起光を外部へ高効率に導くことができる。

検出用レンズ４１〜４３それぞれは、板状部材１０の第１主面１１における励起光の全反射箇所に対応して板状部材１０の第２主面１２の側に設けられ、励起光のエバネセント波により励起された測定対象物８で発生する蛍光を入力して結像する。光ファイバ５１〜５３それぞれは、石英ガラスからなり、第１端面に入力した蛍光を導波して、その蛍光を第２端面から外部へ出力する。光ファイバ５１〜５３それぞれは、１つのコアを有するものであってもよいし、複数のコアを有していてイメージを伝送することができるイメージングファイバであってもよい。検出用レンズ４１〜４３それぞれの焦点距離は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。検出用レンズ４１〜４３それぞれの焦点距離が異なっている場合、それに応じて光ファイバ５１〜５４それぞれの第１端面の位置も異なり、光学倍率を変えることができる。

光ファイバ５１は、検出用レンズ４１に対応して設けられ、第１端面５１１および第２端面５１２を有し、その第１端面５１１が検出用レンズ４１による蛍光の結像位置に配置されている。光ファイバ５２は、検出用レンズ４２に対応して設けられ、第１端面５２１および第２端面５２２を有し、その第１端面５２１が検出用レンズ４２による蛍光の結像位置に配置されている。また、光ファイバ５３は、検出用レンズ４３に対応して設けられ、第１端面５３１および第２端面５３２を有し、その第１端面５３１が検出用レンズ４３による蛍光の結像位置に配置されている。光ファイバ５１〜５３それぞれの第２端面５１２，５２２，５３２は、共通平面上に配置されている。

検出用レンズ４１は、板状部材１０の第２主面１２と光ファイバ５１の第１端面５１１との間の空間に配置されていてもよく、板状部材１０と一体化されていてもよく、別途に製造された上で板状部材１０の第２主面１２に固定されていてもよく、また、光ファイバ５１の第１端面５１１の側に固定されていてもよい。板状部材１０の第２主面１２または光ファイバ５１の第１端面５１１の側に検出用レンズ４１が固定または一体化されていれば、取扱が容易である。検出用レンズ４２，４３についても同様である。

ｆθレンズ６１は、走査光学系として作用し、その前焦点面に光ファイバ５１〜５３それぞれの第２端面が位置していて、光ファイバ５１〜５３それぞれの第２端面から出力される光を入力し、その光をコリメートしてミラー６２へ出力する。ミラー６２は、反射面の方位が可変であり、光ファイバ５１〜５３のうち選択された光ファイバの第２端面から出力されてｆθレンズ６１によりコリメートされた光を所定方向へ反射させる。ミラー６２の反射面の方位が適宜に調整されることにより、光ファイバ５１〜５３のうち何れかの光ファイバの第２端面から出力されてｆθレンズ６１によりコリメートされた光は、ミラー６２により所定方向へ反射される。

ビームスプリッタ６３は、ミラー６２により所定方向へ反射された光を検出部７０へ導き、第２励起光源部８０から出力される励起光を所定方向に沿ってミラー６２へ入射させる。ビームスプリッタ６３は、蛍光を反射させる一方で励起光を透過させるダイクロイックミラーであってもよい。検出部７０は、ミラー６２により所定方向へ反射されてビームスプリッタ６３により導かれた光を検出する。光ファイバ５１〜５３それぞれがイメージングファイバであるときには、検出部７０は、イメージングファイバ５１〜５３のうち何れかの光ファイバにより伝送された光の像を撮像する。第２励起光源部８０は、測定対象物８に含まれる蛍光色素を励起し得る波長の励起光を出力するものであり、好適にはレーザ光源を含む。

以上のように構成される本実施形態に係る蛍光測定装置１は以下のように動作する。板状部材１０の第１主面１１上に設けられた隔壁１３により区分された複数の区画それぞれにおいて、蛍光色素で蛍光標識された測定対象物８が溶液９に浸漬されて配置される。この測定対象物８に含まれる蛍光色素を励起し得る波長の励起光が第１励起光源部２０から出力される。この励起光は、レンズ系３１によりビーム断面形状が整形されて、プリズム３２の入射面３２１に入力される。

プリズム３２の入射面３２１に入力された励起光は、プリズム３２の反射面３２２により反射され、プリズム３２の出射面３２３を経て、板状部材１０の第２主面１２から板状部材１０内へ導かれる。プリズム３２から板状部材１０内へ導かれた励起光は、板状部材１０の第１主面１１と第２主面１２との間で繰り返し全反射される。そして、この繰り返し全反射した後の励起光は、板状部材１０の第２主面１２から、プリズム３３の入射面３３１および出射面３３２を経て、外部へ出力される。

板状部材１０の第１主面１１の複数箇所それぞれにおいて励起光が全反射される際に、その全反射により板状部材１０の第１主面１１の上に励起光のエバネセント波が生じる。この励起光のエバネセント波により、板状部材１０の第１主面１１の付近にある測定対象物８の部分が選択的に励起され、その励起された部分から蛍光が発生する。

励起光のエバネセント波により励起された測定対象物８で発生する蛍光は、板状部材１０の第１主面１１における全反射箇所に対応して第２主面１２の側に設けられた検出用レンズ４１〜４３により、光ファイバ５１〜５３の第１端面に結像される。測定対象物８で発生して検出用レンズ４１により光ファイバ５１の第１端面５１１に結像された蛍光は、光ファイバ５１により導波されて、光ファイバ５１の第２端面５１２から外部へ出力される。測定対象物８で発生して検出用レンズ４２により光ファイバ５２の第１端面５２１に結像された蛍光は、光ファイバ５２により導波されて、光ファイバ５３の第２端面５２２から外部へ出力される。また、測定対象物８で発生して検出用レンズ４３により光ファイバ５３の第１端面５３１に結像された蛍光は、光ファイバ５３により導波されて、光ファイバ５４の第２端面５３２から外部へ出力される。

光ファイバ５１〜５３それぞれの第２端面から出力された蛍光は、ｆθレンズ６１によりコリメートされた後、ミラー６２により反射される。ミラー６２の反射面の方位は可変であり、その方位に応じて、光ファイバ５１〜５３のうち何れかの光ファイバの第２端面から出力されてｆθレンズ６１によりコリメートされた蛍光は、ミラー６２により所定方向へ反射される。ミラー６２により所定方向へ反射された蛍光は、ビームスプリッタ６３により検出部７０へ導かれて、検出部７０により検出される。また、光ファイバ５１〜５３それぞれがイメージングファイバであるときには、イメージングファイバ５１〜５３のうち何れかの光ファイバにより伝送された蛍光の像が検出部７０により撮像される。

本実施形態では、ミラー６２の反射面の方位が適宜に調整されることにより、光ファイバ５１〜５３のうち選択された光ファイバの第２端面から出力されてｆθレンズ６１によりコリメートされた蛍光が、ミラー６２により所定方向へ反射されて、検出部７０により検出される。したがって、ミラー６２の反射面の方位が順次に変更されることにより、板状部材１０の第１主面１１における複数の全反射箇所それぞれにおいて測定対象物８で発生した蛍光は検出部７０により順次に検出される。

ここで、比較例として、測定対象物を載せた状態で透明体をステージ移動させることにより、測定対象物の複数箇所の部分で生じる蛍光を検出する場合を想定する。この比較例では、ステージ移動に時間を要することから、測定対象物の複数箇所の部分それぞれの観察タイミングが異なってしまい、測定対象物の複数箇所の部分の間で対比観察することが困難となる。また、比較例では、測定対象物である生細胞が移動により悪影響を受け、生細胞の有意な観察をすることが困難となる場合がある。

これに対して、本実施形態では、ミラー６２の反射面を変更するだけでよく、その方位変更を高速に行うことが可能であるので、励起光のエバネセント波で励起された測定対象物８の複数箇所の部分から生じる蛍光を略同一タイミングで検出することができる。また、本実施形態では、測定対象物で生細胞である場合に、その生細胞の標本が移動により悪影響を受けることがなく、生細胞の有意な観察をすることが可能となる。

さらに、本実施形態に係る蛍光測定装置１は、第２励起光源部８０を用いて以下のように動作することも可能である。すなわち、測定対象物８に含まれる蛍光色素を励起し得る波長の励起光が第２励起光源部８０から出力される。この励起光は、ビームスプリッタ６３を経て所定方向に沿ってミラー６２に入射されて該ミラー６２により反射され、ミラー６２の反射面の方位に応じて、光ファイバ５１〜５３のうち何れかの光ファイバの第２端面に入射される。したがって、光ファイバ５１〜５３のうち何れかの光ファイバにより励起光が導波され、その導波された励起光は、該光ファイバの第１端面から外部へ出力され、検出用レンズ４１〜４３のうちの該光ファイバに対応する検出用レンズにより集光されて測定対象物８に照射される。この励起光により励起された測定対象物８で発生する蛍光は、励起光の光路に対して逆方向の光路を辿ってビームスプリッタ６３に達し、ビームスプリッタ６３により検出部７０へ導かれて、検出部７０により検出される。

このように第２励起光源部８０が用いられる場合には、測定対象物８に対して励起光が集光照射され、これに伴い発生した蛍光が検出される。また、光ファイバ５１〜５３それぞれの第１端面における励起光出力位置（すなわち蛍光入力位置）と、測定対象物８における励起光集光位置（すなわち蛍光発生位置）とは、共焦点関係にある。したがって、共焦点像の取得が可能である。また、第２励起光源部８０が用いられる場合にも、ミラー６２の反射面を変更するだけでよく、その方位変更を高速に行うことが可能であるので、励起光で励起された測定対象物の複数箇所の部分から生じる蛍光を略同一タイミングで検出することができる。

なお、第１励起光源部２０および第２励起光源部８０は、同時に励起光を出力してもよく、或いは、交互に励起光を出力してもよい。また、第１励起光源部２０および第２励起光源部８０は、互いに同一の波長の励起光を出力してもよく、或いは、互いに異なる波長の励起光を出力してもよい。例えば、測定対象物８を２種類の蛍光色素で蛍光標識しておき、一方の蛍光色素を励起し得る波長λ₂₀の励起光を第１励起光源部２０から出力し、他方の蛍光色素を励起し得る波長λ₈₀の励起光を第２励起光源部８０から出力してもよい。また、このとき、第１励起光源部２０および第２励起光源部８０が互いに異なる波長λ₂₀，λ₈₀の励起光を交互に出力してもよい。このようにすることにより、測定対象物８について多様な観察が可能になる。

図２は、本実施形態に係る蛍光測定装置１において用いられる隔壁１３Ａが設けられた板状部材１０の斜視図である。この図中の隔壁１３Ａは、図１中の隔壁１３に相当するものである。この図に示される板状部材１０では、第１主面１１の上に設けられた隔壁１３Ａにより、一次元配列された３つの矩形の区画１４_１〜１４_３に測定対象物８が区分される。３つの区画１４_１〜１４_３それぞれにおいて、第１主面１１で励起光が全反射され、その全反射箇所に対応して第２主面１２の側に検出用レンズが設けられる。

図３は、本実施形態に係る蛍光測定装置１において用いられる隔壁１３Ｂが設けられた板状部材１０の斜視図である。この図中の隔壁１３Ｂは、図１中の隔壁１３に相当するものである。この図に示される板状部材１０では、第１主面１１の上に設けられた隔壁１３Ｂにより、ニ次元配列された９つの矩形の区画１４_１,１〜１４_３,３に測定対象物８が区分される。９つの区画１４_１,１〜１４_３,３それぞれにおいて、第１主面１１で励起光が全反射され、その全反射箇所に対応して第２主面１２の側に検出用レンズが設けられる。

図１〜図３に示されるように板状部材１０の第１主面１１の上に設けられた隔壁１３（１３Ａ，１３Ｂ）により測定対象物８が複数の区画に区分されることにより、以下のような観察が可能となる。複数の区画それぞれに容れられる測定対象物８は、互いに異なる種類のものであってもよく、互いに異なる条件で調整されたものであってもよく、互いに異なる蛍光色素で標識されていてもよく、また、互いに異なる溶液９に浸漬されていてもよい。例えば、図３に示されたような隔壁１３Ｂが設けられた板状部材１０が用いられる場合に、条件Ｘ_ｍで調整された測定対象物８_ｎが区画１４_ｍ,ｎに容れられてもよく、蛍光色素Ｙ_ｍで標識された測定対象物８_ｎが区画１４_ｍ,ｎに容れられてもよく、また、測定対象物８_ｎが溶液９_ｍに浸漬されて区画１４_ｍ,ｎに容れられてもよい。ただし、ｍ，ｎは１以上３以下の整数である。このようにすることにより、測定対象物８について多様な観察が可能になる。

図４は、本実施形態に係る蛍光測定装置１において用いられる第１励起光源部２０およびレンズ系３１の一構成例を示す図である。同図（ａ）は平面図であり、同図（ｂ）は側面図である。この図に示される構成例では、レンズ系３１は、ビームエキスパンダ３１１，シリンドリカルレンズ３１２およびシリンドリカルレンズ３１３を含む。ビームエキスパンダ３１１は、第１励起光源部２０から出力される励起光を入力し、その励起光のビーム径を大きくした後、その励起光をシリンドリカルレンズ３１２へ出力する。シリンドリカルレンズ３１２，３１３は、一方向についてのみ集光作用を有する。このように構成されるレンズ系３１を含む励起光学系３０は、第１励起光源部２０から出力された励起光を板状部材１０の第１主面１１に平行な方向に拡幅して、その励起光を板状部材１０内に導くことができる。また、この場合、検出用レンズは、板状部材１０の第１主面１１における各全反射箇所に対応して複数個設けられていてもよい。

図５は、本実施形態に係る蛍光測定装置１において用いられる第１励起光源部２０およびレンズ系３１の他の構成例を示す平面図である。この図に示される構成例では、第１励起光源部２０は、波長λ₂₁の励起光を出力する光源２０_１、波長λ₂₂の励起光を出力する光源２０_２、および、波長λ₂₃の励起光を出力する光源２０_３を含む。波長λ₂₁〜λ₂₃は互いに異なる。また、レンズ系３１は、光源２０_１から出力される波長λ₂₁の励起光をプリズム３２へ導くレンズ系３１_１、光源２０_２から出力される波長λ₂₂の励起光をプリズム３２へ導くレンズ系３１_２、および、光源２０_３から出力される波長λ₂₃の励起光をプリズム３２へ導くレンズ系３１_３を含む。レンズ系３１_１〜３１_３それぞれは、図４に示された構成を有していてもよい。このように構成される場合、第１励起光源部２０は複数波長の励起光を出力し、励起光学系３０は、第１励起光源部２０から出力される複数波長の励起光を板状部材１０内に導くことができる。また、この場合、検出用レンズは、板状部材１０の第１主面１１における複数波長の励起光ぞれぞれの全反射箇所に対応して設けられていてもよい。

図２，図３に示された隔壁１３Ａ，１３Ｂが設けられた板状部材１０の構成と、図４，図５に示された第１励起光源部２０およびレンズ系３１の構成とを組み合わせると、測定対象物８について更に多様な観察が可能になる。例えば、図３に示されたような隔壁１３Ｂが設けられた板状部材１０が用いられる場合に、条件Ｘ_ｍで調整された測定対象物８_ｎが区画１４_ｍ,ｎに容れられて、図４に示されるレンズ系３１により第１主面１１に平行な方向に拡幅された励起光が板状部材１０に導入されて、その励起光が第１主面１１の９つの区画１４_１,１〜１４_３,３それぞれにおいて全反射するようにしてもよい。また、図３に示されたような隔壁１３Ｂが設けられた板状部材１０が用いられる場合に、蛍光色素Ｙ_ｍで標識された測定対象物８_ｎが区画１４_ｍ,ｎに容れられて、蛍光色素Ｙ_ｍを励起し得る波長λ_ｍの蛍光が第１主面１１の区画１４_ｍ,ｎにおいて全反射するようにしてもよい。ただし、ｍ，ｎは１以上３以下の整数である。

更に、本実施形態に係る蛍光測定装置１を用いれば、以下のような観察も可能である。図６は、本実施形態に係る蛍光測定装置１の動作の一例を説明するタイミングチャートである。第１励起光源部２０は、断続的に励起光を出力する。すなわち、第１励起光源部２０から励起光が出力されている期間Ｔ１と、第１励起光源部２０から励起光が出力されていない期間Ｔ２とが、交互に存在する。

検出部７０は、第１励起光源部２０から励起光が出力されている各期間Ｔ１に、ミラー６２の反射面の方位の走査により、励起光のエバネセント波により励起された測定対象物８の複数箇所の部分から生じる蛍光を略同一タイミングで検出する。また、検出部７０は、第１励起光源部２０から励起光が出力されていない各期間Ｔ２に、ミラー６２の反射面の方位の走査により、測定対象物８の複数箇所の部分から生じる化学発光を検出する。この場合における測定対象物８は、励起光照射により蛍光を発するとともに、化学発光をも発するものであって、例えば、カルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ-３で処理され更に化学発光試薬ＣＬＡが添加された細胞である。

化学発光を検出する為の光学系は、蛍光を検出する為の光学系と共通である。光ファイバ５１〜５３それぞれの第１端面位置と測定対象物８における観察位置とが共焦点関係にあることから、測定対象物８における共通の観察位置で発生する蛍光および化学発光を検出することができる。また、ミラー６２の反射面の方位変更を高速に行うことが可能であるので、励起光のエバネセント波で励起された測定対象物８の複数箇所の部分から生じる蛍光を略同一タイミングで検出することができるだけでなく、これら測定対象物８の複数箇所の部分から生じる化学発光をも略同一タイミングで検出することができる。

本実施形態に係る蛍光測定装置１の構成図である。本実施形態に係る蛍光測定装置１において用いられる隔壁１３Ａが設けられた板状部材１０の斜視図である。本実施形態に係る蛍光測定装置１において用いられる隔壁１３Ｂが設けられた板状部材１０の斜視図である。本実施形態に係る蛍光測定装置１において用いられる第１励起光源部２０およびレンズ系３１の一構成例を示す図である。本実施形態に係る蛍光測定装置１において用いられる第１励起光源部２０およびレンズ系３１の他の構成例を示す平面図である。本実施形態に係る蛍光測定装置１の動作の一例を説明するタイミングチャートである。

符号の説明

１…蛍光測定装置、１０…板状部材、１１…第１主面、１２…第２主面、１３…隔壁、２０…第１励起光源部、３０…励起光学系、３１…レンズ系、３２…プリズム、３３…プリズム、４１〜４３…検出用レンズ、５１〜５３…光ファイバ、６１…ｆθレンズ、６２…ミラー、６３…ビームスプリッタ、７０…検出部、８０…第２励起光源部。

Claims

互いに対向する第１主面および第２主面を有し、前記第１主面上に測定対象物が配置される板状部材と、
励起光を出力する第１励起光源部と、
前記第１励起光源部から出力された励起光を前記板状部材内に導き、前記板状部材の前記第１主面と前記第２主面との間で前記励起光を繰り返し全反射させて、前記板状部材の前記第１主面の複数箇所それぞれにおける前記励起光の全反射により前記励起光のエバネセント波を生じさせる励起光学系と、
前記板状部材の前記第１主面における全反射箇所に対応して前記板状部材の前記第２主面の側に設けられ、前記励起光のエバネセント波により励起された前記測定対象物で発生する蛍光を入力して結像する複数の検出用レンズと、
前記複数の検出用レンズそれぞれに対応して設けられ、各々の第１端面が前記検出用レンズによる前記蛍光の結像位置に配置され、各々の第２端面が共通平面上に配置されている複数の光ファイバと、
前記複数の光ファイバそれぞれの前記第２端面から出力される光を入力し、その光をコリメートして出力する走査光学系と、
反射面の方位が可変であり、前記複数の光ファイバのうち選択された光ファイバの前記第２端面から出力されて前記走査光学系によりコリメートされた光を所定方向へ反射させるミラーと、
前記ミラーにより前記所定方向へ反射された光を検出する検出部と、
を備えることを特徴とする蛍光測定装置。
前記複数の光ファイバそれぞれはイメージングファイバであり、
前記検出部は該イメージングファイバにより伝送された光の像を撮像する、
ことを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
前記板状部材の前記第１主面上に前記測定対象物を複数の区画に区分するための隔壁が設けられ、これら複数の区画それぞれにおいて前記第１主面における励起光の全反射箇所が存在する、ことを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
励起光を出力する第２励起光源部と、
前記ミラーにより前記所定方向へ反射された光を前記検出部へ導き、前記第２励起光源部から出力される励起光を前記所定方向に沿って前記ミラーへ入射させるビームスプリッタと、
を更に備えることを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
前記励起光学系は、前記第１励起光源部から出力された励起光を前記板状部材の前記第１主面に平行な方向に拡幅して、その励起光を前記板状部材内に導き、
前記検出用レンズは、前記板状部材の前記第１主面における各全反射箇所に対して複数個設けられている、
ことを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
前記第１励起光源部は、複数波長の励起光を出力し、
前記励起光学系は、前記第１励起光源部から出力された複数波長の励起光を前記板状部材内に導き、
前記検出用レンズは、前記板状部材の前記第１主面における前記複数波長の励起光ぞれぞれの全反射箇所に対応して設けられている、
ことを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。
前記第１励起光源部は、断続的に励起光を出力し、
前記検出部は、前記第１励起光源部から励起光が出力されているときに前記測定対象物で発生する蛍光を検出し、前記第１励起光源部から励起光が出力されていないときに前記測定対象物で発生する他の光を検出する、
ことを特徴とする請求項１記載の蛍光測定装置。