JP2000131234A - 化学発光および蛍光の同時測定装置および方法 - Google Patents
化学発光および蛍光の同時測定装置および方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 化学発光および蛍光それぞれを略同時に実時
間で測定することができる装置および方法を提供する。 【解決手段】 励起光源１１から出力された励起光は、
光ファイバ１２、ＮＤフィルタ１３、チョッパ１４およ
びシャッタ１５を順次経て、サンプルホルダ１に容れら
れた被測定試料にパルス的に照射される。被測定試料で
発生した化学発光は、レンズ２１、ダイクロイックミラ
ー２２、フィルタ２３、レンズ２４およびシャッタ２５
を順次経て、光電子増倍管２６により検出される。被測
定試料で発生した蛍光は、レンズ２１、ダイクロイック
ミラー２２、レンズ３１、フィルタ３２およびモノクロ
メータ３３を順次経て、光電子増倍管３４により検出さ
れる。フォトンカウンタ４２により、励起光が被測定試
料に照射されていないときの化学発光の光子数が計数さ
れ、励起光が被測定試料に照射されているときの蛍光の
光子数が計数される。
間で測定することができる装置および方法を提供する。 【解決手段】 励起光源１１から出力された励起光は、
光ファイバ１２、ＮＤフィルタ１３、チョッパ１４およ
びシャッタ１５を順次経て、サンプルホルダ１に容れら
れた被測定試料にパルス的に照射される。被測定試料で
発生した化学発光は、レンズ２１、ダイクロイックミラ
ー２２、フィルタ２３、レンズ２４およびシャッタ２５
を順次経て、光電子増倍管２６により検出される。被測
定試料で発生した蛍光は、レンズ２１、ダイクロイック
ミラー２２、レンズ３１、フィルタ３２およびモノクロ
メータ３３を順次経て、光電子増倍管３４により検出さ
れる。フォトンカウンタ４２により、励起光が被測定試
料に照射されていないときの化学発光の光子数が計数さ
れ、励起光が被測定試料に照射されているときの蛍光の
光子数が計数される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、被測定試料におけ
る化学反応に伴い発生する化学発光と、その被測定試料
への励起光の照射に伴い発生する蛍光とを、略同時に測
定する測定装置および測定方法に関するものである。
る化学反応に伴い発生する化学発光と、その被測定試料
への励起光の照射に伴い発生する蛍光とを、略同時に測
定する測定装置および測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】白血球の一種であるヒト好中球により産
生されるスーパーオキサイド（Ｏ2 -）は、人体に侵入し
た細菌やウイルス等を殺傷するものであり、生体防御に
おいて重要な役割を担っている。このスーパーオキサイ
ドの産生には、好中球細胞内のカルシウムが関与してい
ると考えられているが、このカルシウムの役割について
は不明な点が多い。しかし、スーパーオキサイド産生機
能を欠いた慢性肉芽腫症患者の好中球は、好中球遊走性
ペプチドｆＭＬＰ（formyl-methionyl-leucyl-phenylal
anine ）により刺激されても細胞膜の脱分極が観察され
ないという特徴がある。このことは、同患者の好中球が
細胞外液中のカルシウムを細胞内に動員することができ
ないことを意味しており、好中球がスーパーオキサイド
産生に必要な細胞内カルシウム濃度上昇を得ることがで
きないと考えられている。
生されるスーパーオキサイド（Ｏ2 -）は、人体に侵入し
た細菌やウイルス等を殺傷するものであり、生体防御に
おいて重要な役割を担っている。このスーパーオキサイ
ドの産生には、好中球細胞内のカルシウムが関与してい
ると考えられているが、このカルシウムの役割について
は不明な点が多い。しかし、スーパーオキサイド産生機
能を欠いた慢性肉芽腫症患者の好中球は、好中球遊走性
ペプチドｆＭＬＰ（formyl-methionyl-leucyl-phenylal
anine ）により刺激されても細胞膜の脱分極が観察され
ないという特徴がある。このことは、同患者の好中球が
細胞外液中のカルシウムを細胞内に動員することができ
ないことを意味しており、好中球がスーパーオキサイド
産生に必要な細胞内カルシウム濃度上昇を得ることがで
きないと考えられている。
【０００３】ここで、好中球遊走性ペプチドｆＭＬＰ
は、好中球細胞表面上のｆＭＬＰ受容体に特異的に結合
し、細胞内カルシウム濃度を高めるような刺激を伝達さ
せるものであり、このカルシウム応答から幾つかの細胞
機能（その１つがスーパーオキサイド産生）の発現に向
けて細胞内で更に刺激が伝達される。また、慢性肉芽腫
症（ＣＧＤ： Chronic Granulomatous Disease）は感染
細菌が人体内で殺傷されずに留まることから、その患者
は、非常に細菌感染症にかかり易い状態にあり、細菌を
殺傷できない好中球の死骸が膿として蓄積したような症
状が多くの組織で見られる。
は、好中球細胞表面上のｆＭＬＰ受容体に特異的に結合
し、細胞内カルシウム濃度を高めるような刺激を伝達さ
せるものであり、このカルシウム応答から幾つかの細胞
機能（その１つがスーパーオキサイド産生）の発現に向
けて細胞内で更に刺激が伝達される。また、慢性肉芽腫
症（ＣＧＤ： Chronic Granulomatous Disease）は感染
細菌が人体内で殺傷されずに留まることから、その患者
は、非常に細菌感染症にかかり易い状態にあり、細菌を
殺傷できない好中球の死骸が膿として蓄積したような症
状が多くの組織で見られる。
【０００４】このスーパーオキサイド産生を担う細胞内
カルシウム濃度上昇の実体が解明されれば、慢性肉芽腫
症患者の治療につながる新たな細胞機能診断法が確立さ
れるものと期待される。ところで、スーパーオキサイド
産生の測定は、例えば、好中球における化学反応に伴い
発生する化学発光を検出することにより可能である。ま
た、細胞内カルシウム濃度変化の測定は、例えば、好中
球にカルシウム蛍光指示薬を予め導入しておき、これに
励起光を照射して発生した蛍光を検出することにより可
能である。
カルシウム濃度上昇の実体が解明されれば、慢性肉芽腫
症患者の治療につながる新たな細胞機能診断法が確立さ
れるものと期待される。ところで、スーパーオキサイド
産生の測定は、例えば、好中球における化学反応に伴い
発生する化学発光を検出することにより可能である。ま
た、細胞内カルシウム濃度変化の測定は、例えば、好中
球にカルシウム蛍光指示薬を予め導入しておき、これに
励起光を照射して発生した蛍光を検出することにより可
能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、化学発
光および蛍光それぞれを個別に検出する従来の技術で
は、スーパーオキサイド産生を担う細胞内カルシウム濃
度上昇の実体を解明することは困難である。すなわち、
同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれを同時
に実時間で検出することができないので、スーパーオキ
サイド産生と細胞内カルシウム濃度変化との間の微妙な
関係を検出することができない。
光および蛍光それぞれを個別に検出する従来の技術で
は、スーパーオキサイド産生を担う細胞内カルシウム濃
度上昇の実体を解明することは困難である。すなわち、
同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれを同時
に実時間で検出することができないので、スーパーオキ
サイド産生と細胞内カルシウム濃度変化との間の微妙な
関係を検出することができない。
【０００６】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、化学発光および蛍光それぞれを略同時
に実時間で測定することができる装置および方法を提供
することを目的とする。
れたものであり、化学発光および蛍光それぞれを略同時
に実時間で測定することができる装置および方法を提供
することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明に係る化学発光お
よび蛍光の同時測定装置は、(1) 被測定試料に励起光を
パルス的に照射する励起手段と、(2) 励起手段により励
起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試料
で発生した化学発光を検出する化学発光検出手段と、
(3) 励起手段により励起光が被測定試料に照射されてい
るときに被測定試料で発生した蛍光を検出する蛍光検出
手段と、を備えることを特徴とする。
よび蛍光の同時測定装置は、(1) 被測定試料に励起光を
パルス的に照射する励起手段と、(2) 励起手段により励
起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試料
で発生した化学発光を検出する化学発光検出手段と、
(3) 励起手段により励起光が被測定試料に照射されてい
るときに被測定試料で発生した蛍光を検出する蛍光検出
手段と、を備えることを特徴とする。
【０００８】この装置によれば、被測定試料は、励起手
段により励起光がパルス的に照射される。励起手段によ
り励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定
試料で発生した化学発光は、化学発光検出手段により検
出される。一方、励起手段により励起光が被測定試料に
照射されているときに被測定試料で発生した蛍光は、蛍
光検出手段により検出される。したがって、同一試料で
発生した化学発光および蛍光それぞれは略同時に実時間
で検出される。
段により励起光がパルス的に照射される。励起手段によ
り励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定
試料で発生した化学発光は、化学発光検出手段により検
出される。一方、励起手段により励起光が被測定試料に
照射されているときに被測定試料で発生した蛍光は、蛍
光検出手段により検出される。したがって、同一試料で
発生した化学発光および蛍光それぞれは略同時に実時間
で検出される。
【０００９】また、本発明に係る化学発光および蛍光の
同時測定装置は、被測定試料の温度を制御する温度制御
手段を更に備えることを特徴とする。この場合には、被
測定試料の温度は温度制御手段により制御されるので、
例えば被測定試料が細胞である場合に好適である。
同時測定装置は、被測定試料の温度を制御する温度制御
手段を更に備えることを特徴とする。この場合には、被
測定試料の温度は温度制御手段により制御されるので、
例えば被測定試料が細胞である場合に好適である。
【００１０】また、本発明に係る化学発光および蛍光の
同時測定装置は、被測定試料が液体であって、その被測
定試料を攪拌する攪拌手段を更に備えることを特徴とす
る。この場合には、被測定試料は攪拌手段により攪拌さ
れるので、被測定試料が懸濁液である場合に好適であ
る。
同時測定装置は、被測定試料が液体であって、その被測
定試料を攪拌する攪拌手段を更に備えることを特徴とす
る。この場合には、被測定試料は攪拌手段により攪拌さ
れるので、被測定試料が懸濁液である場合に好適であ
る。
【００１１】本発明に係る化学発光および蛍光の同時測
定方法は、被測定試料に励起光をパルス的に照射して、
励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試
料で発生した化学発光を検出し、励起光が被測定試料に
照射されているときに被測定試料で発生した蛍光を検出
する、ことを特徴とする。この方法によれば、同一試料
で発生した化学発光および蛍光それぞれは略同時に実時
間で検出される。
定方法は、被測定試料に励起光をパルス的に照射して、
励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試
料で発生した化学発光を検出し、励起光が被測定試料に
照射されているときに被測定試料で発生した蛍光を検出
する、ことを特徴とする。この方法によれば、同一試料
で発生した化学発光および蛍光それぞれは略同時に実時
間で検出される。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。
【００１３】先ず、本発明に係る化学発光および蛍光の
同時測定装置の実施形態について説明する。図１は、本
実施形態に係る化学発光および蛍光の同時測定装置の構
成図である。
同時測定装置の実施形態について説明する。図１は、本
実施形態に係る化学発光および蛍光の同時測定装置の構
成図である。
【００１４】被測定試料を容れるサンプルホルダ１は、
サーモバス２と配管３，４を介して接続されており、被
測定試料の温度を所定温度に制御することができる。ま
た、サンプルホルダ１は、被測定試料を攪拌するマグネ
ティックスターラを備えている。このマグネティックス
ターラは、マグネティックスターラコントローラ５によ
り制御される。また、サンプルホルダ１は、被測定試料
や試薬を導入するためのサンプルディスペンサ６と接続
されている。
サーモバス２と配管３，４を介して接続されており、被
測定試料の温度を所定温度に制御することができる。ま
た、サンプルホルダ１は、被測定試料を攪拌するマグネ
ティックスターラを備えている。このマグネティックス
ターラは、マグネティックスターラコントローラ５によ
り制御される。また、サンプルホルダ１は、被測定試料
や試薬を導入するためのサンプルディスペンサ６と接続
されている。
【００１５】サンプルホルダ１に容れられた被測定試料
に励起光をパルス的に照射する励起手段は、励起光源１
１、光ファイバ１２、ＮＤフィルタ１３、チョッパ１
４、シャッタ１５、チョッパコントローラ１６およびシ
ャッタコントローラ１７を備えている。励起光源１１
は、励起光を出力するものであり、光ファイバ１２は、
その励起光源１１から出力された励起光をＮＤフィルタ
１３へ導く。ＮＤフィルタ１３は、被測定試料に照射さ
れる励起光の強度を調整する。チョッパ１４は、チョッ
パコントローラ１６により制御されて回転し、ＮＤフィ
ルタ１３を透過した励起光の通過／遮断の制御を行い、
励起光を被測定試料にパルス的に照射するためのもので
ある。シャッタ１５は、シャッタコントローラ１７によ
り制御されて開閉し、開いているときに励起光を被測定
試料にパルス的に照射する。
に励起光をパルス的に照射する励起手段は、励起光源１
１、光ファイバ１２、ＮＤフィルタ１３、チョッパ１
４、シャッタ１５、チョッパコントローラ１６およびシ
ャッタコントローラ１７を備えている。励起光源１１
は、励起光を出力するものであり、光ファイバ１２は、
その励起光源１１から出力された励起光をＮＤフィルタ
１３へ導く。ＮＤフィルタ１３は、被測定試料に照射さ
れる励起光の強度を調整する。チョッパ１４は、チョッ
パコントローラ１６により制御されて回転し、ＮＤフィ
ルタ１３を透過した励起光の通過／遮断の制御を行い、
励起光を被測定試料にパルス的に照射するためのもので
ある。シャッタ１５は、シャッタコントローラ１７によ
り制御されて開閉し、開いているときに励起光を被測定
試料にパルス的に照射する。
【００１６】サンプルホルダ１に容れられた被測定試料
で発生した化学発光を検出する化学発光検出手段は、レ
ンズ２１、ダイクロイックミラー２２、フィルタ２３、
レンズ２４、シャッタ２５、光電子増倍管２６、シャッ
タコントローラ２７および高電圧電源２８を備えてい
る。レンズ２１およびレンズ２４は、被測定試料で発生
した化学発光を光電子増倍管２６の受光面に集光する。
ダイクロイックミラー２２は、被測定試料で発生した化
学発光を反射させるとともに、被測定試料で発生した蛍
光を透過させる。フィルタ２３は、化学発光の波長成分
を選択的に透過させる。シャッタ２５は、シャッタコン
トローラ２７により制御されて開閉し、開いているとき
に化学発光を光電子増倍管２６の受光面に入射させる。
光電子増倍管２６は、高電圧電源２８から供給された高
電圧により駆動され、受光面に入射した化学発光の強度
に応じた化学発光検出信号を出力する。
で発生した化学発光を検出する化学発光検出手段は、レ
ンズ２１、ダイクロイックミラー２２、フィルタ２３、
レンズ２４、シャッタ２５、光電子増倍管２６、シャッ
タコントローラ２７および高電圧電源２８を備えてい
る。レンズ２１およびレンズ２４は、被測定試料で発生
した化学発光を光電子増倍管２６の受光面に集光する。
ダイクロイックミラー２２は、被測定試料で発生した化
学発光を反射させるとともに、被測定試料で発生した蛍
光を透過させる。フィルタ２３は、化学発光の波長成分
を選択的に透過させる。シャッタ２５は、シャッタコン
トローラ２７により制御されて開閉し、開いているとき
に化学発光を光電子増倍管２６の受光面に入射させる。
光電子増倍管２６は、高電圧電源２８から供給された高
電圧により駆動され、受光面に入射した化学発光の強度
に応じた化学発光検出信号を出力する。
【００１７】サンプルホルダ１に容れられた被測定試料
で発生した蛍光を検出する蛍光検出手段は、レンズ２
１、ダイクロイックミラー２２、レンズ３１、フィルタ
３２、モノクロメータ３３、光電子増倍管３４および高
電圧電源３５を備えている。レンズ２１およびレンズ３
１は、被測定試料で発生した蛍光をモノクロメータ３３
の入力開口部に集光する。フィルタ３２は、励起光の波
長成分を遮断するとともに、蛍光の波長成分を選択的に
透過させる。モノクロメータ３３は、入力した蛍光を分
光して、所望の波長成分のみを出力する。光電子増倍管
３４は、高電圧電源３５から供給された高電圧により駆
動され、モノクロメータ３３から出力された蛍光の強度
に応じた蛍光検出信号を出力する。
で発生した蛍光を検出する蛍光検出手段は、レンズ２
１、ダイクロイックミラー２２、レンズ３１、フィルタ
３２、モノクロメータ３３、光電子増倍管３４および高
電圧電源３５を備えている。レンズ２１およびレンズ３
１は、被測定試料で発生した蛍光をモノクロメータ３３
の入力開口部に集光する。フィルタ３２は、励起光の波
長成分を遮断するとともに、蛍光の波長成分を選択的に
透過させる。モノクロメータ３３は、入力した蛍光を分
光して、所望の波長成分のみを出力する。光電子増倍管
３４は、高電圧電源３５から供給された高電圧により駆
動され、モノクロメータ３３から出力された蛍光の強度
に応じた蛍光検出信号を出力する。
【００１８】アンプ４１は、光電子増倍管２６から出力
された化学発光検出信号を増幅するとともに、光電子増
倍管３４から出力された蛍光検出信号をも増幅する。フ
ォトンカウンタ４２は、アンプ４１により増幅されて出
力された化学発光検出信号および蛍光検出信号それぞれ
を入力し、また、チョッパコントローラ１６による励起
光の通過／遮断の制御信号を入力する。そして、フォト
ンカウンタ４２は、これらの信号に基づいて、励起光が
被測定試料に照射されていないときに光電子増倍管２６
が検出した化学発光の光子数を計数し、励起光が被測定
試料に照射されているときに光電子増倍管３４が検出し
た蛍光の光子数を計数する。コンピュータ４３は、フォ
トンカウンタ４２により計数された化学発光の光子数お
よび蛍光の光子数に基づいて被測定試料の解析を行う。
された化学発光検出信号を増幅するとともに、光電子増
倍管３４から出力された蛍光検出信号をも増幅する。フ
ォトンカウンタ４２は、アンプ４１により増幅されて出
力された化学発光検出信号および蛍光検出信号それぞれ
を入力し、また、チョッパコントローラ１６による励起
光の通過／遮断の制御信号を入力する。そして、フォト
ンカウンタ４２は、これらの信号に基づいて、励起光が
被測定試料に照射されていないときに光電子増倍管２６
が検出した化学発光の光子数を計数し、励起光が被測定
試料に照射されているときに光電子増倍管３４が検出し
た蛍光の光子数を計数する。コンピュータ４３は、フォ
トンカウンタ４２により計数された化学発光の光子数お
よび蛍光の光子数に基づいて被測定試料の解析を行う。
【００１９】なお、励起手段におけるシャッタ１５から
サンプルホルダ１に到る光学系、化学発光検出手段にお
けるサンプルホルダ１から光電子増倍管２６に到る光学
系、および、蛍光検出手段におけるサンプルホルダ１か
ら光電子増倍管３４に到る光学系は、暗箱５１内に収め
られている。
サンプルホルダ１に到る光学系、化学発光検出手段にお
けるサンプルホルダ１から光電子増倍管２６に到る光学
系、および、蛍光検出手段におけるサンプルホルダ１か
ら光電子増倍管３４に到る光学系は、暗箱５１内に収め
られている。
【００２０】次に、本実施形態に係る化学発光および蛍
光の同時測定装置の動作を説明するとともに、本実施形
態に係る化学発光および蛍光の同時測定方法についても
説明する。また、以下の説明では具体的な実施例として
被測定試料がヒト好中球様細胞である場合について説明
する。ここで、ヒト好中球様細胞は、ヒト単球系株細胞
ＴＨＰ−１を０．５ｍＭのＢｔ2cＡＭＰ（ジブチリル環
状アデノシンリン酸）を含む１０％血清入りＲＰＭＩme
diumで細胞密度を３×１０5 細胞／ｍｌに合わせ、これ
を３日間３７℃で５％ＣＯ2 存在下で培養したものであ
る。
光の同時測定装置の動作を説明するとともに、本実施形
態に係る化学発光および蛍光の同時測定方法についても
説明する。また、以下の説明では具体的な実施例として
被測定試料がヒト好中球様細胞である場合について説明
する。ここで、ヒト好中球様細胞は、ヒト単球系株細胞
ＴＨＰ−１を０．５ｍＭのＢｔ2cＡＭＰ（ジブチリル環
状アデノシンリン酸）を含む１０％血清入りＲＰＭＩme
diumで細胞密度を３×１０5 細胞／ｍｌに合わせ、これ
を３日間３７℃で５％ＣＯ2 存在下で培養したものであ
る。
【００２１】被測定試料である好中球様細胞は、予め、
カルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３（1-[2-amino-5-(2,
7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl)phenoxyl]-2
-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraac
etic acid ）で処理され、また、化学発光試薬ＣＬＡ
（ウミホタルルシフェリン誘導体、2-methyl-6-phenyl-
3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-3-one）が添加され
て、懸濁液とされる。この被測定試料は、石英セルに容
れられてサンプルホルダ１にセットされる。サンプルホ
ルダ１にセットされた被測定試料は、サーモバス２によ
り一定温度３７℃に維持され、マグネティックスターラ
コントローラ５により制御されたマグネティックスター
ラにより攪拌される。
カルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３（1-[2-amino-5-(2,
7-dichloro-6-hydroxy-3-oxy-9-xanthenyl)phenoxyl]-2
-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraac
etic acid ）で処理され、また、化学発光試薬ＣＬＡ
（ウミホタルルシフェリン誘導体、2-methyl-6-phenyl-
3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-3-one）が添加され
て、懸濁液とされる。この被測定試料は、石英セルに容
れられてサンプルホルダ１にセットされる。サンプルホ
ルダ１にセットされた被測定試料は、サーモバス２によ
り一定温度３７℃に維持され、マグネティックスターラ
コントローラ５により制御されたマグネティックスター
ラにより攪拌される。
【００２２】以上の測定準備が終了すると、チョッパ１
４はチョッパコントローラ１６により制御されて一定速
度で回転し、シャッタ１５はシャッタコントローラ１７
により制御されて開く。チョッパ１４による励起光の通
過／遮断の周期は、例えばミリ秒程度である。
４はチョッパコントローラ１６により制御されて一定速
度で回転し、シャッタ１５はシャッタコントローラ１７
により制御されて開く。チョッパ１４による励起光の通
過／遮断の周期は、例えばミリ秒程度である。
【００２３】励起光源１１から出力された励起光は、光
ファイバ１２を経てＮＤフィルタ１３に入射し、ＮＤフ
ィルタ１３により光量が調整され、チョッパ１４に入射
する。そして、チョッパ１４に入射した励起光は、チョ
ッパ１４により通過／遮断の制御を受け、シャッタ１５
を通過して、サンプルホルダ１に容れられた被測定試料
にパルス的に照射される。励起光源１１は、波長４８８
ｎｍのレーザ光を出力するアルゴンレーザ光源が用いら
れる。
ファイバ１２を経てＮＤフィルタ１３に入射し、ＮＤフ
ィルタ１３により光量が調整され、チョッパ１４に入射
する。そして、チョッパ１４に入射した励起光は、チョ
ッパ１４により通過／遮断の制御を受け、シャッタ１５
を通過して、サンプルホルダ１に容れられた被測定試料
にパルス的に照射される。励起光源１１は、波長４８８
ｎｍのレーザ光を出力するアルゴンレーザ光源が用いら
れる。
【００２４】被測定試料で発生した化学発光は、レンズ
２１およびレンズ２４により集光され、ダイクロイック
ミラー２２により反射され、フィルタ２３およびシャッ
タ２５を通過し、光電子増倍管２６の受光面に入射す
る。光電子増倍管２６からは、受光面に入射した化学発
光の強度に応じた化学発光検出信号が出力される。この
化学発光は、スーパーオキサイドと化学発光試薬ＣＬＡ
とが化学反応してＣＬＡ酸化物が生成される際に発生す
る化学発光である。すなわち、化学発光強度は、スーパ
ーオキサイド産生量を表している。
２１およびレンズ２４により集光され、ダイクロイック
ミラー２２により反射され、フィルタ２３およびシャッ
タ２５を通過し、光電子増倍管２６の受光面に入射す
る。光電子増倍管２６からは、受光面に入射した化学発
光の強度に応じた化学発光検出信号が出力される。この
化学発光は、スーパーオキサイドと化学発光試薬ＣＬＡ
とが化学反応してＣＬＡ酸化物が生成される際に発生す
る化学発光である。すなわち、化学発光強度は、スーパ
ーオキサイド産生量を表している。
【００２５】一方、被測定試料で発生した蛍光は、レン
ズ２１およびレンズ３１により集光され、ダイクロイッ
クミラー２２およびフィルタ３２を透過し、モノクロメ
ータ３３により分光されて所望の波長成分のみが出力さ
れ、その所望の波長成分のみが光電子増倍管３４の受光
面に入射する。光電子増倍管３４からは、モノクロメー
タ３３から出力された蛍光の強度に応じた蛍光検出信号
が出力される。この蛍光は、好中球様細胞内の遊離カル
シウムイオンとカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３とが
結合して生成された錯体に励起光が照射されて発生する
蛍光である。すなわち、蛍光強度は、好中球様細胞内の
遊離カルシウムイオンの濃度を表している。なお、励起
光の散乱光は、ダイクロイックミラー２２、フィルタ３
２およびモノクロメータ３３それぞれにより遮断される
ので、光電子増倍管３４の受光面に入射することはな
い。
ズ２１およびレンズ３１により集光され、ダイクロイッ
クミラー２２およびフィルタ３２を透過し、モノクロメ
ータ３３により分光されて所望の波長成分のみが出力さ
れ、その所望の波長成分のみが光電子増倍管３４の受光
面に入射する。光電子増倍管３４からは、モノクロメー
タ３３から出力された蛍光の強度に応じた蛍光検出信号
が出力される。この蛍光は、好中球様細胞内の遊離カル
シウムイオンとカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３とが
結合して生成された錯体に励起光が照射されて発生する
蛍光である。すなわち、蛍光強度は、好中球様細胞内の
遊離カルシウムイオンの濃度を表している。なお、励起
光の散乱光は、ダイクロイックミラー２２、フィルタ３
２およびモノクロメータ３３それぞれにより遮断される
ので、光電子増倍管３４の受光面に入射することはな
い。
【００２６】光電子増倍管２６から出力された化学発光
検出信号、および、光電子増倍管３４から出力された蛍
光検出信号それぞれは、アンプ４１に入力し、アンプ４
１により増幅される。アンプ４１により増幅されて出力
された化学発光検出信号および蛍光検出信号それぞれ
は、フォトンカウンタ４２に入力する。また、チョッパ
コントローラ１６による励起光の通過／遮断の制御信号
も、フォトンカウンタ４２に入力する。そして、フォト
ンカウンタ４２により、励起光が被測定試料に照射され
ていないときに光電子増倍管２６が検出した化学発光の
光子数が計数され、励起光が被測定試料に照射されてい
るときに光電子増倍管３４が検出した蛍光の光子数が計
数される。
検出信号、および、光電子増倍管３４から出力された蛍
光検出信号それぞれは、アンプ４１に入力し、アンプ４
１により増幅される。アンプ４１により増幅されて出力
された化学発光検出信号および蛍光検出信号それぞれ
は、フォトンカウンタ４２に入力する。また、チョッパ
コントローラ１６による励起光の通過／遮断の制御信号
も、フォトンカウンタ４２に入力する。そして、フォト
ンカウンタ４２により、励起光が被測定試料に照射され
ていないときに光電子増倍管２６が検出した化学発光の
光子数が計数され、励起光が被測定試料に照射されてい
るときに光電子増倍管３４が検出した蛍光の光子数が計
数される。
【００２７】以上のように励起光照射、化学発光検出お
よび蛍光検出を行いながら、サンプルディスペンサ６よ
り刺激薬が被測定試料（好中球様細胞）へ滴下される。
刺激薬として例えば好中球遊走性ペプチドｆＭＬＰが用
いられる。そして、コンピュータ４３により、刺激薬の
被測定試料への滴下、化学発光強度（スーパーオキサイ
ド産生量）および蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）の
間の因果関係や時間的関係が解析される。
よび蛍光検出を行いながら、サンプルディスペンサ６よ
り刺激薬が被測定試料（好中球様細胞）へ滴下される。
刺激薬として例えば好中球遊走性ペプチドｆＭＬＰが用
いられる。そして、コンピュータ４３により、刺激薬の
被測定試料への滴下、化学発光強度（スーパーオキサイ
ド産生量）および蛍光強度（細胞内カルシウム濃度）の
間の因果関係や時間的関係が解析される。
【００２８】図２は、化学発光および蛍光の同時測定の
結果を示すグラフである。このグラフには、化学発光強
度（スーパーオキサイド産生量）および蛍光強度（細胞
内カルシウム濃度）が示されている。被測定試料は、上
述したようなカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３で処理
され化学発光試薬ＣＬＡが添加された好中球様細胞を、
１ｍＭの細胞外カルシウム溶液内に容れて懸濁液とした
ものである。測定開始後の１５０秒の時点で１μＭのｆ
ＭＬＰで被測定試料を刺激した。
結果を示すグラフである。このグラフには、化学発光強
度（スーパーオキサイド産生量）および蛍光強度（細胞
内カルシウム濃度）が示されている。被測定試料は、上
述したようなカルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３で処理
され化学発光試薬ＣＬＡが添加された好中球様細胞を、
１ｍＭの細胞外カルシウム溶液内に容れて懸濁液とした
ものである。測定開始後の１５０秒の時点で１μＭのｆ
ＭＬＰで被測定試料を刺激した。
【００２９】このグラフから判るように、ｆＭＬＰで被
測定試料が刺激されると、直ちに蛍光強度が上昇し、そ
の後に数秒遅れて、化学発光強度が上昇している。この
ことから、ｆＭＬＰ刺激により、細胞内カルシウム濃度
が直ちに上昇し、その後に数秒遅れてスーパーオキサイ
ドが産生されることが確認された。
測定試料が刺激されると、直ちに蛍光強度が上昇し、そ
の後に数秒遅れて、化学発光強度が上昇している。この
ことから、ｆＭＬＰ刺激により、細胞内カルシウム濃度
が直ちに上昇し、その後に数秒遅れてスーパーオキサイ
ドが産生されることが確認された。
【００３０】図３は、化学発光および蛍光それぞれを単
独で測定した結果を示すグラフである。同図（ａ）は、
カルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３で負荷をかけない好
中球様細胞を１ｍＭの細胞外カルシウム存在下で１μＭ
のｆＭＬＰで刺激して、本実施形態に係る測定装置およ
び測定方法により測定した結果を示す。このグラフから
判るように、ｆＭＬＰ刺激が与えられたときに、蛍光強
度（すなわち、細胞内カルシウム濃度）の変化は無い
が、化学発光強度（すなわち、スーパーオキサイド産生
量）の変化は図２と同様の変化を示した。
独で測定した結果を示すグラフである。同図（ａ）は、
カルシウム蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３で負荷をかけない好
中球様細胞を１ｍＭの細胞外カルシウム存在下で１μＭ
のｆＭＬＰで刺激して、本実施形態に係る測定装置およ
び測定方法により測定した結果を示す。このグラフから
判るように、ｆＭＬＰ刺激が与えられたときに、蛍光強
度（すなわち、細胞内カルシウム濃度）の変化は無い
が、化学発光強度（すなわち、スーパーオキサイド産生
量）の変化は図２と同様の変化を示した。
【００３１】一方、同図（ｂ）は、カルシウム蛍光指示
薬ｆｌｕｏ−３で負荷をかけた好中球様細胞を化学発光
試薬ＣＬＡ非存在下で１μＭのｆＭＬＰで刺激して、本
実施形態に係る測定装置および測定方法により測定した
結果を示す。このグラフから判るように、ｆＭＬＰ刺激
が与えられたときに、化学発光強度（すなわち、スーパ
ーオキサイド産生量）の変化は無いが、蛍光強度（すな
わち、細胞内カルシウム濃度）の変化は図２と同様の変
化を示した。
薬ｆｌｕｏ−３で負荷をかけた好中球様細胞を化学発光
試薬ＣＬＡ非存在下で１μＭのｆＭＬＰで刺激して、本
実施形態に係る測定装置および測定方法により測定した
結果を示す。このグラフから判るように、ｆＭＬＰ刺激
が与えられたときに、化学発光強度（すなわち、スーパ
ーオキサイド産生量）の変化は無いが、蛍光強度（すな
わち、細胞内カルシウム濃度）の変化は図２と同様の変
化を示した。
【００３２】これらの図より、本実施形態に係る測定装
置および測定方法は、蛍光強度（すなわち、細胞内カル
シウム濃度）の変化および化学発光強度（すなわち、ス
ーパーオキサイド産生量）の変化それぞれを忠実に且つ
同時に検出することができることが確認された。
置および測定方法は、蛍光強度（すなわち、細胞内カル
シウム濃度）の変化および化学発光強度（すなわち、ス
ーパーオキサイド産生量）の変化それぞれを忠実に且つ
同時に検出することができることが確認された。
【００３３】なお、図３に示すように化学発光および蛍
光それぞれを単独で測定する場合には、化学発光強度
（スーパーオキサイド産生量）および蛍光強度（細胞内
カルシウム濃度）の間の微妙な因果関係や時間的関係を
解析することは非常に困難である。しかし、図２に示す
ように化学発光および蛍光を同時測定する場合には、同
一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれを略同時
に実時間で検出することができるので、両者間の微妙な
因果関係や時間的関係を解析することができる。
光それぞれを単独で測定する場合には、化学発光強度
（スーパーオキサイド産生量）および蛍光強度（細胞内
カルシウム濃度）の間の微妙な因果関係や時間的関係を
解析することは非常に困難である。しかし、図２に示す
ように化学発光および蛍光を同時測定する場合には、同
一試料で発生した化学発光および蛍光それぞれを略同時
に実時間で検出することができるので、両者間の微妙な
因果関係や時間的関係を解析することができる。
【００３４】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。上記実施形態では、
ヒト好中球様細胞を被測定対象として、励起光が被測定
試料に照射されていないときに被測定試料においてスー
パーオキサイド産生に伴い発生した化学発光を検出し、
励起光が被測定試料に照射されているときに被測定試料
においてカルシウム濃度変化に伴い発生した蛍光を検出
する場合について説明したが、これに限られるものでは
ない。
ではなく種々の変形が可能である。上記実施形態では、
ヒト好中球様細胞を被測定対象として、励起光が被測定
試料に照射されていないときに被測定試料においてスー
パーオキサイド産生に伴い発生した化学発光を検出し、
励起光が被測定試料に照射されているときに被測定試料
においてカルシウム濃度変化に伴い発生した蛍光を検出
する場合について説明したが、これに限られるものでは
ない。
【００３５】
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明に
よれば、被測定試料に励起光をパルス的に照射して、励
起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試料
で発生した化学発光を検出し、励起光が被測定試料に照
射されているときに被測定試料で発生した蛍光を検出す
るので、同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞ
れを略同時に実時間で検出することができる。
よれば、被測定試料に励起光をパルス的に照射して、励
起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試料
で発生した化学発光を検出し、励起光が被測定試料に照
射されているときに被測定試料で発生した蛍光を検出す
るので、同一試料で発生した化学発光および蛍光それぞ
れを略同時に実時間で検出することができる。
【００３６】特に、被測定試料がヒト好中球であって、
励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試
料においてスーパーオキサイド産生に伴い発生した化学
発光を検出し、励起光が被測定試料に照射されていると
きに被測定試料においてカルシウム濃度変化に伴い発生
した蛍光を検出することにより、スーパーオキサイド産
生を担う細胞内カルシウム濃度上昇の実体の解明に貢献
することができ、慢性肉芽腫症患者の治療につながる新
たな細胞機能診断法が確立されるものと期待される。
励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試
料においてスーパーオキサイド産生に伴い発生した化学
発光を検出し、励起光が被測定試料に照射されていると
きに被測定試料においてカルシウム濃度変化に伴い発生
した蛍光を検出することにより、スーパーオキサイド産
生を担う細胞内カルシウム濃度上昇の実体の解明に貢献
することができ、慢性肉芽腫症患者の治療につながる新
たな細胞機能診断法が確立されるものと期待される。
【図１】本実施形態に係る化学発光および蛍光の同時測
定装置の構成図である。
定装置の構成図である。
【図２】化学発光および蛍光の同時測定の結果を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図３】化学発光および蛍光それぞれを単独で測定した
結果を示すグラフである。
結果を示すグラフである。
１…サンプルホルダ、２…サーモバス、３，４…配管、
５…マグネティックスターラコントローラ、６…サンプ
ルディスペンサ、１１…励起光源、１２…光ファイバ、
１３…ＮＤフィルタ、１４…チョッパ、１５…シャッ
タ、１６…チョッパコントローラ、１７…シャッタコン
トローラ、２１…レンズ、２２…ダイクロイックミラ
ー、２３…フィルタ、２４…レンズ、２５…シャッタ、
２６…光電子増倍管、２７…シャッタコントローラ、２
８…高電圧電源、３１…レンズ、３２…フィルタ、３３
…モノクロメータ、３４…光電子増倍管、３５…高電圧
電源、４１…アンプ、４２…フォトンカウンタ、４３…
コンピュータ、５１…暗箱。
５…マグネティックスターラコントローラ、６…サンプ
ルディスペンサ、１１…励起光源、１２…光ファイバ、
１３…ＮＤフィルタ、１４…チョッパ、１５…シャッ
タ、１６…チョッパコントローラ、１７…シャッタコン
トローラ、２１…レンズ、２２…ダイクロイックミラ
ー、２３…フィルタ、２４…レンズ、２５…シャッタ、
２６…光電子増倍管、２７…シャッタコントローラ、２
８…高電圧電源、３１…レンズ、３２…フィルタ、３３
…モノクロメータ、３４…光電子増倍管、３５…高電圧
電源、４１…アンプ、４２…フォトンカウンタ、４３…
コンピュータ、５１…暗箱。
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１２月１日（１９９９．１２．
１）
１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明に係る化学発光お
よび蛍光の同時測定装置は、(1) 被測定試料に励起光を
パルス的に照射する励起手段と、(2) 励起手段により励
起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試料
で発生した化学発光を検出する化学発光検出手段と、
(3) 励起手段により励起光が被測定試料に照射されてい
るときに被測定試料で発生した蛍光を検出する蛍光検出
手段と、を備え、化学発光検出手段による化学発光検出
および蛍光検出手段による蛍光検出を略同時に行うこと
を特徴とする。
よび蛍光の同時測定装置は、(1) 被測定試料に励起光を
パルス的に照射する励起手段と、(2) 励起手段により励
起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試料
で発生した化学発光を検出する化学発光検出手段と、
(3) 励起手段により励起光が被測定試料に照射されてい
るときに被測定試料で発生した蛍光を検出する蛍光検出
手段と、を備え、化学発光検出手段による化学発光検出
および蛍光検出手段による蛍光検出を略同時に行うこと
を特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】本発明に係る化学発光および蛍光の同時測
定方法は、被測定試料に励起光をパルス的に照射して、
励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試
料で発生した化学発光を検出し、励起光が被測定試料に
照射されているときに被測定試料で発生した蛍光を検出
して、化学発光検出および蛍光検出を略同時に行うこと
を特徴とする。この方法によれば、同一試料で発生した
化学発光および蛍光それぞれは略同時に実時間で検出さ
れる。
定方法は、被測定試料に励起光をパルス的に照射して、
励起光が被測定試料に照射されていないときに被測定試
料で発生した化学発光を検出し、励起光が被測定試料に
照射されているときに被測定試料で発生した蛍光を検出
して、化学発光検出および蛍光検出を略同時に行うこと
を特徴とする。この方法によれば、同一試料で発生した
化学発光および蛍光それぞれは略同時に実時間で検出さ
れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 31/00 Ｇ０１Ｎ 31/00 Ａ Ｋ 33/483 33/483 Ｃ Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BB20 BC02 CA10 CB03 CB04 DA06 DA08 EA20 FA06 FA11 FA20 GA01 HA05 HA07 2G043 AA01 BA07 BA16 CA03 DA02 DA06 EA01 EA15 FA03 GA02 GB07 GB18 GB19 HA01 HA05 HA09 HA11 HA12 HA15 JA03 KA02 KA05 KA08 KA09 LA02 2G045 AA01 BA13 BB20 BB50 CA01 CA12 DB07 FA11 FA12 FA21 FA23 FA29 FB12 FB13 GC15 HA09 JA01 2G054 AA03 AA08 AB07 BA04 BB10 BB13 BB20 CA21 CB03 CD01 CE02 EA01 EA03 EB01 EB03 EB04 FA10 FA12 FA17 FA19 FA20 FA22 FA36 FB10 GA04 GA08 GA09
Claims (4)
- 【請求項１】 被測定試料に励起光をパルス的に照射す
る励起手段と、 前記励起手段により前記励起光が前記被測定試料に照射
されていないときに前記被測定試料で発生した化学発光
を検出する化学発光検出手段と、 前記励起手段により前記励起光が前記被測定試料に照射
されているときに前記被測定試料で発生した蛍光を検出
する蛍光検出手段と、 を備えることを特徴とする化学発光および蛍光の同時測
定装置。 - 【請求項２】 前記被測定試料の温度を制御する温度制
御手段を更に備えることを特徴とする請求項１記載の化
学発光および蛍光の同時測定装置。 - 【請求項３】 前記被測定試料は液体であり、前記被測
定試料を攪拌する攪拌手段を更に備えることを特徴とす
る請求項１記載の化学発光および蛍光の同時測定装置。 - 【請求項４】 被測定試料に励起光をパルス的に照射し
て、 前記励起光が前記被測定試料に照射されていないときに
前記被測定試料で発生した化学発光を検出し、 前記励起光が前記被測定試料に照射されているときに前
記被測定試料で発生した蛍光を検出する、 ことを特徴とする化学発光および蛍光の同時測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30868898A JP3183863B2 (ja) | 1998-10-29 | 1998-10-29 | 化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30868898A JP3183863B2 (ja) | 1998-10-29 | 1998-10-29 | 化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000131234A true JP2000131234A (ja) | 2000-05-12 |
| JP3183863B2 JP3183863B2 (ja) | 2001-07-09 |
Family
ID=17984096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30868898A Expired - Fee Related JP3183863B2 (ja) | 1998-10-29 | 1998-10-29 | 化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3183863B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008191054A (ja) * | 2007-02-06 | 2008-08-21 | Hamamatsu Univ School Of Medicine | 蛍光測定装置 |
| WO2008123610A1 (ja) * | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Olympus Corporation | 発光タンパクによる長期モニタリング方法および解析方法 |
| JP2016073209A (ja) * | 2014-10-02 | 2016-05-12 | 株式会社ヘルスケアシステムズ | ミトコンドリア膜透過性の評価方法、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法、ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法、及びミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11754504B2 (en) | 2017-09-19 | 2023-09-12 | Beckman Coulter, Inc. | System for analog light measuring and photon counting in chemiluminescence measurements |
-
1998
- 1998-10-29 JP JP30868898A patent/JP3183863B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008191054A (ja) * | 2007-02-06 | 2008-08-21 | Hamamatsu Univ School Of Medicine | 蛍光測定装置 |
| WO2008123610A1 (ja) * | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Olympus Corporation | 発光タンパクによる長期モニタリング方法および解析方法 |
| JPWO2008123610A1 (ja) * | 2007-04-04 | 2010-07-15 | オリンパス株式会社 | 発光タンパクによる長期モニタリング方法および解析方法 |
| JP2013240352A (ja) * | 2007-04-04 | 2013-12-05 | Olympus Corp | 発光タンパクによる長期モニタリング方法および解析方法 |
| JP2014089193A (ja) * | 2007-04-04 | 2014-05-15 | Olympus Corp | 発光タンパクによる長期モニタリング方法および解析方法 |
| JP2016073209A (ja) * | 2014-10-02 | 2016-05-12 | 株式会社ヘルスケアシステムズ | ミトコンドリア膜透過性の評価方法、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法、ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法、及びミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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