JPH09203865A - 指標ガラス及びそれを用いた蛍光光学機器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛍光観察・測定時に基準となるマークやアラ
イメント操作のための座標等の指標が蛍光像と同時に観
察することができる指標ガラス及び蛍光光学機器を提供
する。 【解決手段】 紫外線の照射により励起されて可視光を
発光する無機物質によって所定形状のパターンを形成し
た指標ガラス。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、指標ガラス、及び
それを用いた蛍光光学機器に関し、特に蛍光顕微鏡に用
いる指標ガラスに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】蛍光顕微鏡に代表される蛍光標本サンプ
ルの蛍光を観察・測定する装置においては、励起光のモ
レや反射などのフレア、不要な自家蛍光などは極力カッ
トされ、対象とする蛍光標本サンプル由来の蛍光のみが
観察光学系に導かれる（以下、観察・測定対象となる蛍
光標本サンプルを単に“サンプル”と称す）。従って、
観察光学系によって観察されるサンプルの蛍光像は、通
常真暗なバックグランドの中に、蛍光を発する部分のみ
が光って見えている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上述の如き従来の装置
（例えば蛍光顕微鏡）においては以下のような不便な点
がある。 １．一度見た部位に戻りたいとか、染色をやり直して同
一箇所を見たい時など、座標が判りにくい ２．自動測定化する場合のアライメントの基準がとりに
くい ３．スケ−ルやパタ−ンを重ねて写し込みにくい 第一の問題点については、格子やスケ−ルをスライドガ
ラス上に印刷した製品が既に知られており、この上にサ
ンプルを配置すれば、明視野、位相差、ＤＩＣ等の検鏡
法ではサンプルとパタ−ンの同時観察が可能であり、座
標の識別は容易である。しかし、パタ−ンは蛍光を発し
ないため、サンプルと同時に蛍光で見ることはできなか
った。

【０００４】そこで、他の検鏡法と蛍光法の同時観察と
いう方法が考えられるが、蛍光像は他の検鏡法にくらべ
百倍以上は暗いため、バックグランドが暗くないとよく
観察ができない。たとえ、照明光をＮＤフィルタで減光
してパタ−ンを照明し、サンプルの蛍光像と重ねても、
蛍光像もパタ−ン像も見にくくなる問題がある。また、
蛍光検鏡法と他の検鏡法を切り換えるのは、明るさが違
いすぎて使いずらいという問題がある。

【０００５】スキャニングステ−ジを使えば、同一座標
の再現はもちろん可能であるが、高価なため、臨床分野
までは殆ど普及していないのが現状である。第二の問題
点であるアライメントについては、特開平６−２５００
９４号公報に開示されている技術が知られているが、蛍
光検鏡法の場合はアライメント時に明視野照明をしなけ
ればならず、操作が煩雑になる問題までは解決されな
い。

【０００６】第三の蛍光像にスケ−ルのような別個のパ
タ−ンを重ねるには、像面と共役な結像面に、照明可能
なレチクルを配置し、照明しながら写し込むか、別光学
系を使って結像面にパタ−ン像を投影するか、カメラの
デ−タバック機能を応用する等の方法が知られている。
しかし、いずれも装置が複雑となり、高価になってしま
うという問題がある。

【０００７】本発明は上述の如き問題点に鑑み、蛍光観
察・測定時に基準となるマークやアライメント操作のた
めの座標等の指標が、蛍光像と同時に観察することがで
きる指標ガラス及び蛍光光学機器を提供することを目的
とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の本発明
は、紫外線の照射により励起されて可視光を発光する無
機物質によって所定形状のパターンが形成された蛍光光
学機器用指標ガラスである。請求項２記載の本発明は、
請求項１記載の指標ガラスをスライドガラス又はカバー
ガラスとして用いた蛍光光学機器であって、試料の励起
させる紫外線を該試料に対して照射する照射系と、試料
から発する蛍光を観察するための観察光学系と、観察光
学系の光路中に挿脱可能に配置され、紫外線が照射され
たときに指標ガラス上のパターンから発する可視光の波
長域を遮断するフィルターを有することを特徴とするも
のである。

【０００９】請求項３記載の本発明は、請求項１記載の
指標ガラスをスライドガラス又はカバーガラスとして用
いた蛍光光学機器であって、試料を励起させる可視光
線、及び指標ガラス上のパターンを励起させる紫外線を
試料に対して照射する照射系と、試料から発する蛍光を
観察するための観察光学系と、照射系の光路中に挿脱可
能に配置され、指標ガラス上のパターンを励起させる紫
外線の波長域を遮断するフィルターを有することを特徴
とするものである。

【００１０】本発明に用いる無機物質（無機蛍光物質）
としては、ストロンチウム化合物、イットリウム化合物
等の直径０．８〜数μｍ程度の粒状性粉体である。３４
０〜３８０ｎｍの紫外線で励起ができ、蛍光は褪色が殆
どない位安定しており、後述のように種類により蛍光の
波長域が異なっている。印刷用インクやシリコン系の媒
液にもよく混ざる上、ガラスの焼結温度（５００〜６０
０°Ｃ）にも耐えるので、ガラス上に印刷したり、エッ
チングしたガラスの溝に埋め込むことが可能である。こ
の無機蛍光物質によってガラスに所定形状のパターンを
形成する。これを例えばスライドガラスとして用い、サ
ンプルを乗せて紫外線を含んだ励起光を照射すると、サ
ンプル由来の蛍光と、該パタ−ン由来の蛍光が得られ
る。

【００１１】また、請求項２及び３に記載の本発明にお
いては、サンプルとパタ−ンの励起光波長域または蛍光
波長域が重ならない場合、パタ−ンの蛍光または励起波
長域の光をカットすることにより、サンプル由来の蛍光
のみを観察することができる。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明における蛍光光学機器用指
標ガラスの実施形態を図１ａ、図１ｂ、図１ｃ、図１ｄ
に示す。本実施形態は蛍光顕微鏡に用いるスライドガラ
スである。スライドガラス上のパタ−ンとしては、図１
ａに示す格子状の方眼、図１ｂに示すスケ−ル、図１ｃ
に示すアライメント基準線や基準マ−ク、図１ｄに示す
測光基準スポット径列、結晶や細胞の基準形状等、目的
に応じて様々なパタ−ンが考えられる。

【００１３】次に、上記パタ−ンの形成されたスライド
ガラスの作成方法について述べる。不透明・非蛍光イン
クでスライドガラス上にパタ−ンを印刷した製品は、既
に市場に出回っているが、透明な媒液のインクに上述の
無機蛍光物質の粒子を混ぜ、従来製品同様に印刷すれ
ば、蛍光性のパタ−ンを持ったスライドガラスが作成可
能である。印刷で描ける線幅は０．８〜１ｍｍ程度であ
る。

【００１４】上記線幅よりも狭い線幅を形成する方法と
して、エッチング法を以下に述べる。まず、無蛍光性の
ガラス上にエッチングによって所定形状のパタ−ンを形
成する。エッチングでは幅１０μｍ〜、深さ数μｍ〜数
十μｍの溝をガラス表面に加工できる。

【００１５】ここに酸化シリコンを主成分とする媒液に
上記無機蛍光物質の粒子を混ぜたものを塗り込んだ後、
６００°Ｃで焼結する。また塗り込んだ上に酸化シリコ
ンを含んだ媒液を吹き付け、焼結してガラス質の保護膜
を形成することも可能である。純粋な酸化シリコンは励
起波長である紫外線（ＵＶ光）を通すと共に、無蛍光性
なので、混ぜた無機蛍光物質の蛍光発光を妨げたり自家
蛍光をのせたりすることなく当該物質由来の蛍光を引き
出せる。

【００１６】また、化学的に安定なガラス質の媒質に該
蛍光物質が封じ込まれているためこのガラス上に作成す
るサンプルの溶液に該蛍光物質が侵されたり、解け出し
たりすることがない。また、アルコ−ル、キシレン、ベ
ンジン等、プレパラ−トの清掃に使われる有機溶剤に
も、同様に耐性がある。上述の如きエッチング法によれ
ば、サンプルや有機溶剤に対し、化学的に安定で顕微鏡
観察に適した１０μｍ程度の線幅でパタ−ンが形成され
たスライドガラスを作成することができる。

【００１７】図２ａは本発明の指標ガラスをカバ−ガラ
スとした例であり、図２ｂは本発明の指標ガラスをガラ
ス小片とした例である。後者はパタ−ンのある側の面を
接着面とし、図３のようにスライドガラスや研磨面上に
貼りつけられるようにしたもので、後から基準点を追加
する場合に使用できる。これらの実施形態も上述と同様
の作成方法によって作成することができる。

【００１８】次に、上述の如く作成されたスライドガラ
スを用いた蛍光顕微鏡の実施形態について説明する。図
４は蛍光顕微鏡における落射蛍光用の光学系で、ＵＶ励
起のサンプルの蛍光像を観察するものである。光源１か
ら射出される励起光はレンズ２、視野絞り３、フィルタ
カセット５、対物レンズ７を介して試料８に照射され
る。フィルターカセット５は、励起フィルタ５ａ、ダイ
クロイックミラ−５ｂ、バリアフィルタ５ｃにより構成
される。その波長特性は図５に示すように、励起フィル
タ５ａの透過波長域１１が３３０〜３８０ｎｍ、ダイク
ロイックミラ−５ｂの透過波長１３が４００ｎｍ以上、
バリアフィルタ５ｃの透過波長１２が４２０ｎｍ以上で
ある。また、図６に示すように、通常ＵＶ励起の生物標
本のサンプルは上記波長で励起すると４００〜５２０ｎ
ｍの間に最大ピ−クを持つ蛍光を発し、６００ｎｍ以上
の蛍光は僅かとなる。サンプル８から発する蛍光は、フ
ィルタカセット５のバリアフィルタ５ｃ、ビームスプリ
ッタ９を介して観察光学系１０で観察される。

【００１９】本実施形態に用いるスライドガラスは、Ｕ
Ｖ光の照射によって図７（ａ）に示す波長域の蛍光を発
するようなイットリウム化合物でスケール等のパタ−ン
をつけたものである。このような蛍光顕微鏡において
は、図８（ａ）に示すようにサンプル由来の青白い蛍光
像に加えて、スライドガラスに形成されたパタ−ンの赤
い蛍光像を観察することができる。

【００２０】ここで、図９に示すような分光透過特性を
示すパンドパスフィルタ６を補助バリアフィルタとし
て、図４に示すフィルタカセット５〜ビ−ムスプリッタ
９間の光路中に挿入すると、図８（ｂ）に示すようにス
ライドガラスに形成されたパタ−ン由来の蛍光成分がカ
ットされ、サンプル由来の蛍光のみを観察することがで
きる。本実施形態の蛍光顕微鏡は、このフィルターを光
路中に挿脱することができる切り換え装置（例えばター
レット板やスライド装置等）を有する。

【００２１】次に、本実施形態における蛍光顕微鏡で観
察するサンプルがＢ励起やＧ励起の場合について考え
る。図１１に示すようにＢ励起の励起波長１９は４９０
ｎｍ付近、蛍光波長２０は５２０〜５３０ｎｍ付近にピ
−クがある。Ｇ励起の励起波長２１は５５０ｎｍ付近、
蛍光波長２２は５９０〜６２０ｎｍ付近にピ−クがあ
る。この蛍光顕微鏡に用いるスライドガラスは、ＵＶ光
の照射によって図７（ｂ）に示す波長域の蛍光を発する
ようなストロンチウム化合物でスケール等のパタ−ンを
つけたものである。この波長域は図１１ａの１８で示
し、照射するＵＶ光を１７で示す。このような蛍光顕微
鏡によりＵＶ光およびサンプルの励起波長の光を照射す
ると、サンプル由来の緑〜赤色の蛍光像に加え、スライ
ドガラスに形成されたパタ−ンの青白い蛍光像を観察す
ることができる。

【００２２】ここで図１０に示す分光透過特性のロング
パスフィルタ４を補助励起フィルタとして、図４に示す
光源１〜フィルタカセット５間の光路中に挿入すれば、
スライドガラスのパターンを励起するＵＶ励起の波長域
がカットされるため、パタ−ン像が消え、サンプル由来
のＢ励起像又はＧ励起像のみを観察できる。この波長域
は図１１（ｂ）の２４で示す。

【００２３】サンプルをＢ励起とＧ励起の試薬であるＦ
ＩＴＣとロ−ダミンで二重染色し、図１１（ａ）の分光
透過特性２３をもったトリプルバンドのフィルタカセッ
トを用いて励起した場合を考えると、図１０のロングパ
スフィルタを補助励起フィルタとして入れたら、図１１
（ｂ）に示すようにＵＶ励起部１７がカットされ、Ｂ，
Ｇ励起のみが有効になることがわかる。

【００２４】以上の実施形態ではパタ−ンの蛍光のカッ
トをそれぞれ補助バリアフィルタや補助励起フィルタを
加えることにより行ったが、ダイクロイックミラ- を固
定しておき、バリアフィルタや励起フィルタをそれぞれ
切換式にしておいてパタ−ンの蛍光の有無を切換えても
同様の効果が得られる。また、これらフィルターの切換
を電動化しておき、自動機でサンプルのアライメントを
行なう時のみ基準線をディテクトできるできるようする
ことも可能である。

【００２５】以上落射蛍光顕微鏡を例にとり説明した
が、顕微鏡用に限らず、ＵＶ光で励起する標本を観察、
測定する装置であれば、全てに応用可能であることは言
うまでもない。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、蛍光光学機器において
観察されるサンプルの蛍光像と同時に、サンプルの蛍光
像のコントラストを損なうことなく蛍光で光るスケ−ル
等のパタ−ンを鮮明に重ねて見ることができる。また、
請求項２及び３に記載の本発明においては、他の検鏡法
を使用することなく、簡単な構成で安価にサンプルのア
ライメントや観察位置の再現をすることができる蛍光光
学機器を提供することができる。また、パタ−ンの蛍光
または励起波長域の光をカットすることにより、サンプ
ル由来の蛍光のみを観察することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）は夫々、本発
明における蛍光光学機器用指標ガラスの実施形態を示す
図である。

【図２】カバ−ガラスおよびガラス小片上に配置した実
施形態であり、（ａ）は本発明の指標ガラスをカバ−ガ
ラスとした実施形態を示す図であり、（ｂ）は、ガラス
小片とした実施形態を示す図である。

【図３】図２（ｂ）に示すガラス小片ををスライドガラ
ス上に貼り付けた様子を示す斜視図である。

【図４】本発明の蛍光光学機器の実施形態である蛍光顕
微鏡の概略的な構成を示す図である。

【図５】励起フィルタ５ａ、ダイクロイックミラ−５
ｂ、バリアフィルタ５ｃの夫々の分光透過特性を示す図
である。

【図６】代表的なＵＶ励起用サンプルの蛍光波長特性を
示す図である。

【図７】無機蛍光物質の蛍光波長特性を示す図であり、
（ａ）はイットリウム化合物の蛍光波長特性であり、
（ｂ）はストロンチウム化合物の蛍光波長特性である。

【図８】蛍光像の観察例であり、（ａ）はサンプル由来
の蛍光像とガラス上のパタ−ン由来の蛍光像が見える様
子を示す図であり、（ｂ）はサンプル由来の蛍光像のみ
見える様子を示す図である。

【図９】バンドパスフィルタ６の分光透過特性を示す図
である。

【図１０】ロングパスフィルタ４の分光透過特性を示す
図である。

【図１１】（ａ）はＵＶ励起光、Ｂ励起光、Ｇ励起光と
夫々に対応した蛍光の波長特性、及びトリプルバンドの
フィルタカセットの分光透過特性を示す図であり、
（ｂ）は図１０に示すロングパスフィルタの分光透過特
性を加えた図である。

【符号の説明】

１・・・光源 ２・・・コレクタレンズ ３・・・視野絞り ４・・・補助励起フィルタ ５・・・フィルタカセット ５ａ・・励起フィルタ ５ｂ・・ダイクロイックミラ− ５ｃ・・バリアフィルタ ６・・・補助バリアフィルタ ７・・・対物レンズ ８・・・標本 ９・・・ビームスプリッタ １０・・・接眼レンズ １１・・・励起フィルタの透過波長特性 １２・・・ダイクロイックミラ- の透過波長特性 １３・・・バリアフィルタの透過波長特性 １４・・・サンプル由来の蛍光像 １５・・・パタ−ン由来の蛍光像 １６・・・バックグランド １７・・・UV励起用励起フィルタの透過波長特性 １８・・・UV励起用バリアフィルタの透過波長特性 １９・・・Ｂ励起用励起フィルタの透過波長特性 ２０・・・Ｂ励起用バリアフィルタの透過波長特性 ２１・・・Ｇ励起用励起フィルタの透過波長特性 ２２・・・Ｇ励起用バリアフィルタの透過波長特性 ２３・・・ダイクロイックミラ- の透過波長特性 ２４・・・ロングパスフィルタの透過波長特性

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 紫外線の照射により励起されて可視光を
   発光する無機物質によって所定形状のパターンが形成さ
   れたことを特徴とする指標ガラス。
2. 【請求項２】 請求項１記載の指標ガラスをスライドガ
   ラス又はカバーガラスとして用いた蛍光光学機器であっ
   て、 試料の励起させる紫外線を該試料に対して照射する照射
   系と、 前記試料から発する蛍光を観察するための観察光学系
   と、 前記観察光学系の光路中に挿脱可能に配置され、前記紫
   外線が照射されたときに前記指標ガラス上のパターンか
   ら発する可視光の波長域を遮断するフィルターを有する
   ことを特徴とする蛍光光学機器。
3. 【請求項３】 請求項１記載の指標ガラスをスライドガ
   ラス又はカバーガラスとして用いた蛍光光学機器であっ
   て、 試料を励起させる可視光線、及び前記指標ガラス上のパ
   ターンを励起させる紫外線を前記試料に対して照射する
   照射系と、 前記試料から発する蛍光を観察するための観察光学系
   と、 前記照射系の光路中に挿脱可能に配置され、前記指標ガ
   ラス上のパターンを励起させる紫外線の波長域を遮断す
   るフィルターを有することを特徴とする蛍光光学機器。