CN106854674B - 一种基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种生物医学技术领域的基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法；所述方法为利用毛细管组装、浇铸、机械加工等方式加工出微阵列，内含若干亲水性垂直微管道，阵列的外表面采用化学方法进行超疏水性修饰；将若干组核酸扩增引物分别加入若干微管道中并干燥固定，将微阵列置于反应管中；然后利用特殊加样装置通过虹吸方式将核酸扩增反应组分一次性引入各微管道中，放入温控装置中进行扩增反应；通过在反应中连续测量或反应后一次测量微管道内的荧光信号分别实现实时检测和终点检测；扩增产物也可回收用于后续其它用途。本发明可在一次反应中快速方便地实现对多个核酸靶标的检测。本发明将在核酸多重检测、现场检测等领域有广泛的应用。

Description

一种基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域的检测方法，具体涉及一种基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法。
背景技术
基于核酸(DNA/RNA)的便携式快速检测在传染病快速诊断、出入境检验检疫、转基因作物产品现场检测、食品水源微生物现场检测、犯罪现场证物鉴定及生物反恐等领域有着广泛而迫切的需求(Yager P.，et al，2008，Annu.Rev.Biomed.Eng.，10，107-144；NiemzA.，et al，2010，Trends in Biotechnology,29,240-250)。现有的商业化核酸快速检测平台大多基于传统PCR(聚合酶链式反应)技术或者实时定量PCR技术，在普通PCR管或96孔PCR板中进行，存在使用不便(如仪器体积较大，不便于携带、耗电量大、操作复杂等)、通量较低(每个反应基本只能检测一种靶标)等问题，难以满足实际需求。
随着微加工技术的发展，微芯片平台，包括微阵列芯片和微流控芯片，开始越来越多地应用于包括核酸扩增及检测在内的各种生化反应中。现已有很多基于微阵列芯片和微流控芯片的核酸扩增及检测方法(Ahmad,F.,et al.，2012，Analytica chimica acta,733,1-15；Asiello,P.J.,et al.，2011，Lab on a Chip,11,1420-1430)，并且其中有一些能实现多重检测，如Li等利用微孔阵列芯片实现了多达100重的PCR扩增(Li Y.,et al.，2011，Lab on a chip 11.21,3609-3618)，Guo等利用微流控液滴芯片结合毛细管电泳实现了超过20重的PCR扩增(Guo J.,et al.,2011,Analytical chemistry,83.5,1579-1586)，Fang等利用PDMS微流控芯片和环介导等温扩增实现了对10种核酸靶标的并行检测(Fang,X.,etal.,2010，Analytical chemistry,83,690-695)。虽然上述基于微阵列芯片和微流控芯片的核酸扩增及检测平台大大缩小了反应的体积进而减少了试剂样本耗费，同时增加了便携性，并且通量也得到了提高，但依然存在一些问题，如制作工艺复杂难以标准化、成本较高、操作较为复杂、依赖专门的仪器设备等，限制了其实用性。
毛细管是一种良好的生化反应容器，其成本低廉、表面积体积比大提高生化反应效率(MastichiadisC.,et al.，2008，Trends in Analytical Chemistry 27.9，771-784)、虹吸特性易于反应中样品自动载入、而且可方便地集成为毛细管阵列而用于多重反应和检测。由于其种种优良特性，毛细管已在气相色谱(Ballschmiter,K.,&Zell,M.1980，Fresenius'Journal of Analytical Chemistry,302,20-31)、毛细管电泳(Ewing A.，etal，1989,Anal.Chem.，61,292-303)、蛋白质检测(Cao Y.，2015，Journal offluorescence,25，563-568)等领域得到了广泛应用。
近来也有人在毛细管内成功实现了核酸扩增反应，如Manage等人在毛细管凝胶内实现了PCR扩增反应(Manage D.，et al，2013,Lab Chip,13,2576-2584)，McCarthy等人利用padlock探针和RCA(滚环扩增)在毛细管中成功扩增并检测了两种病毒的DNA(McCarthy,E.,et al.，2006，Analytical and bioanalytical chemistry，386，1975-1984)，Zhang等在毛细管中用LAMP(环介导等温扩增)技术实现了对血液中一种SNP的快速检测(Zhang L.，et al，2014,Anal.Chem.，86,10461-10466)，Liu等利用LAMP技术在毛细管阵列中实现了对多份样本中结核分枝杆菌的并行检测。这些方法都利用了毛细管的优良特性，降低了试剂和样品的耗费，同时大大降低了能耗而增加了便携性，但均难以在一次反应中实现对较多靶标的并行检测。如将微型毛细管微阵列多重反应平台与现有核酸检测技术相结合，将是一个很好的高通量核酸快检解决方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法，具体是一种提高检测通量和检测效率、降低检测成本和样品耗费的基于毛细管微阵列的核酸高通量检测方法。该方法适用于各种核酸检测领域。
本发明构建了一套毛细管微阵列多重反应平台，可非常简单地在微小体系内实现核酸扩增试剂的快速并行进样及扩增反应的快速并行进行。相比较现有方法，有其特有的优点如，检测通量高、实验操作简单、样品耗费少、检测费用低、无需昂贵设备等。可以在传染病快速诊断、出入境检验检疫、转基因作物产品现场检测、食品水源微生物现场检测、犯罪现场证物鉴定及生物反恐等领域得到广泛的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
第一步、将若干组核酸扩增引物分别加入毛细管微阵列上的若干微管道中，干燥，再将毛细管微阵列固定于透明反应管中；
第二步、将含有样品核酸的除引物外的其他核酸扩增反应组分加入微管道中，形成核酸扩增体系，封住反应管口；
第三步、将装有核酸扩增体系的反应管置于控温条件下进行扩增反应；
第四步、通过对扩增反应连续荧光信号测量实现实时检测或对扩增反应结束后一次荧光信号测量实现终点检测。
优选地，第一步中，所述干燥的作用是为了将核酸扩增引物附于微管道内壁。
优选地，第一步中，所述核酸扩增引物包括但不限于：普通PCR引物、实时定量PCR引物、环介导等温扩增引物、滚环扩增引物、重组酶聚合酶扩增引物；
其中，当所述核酸扩增引物为实时定量PCR引物时，引物是同相应探针一并加入微管道中的。
优选地，第一步中，所述毛细管微阵列还包括基底；
其中，毛细管微阵列中若干个微管道以阵列方式贯穿排布于基底上，并且微管道端部有少部分露出基底表面；基底的上表面、微管道露出基底部分的外表面以及微管道底端内表面均为疏水性表面；
所述疏水性表面可通过在相应表面涂覆一层疏水性涂料来实现。
优选地，第一步中，所述毛细管微阵列的获得方式包括一次性加工成型或将含微管道孔阵列的毛细管微阵列基底与微管道组装；进一步地，所述加工成型包括制模浇铸或机械加工。
进一步优选地，所述基底的材质包括塑料、玻璃、金属及其它高分子材料；其中，所述其它高分子材料如聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、橡胶等；微管道为亲水性毛细管，微管道露出基底的部分及微管道的底端表面为疏水的，而微管道本身的材质为亲水的。
优选地，第一步中，所述加入具体指将核酸扩增引物溶于交联剂中后再加入微管道中；
其中，所述交联剂为以下三种混合液中的任意一种：
a、质量百分比为0.1-1％的壳聚糖的乙酸水溶液，pH为4.5-6.0；
b、质量百分比为0.1-1％的明胶水溶液；
c、质量百分比为0.05-5％的聚乙二醇水溶液。
优选地，第二步中，所述加入具体指通过倒置虹吸方式将核酸扩增反应组分引入各微管道中；
进一步地，所述加入具体指采用加样装置加入；其中，所述加样装置包括样品池和手柄，手柄连接于样品池底部；样品池为外横截面小于反应管的内横截面，样品池的内横截面大于毛细管微阵列横的截面，样品池的深度略小于微管道露出基底表面部分的高，样品池的内表面为亲水性；(加样过程示意图见附图3)。
优选地，第二步中，所述倒置虹吸方式是指：将充满核酸扩增反应组分溶液的加样装置样品池朝下插入反应管中，核酸扩增反应组分与亲水性微管道内壁顶端接触后靠虹吸作用迅速充满亲水性管道，之后再移除加样装置。
优选地，第五步中，所述测量可以是借助荧光检测设备或光度检测设备进行检测，也可以是通过肉眼辨别颜色或亮度差异；具体是指：每次测量前需用相应发射波长的光源照射微管道内反应物，再进行测量。
优选地，第五步得到的可回收产物可用于后续其它检测，具体是指：可单独回收特定毛细管内的产物或一次性回收所有毛细管内产物，进一步用于包括琼脂糖凝胶电泳、核酸杂交、DNA芯片、DNA测序等方法的检测。
优选地，所述方法中，第四中的温控的装置及第五步的所述测量可集成于一个自动化装置，由软件程序控制其自动运行。
优选地，所述方法既可以在单个反应管中单独实现，也可以在集成的8连管、96孔板或384孔板中并行实现。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、利用毛细管微阵列和亲疏水特性，采用特殊设计的加样装置(见附图3)可快速便捷地将反应液一次性加入多个微管道中，从而提高了一次检测的通量和检测效率；
2、采用微管道作为反应腔也大大减小了试剂样品用量，从而降低了检测成本；
3、本发明可适用于各种核酸高通量快速检测领域，如传染病快速检测、出入境检验检疫、食品安全和转基因检测、刑侦鉴定等。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明以实施例1为例的工作流程图；
图2为毛细管微阵列；
其中，21是微管道，22是基底顶部的疏水表面，23是基底。
图3为加样原理示意图；
其中31是加样装置中的亲水性加样池，32是加样装置中的手柄，33是反应管，34是毛细管微阵列。
图4为实施例1和实施例2中引物排列模式图；
其中，1-10分别为：P-CaMV35S、bar、CP4epsps、P-FMV35S、pat、T-nos、nptII、ADH1、空白对照、空白对照；
图5为实施例1结果示意图；
图6为实施例2结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1：利用环介导等温扩增(LAMP)对成分已知转基因材料的多重检测
针对目前转基因产品中常检出的7种转基因元件和玉米的内源参照基因，查询相关文献，找到针对这些基因的LAMP引物组。所有引物由英潍捷基公司(上海)合成。用含钙黄绿素染料的常规LAMP反应对所有引物进行验证筛选，每种基因筛选出一套可以成功检出的LAMP引物组。引物具体信息如下表1所示：
表1
Figure BDA0000871298460000051
Figure BDA0000871298460000061
将实验室已有的转基因玉米事件MON863的种子粉末，利用商业化的DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取和纯化，再利用NanoDrop 1000验证DNA的浓度，作为待测样品。
利用毛细管微阵列(见图2，具体包括微管道21和基底23，基底23的顶部表面和微管道露出基底顶部表面的部分22是疏水性的)平台进行多重LAMP反应。即事先用移液器将8组LAMP引物(微阵列中微管道1-10分别为：P-CaMV35S、bar、CP4epsps、P-FMV35S、pat、T-nos、nptII、ADH1、空白对照、空白对照)分别加入阵列中的各毛细管中并干燥固定，采用倒置虹吸法加入含DNA模板的LAMP反应体系，进行多重LAMP反应。每个反应体系仅有1.6μL。具体操作流程见图1。
具体加样过程见图3，加样采用加样装置，加样装置包括样品池31和手柄32，手柄32连接于样品池31底部；样品池31为外横截面小于反应管的内横截面，样品池31的内横截面大于毛细管微阵列横的截面，样品池31的深度略小于微管道露出基底表面部分的高，样品池31的内表面为亲水性。加样时，将充满含DNA模板的LAMP反应体系(引物除外)样品池31朝下插入反应管中，核酸扩增反应组分与亲水性微管道内壁顶端接触后靠虹吸作用迅速充满亲水性微管道，之后再移除加样装置即可。
其他未明确给出的反应条件均为常规核酸扩增条件。
结果检测和分析。待反应结束后用发射波长为365nm的手持式紫外灯从反应管侧面照射，激发微管道内反应物发出荧光，再用数码相机从反应管顶部朝下拍照记录微阵列中各个毛细管内的荧光信号。用Photoshop7.0(Adobe Systems Inc.,USA)将照片格式转换为16Bit TIFF格式，再使用GenePix Pro 6.1(Molecular Devices,USA)读取每个毛细管内的具体荧光强度。
由图5，并结合模式图4可知，结果图中阳性信号分别是序号：1、6、7、8，其对应的靶标名称分别是：P-CaMV35s、T-nos、nptII以及玉米内源基因ADH1。查找相关数据库和文献得出，理论上该转基因玉米所含转基因元件和玉米內源基因在毛细管微阵列多重LAMP反应中一次性全部检出。对于同一样品的两次重复，检测结果完全一致，且都与预期相符。
实施例2：对成分未知转基因材料的多重检测
利用上述实验过程对由上海市出入境检验检疫局收集自上海港口、成分未知的玉米样本M2进行检测。检测结果如附图6；由图6并结合模式图4可知，结果图中阳性信号分别是序号：1、4、5、6、8，其对应的靶标名称分别是：P-CaMV35s、FMV-35S、pat、T-nos以及玉米内源基因ADH1。将此结果与独立进行的real-time PCR实验结果进行比较，所检出靶标完全一致，故可以认为该检测方法具有很高的特异性和准确性。real-time PCR实验结果如下：
表2
Figure BDA0000871298460000071
Figure BDA0000871298460000081
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种非诊断和治疗目的的基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
第一步、将若干组核酸扩增引物分别加入毛细管微阵列上的若干微管道中，干燥，再将毛细管微阵列固定于反应管中，所述毛细管包括基底；
其中，毛细管微阵列中若干个微管道以阵列方式贯穿排布于基底上，并且微管道顶端有少部分露出基底表面，所述基底的上表面、微管道露出基底部分的外表面以及微管道底端内表面均为疏水性表面，微管道的其余面为亲水性面；
第二步、将含有样品核酸的除引物外的其他核酸扩增反应组分加入微管道中，形成核酸扩增体系；
第三步、将装有核酸扩增体系的反应管置于控温条件下进行扩增反应，其中，加样时，采用的加样装置包括样品池和手柄，手柄连接于样品池底部；
所述样品池为外横截面小于反应管的内横截面，样品池的内横截面大于毛细管微阵列横的截面，样品池的深度略小于微管道露出基底表面部分的高度；
第四步、通过对扩增反应连续荧光信号测量实现实时检测或对扩增反应结束后一次荧光信号测量实现终点检测；
其中，第二步中，所述加入具体指通过倒置虹吸方式将其他核酸扩增反应组分引入各微管道中；
所述倒置虹吸方式是指：将充满核酸扩增反应组分溶液的加样装置样品池朝下插入反应管中，核酸扩增反应组分与亲水性微管道内壁顶端接触后靠虹吸作用迅速充满亲水性管道，之后再移除加样装置；
所述样品池的内表面为亲水性。
2.根据权利要求1所述的非诊断和治疗目的的基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法，其特征在于，第一步中，所述核酸扩增引物包括但不限于：普通PCR引物、实时定量PCR引物、环介导等温扩增引物、滚环扩增引物、重组酶聚合酶扩增引物；
其中，当所述核酸扩增引物为实时定量PCR引物时，引物是同相应探针一并加入微管道中的。
3.根据权利要求1所述的非诊断和治疗目的的基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法，其特征在于，第一步中，所述加入具体指将核酸扩增引物溶于交联剂中后再加入微管道中；
其中，所述交联剂为以下三种混合液中的任意一种：
a、质量百分比为0.1-1%的壳聚糖的乙酸水溶液，pH为4.5-6.0；
b、质量百分比为0.1-1%的明胶水溶液；
c、质量百分比为0.05-5%的聚乙二醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的非诊断和治疗目的的基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法，其特征在于，第四步中，所述测量为借助荧光检测设备或光度检测设备进行检测，或所述测量为通过肉眼辨别颜色或亮度差异。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的非诊断和治疗目的的基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法，其特征在于，所述方法在单个反应管中单独实现，或所述方法在集成的8连管、96孔板或384孔板中并行实现。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110846214A (zh) * 2018-08-01 2020-02-28 上海真测生物科技有限公司 一种微型多指标核酸分析系统及其操作方法
CN109797204A (zh) * 2019-02-22 2019-05-24 上海交通大学苏北研究院 一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法
CN110592193A (zh) * 2019-09-20 2019-12-20 中国科学院成都生物研究所 基于lamp技术的转基因抗除草剂外源基因的检测方法及试剂盒
CN113512590A (zh) * 2020-04-09 2021-10-19 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 一种基于蜂巢芯片的检测棘球蚴不同虫种的试剂盒及检测方法
CN113512606A (zh) * 2020-04-09 2021-10-19 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 基于蜂巢芯片的高通量检测肠道原虫的试剂盒及检测方法
CN112080806B (zh) * 2020-10-23 2024-02-20 江苏吉诺思美精准医学科技有限公司 一种毛细管96孔板的血浆游离dna建库方法
CN114100714B (zh) * 2021-11-22 2023-01-17 上海睿度光电科技有限公司 一种核酸或多肽高通量合成芯片及其用途

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008154490A (ja) * 2006-12-22 2008-07-10 Olympus Corp 複数種類の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板と、該基板を用いた塩基配列の増幅方法
US9156010B2 (en) * 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
CN101838609B (zh) * 2010-03-15 2012-06-20 上海浩源生物科技有限公司 加样装置及其应用
CN101851652B (zh) * 2010-04-27 2013-11-13 上海交通大学 基于微阵列芯片的通用多重聚合酶链式反应的实现方法
CN103975053A (zh) * 2011-12-01 2014-08-06 三菱丽阳株式会社 核酸扩增用基材以及核酸扩增方法
SG2012075792A (en) * 2012-10-09 2014-05-29 Jn Medsys Pte Ltd An improved device and method
CN103114033A (zh) * 2012-11-08 2013-05-22 杭州腾越生物科技有限公司 用于hpv检测的阵列式多重微流体恒温扩增芯片
CN103409317B (zh) * 2013-07-23 2015-04-22 广州市第一人民医院 一种毛细管生物分析系统及其分析方法与应用
CN204142525U (zh) * 2014-10-29 2015-02-04 博奥生物集团有限公司 一种微量液体取样加样装置

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