CN109797204A - 一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法 - Google Patents
一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109797204A CN109797204A CN201910133177.1A CN201910133177A CN109797204A CN 109797204 A CN109797204 A CN 109797204A CN 201910133177 A CN201910133177 A CN 201910133177A CN 109797204 A CN109797204 A CN 109797204A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- capillary
- nucleic acid
- discoid
- microarray
- detection method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 46
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 238000002493 microarray Methods 0.000 title claims abstract description 34
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 230000010148 water-pollination Effects 0.000 claims abstract description 4
- NJPPVKZQTLUDBO-UHFFFAOYSA-N novaluron Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(OC(F)(F)F)F)=CC=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F NJPPVKZQTLUDBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims abstract 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229920005573 silicon-containing polymer Polymers 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000238413 Octopus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000725681 Swine influenza virus Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011840 criminal investigation Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- -1 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Abstract
本发明公开一种新的基于圆盘状毛细管微阵列的可视化多重核酸检测方法,所述方法为利用PDMS基座制作、毛细管组装、亲疏水处理等方式加工出微阵列,内含亲水性圆盘状微管道,阵列的外表面采用化学方法进行超疏水性修饰,可将若干组核酸扩增引物分别加入不同毛细管中并干燥固定,然后利用圆盘状毛细管微阵列的中心圆孔通过虹吸方式将核酸扩增反应组分一次性引入各微管道中,放入温控装置中进行扩增反应,通过观察毛细管通道内的荧光信号实现检测,本发明可在一次反应中快速方便地实现对多个核酸靶标的检测,同时该毛细管微阵列可进一步扩展实现更多通量的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域的检测方法,具体涉及一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法。
背景技术
近年来,多重核酸检测(nucleic acids detection,NAT)由于成本低、时间短、操作便捷等优势在很多领域得到了广泛的应用,如临床诊断、转基因检测、微生物监测、法医检验领域等,特别是对于现场实时检测(POCTs)发挥了很大的作用(Yager,P.,et al.,2008, Annu.Rev.Biomed.Eng.,10,107-144;Guo,J.,et al.,2011, Anal.Chem.,83(5),1579-1586;Sciancalepore,A.G.,et al., 2013,Food Microbial.,35(1),10-14;Estes,M.D.,et al.,2012, Analyst,137(23),5510-5519;Niemz,A.,et al.,2011,TrendsBiotechnol.,29(5),240-250)。
在核酸扩增分析中,环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)因其灵敏度高、特异性强、效率高,对专业设备要求低等特点而被广泛应用(Notomi,T.,et al., 2000,Nucleic Acids Res.,28(12),e63-e63),在过去的十年中, LAMP方法与不同系统比如微流控和毛细管等系统整合在一起,为开发多重检测平台提供了巨大的潜力,与常规检测方法相比,微流控技术或毛细管技术可以结合核酸扩增分析、免疫分析和细胞操作的过程,并将反应过程整合在很小的芯片或毛细管中。这种微型反应系统有助于开发更加智能化、自动化的分析系统,并且密封性良好,以减少交叉污染的机会及手动步骤,以此来实现一个快速、多元化并易于操作的分析系统(McCalla,S.E.,et al.,2011,Annu.Rev.Biomed. Eng.,13,321-343;Asiello,P.J.,et al.,2011,Lab Chip, 11(8):1420)。
基于微流控芯片的多重LAMP技术已经被用于开发现场实时检测 (POC)的设备,2010年,Fang等人开发了微型LAMP(μLAMP)系统,该系统将LAMP扩增和八通道微流控芯片结合在一起进行病原体检测(Fang,X.,et al.,2010,Anal.Chem.,82(7),3002-3006)。为了改善μLAMP方法,该课题组又开发了一种章鱼形状的多重微流控LAMP(mμLAMP)系统(10个微反应室)用于区分三种人类A型流感亚型并鉴定八种重要的猪流感病毒(Fang,X.,et al.,2010, Anal.Chem.,83(3),690-695)。在μLAMP和mμLAMP多重核酸检测平台的基础上,开发出便携式集成微芯片系统即集成化微型LAMP 体系(iμLAMP)对细菌(结核杆菌、转基因大肠杆菌)进行单重、多重检测,并且能够实现“样品进-结果出”的一体化检测模式(Fang, X.,et al.,2012,Lab Chip,12(8),1495-1499)。另外,开发了一种微流控芯片对多种病原体用LAMP方法进行定量分析,其中包含 15个互连反应孔阵列,并且整个过程一次加样即可(Tourlousse,D. M.,et al.,2012,Biomed.Microdevices,14(4),769-778)。基于类似的微流控芯片系统,一个基于智能手机的现场测试设备Gene-Z 被生产用于快速定量检测多个遗传标记,具有高灵敏度和特异性 (Stedtfeld,R.D.,et al.,2012,Lab Chip,12(8),1454-1462)。除此之外,MACRO平台是另一种高通量系统,可以在一次测试中同时检测100多个靶标(Shao,N.,et al.,2014,Anal.Chem.,86(2), 1269-1276),然而,对于微流控芯片系统来说,仍有一些不足的地方,比如芯片的制作工艺繁琐复杂,引物固定也相对困难。
与微流控芯片的复杂操作和高成本制造相比,毛细管成本低廉,其虹吸特性易于反应样品自动载入,而且可方便集成为毛细管阵列用于多重反应及检测,基于上述的种种优势,毛细管通道的系统近年来也逐渐运用到了多重核酸检测中。2013年,Liu等报道了第一个结合环介导等温扩增(LAMP)方法的高通量毛细管阵列微系统(10个样品并行),该系统通过微滴技术与磁珠(MB)的使用,将DNA提取、 LAMP和在线荧光检测的整个分析过程整合在毛细管阵列中。它可以在50分钟内自动完成,并且可以同时检测10种细菌(Liu,D.,etal., 2013,Anal.Chem.,85(9),4698-4704)。2014年,Zhang等人建立了一种高效、多重并且能够实现现场检测的基于毛细管的环介导等温扩增(cLAMP)的体系,该体系能够从多个血浆样品同时检测人类免疫缺陷病毒(HIV)的两个RNA靶标,并且能够检测到两个拷贝的标准质粒(Zhang,Y.,et al.,2014,Anal.Chem.,86(14), 7057-7062)。另外,整合的基于微毛细管的环介导等温扩增(icLAMP) 系统通过提前固定试剂和DNA提取卡的可以在150分钟内实现未处理的血液样品“样品进-结果出”的一体化检测模式,并且能够实现现场核酸检测(Zhang,L.,et al.,2014,Anal.Chem.,86(20), 10461-10466),先前研究也报道了一种基于毛细管阵列的多重可视化检测体系(CALM平台),该平台能够同时检测七种常用的转基因元件和五种植物内源参考基因,具有高特异性和高灵敏度(Shao,N.,et al.,2017,LabChip,17(3),521-529)。然而,易于提高检测通量、操作方便、成本低廉的多重检测方法仍然还有待开发。
基于CALM平台的前期工作,为了进一步简化毛细管阵列的制作及加样过程,本发明建立了一种新型、快速、简便的圆盘状毛细管芯片平台(RCC),该平台将环介导等温扩增(LAMP)方法与圆盘状毛细管阵列结合在一起用于转基因作物的检测。该轮盘式毛细管芯片在聚二甲基硅氧烷(PDMS)微通道的中心圆孔中加入反应液进行LAMP 反应,最后通过简易的紫外装置进行结果观察。以6或10通道的RCC 平台的性能测试结果为基础,以常见转基因元件分析为例,验证了 RCC平台在核酸检测中具有高特异性、高灵敏度、高产能和高可行性等优点。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法,具体是一种提高检测通量和检测效率、降低检测成本和样品耗费的基于毛细管微阵列的核酸高通量检测方法。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
本发明涉及一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法,其特征在于,包含以下步骤:
第一步、将毛细管固定于PDMS基座微阵列中,经过疏水处理后,将若干组核酸扩增引物分别加入毛细管微阵列上的若干微管道中,再放置烘箱中干燥;
第二步、预制含有样品核酸的除引物外的其他核酸扩增反应组分,形成核酸扩增体系;
第三步、将反应预混液从圆盘状毛细管微阵列中心圆孔加入,并将圆盘状毛细管微阵列密封好置于控温条件下进行扩增反应;
第四步、通过简易的紫外检测装置对毛细管中的荧光信号进行检测和观察。
优选地,第一步中,所述干燥的作用是为了将核酸扩增引物附于毛细管内壁。
优选地,第一步中,所述核酸扩增引物包括但不限于:普通PCR 引物、实时定量PCR引物、环介导等温扩增引物、滚环扩增引物、重组酶聚合酶扩增引物;
其中,当所述核酸扩增引物为实时定量PCR引物时,引物是同相应探针一并加入毛细管中的。
优选地,第一步中,所述毛细管微阵列的获得方式包括通过模具一次性加工成型;进一步地,所述加工成型是用制模浇铸。
进一步优选地,所述基底的材质包括塑料、玻璃、金属及其它高分子材料;其中,所述其它高分子材料如聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、橡胶等;微管道为亲水性毛细管,所述基于圆盘状毛细管微阵列的毛细管的外表面以及微管道底端内表面均为疏水性表面,毛细管通道内部为亲水性面。
优选地,第一步中,所述加入具体指将核酸扩增引物溶于交联剂中后再加入毛细管通道中;其中,所述交联剂为:质量百分比为0.1-1%的壳聚糖的乙酸水溶液,pH为4.5-6.0;
优选地,第三步中,所述加入具体指通过虹吸作用将核酸扩增反应组分引入各微管道中;
优选地,第三步中,所述的基于圆盘状毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法,其特征在于,所述加入具体指通过圆盘状毛细管阵列的中心圆孔加入。
优选地,第四步中,所述测量可以是借助荧光检测设备或光度检测设备进行检测,也可以是通过肉眼辨别颜色或亮度差异;具体是指:每次测量前需用相应发射波长的光源照射微管道内反应物,再进行测量。
优选地,第四步得到的可回收产物可用于后续其它检测,具体是指:可单独回收特定毛细管内的产物或一次性回收所有毛细管内产物,进一步用于包括琼脂糖凝胶电泳、核酸杂交、DNA芯片、DNA测序等方法的检测。
优选地,所述方法中,第三步的温控的装置及第四步的所述测量可集成于一个自动化装置,由软件程序控制其自动运行。
优选地,所述方法既可以在单个反应管中单独实现,也可以在6 通道、10通道甚至更多通道中实现。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、该圆盘状毛细管微阵列只需要通过PDMS在模具上浇铸,烘干2~4小时即可,制作过程简单,省时省力,并且能够节约成本,提高阵列制作效率。
2、利用圆盘状毛细管微阵列和亲疏水特性,通过从中心圆孔加样可快速便捷地将反应液一次性加入多个微管道中,从而提高了一次检测的通量和检测效率。
3、采用微管道作为反应空间也大大减小了试剂样品用量,从而降低了检测成本。
4、本发明可适用于各种核酸高通量快速检测领域,如传染病快速检测、出入境检验检疫、食品安全和转基因检测、刑侦鉴定等。
附图说明
下面是结合附图和实例对本发明进一步说明:
图1为本发明以实施例1为例的工作流程图;
图2为毛细管微阵列;
图3为加样原理示意图;
图4为实施例1和实施例2中引物排列模式图;
图5为实施例1结果示意图;
图6为实施例2结果示意图;
图中:1.P-CaMV35S、2.P-FMV35S、3.pat、4.NPTII、5.ADH1、 6.空白对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。
实施例1:利用环介导等温扩增(LAMP)对成分已知转基因材料的多重检测
针对目前转基因产品中常检出的4种转基因元件和玉米的内源参照基因,查询相关文献,找到针对这些基因的LAMP引物组,用含钙黄绿素染料的常规LAMP反应对所有引物进行验证筛选,每种基因筛选出一套可以成功检出的LAMP引物组。引物具体信息如下表1所示:
表1
将实验室已有的转基因玉米事件MON863的种子粉末,利用商业化的DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取和纯化,再利用NanoDrop 1000验证DNA的浓度,作为待测样品。
利用毛细管微阵列平台进行多重LAMP反应。即事先用移液器将 5组LAMP引物(微阵列中微管道1-5分别为:P-CaMV35S、P-FMV35S、pat、NPTII、ADH1、空白对照)分别加入阵列中的各毛细管中并干燥固定,通过虹吸作用加入含DNA模板的LAMP反应体系,进行多重LAMP反应。每个反应体系仅有1.6μL。
具体加样过程见图3,通过圆盘状毛细管阵列的中心圆孔加样,通过虹吸作用自动分散到周围的毛细管中。
其他未明确给出的反应条件均为常规核酸扩增条件。
结果检测和分析。待反应结束后用发射波长为365nm的手持式紫外灯从反应管侧面照射,激发微管道内反应物发出荧光,再用数码相机从反应管顶部朝下拍照记录微阵列中各个毛细管内的荧光信号。用 Photoshop7.0(Adobe Systems Inc.,USA)将照片格式转换为16Bit TIFF格式,再使用GenePix Pro 6.1(Molecular Devices,USA)读取每根毛细管的具体荧光强度。
由图5,并结合模式图4可知,结果图中阳性信号分别是序号:1、 4、5,其对应的靶标名称分别是:P-CaMV35s、NPTII以及玉米内源基因ADH1,查找相关数据库和文献得出,理论上该转基因玉米所含转基因元件和玉米內源基因在毛细管微阵列多重LAMP反应中一次性全部检出,对于同一样品的两次重复,检测结果完全一致,且都与预期相符。
实施例2:对成分未知转基因材料的多重检测
利用上述实验过程对由美国农业部(USDA)的下属机构,GIPSA (谷物检验、批发及畜牧场管理局)提供的样品C4.2进行检测,检测结果如附图6,由图6并结合模式图4可知,结果图中阳性信号分别是序号:1、2、5,其对应的靶标名称分别是:P-CaMV35s、FMV-35S 及玉米内源基因ADH1。将此结果与独立进行的real-time PCR实验结果进行比较,所检出靶标完全一致,故可以认为该检测方法具有很高的特异性和准确性,real-time PCR实验结果如下:
表2
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内,不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (9)
1.一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法,其特征在于,包含以下步骤:
第一步、将毛细管固定于PDMS基座微阵列中,经过疏水处理后,将若干组核酸扩增引物分别加入毛细管微阵列上的若干微管道中,再放置烘箱中干燥;
第二步、预制含有样品核酸的除引物外的其他核酸扩增反应组分,形成核酸扩增体系;
第三步、将反应预混液从圆盘状毛细管微阵列中心圆孔加入,并将圆盘状毛细管微阵列密封好置于控温条件下进行扩增反应;
第四步、通过简易的紫外检测装置对毛细管中的荧光信号进行检测和观察。
2.根据权利要求1所述的基于圆盘状毛细管微阵列的可视化多重核酸检测方法,其特征在于,所述第一步中核酸扩增引物包括但不限于:普通PCR引物、实时定量PCR引物、环介导等温扩增引物、滚环扩增引物、重组酶聚合酶扩增引物,当所述核酸扩增引物为实时定量PCR引物时,引物是同相应探针一并加入微管道中的。
3.根据权利要求1所述的基于圆盘状毛细管微阵列的可视化多重核酸检测方法,其特征在于,所述第一步中毛细管微阵列是圆盘状。
4.根据权利要求3所述的基于圆盘状毛细管微阵列的可视化多重核酸检测方法,其特征在于,所述基于圆盘状毛细管微阵列的毛细管的外表面以及微管道底端内表面均为疏水性表面,毛细管通道内部为亲水性面。
5.根据权利要求1所述的基于圆盘状毛细管微阵列的可视化多重核酸检测方法,其特征在于,所述第一步中加入具体指将核酸扩增引物溶于交联剂中后再加入毛细管通道中,所述交联剂为:质量百分比为0.1-1%的壳聚糖的乙酸水溶液,pH为4.5-6.0。
6.根据权利要求1所述的基于圆盘状毛细管微阵列的可视化多重核酸检测方法,其特征在于,所述在第三步中加入具体指通过虹吸作用将其他核酸扩增反应组分引入各微管道中。
7.根据权利要求1或6所述的基于圆盘状毛细管微阵列的可视化多重核酸检测方法,其特征在于,所述加入具体指通过圆盘状毛细管阵列的中心圆孔加入。
8.根据权利要求1所述的基于圆盘状毛细管微阵列的可视化多重核酸检测方法,其特征在于,所述第四步中测量可以是借助荧光检测设备或光度检测设备进行检测,也可以是通过肉眼辨别颜色或亮度差异。
9.根据权利要求1至6或8中任一项所述的基于圆盘状毛细管微阵列的可视化多重核酸检测方法,其特征在于,所述方法既可以在单个反应管中单独实现,也可以在6通道、10通道甚至更多通道中实现。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910133177.1A CN109797204A (zh) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | 一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910133177.1A CN109797204A (zh) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | 一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109797204A true CN109797204A (zh) | 2019-05-24 |
Family
ID=66561243
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910133177.1A Pending CN109797204A (zh) | 2019-02-22 | 2019-02-22 | 一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109797204A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113512490A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-10-19 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 一种自驱动微流控检测装置及其用途 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101400801A (zh) * | 2005-12-30 | 2009-04-01 | 霍尼韦尔国际公司 | 用于鉴定病原体的寡核苷酸微阵列 |
CN102199531A (zh) * | 2011-03-30 | 2011-09-28 | 复旦大学 | 一种用于多重lamp检测的微流控芯片及其制备方法 |
CN105331528A (zh) * | 2014-08-14 | 2016-02-17 | 天津市农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于核酸扩增技术的微流控检测芯片及其制备方法 |
CN106854674A (zh) * | 2015-12-08 | 2017-06-16 | 上海交通大学 | 一种基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法 |
-
2019
- 2019-02-22 CN CN201910133177.1A patent/CN109797204A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101400801A (zh) * | 2005-12-30 | 2009-04-01 | 霍尼韦尔国际公司 | 用于鉴定病原体的寡核苷酸微阵列 |
CN102199531A (zh) * | 2011-03-30 | 2011-09-28 | 复旦大学 | 一种用于多重lamp检测的微流控芯片及其制备方法 |
CN105331528A (zh) * | 2014-08-14 | 2016-02-17 | 天津市农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于核酸扩增技术的微流控检测芯片及其制备方法 |
CN106854674A (zh) * | 2015-12-08 | 2017-06-16 | 上海交通大学 | 一种基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113512490A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-10-19 | 杭州优思达生物技术有限公司 | 一种自驱动微流控检测装置及其用途 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kadimisetty et al. | Fully 3D printed integrated reactor array for point-of-care molecular diagnostics | |
CN206334683U (zh) | 一种cd盘状微流控芯片 | |
EP2016091B1 (en) | Droplet-based biochemistry | |
CN106047687B (zh) | 核糖核酸链式聚合扩增反应检测装置及其进行dna浓度检测的方法 | |
CN106854674B (zh) | 一种基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法 | |
CN110452808A (zh) | 核酸扩增装置、核酸扩增方法以及核酸扩增用芯片 | |
JP2024028879A (ja) | 核酸分析および定量化のための方法ならびにシステム | |
CN103071548A (zh) | 一种无动力源无阀型单分子检测芯片及应用 | |
CN105802843A (zh) | 液滴捕获芯片和微流控芯片 | |
CN104293945B (zh) | 利用纸质微流体进行核酸等温扩增的方法 | |
Li et al. | Recent advancements in nucleic acid detection with microfluidic chip for molecular diagnostics | |
EP1371419A1 (en) | Method and device for detecting the presence of an analyte in a test sample | |
CN107619775B (zh) | 一种适用于pcr层析法的便携式核酸检测平台 | |
CN109797204A (zh) | 一种基于圆盘状毛细管微阵列的多重核酸检测方法 | |
JP6374967B2 (ja) | 多孔質基材における核酸増幅の検出 | |
CN103602583A (zh) | 一种集成式多功能微流控芯片 | |
KR101816520B1 (ko) | 다중 분자진단을 위한 칩 구조 | |
WO2016121886A1 (ja) | 分析用デバイス、分析用チップ、分析キット、および、これらを用いた分析方法 | |
JP2013208127A (ja) | マイクロ反応容器及びマイクロ反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応方法 | |
CN108291251A (zh) | 用于核酸分析的系统和方法 | |
WO2014058064A1 (ja) | 検査システム及び検査方法 | |
CN115305183A (zh) | 集等温扩增和CRISPR/Cas核酸检测于一体的离心式微流控芯片及方法 | |
Tupik et al. | Microchip device with dry-stored reagents for Loop mediated isothermal amplification | |
CN103627788A (zh) | 一种电化学基因传感器生物芯片的制备方法 | |
Huang et al. | Novel micro-nanofluidic chip and device for fast identifying pathogenic bacteria |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |