CN104583397A - 用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体状及其用途 - Google Patents

用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体状及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN104583397A
CN104583397A CN201380044466.5A CN201380044466A CN104583397A CN 104583397 A CN104583397 A CN 104583397A CN 201380044466 A CN201380044466 A CN 201380044466A CN 104583397 A CN104583397 A CN 104583397A
Authority
CN
China
Prior art keywords
biological sample
porous solid
solid shape
nucleic acid
biomolecules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380044466.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104583397B (zh
Inventor
朴旲浩
申埈盛
韩定宪
印金淑
崔洪秀
金政洙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIO CUBE SYSTEM Co Ltd
Original Assignee
BIO CUBE SYSTEM Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIO CUBE SYSTEM Co Ltd filed Critical BIO CUBE SYSTEM Co Ltd
Publication of CN104583397A publication Critical patent/CN104583397A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104583397B publication Critical patent/CN104583397B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01F—COMPOUNDS OF THE METALS BERYLLIUM, MAGNESIUM, ALUMINIUM, CALCIUM, STRONTIUM, BARIUM, RADIUM, THORIUM, OR OF THE RARE-EARTH METALS
    • C01F7/00—Compounds of aluminium
    • C01F7/02—Aluminium oxide; Aluminium hydroxide; Aluminates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G21/00—Compounds of lead
    • C01G21/02—Oxides
    • C01G21/06—Lead monoxide [PbO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G49/00—Compounds of iron
    • C01G49/02—Oxides; Hydroxides
    • C01G49/06—Ferric oxide [Fe2O3]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G9/00—Compounds of zinc
    • C01G9/02—Oxides; Hydroxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Geology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供一种利用可使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至空隙的多孔性固体状，来从生物样品迅速地分离核酸扩增反应用生物分子并将其扩增，进而在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法。

Description

用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体状及其用途
技术领域
本发明涉及用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体状及其用途，更具体地涉及从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，包括将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙的步骤；在生物样品中扩增靶序列的方法，包括直接添加多孔性固体状，或者执行逆转录酶反应之后，作为用于核酸扩增反应的模具来扩增靶序列的步骤，其中，上述多孔性固体状为通过将多孔性固体状接触于生物样品而使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙的多孔性固体状；利用上述在生物样品中扩增靶序列的方法的在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法；用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的试剂盒及组合物，包括多孔性固体状，其能够使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙。
背景技术
在检测动植物发病病原体的方法中，最常见的就是检测病原体的固有蛋白质的血清学诊断方法和检测核酸的分子生物学诊断方法。在分子生物学诊断方法中，最常用的方法就是聚合酶链反应(PCR,polymerase chain reaction)方法，它具有检测灵敏度高、任何人都可以方便使用的优点。为了执行PCR，首先应从对象组织中提取作为模具来利用的基因体。目前，DNA的提取方法有，使用苯酚/三氯甲烷的方法、盐析方法、使用离液序列高的盐及二氧化硅树脂的方法、使用亲和性树脂的方法、离子交换色谱法及使用磁珠的方法等。这些方法记载于美国专利第5057426号、第4923978号、EP专利第0512767A1号及EP第0515484B号、WO第95/13368号、WO第97/10331号及WO第96/18731号等。这些专利中的记载内容涉及使核酸吸收至固体支撑体之后从中分离(isolation)核酸的方法。根据以往使用的方法，为了分离核酸而使用恒定类型的溶剂。
利用PCR来扩增DNA或RNA模具中的靶部位的方法可应用于DNA分子标记、探针制作、cDNA及基因组组DNA文库制作、病原体检测等各种领域。例如，在对病原体的基因体进行扩增的情况下，可通过标的产物的扩增与否来轻松判断检体内是否存在病原体。在用于病原体诊断的情况下，PCR的特异性和检测灵敏度非常高，但很难实现一次性检查大量试料。这是由于如需从各种检体迅速分离PCR模具，仍需要消耗大量时间和费用。已报告有很多可从各种组织分离出DNA或RNA的多种方法，还有将血迹、头发、上皮细胞、叶片作为对象煮沸的方法、氢氧化钠(NaOH)处理VC-捕获、热提取、微波炉提取、氢氧化钠(NaOH)提取等方法，可使得PCR尽可能轻松地获取到基因体。但是，这些方法的基因体提取效率不均一，PCR的再现性低。若不阻碍PCR技法所具有的高特异性和检测灵敏度的前提下可从各种检体轻松地大量提取到PCR模具用生物分子，则PCR的应用性将远远高于目前的水平，这是显而易见的。
一方面，韩国授权专利第2005-0088164号中公开了核酸分离方法，日本授权专利第2007-506404号中公开了用于迅速检测核酸分子的方法，但并未揭示本发明的利用多孔性固体状来从生物样品中迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法。
发明内容
本发明是鉴于如上所述的需求而提出的，本发明人将感染黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)的辣椒叶作为生物样品，利用金属引脚V的后方扁平部分施压，使得作为多孔性固体状的氧化物材质的多孔性陶瓷立方体与上述生物样品相接触，并使得存在于辣椒试料内的RNA、gDNA及病毒粒子吸收至多孔性陶瓷立方体的空隙之后，针对被吸收的生物分子不实施利用单独溶剂的洗脱过程，而直接将多孔性陶瓷立方体作为模具放入PCR管，以黄瓜花叶病毒特异性引物扩增结果，可知其为感染黄瓜花叶病毒的辣椒。由此可知，将上述方法适用于精制的黄瓜花叶病毒粒子、感染黄瓜花叶病毒的全部RNA、精制的辣椒基因组DNA，根据陶瓷立方体的材质和制备温度，可有效地吸收上述基因体，并用于PCR和cDNA合成。并且，利用本发明的低温共烧陶瓷立方体，将从烟叶分离的核酸作为模具，成功的执行了多重逆转录PCR和以大肠菌为对象的细菌人工染色体(BAC)质粒扩增。
由此，本发明能够通过迅速分离存在于生物样品内的生物分子，来迅速诊断出是否存在靶序列，从而完成本发明。
为了解决上述问题，本发明提供从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，该方法包括将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙的步骤。
并且，本发明提供在生物样品中扩增靶序列的方法及利用上述方法在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法，上述在生物样品中扩增靶序列的方法包括直接添加多孔性固体状，或者执行cDNA合成所需逆转录酶反应之后，作为用于核酸扩增反应的模具来扩增靶序列的步骤，其中，上述多孔性固体状为通过将多孔性固体状接触于生物样品而使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙的多孔性固体状。
并且，本发明提供在生物样品内用于扩增靶序列的核酸扩增反应用试剂盒，该试剂盒包括多孔性固体状，能够使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙。
并且，本发明提供用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的试剂盒及组合物，该试剂盒及组合物包括多孔性固体状，其能够使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙。
本发明通过迅速分离存在于生物样品内的生物分子，可迅速诊断出是否存在靶序列，其将易于迅速准确地判别对象基因组DNA扩增、cDNA合成、病原体感染与否等。
附图说明
图1表示利用多孔性陶瓷立方体的基因体吸附和作为逆转录PCR/PCR模具的应用模式图。A：多孔性陶瓷立方体；B：多孔性陶瓷立方体的放大图，通过改变材料和制备温度，使得1立方毫米(1mm3)的立方体表面的空隙大小发生变化，进而制备14种立方体；C：将1个立方体放在植物体叶子上，利用引脚V后面向立方体施压，破碎组织，使得基因体吸收至立方体的空隙；D：将吸收基因体的1个立方体作为逆转录PCR或PCR的模具使用；E：在琼脂糖凝胶中确认PCR产物。
图2表示利用陶瓷切片从生物样品分离出核酸扩增反应所需的DNA/RNA模具的结果。A：用于制备约1mm3大小的陶瓷碎片的陶瓷切片(1～8)，6表示陶瓷切片5的箭头部位；B：将8种类型的陶瓷碎片放在甜椒(Capsicum annuum)CM334辣椒叶，利用引脚V施压之后，将其作为PCR模具来使用，以Tscar引物执行PCR的结果；C：以从A获得的8种类型陶瓷碎片吸收从CM334辣椒叶中精制的gDNA(1ug/μl)，将其作为PCR模具来使用，以Tscar引物执行PCR的结果，Lane M；1kb DNALadder，Lane PC；从CM334辣椒叶精制的gDNA(1ug/μl)1μl作为PCR模具来使用；D：借助逆转录PCR的番茄花叶病毒病(TSWV)检测，Lane M；1kb DNALadder，Lane NC；从健全的黄花烟草(Nicotiana rustica)烟叶分离的总RNA1μl作为逆转录反应模具来使用，Lane PC；从人工感染番茄花叶病毒病的烟叶中分离的总RNA1μl作为逆转录反应模具来使用，Lane 1～8；将8种的陶瓷碎片向感染番茄花叶病毒病的黄花烟(N.rustica)烟叶施压，使吸收生物分子(其中，病毒粒子或RNA)之后，将其作为逆转录反应模具来使用，箭头表示预计的PCR产物的大小。
图3为基因组DNA扩增最佳的图2A的4的陶瓷碎片(A)和以各个氧化物材质制备的多孔性陶瓷立方体的表面的扫描电子显微镜(SEM)放大图。图片均为1万倍放大图，根据材料和制备温度的不同，表面形态、空隙大小和数量均有差异。1～14：按顺序记录于表1的材料，bar：1μm。
图4为利用以各个氧化物材质制备的多孔性陶瓷立方体，从辣椒叶中分离黄瓜花叶病毒RNA及基因组DNA来执行逆转录PCR/PCR的结果。
A：以黄瓜花叶病病毒(cucumber mosaic virus，黄瓜花叶病毒)总RNA作为对象执行逆转录PCR的结果；B：以从辣椒叶中精制的基因组DNA作为对象执行PCR的结果，Lane M:1kb DNALadder，Lane PC：在A中，将从感染黄瓜花叶病毒的辣椒叶中分离的总RNA1μl作为逆转录PCR模具来使用。Lane 1～14：按顺序记录于表1的材料。在B中，将从CM334辣椒中分离的基因组DNA1μl作为PCR模具来使用。
图5为利用以各个氧化物材质制备的多孔性陶瓷立方体，以感染黄瓜花叶病毒的辣椒叶及精制的黄瓜花叶病毒粒子作为对象来调查生物分子的吸收率的结果。A：黄瓜花叶病毒感染辣椒叶，B：精制的黄瓜花叶病毒(Lane PC1：将感染黄瓜花叶病毒的CM334的总RNA1μl作为模具来使用。Lane PC2：将感染黄瓜花叶病毒的烟草细菌人工染色体(BAC)cum Xanthi-nc的总RNA1μl作为模具来使用)。Lane 1～14：按顺序记录于表1的材料。
图6为以辣椒叶为对象并利用在本发明中制备的各种多孔性陶瓷立方体来分析DNA扩增效率的结果。Lane M：1kb DNALadder，Lane 1～14：按顺序记录于表1的材料，Lane PC：将精制的gDNA1μl作为模具来使用。
图7为本发明的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体制备温度对PCR扩增产生影响的分析结果。Lane M：1kb DNALadder，Lane PC：将精制的gDNA1μl作为模具来使用，Lane 30～34：30(低温共烧陶瓷，650℃)，31(低温共烧陶瓷，700℃)，32(低温共烧陶瓷，750℃)，33(低温共烧陶瓷，800℃)，34(低温共烧陶瓷，850℃)。
图8表示根据制备温度的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体的表面(A～E)和内部(F～J)剖面。A～J：10,000倍观察的扫描电子显微镜(SEM)图片。30～34：30(低温共烧陶瓷，650℃)，31(低温共烧陶瓷，700℃)，32(低温共烧陶瓷，750℃)，33(低温共烧陶瓷，800℃)，34(低温共烧陶瓷，850℃)。
图9为根据制备温度的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷的物质吸收能力和过滤能力的调查结果。分别利用500倍扫描电子显微镜(SEM)和250倍透射电子显微镜(TEM)观察立方体的表面(A～E)和内部(F～J)剖面，调查金纳米粒子和聚苯乙烯粒子的混合液分布。30～34：30(低温共烧陶瓷，650℃)，31(低温共烧陶瓷，700℃)，32(低温共烧陶瓷，750℃)，33(低温共烧陶瓷，800℃)，34(低温共烧陶瓷，850℃)。
图10为根据制备温度的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷的物质吸收能力和过滤能力的调查结果。
洗脱吸收至低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体的内部的金纳米粒子及聚苯乙烯粒子之后，利用3500倍透射电子显微镜(TEM)调查其分布。33(低温共烧陶瓷，800℃)，34(低温共烧陶瓷，850℃)。
图11为立方体表面的特性对PCR产物扩增效率产生的影响的调查结果。A～C：以1000倍拍摄的扫描电子显微镜(SEM)图片。A、33(低温共烧陶瓷，800℃)立方体，不研磨；B、33，研磨48小时；C、33，研磨72小时。D与E：Lane M，1kb DNA(DNA)Ladder；Lane PC，将精制的基因组DNA(gDNA)1μl作为模具来使用；Lane 39，33(低温共烧陶瓷，800℃)立方体，不研磨；Lane 41，33，研磨48小时；Lane 42，33，研磨72小时。使用引物10(D)和146(E)。
图12为将利用本发明的低温共烧陶瓷立方体而从烟叶分离的生物分子作为模具的多重(multiplex)逆转录PCR结果。Lane M：1kb DNALadder，Lane 1～3为分别是黄瓜花叶病毒(473bp)、三叶草黄脉病毒(CIYVV)(806bp)、黄瓜花叶病毒(473bp)+三叶草黄脉病毒(806bp)的逆转录PCR产物。
图13为利用本发明的低温共烧陶瓷立方体并以大肠菌为对象的细菌人工染色体(BAC)质粒扩增结果。Lane M：1kb DNALadder，Lane 1～4将大肠菌培养液1μl、2μl、3μl、4μl作为模具来使用。5～8分别放入使吸收大肠菌的多孔性陶瓷立方体(8，低温共烧陶瓷，850℃)一个、两个、三个、四个并作为模具来使用。聚合酶链条厚度保持恒定，即，大肠菌被均匀地吸收，吸收至1个立方体的模具与4个的情况并无差别。此时，当提高引物浓度时，相比于聚合酶链条为1个的情况，使用4个时明显变厚。1～4表示大肠菌培养液的粘度高而导致无法恒定地添加的结果。
图14表示为了使吸收生物分子而可利用的多孔性陶瓷的形态。
A；单一的简单结构(矩形、圆形等)，B；为了提高材料吸收率，在单一简单结构的内部形成孔状空间的结构，C；表面气孔尺寸及相互不同的材料整合的结构，D；密度不同的双重结构(左侧)及内部包含空隙的结构(右侧)
具体实施方式
为了实现本发明的目的，本发明提供从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，该方法包括将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙的步骤。
在本发明的一实现例的方法中，上述生物样品可源于动物、植物、细菌或霉菌，优选地，可源于植物或动物，但不受此限定。
在本发明中，作为将多孔性固体状接触于生物样品的方法，在生物样品的形态为液状的情况下，上述方法表示通过单纯接触来引导向多孔性固体状的吸收的方法，在生物样品的形态为固体状的情况下，上述方法表示利用引脚V扎入多孔性固体状而导致细胞被破坏时产生的生物分子的吸收方法，但上述方法不受此限定。
在本发明的一实现例的方法中，上述生物分子可以是DNA、RNA、dsRNA、microRNA、类病毒(viroid)、病毒、细菌、霉菌或微藻类，优选地，可以是DNA或RNA，但不受此限定。
关于本发明的生物分子，在动物的情况下，可以从各种来源(source)获取，例如肌肉、表皮、血液、骨头、脏器，最优选地，可以从肌肉或血液中获取，但不受此限定。在植物的情况下，可以从各种部位提取物中获取，例如叶、花、茎、根、果、种，最优选地，可以从叶、种或花中获取，但不受此限定。在微生物的情况下，可以从菌种、菌丝或分泌物(ooze)获取，最优选地，可以从它们集中栖息的地方(病变发生部位)中获取，但不受此限定。在病毒、细菌、霉菌或微藻类的情况下，通过使合理调整空隙大小的多孔性固体状接触，使得它们的部分粒子或全部细胞吸收至空隙内，并将其作为模具促使PCR，在PCR步骤中的高温改性步骤(约94～96℃)中，由于组织破坏，可释放内部的核酸，进而可以分析对象遗传基因。
本发明的生物分子不仅可以包括作为核酸分子的基本构成单位的核苷酸，还可以包括核苷酸的盐基变形的类似物(analogue)。
在通过本发明的方法分离的生物分子为gDNA的情况下，可以使陶瓷棒前端接触生物样品来进行吸附。在先驱体为mRNA的情况下，使陶瓷棒前端接触生物样品，将吸附于前端的总RNA作为模具并利用逆转录酶，合成至cDNA。由于上述总RNA是从植物或动物细胞中分离的，因此，mRNA的末端具有多聚腺苷酸尾，利用这种序列特性的OligodT引物及逆转录酶，可容易合成cDNA。并且，在病毒的情况下，若有多聚腺苷酸尾，cDNA，而如若烟草花叶病毒没有多聚腺苷酸尾，则根据本发明所属行业公开的各种方法，利用特异性下游引物(antisense primer)，向对象核糖核酸(RNA)合成cDNA。
在本发明的方法中，上述少量的生物分子可应用于可作为模具的本发明所属行业公开的各种方法。例如，可应用于本发明的技术包括CAPS或SCAR分子标记、使用荧光标记的HRM、实时PCR、嵌套(Nested)PCR、免疫捕捉(immunocapture)PCR、同时用于各种病原体检测的多重(Mutiplex)PCR、直接性DNA序列决定、单链构象分析(SSCA，Orita et al.，PNAS，USA 86:2776(1989))、RNase保护分析(Finkelstein et al.，Genomics，7:167(1990))、改性梯度凝胶电泳(DGGE，Wartell et al.，Nucl.Acids Res.，18:2699(1990))、利用可识别核苷酸失配的蛋白质(例如：E.coli的mutS蛋白质)的方法(Modrich，Ann.Rev.Genet.，25:229-253(1991))、对立型特异PCR，但不受此限定。
在适用核酸扩增技术的情况下，为了本发明的病毒检测，如何设计合适的引物很重要。但是，相比于在相同管中执行逆转录反应(RT)及PCR的情况，在分别于不同的管中执行逆转录反应和PCR的情况下，更能够增加模具的扩增量，进而提高病毒检定结果的可靠性。在本发明的优选实现例中，本发明提供一种以与吸收至陶瓷块的核苷酸相匹配的方式设计的利用基因分型(genotyping)引物来分析组织内是否存在病毒的方法。
通过本发明的核酸扩增可用于DNA分子标记制作、探针制作、cDNA及基因组DNA文库制作、病原体检定等，但不受此限定。
在本发明的一实现例的方法中，上述核酸扩增反应有cDNA合成、聚合酶链反应(PCR)、多重(muliplex)PCR、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、连接酶链反应(ligase chain reaction)、基于核算序列的扩增(nucleic acidsequence-based amplification)、基于转录的扩增系统(transcription-basedamplification system)、链置换扩增(strand displacement amplification)或通过Qβ复制酶(replicase)的扩增或本发明所属行业公开的用于扩增核酸分子的任何其它合适的方法。在上述内容中，PCR是指利用聚合酶从以特异性方式结合于对象核酸的引物对来扩增目标核酸的方法。这种PCR方法已被本发明所属行业公开，还可利用商用试剂盒。
在本发明的一实现例的方法中，上述多孔性固体状可以是碳化纤维素类、粒子状纸团、天然沸石或合成沸石、聚苯乙烯(polystylene)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚丙烯(polyprophylene)、多孔性金属粒子、多孔性橡胶、以粒子状玻璃纤维团形成的微孔玻璃、石灰、贝壳、陶瓷切片或氧化物材质的陶瓷，优选地，可以是氧化物材质的陶瓷，但不受此限定。
在本发明的一实现例的方法中，上述氧化物材质的陶瓷可以是三氧化二铝(Al2O3)、三氧化二铁(Fe2O3)、低温共烧陶瓷(Low temperature co-firedceramic)、以氧化铅(PbO)或氧化锌(ZnO)为主要成分制备的陶瓷，但不受此限定。
在本发明的一实现例的方法中，上述多孔性固体状可以是正方体、长方体、球形、圆柱形、条形(bar type)、条的一侧末端具有槽的条形或端部尖锐的条形、条的一侧末端具有槽并且端部尖锐的条形或者条的一侧末端具有槽且端部尖锐且尖锐端部一侧的内部具有大空隙的条形，但不受此限定。
作为本发明的多孔性固体状，在使用氧化物材质的陶瓷的情况下，可调节其空隙的大小，在使用相同氧化物材质来制备多孔性陶瓷的情况下，可以根据制备温度来调节空隙的大小及空隙的数量，根据对象生物分子的类型来利用最优化的多孔性陶瓷，可有效地执行PCR或逆转录PCR。这种多孔性陶瓷的空隙的大小可合理地调节多孔性固体状的大小，使得在对象生物样品中选择性地吸收目标生物分子。并且，对于上述氧化物材质的陶瓷的外形大小，只要能够轻易地进入PCR用管中，对此不做特殊限制，例如，可以是1mm3，但不受此限定。
并且，本发明提供在生物样品中扩增靶序列的方法，该方法包括如下步骤：
步骤a，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙；以及
步骤b，将步骤a的使吸收生物分子的多孔性固体状作为用于核酸扩增反应的模具进行添加，利用目标引物组执行扩增反应，来扩增靶序列
在本发明的一实现例的方法中，上述核酸扩增反应如上所述。
并且，本发明提供在生物样品中扩增靶序列的方法，该方法包括如下步骤：
步骤a，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙；
步骤b，向步骤a的使吸收生物分子的多孔性固体状添加逆转录酶(Reverse Transcriptase)，来执行逆转录酶反应；以及
步骤c，将上述逆转录酶反应物作为用于核酸扩增反应的模具进行添加，利用目标引物组执行扩增反应，来扩增靶序列。
并且，本发明提供在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法，该方法包括如下步骤：
步骤a，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙；
步骤b，将步骤a的使吸收生物分子的多孔性固体状作为用于核酸扩增反应的模具进行添加，利用目标引物组执行扩增反应，来扩增靶序列；以及
步骤c，检测上述扩增产物。
并且，本发明提供在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法，该方法包括如下步骤：
步骤a，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙；
步骤b，向步骤a的使吸收生物分子的多孔性固体状添加逆转录酶(Reverse Transcriptase)，来执行逆转录酶反应；
步骤c，将上述逆转录酶反应物作为用于核酸扩增反应的模具进行添加，利用目标引物组执行扩增反应，来扩增靶序列；以及
步骤d，检测上述扩增产物。
本发明的方法包括检测上述扩增产物的方法。上述扩增产物的检测可通过DNA芯片、凝胶电泳、放射性测量、荧光测量或磷光测量来执行，但不受此限定。作为检测扩增产物的方法之一，可执行凝胶电泳。凝胶电泳可根据扩增产物的大小，利用琼脂糖凝胶电泳或丙烯酰胺凝胶电泳。并且，根据荧光测量方法，在引物的5'-末端标记Cy-5或Cy-3并执行PCR时，靶序列标记成可检测的荧光标记物质，利用荧光测定仪可测量这种被标记的荧光。并且，根据放射性测量方法，当执行PCR时，向PCR反应液添加如32P或35S等的放射性同位元素来标记扩增产物之后，利用放射性测量仪器，例如盖革计数器(Geiger counter)或液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)来测量放射性。
并且，本发明提供在生物样品内用于扩增靶序列的核酸扩增反应用试剂盒，包括：多孔性固体状，能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空隙；目标引物组；以及试剂，用于执行扩增反应。
本发明的上述核酸扩增反应用试剂盒可包括用于microRNA分离、smallRNA分离或cDNA合成的试剂，但不受此限定。
在根据本发明的一实现例的试剂盒中，用于执行扩增反应的上述试剂可包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲剂等。并且，本发明的试剂盒可补充包括记载有最佳反应执行条件的使用指南书。指南书是说明有试剂盒的使用方法的印刷物，例如PCR缓冲液制备方法、建议反应条件等。指南书包括在手册或传单形态的指南册子、附着在试剂盒的标签以及用于包含试剂盒的包装的表面上的说明。并且，指南书还包括通过如同互联网等电子媒介公开或提供的信息。
在根据本发明的一实现例的试剂盒中，上述核酸扩增反应可以是cDNA合成、PCR(Polymerase Chain Reaction)、多重(multiplex)PCR或逆转录PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)，但不受此限定。并且，上述多孔性固体状如上所述。
并且，本发明提供用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的试剂盒，该试剂盒包括多孔性固体状，能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空隙。
在根据本发明的一实现例的试剂盒中，上述核酸扩增反应可以是cDNA合成、PCR(Polymerase Chain Reaction)、多重(multiplex)PCR或逆转录PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)，但不受此限定。并且，上述多孔性固体状如上所述。
并且，本发明提供用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的组合物，该组合物包括多孔性固体状，能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空隙。上述组合物包括能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空隙多孔性固体状，通过使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至上述多孔性固体状的空隙，来用于核酸扩增反应。上述多孔性固体状如上所述。
在根据本发明的一实现例的组合物中，上述核酸扩增反应可以是cDNA合成、PCR(Polymerase Chain Reaction)、多重(multiplex)PCR或逆转录PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)，但不受此限定。并且，上述多孔性固体状如上所述。
以下，将根据实施例对本发明进行详细说明。但是，下述实施例仅仅用于例示本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。
实施例1.利用多孔性陶瓷立方体的基因体吸附与作为逆转录PCR/PCR模具的应用
图1表示了本发明的利用多孔性陶瓷立方体的基因体吸附与作为逆转录PCR/PCR模具的应用模式图。在本发明中，以表1中记载的主要成分作为材料，通过改变制备温度，使得1立方毫米(1mm3)的立方体表面的空隙大小发生变化，进而制备14种立方体，将其多孔性陶瓷立方体放大显示于图1B。由于立方体为多孔性，因此，非选择性地吸收小于空隙的物质，通过改变空隙的大小(通常，在高温下制备陶瓷时，空隙变小)，在组织被破坏时产生的各种物质中，可以选择性地进行吸收，即，目的在于以可最大限度地排除PCR阻碍物质的空隙的大小来向立方体赋予超滤(ultrafiltration)功能。
在本发明中，将制备的上述1个多孔性陶瓷立方体放在植物体叶子上，利用引脚V后面向立方体施压，破碎组织，使得基因体吸收至立方体的空隙，在琼脂糖凝胶中确认将吸收有基因体的上述1个立方体作为逆转录PCR或PCR模具来使用的结果(图1E)。
实施例2.利用陶瓷切片从生物样品分离用于核酸扩增反应的DNA/RNA模具
使用钳子(nipper)细碎包括青瓷和白瓷的7种类的陶瓷切片，在不包含釉料的部位中，挑选大小约为1mm3的碎片，用作基因体吸附材料。在图2A的5号陶瓷切片的情况下，根据涂敷有釉料的部位，分为黄色和灰色，由此分别获得的黄土色碎片标记为5号，灰色碎片标记为6号。在甜椒CM334辣椒叶上放置各陶瓷碎片，利用引脚V的扁平的后端轻压陶瓷碎片，使得吸收gDNA向PCR管添加可检定出辣椒的表皮毛管相关分子标记的引物预混料，并向每个PCR管添加各一个吸收有gDNA的陶瓷碎片。PCR预混料由10pmol上游引物(Tsca-F：AAACGCCATCATTCGTTTTC：序列号1)0.5μl、10pmol下游引物(Tsca-R：CATGAAAGTTGACCCGAACA：序列号2)0.5μl、rTaq-Mix 4μl、DW 15μl构成，PCR产物在94℃条件下实施3分钟改性过程，然后，在(94℃/30秒钟、59℃/30秒钟、72℃/60秒钟)条件下扩增35次，使反应72℃/5分钟之后，在包含EtBr的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，来确认是否存在对象PCR产物的扩增。
其结果，如图2B所示，在陶瓷碎片4、5、6中，可知PCR产物得到扩增。使用电子显微镜观察基因组DNA的扩增最佳的陶瓷碎片4的表面，可知陶瓷内的空隙以各种不同的大小分布(图3的A)。但是，在无法一致地调节陶瓷碎片的表面或面积的情况下，难以明确区分陶瓷碎片的类型和PCR产物扩增效率。
因此，为了确认每个陶瓷碎片对辣椒的gDNA的吸收程度以及实际上是否可适用于PCR，以精制的CM334gDNA(1ug/μl)替代叶子来用作材料。
向塑料培养皿的表面滴落精制的gDNA，每次滴落1μl，接着，以各个陶瓷碎片吸收gDNA，将其用作PCR用模具。如图2C所示，可知如同将1μl的CM334gDNA作为模具来使用的阳性对照区(PC)，相同大小的PCR产物在所有处理区均得到扩增，它们的浓度之间有所差异，而这应该是由于所使用的陶瓷碎片的大小或表面积不均匀所致。一方面，吸收gDNA的上述陶瓷碎片可用作PCR扩增用模具，对此，调查了它们能否用于植物病毒诊断。利用QIAGEN RNeasy Mini Kit，为了精制阴性对照区用RNA和阳性对照区用RNA，从未感染病毒的健全的黄花烟草烟叶(NC用)和人工感染番茄花叶病毒病(TSWV)的黄花烟草烟叶(PC用)分离全部RNA，并将其用作逆转录反应用模具。在感染番茄花叶病毒病的烟叶上放置各个陶瓷碎片，使用引脚V下压，使得吸收RNA或病毒粒子，向添加有10pmol下游引物TSNCPR(5'-TCAAGCAAGTTCTGCGAGTT-3'：序列号3)0.5μl的逆转录反应用RT-预混料(reverse transcription master premix，ELPIS-Biotech，Korea)，每管各添加一个陶瓷碎片。在42℃条件下执行1小时的逆转录反应之后，将1μl反应液用作PCR用模具。PCR预混料由10pmol上游引物(Tsca-FAAACGCCATCATTCGTTTTC：序列号4)0.5μl、10pmol下游引物(Tsca-RCATGAAAGTTGACCCGAACA：序列号5)0.5μl、rTaq-Mix 4μl、DW 15μl构成。PCR在94℃条件下实施3分钟改性过程，然后，在(94℃/30秒钟、59℃/30秒钟、72℃/60秒钟)条件下扩增35次，使反应72℃/5分钟之后，在包含EtBr的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，来确认是否存在对象PCR产物(777bp)的扩增。如图2D所示，除了4号和6号的陶瓷碎片之外的剩余陶瓷碎片处理区中确认了预计的逆转录PCR产物成功得到扩增。这意味着仅以吸收至陶瓷碎片的番茄花叶病毒RNA或番茄花叶病毒粒子也可以实现番茄花叶病毒检定，相比于如图2B所示的gDNA，在逆转录PCR中PCR产物实现了更好的扩增，是由于通过逆转录反应生成了更多的PCR模具。根据以上结果，可判断出若按照恒定大小制备陶瓷碎片并将其用于吸收生物分子，则可以实现更优秀的结果。
实施例3.根据氧化物材质的多孔性陶瓷立方体的种类的生物分子的吸收率调查
图3表示以表1中记载的氧化物为主要成分制备的各个多孔性陶瓷立方体的表面的扫描电子显微镜(SEM)放大图。由于根据陶瓷主要成分和制备温度，表面和空隙的大小会不同，因此，为了提高对象生物分子的吸收率，应制备成具有陶瓷立方体的最优化空隙的大小及数量后投入使用。
表1[表1]
编号 主要成分 制备温度(℃)
1 三氧化二铝(Al2O3) 1450
2 三氧化二铝(Al2O3) 1550
3 三氧化二铁(Fe2O3) 800
4 三氧化二铁(Fe2O3) 850
5 三氧化二铁(Fe2O3) 900
6 低温共烧陶瓷 650
7 低温共烧陶瓷 750
8 低温共烧陶瓷 850
9 氧化铅(PbO) 1000
10 氧化铅(PbO) 1150
11 氧化铅(PbO) 1250
12 氧化锌(ZnO) 800
13 氧化锌(ZnO) 900
14 氧化锌(ZnO) 1000
①从感染黄瓜花叶病毒的甜椒CM334辣椒叶分离的总RNA和从CM334辣椒中分离的基因组DNA对象
为了调查根据氧化物材质的多孔性陶瓷立方体的类型的生物分子的吸收效率，使得从感染黄瓜花叶病毒的辣椒叶中分离的总RNA和从CM334辣椒中分离的基因组DNA分别吸收至各个陶瓷立方体之后，将其用作逆转录PCR和PCR用模具。关于黄瓜花叶病毒，分别以25pmol的浓度向逆转录PCR预混料(RTamp1，Biocubesystem，Korea)添加上游(5'-TACATTGAGTCGAGTCATG-3'：序列号6)及下游(5'-TGGAATCAGACTGGGACA-3'：序列号7)引物，50℃/20分钟、94℃/10分钟，(94℃/30秒钟、55℃/30秒钟、72℃/60秒钟)35次，反应72℃/5分钟之后，在包含EtBr的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，确认对象PCR产物(670bp)的扩增与否(图4A)。在gDNA的情况下，将从甜椒CM334(Capsicum annuum CM334)辣椒叶分离的高浓度(100ug)gDNA分别吸收至多孔性陶瓷立方体，向每个PCR管分别添加1个上述立方体。PCR预混料由10pmol上游引物(Tsca-F：AAACGCCATCATTCGTTTTC：序列号8)0.5μl、10pmol下游引物(Tsca-R：CATGAAAGTTGACCCGAACA：序列号9)0.5μl、rTaq-Mix 4μl、DW 15μl构成，PCR产物在94℃条件下实施3分钟改性过程，然后，在(94℃/30秒钟、59℃/30秒钟、72℃/60秒钟)条件下扩增35次，使反应72℃/5分钟之后，在包含EtBr的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，来确认是否存在对象PCR产物的扩增。在病毒RNA的情况下，如图4A所示，14种陶瓷立方体均表现出相似的结果(图4A)。相反，利用精制的gDNA的PCR的效率，根据材质和制备温度的不同而表现各异(图4B)。在Lane 1(三氧化二铝(Al2O3)，1450℃)和Lane 2(三氧化二铝(Al2O3)，1550℃)中，扩增量并无明显差异，在低温下制备的Lane 3(三氧化二铁(Fe2O3)，800℃)与Lane 4(三氧化二铁(Fe2O3)，850℃)中几乎未实现扩增，但在高温下制备的Lane 5(三氧化二铁(Fe2O3)，900℃)中出现微弱扩增。Lane 6(低温共烧陶瓷，650℃)虽未实现扩增，但在Lane 7(低温共烧陶瓷，750℃)和Lane 8(低温共烧陶瓷，850℃)中实现明显扩增。Lane 9(氧化铅(PbO)，1000℃)和Lane 11(氧化铅(PbO)，1250℃)的扩增量虽小，但Lane 10(氧化铅(PbO)，1150℃)的扩增明显。Lane 12(氧化锌(ZnO)，800℃)和Lane 14(氧化锌(ZnO)，1000℃)几乎未实现扩增，Lane 13(氧化锌(ZnO)，900℃)少量扩增。综合以上结果，根据立方体材料和制备温度，基因组DNA的吸收率不同，如Lane 8(低温共烧陶瓷、850℃)、Lane 11(氧化铅(PbO)，1250℃)、Lane 14(氧化锌(ZnO)，1000℃)，在几乎不存在空隙的结构中，本实验所用PCR条件下只能吸收非常少量的几乎无法检测到的基因组DNA。
②感染黄瓜花叶病毒的辣椒叶和精制的黄瓜花叶病毒粒子对象
为了调查根据多孔性陶瓷立方体的类型的生物分子的吸收效率，使得感染黄瓜花叶病毒的辣椒叶和精制的黄瓜花叶病毒粒子分别吸收至各个陶瓷立方体之后，将其用作逆转录PCR和PCR用模具。关于黄瓜花叶病毒，分别以25pmol的浓度向逆转录PCR预混料(RTamp1，Biocubesystem，Korea)添加作为黄瓜花叶病毒粒子对象特异性引物组的上游(5'-TACATTGAGTCGAGTCATG-3'：序列号10)及下游引物(5'-TGGAATCAGACTGGGACA-3'：序列号11)，50℃/20分钟、94℃/10分钟，(94℃/30秒钟、55℃/30秒钟、72℃/60秒钟)35次，反应72℃/5分钟之后，在包含EtBr的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，确认对象PCR产物(670bp)的扩增与否。当使精制的病毒吸收至多孔性陶瓷立方体时，PCR产物的扩增量更多，但两个处理区间的PCR产物扩增形态相似(图5)。
③根据多孔性陶瓷立方体的制备温度及材质的生物分子的吸收率
图5A的Lane 1、2的主要成分均为三氧化二铝(Al2O3)，制备温度分别为1450℃、1550℃，Lane 3、4、5的主要成分均为三氧化二铁(Fe2O3)，制备温度分别为800℃、850℃、900℃，使用三氧化二铝(Al2O3)及三氧化二铁(Fe2O3)分别在1550℃及900℃条件下制备多孔性陶瓷立方体，并利用上述立方体分离DNA，此时，PCR效率表现出高水平。Lane 6、7、8的主要成分均为低温共烧陶瓷(Low temperature co-fired ceramic)，制备温度分别为650℃、750℃、850℃，Lane 6完全没有实现扩增，Lane 8的扩增优于Lane 7的扩增。
④利用多孔性陶瓷立方体的辣椒DNA的扩增效率分析
在甜椒sr10(Capsicum annuum sr10)辣椒叶上面分别放置一个多孔性陶瓷立方体，使用引脚V的后端部分下压，使得gDNA吸收至各个立方体，并向每个PCR管各添加一个立方体。在PCR反应液的制备中，向2X PCR预混料(gDamp1，Biocubesystem，Korea)10μl添加10pmol上游引物(Primer 10-F：5'-TGGCTTATCGAAGGAGCCAT-3'：序列号12)0.5μl、10pmol下游引物(Primer 10-R：5'-AGATGAAACCAAAGCCTCCA-3'：序列号13)0.5μl、吸收有gDNA的1个立方体、DW 9μl，而在阳性对照区中，以精制的gDNA(20ng/μl)2μl和DW 7μl替代立方体。PCR产物在94℃条件下实施3分钟改性过程，然后，在94℃/30秒钟、59℃/30秒钟、72℃/60秒钟条件下扩增35次，使反应72℃/5分钟之后进行扩增，在包含EtBr的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，来确认是否存在对象PCR产物的扩增。其结果，Lane 5(三氧化二铁(Fe2O3)，900℃)、Lane 8(低温共烧陶瓷，850℃)，Lane 9(氧化铅(PbO)，1000℃)、10(氧化铅(PbO)，1150℃)及Lane 14(氧化锌(ZnO),1000℃)扩增良好，Lane 6(低温共烧陶瓷，650℃)、Lane 7(低温共烧陶瓷，750℃)及Lane 8(低温共烧陶瓷，850)和Lane 12(氧化锌(ZnO)，800℃)、Lane13(氧化锌(ZnO)，900℃)及Lane 14(氧化锌(ZnO)，1000℃)则根据制备温度的不同而扩增效率显著不同(图6)。
实施例4.根据制备条件的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体
①低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体制备温度对PCR扩增产生的影响
反复进行实验的结果，相比于使用氧化锌(ZnO)的情况，当采用低温共烧陶瓷材料时，根据制备温度的基因组gDNA扩增差异显著(参考图6)。为了更加仔细地调查根据制备温度的gDNA扩增效率，重新制备低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体5种(30～34)。制备温度为650～850℃，以每种50℃的差异进行制备。(30(低温共烧陶瓷，650℃)、31(低温共烧陶瓷，700℃)、32(低温共烧陶瓷，750℃)、33(低温共烧陶瓷，800℃)、34(低温共烧陶瓷，850℃))。此时，所用的引物为两种，即，上游引物(Primer 10-F：5'-TGGCTTATCGAAGGAGCCAT-3'：序列号12)、下游引物(Primer 10-R：5'-AGATGAAACCAAAGCCTCCA-3'：序列号13)和上游引物(Primer 146-F：5'-AGAAGAAAGAGGAGGCTCCA-3'：序列号14)、下游引物(Primer 146-R：5'-TGGAAGCCTTTGAGGGATCT-3'：序列号15)。PCR产物在94℃条件下实施3分钟改性过程，然后，在94℃/30秒钟、59℃/30秒钟、72℃/60秒钟条件下扩增35次，使反应72℃/5分钟之后进行扩增，在包含EtBr的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，来确认是否存在对象PCR产物的扩增(图7)。
从表示PCR结果的图7可知，在Lane 30(低温共烧陶瓷，650℃)的情况下，如图6的Lane 6(低温共烧陶瓷，650℃)，两种类型引物中均未实现gDNA扩增。在Lane 31(低温共烧陶瓷，700℃)中，引物10实现了微小的扩增，但引物146的扩增良好。在Lane 32(低温共烧陶瓷，750℃)和Lane33(低温共烧陶瓷，800℃)中，两个引物均实现了很好的扩增。相反，在Lane 34(低温共烧陶瓷，850℃)中，表现出与Lane 31(低温共烧陶瓷，700℃)相似的结果，这启示着根据不同引物的PCR扩增效率会不同。从以上结果可分析出，当以低温共烧陶瓷制备多孔性陶瓷立方体时，合适的制备温度为750℃～800℃。
②根据制备温度的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体的表面(A～E)和内部(F～J)剖面
为了调查根据制备温度的立方体的特性，制备5种低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体，分别以扫描电子显微镜和透射电子显微镜对它们的表面(图8A～E)和内部(图8F～J)剖面、物质吸收能力及过滤能力进行调查。立方体的表面(图8A～E)和内部(图8F～J)剖面，随着制备温度的增加，表现出越来越光滑的倾向。在两种情况下，细孔尺寸在μm水平上几乎相似，而且温度越高，细孔数量表现出越来越减少的倾向。
③根据制备温度的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体的物质吸收能量和过滤能力分析
细孔数量减少可以理解成分子吸收量变少，但为了获得进一步明确的资料，针对具有不同制备温度的低温共烧陶瓷多孔性陶瓷立方体的物质吸收能量和过滤能力，利用人为制备的金纳米粒子(平均直径为40nm)和聚苯乙烯粒子(平均大小直径为2μm、5μm、38～45μm，Beads&Micro，Korea)的混合液进行了调查。向每个不同直径的上述两种物质的混合液20μl中，浸渍在相同温度下制备的立方体10个，利用微量吸管和过滤纸，彻底去除了滤液。向相同管添加灭菌水10μl后，在65℃温度条件下静置30分钟，实施10秒钟的涡流之后，观察剩余立方体的表面特性和洗涤液(washing)的粒子分布(扫描电子显微镜为5000倍、透射电子显微镜为250倍)。
5000倍放大观察立方体的表面的结果，可从图9D及9E中容易观察到的细孔中，集中分布有相似大小的粒子(直径约为1μm以内)(图9D及9E)，在33及34立方体的表面上实现明显区分。当以透射电子显微镜观察立方体洗涤液时，观察到直径为38μm以上的粒子在所有处理区中分散地分布(未提交资料)。对此，判断为由于附在立方体表面的混合液未能完全去除而产生的结果。一方面，观察到直径为2～5μm的粒子在所有处理区中均匀地分布，在30(低温共烧陶瓷，650℃)处理区中，相比于其它处理区，洗脱的粒子的量明显多(图9F)，在其它处理区中主要观察到直径约为2μm的粒子(图9G～J)。在DNA扩增结果最好的33(低温共烧陶瓷，800℃)立方体处理区中，相比于其它处理区，主要分布有2μm以下的粒子。
图9的结果意味着，合成粒子因多孔性陶瓷立方体的吸收力而被动地吸入至细孔内，而且根据细孔的直径，可以选择性地吸入粒子，而实际上，当以更高倍率观察33和34立方体的洗涤液时，洗脱的粒子直径为26nm至500nm(图10A及图10B)，以非常恒定的大小分布。这也启示着在恒定地调节细孔大小的情况下，可以选择性地吸收特定大小的粒子。
④立方体的表面的特性对PCR产物扩增效率产生的影响
调查表面的粗糙度和细孔数量对生物分子(在这里是gDNA)的吸收量造成多大影响。针对DNA扩增结果最好的33(低温共烧陶瓷，800℃)立方体的表面进行分别48小时和72小时的研磨，比较它们的表面特性和PCR扩增效率。
在辣椒叶上放置一个多孔性陶瓷立方体，利用引脚V的后端部分下压，使得吸收至各个立方体，将其向每个PCR管各添加一个。PCR反应液通过向2X PCR预混料(gDamp1，Biocubesystem，Korea)10μl添加10pmol上游引物0.5μl、10pmol下游引物0.5μl、吸收有gDNA的1个立方体、DW 9μl而完成制备，在阳性对照区中，以精制的基因组gDNA(20ng/μl)2μl和DW 7μl替代了立方体。PCR产物在94℃条件下实施3分钟改性过程，然后，在(94℃/30秒钟、59℃/30秒钟、72℃/60秒钟)条件下扩增35次，使反应72℃/5分钟之后实施扩增，在包含EtBr的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，来确认是否存在对象PCR产物的扩增。
观察各立方体表面的结果，表面的粗糙程度以48小时、72小时、0小时的顺序增加，相比于其它处理区，48小时处理区的细孔数量少。利用这些试料以PCR用引物10号和146号调查DNA扩增效率的结果，相比于非研磨区，48小时研磨区中的PCR扩增效率低，但是在72小时处理区，PCR产物的扩增效率相似或略高(图11)。
从以上结果可知，制备温度对立方体表面的粗糙度和表面积以及细孔大小产生影响。并且，根据制备温度的立方体的特性变化，在将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子(在这里是gDNA或核)吸收至多孔性固体状的空隙的步骤中，对于用于PCR的模具和反应抑制物质的整体吸收力产生影响。但是，作为更为重要的特性变化，制备温度通过对存在于多孔性立方体的细孔的数量或大小以及表面积进行调节，不仅可以选择性地去除PCR阻碍物质，还对于获取PCR所需足够量的初始模具造成很多影响。
实施例5.利用本发明的低温共烧陶瓷立方体，从复合感染病毒的烟叶分离的生物分子作为模具的多重(multiplex)逆转录PCR
使本烟(N.benthamiana)复合感染黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)和三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein potyvirus)，增殖病毒之后，向复合感染的烟叶上面放置1个多孔性陶瓷立方体(33，低温共烧陶瓷，800℃)，使用引脚V的后端部分下压，使生物分子(病毒粒子或病毒中间体)吸收至立方体。向每个PCR管分别添加1个吸收有模具的立方体，分注逆转录PCR反应液。在单独检测各病毒的情况下，逆转录PCR反应液通过向逆转录PCR预混料(RTamp1，Biocubesystem，Korea)添加10pmol上游引物1μl、10pmol下游引物1μl、吸收有模具的1个立方体、DW 18μl来完成制备。在多重逆转录PCR中，按照如上方式添加相应病毒的引物之后，添加DW 6μl来完成制备。PCR产物在94℃条件下实施3分钟改性过程，然后，在52℃/20分钟、94℃/30秒钟、68℃/30秒钟、72℃/60秒钟条件下扩增35次，使反应72℃/5分钟之后实施扩增，在包含EtBr的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，来确认是否存在对象PCR产物的扩增。关于在逆转录PCR中使用的引物，在黄瓜花叶病毒的情况下，使用DPU1上游引物(5'-CGTCGTGGTTCCCGCTCCG-3'：序列号16)和DPd2下游引物(5'-AGCGCGCATCGCCGAAAGAT-3'：序列号17)，在三叶草黄脉病毒的情况下，使用2F上游引物(5'-TAAGAGAGGGGCACAGTGGA-3'：序列号18)和2R下游引物(5'-GCAACAGCACGGGTAACA-3'：序列号19)。图12的结果意味着以吸收至多孔性陶瓷立方体的模具足够在当前的反应液中实施多重逆转录PCR。
实施例6.利用本发明的低温共烧陶瓷立方体并以大肠菌为对象的细菌人工染色体(BAC)质粒扩增
分析得出多孔性陶瓷立方体具有吸收能力和过滤效果，这一结果是通过使细菌培养液吸收至立方体，并将其作为模具来使用时，是否成功发生PCR来得到证实的。将细菌人工染色体(BAC)菌落用灭菌的牙签接种至大肠菌培养液液体培养基5ml，作为阳性对照区培养15小时的大肠菌，并将增殖液1μl、2μl、3μl、4μl作为模具来使用。将保鲜膜平整地铺在实验台上面，向保鲜膜上面分别以10μl的量分体大肠菌培养液之后，将多孔性陶瓷立方体(34，低温共烧陶瓷，850℃)分别放入一个、两个、三个、四个，使吸收大肠菌。使用引脚V捞取吸收有大肠菌的立方体，纸巾擦拭附在引脚V的残留液之后，将各个立方体放入PCR管，添加PCR反应液。PCR反应液通过向2X PCR预混料(gDamp1，Biocubesystem，Korea)10μl添加10pmol上游引物(Primer：5'-GTCAAATCTGAGGACGCTATGTCT-3'：序列号20)1μl、10pmol下游引物(Primer：5'-CACTATAGAGAACTAGGTATGTCGTTG-3'：序列号21)1μl、吸收有模具的立方体1～4个、DW最终体积20μl来完成制备。PCR产物在95℃条件下实施3分钟改性过程，然后，在95℃/30秒钟、58℃/30秒钟、72℃/60秒钟条件下扩增30次，使反应72℃/10分钟之后实施扩增，在包含EtBr的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，来确认是否存在对象PCR产物的扩增(图13)。当培养液直接用作PCR模具时，根据所添加的模具的量，PCR扩增产物的量未按比例增加。相反地，在吸收有培养液的多孔性陶瓷立方体处理区中，PCR扩增产物的量保持恒定。这意味着仅以吸收至一个多孔性陶瓷立方体的模具也能够足够引起当前的反应液中的PCR扩增。因此，在以细菌为模具的PCR扩增中，也可以成功的利用多孔性陶瓷立方体。
实施例7.用于吸收生物分子的可利用的多孔性陶瓷的形态
在本发明中，为了按目的从生物样品有效地吸收生物分子，可利用如图14的结构。作为基本结构，可以是具有空隙的正方体、圆柱体、球体或长方体(图14A)，为了提高吸收力，可以采用内部包含大空隙的形态(图14B)。在图14A结构中，可以单纯地向表面空隙选择性地吸收基因体，图14B是通过提高图14A的吸收率来使得吸收的基因体的量增多的结构。这需要孔外壁的空隙大小保持恒定，孔的功能不仅可以提高吸收力，还可以预先放入PCR引物来减少PCR步骤。这适合于后续需要大量初始模具的基因组DNA用PCR。
并且，在图14C的中间及右侧显示的结构中，使吸收生物分子之后，向具有槽的右侧部位稍加施压，使得该部分掉落，进而使得容易地进入PCR管，但立方体过小，因此，为了在实际生产产品时该结构得以利用，在四方形的情况下，槽部分进行部分切割，使得条的前端侧轻易地掉落1mm3左右，条的后端部分为用于插入以手柄用制作的塑料棒的位置。图14D的具有尖锐状的结构为以种子或树木为对象的情况下便于扎入的结构，当条以相同材质构成时，基因体可以流入到条整体，提高相当于条部分的大小的吸收力，为了使得基因体集中于进入PCR管的前端部，可采用不同材料来设计，这对于防止污染和增加吸收力非常有效。

Claims (18)

1.一种从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其中，包括将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙的步骤。
2.根据权利要求1所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其中，上述生物样品源于动物、植物、细菌或霉菌。
3.根据权利要求1所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其中，上述生物分子为DNA、RNA、dsRNA、microRNA、类病毒、病毒、细菌、霉菌或微藻类。
4.根据权利要求1所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其中，上述核酸扩增反应为cDNA合成、PCR、多重PCR或逆转录-PCR。
5.根据权利要求1所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其中，上述多孔性固体状为选自由碳化纤维素类、粒子状纸团、天然沸石或合成沸石、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、多孔性金属粒子、多孔性橡胶、以粒子状玻璃纤维团形成的微孔玻璃、石灰、贝壳、陶瓷切片及氧化物材质的陶瓷组成的组中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其中，上述氧化物材质的陶瓷的主要成分为三氧化二铝、三氧化二铁、低温共烧陶瓷、氧化铅或氧化锌。
7.根据权利要求1所述的从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的方法，其中，上述多孔性固体状呈正方体、长方体、球形、圆柱形、条形、条的一侧末端具有槽的条形或端部尖锐的条形。
8.一种在生物样品中扩增靶序列的方法，其中，包括：
步骤(a)，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙；以及
步骤(b)，将步骤(a)的使吸收生物分子的多孔性固体状作为用于核酸扩增反应的模具进行添加，利用目标引物组执行扩增反应，来扩增靶序列。
9.根据权利要求8所述的在生物样品中扩增靶序列的方法，其中，上述核酸扩增反应为PCR。
10.一种在生物样品中扩增靶序列的方法，其中，包括：
步骤(a)，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙；
步骤(b)，向步骤(a)的使吸收生物分子的多孔性固体状添加逆转录酶，来执行逆转录酶反应；以及
步骤(c)，将上述逆转录酶反应物作为用于核酸扩增反应的模具进行添加，利用目标引物组执行扩增反应，来扩增靶序列。
11.一种在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法，其中，包括：
步骤(a)，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙；
步骤(b)，将步骤(a)的使吸收生物分子的多孔性固体状作为用于核酸扩增反应的模具进行添加，利用目标引物组执行扩增反应，来扩增靶序列；以及
步骤(c)，检测上述扩增产物。
12.一种在生物样品内迅速确认是否存在靶序列的方法，其中，包括：
步骤(a)，将多孔性固体状接触于生物样品，使存在于生物样品内的生物分子吸收至多孔性固体状的空隙；
步骤(b)，向步骤(a)的使吸收生物分子的多孔性固体状添加逆转录酶，来执行逆转录酶反应；
步骤(c)，将上述逆转录酶反应物作为用于核酸扩增反应的模具进行添加，利用目标引物组执行扩增反应，来扩增靶序列；以及
步骤(d)，检测上述扩增产物。
13.一种在生物样品内用于扩增靶序列的核酸扩增反应用试剂盒，其中，包括：
多孔性固体状，能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空隙；
目标引物组；以及
试剂，用于执行扩增反应。
14.根据权利要求13所述的在生物样品内用于扩增靶序列的核酸扩增反应用试剂盒，其中，用于执行上述扩增反应的试剂包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs及缓冲溶液。
15.根据权利要求13所述的在生物样品内用于扩增靶序列的核酸扩增反应用试剂盒，其中，上述多孔性固体状为选自由碳化纤维素类、粒子状纸团、天然沸石或合成沸石、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、多孔性金属粒子、多孔性橡胶、以粒子状玻璃纤维团形成的微孔玻璃、石灰、贝壳、陶瓷切片及氧化物材质的陶瓷组成的组中的至少一种。
16.一种用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的试剂盒，其中，包括多孔性固体状，其能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空隙。
17.一种用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的组合物，其中，包括多孔性固体状，其能够使存在于生物样品内的生物分子迅速地吸收至多孔性固体状的空隙。
18.根据权利要求17所述的用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的组合物，其中，上述多孔性固体状为选自由碳化纤维素类、粒子状纸团、天然沸石或合成沸石、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、多孔性金属粒子、多孔性橡胶、以粒子状玻璃纤维团形成的微孔玻璃、石灰、贝壳、陶瓷切片及氧化物材质的陶瓷组成的组中的至少一种。
CN201380044466.5A 2012-08-28 2013-08-20 用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体相及其用途 Active CN104583397B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20120094046 2012-08-28
KR10-2012-0094046 2012-08-28
PCT/KR2013/007469 WO2014035090A1 (ko) 2012-08-28 2013-08-20 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 다공성 고체상 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104583397A true CN104583397A (zh) 2015-04-29
CN104583397B CN104583397B (zh) 2018-05-25

Family

ID=50183848

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380044466.5A Active CN104583397B (zh) 2012-08-28 2013-08-20 用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体相及其用途

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20150252356A1 (zh)
EP (1) EP2891716B1 (zh)
JP (1) JP6170154B2 (zh)
KR (1) KR101365737B1 (zh)
CN (1) CN104583397B (zh)
WO (1) WO2014035090A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201411624D0 (en) 2014-06-30 2014-08-13 Ge Healthcare Uk Ltd Spatial molecular profiling of solid biological masses and profile storage
KR102117833B1 (ko) 2019-01-04 2020-06-02 남장희 생물시료로부터 유전물질을 신속하게 분리하는 핵산 흡착 물질을 포함하는 조성물 및 그를 이용하여 생물시료로부터 유전물질을 신속하게 분리하는 방법
KR20200086007A (ko) 2019-01-08 2020-07-16 남장희 지르코니아를 이용하여 생물시료로부터 표적서열을 증폭하는 방법
KR20200086006A (ko) 2019-01-08 2020-07-16 남장희 RAPD(random amplified polymorphic DNA)를 이용하여 생물시료로부터 표적서열을 증폭하는 방법
KR20200086005A (ko) 2019-01-08 2020-07-16 남장희 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법
KR102562639B1 (ko) 2021-04-29 2023-08-02 주식회사 한국과학 Pcr 진단용 시료 채취 진단 방법 및 이를 실행하기 위한 pcr 진단용 시료 채취 도구
KR102597565B1 (ko) * 2021-05-03 2023-11-06 성균관대학교산학협력단 Ｐｃｒ 장치

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000053807A1 (en) * 1999-03-11 2000-09-14 Whatman, Inc. Solid medium and process for the storage and rapid purification of nucleic acid
CN1616477A (zh) * 2003-10-13 2005-05-18 霍夫曼-拉罗奇有限公司 分离核酸的方法
CN1861800A (zh) * 2005-02-18 2006-11-15 英飞凌科技股份公司 用于化学扩增反应的大孔载体
US20070181482A1 (en) * 2004-02-12 2007-08-09 Gl Sciences Incorporated Mechanism of separating and purifying dna and the like
CN101103109A (zh) * 2005-02-04 2008-01-09 富士胶片株式会社 用于分离和纯化核酸的方法
CN101331227A (zh) * 2005-12-13 2008-12-24 日本烟草产业株式会社 使用粉体来提高转化效率的方法

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3639949A1 (de) 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren
US4923978A (en) 1987-12-28 1990-05-08 E. I. Du Pont De Nemours & Company Process for purifying nucleic acids
GB9003253D0 (en) 1990-02-13 1990-04-11 Amersham Int Plc Precipitating polymers
CA2067711C (en) 1991-05-03 2000-08-08 Daniel Lee Woodard Solid phase extraction purification of dna
GB9323305D0 (en) 1993-11-11 1994-01-05 Medinnova Sf Isoaltion of nucleic acid
GB9425138D0 (en) 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
US5783686A (en) 1995-09-15 1998-07-21 Beckman Instruments, Inc. Method for purifying nucleic acids from heterogenous mixtures
JPH10257887A (ja) * 1996-09-30 1998-09-29 Dainippon Printing Co Ltd 遺伝子解析装置および方法
KR20010032806A (ko) 1997-12-06 2001-04-25 매튜 존 베이커 핵산 분리방법
DE19856064C2 (de) * 1998-12-04 2000-11-30 Invitek Gmbh Universelles Verfahren zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien
ATE280225T1 (de) * 1999-08-20 2004-11-15 Promega Corp Simultane isolierung und quantifizierung von dna
AU772755B2 (en) * 1999-10-18 2004-05-06 Ferx Incorporated Magnetic targeted carrier composed of iron and porous materials for the targeted delivery of biologically active agents
US20040161741A1 (en) * 2001-06-30 2004-08-19 Elazar Rabani Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification
JP2004201607A (ja) * 2002-12-26 2004-07-22 Asahi Kasei Corp 核酸吸着固相体上でのｌａｍｐ反応
CN1580283A (zh) 2003-08-13 2005-02-16 清华大学 一种检测核酸分子的方法
US20070148649A1 (en) * 2003-10-21 2007-06-28 Fuji Photo Film Co., Ltd. Cartridge for nucleic acid separation and purification and method for producing the same
US20050176588A1 (en) 2003-12-22 2005-08-11 The Boc Group, Inc. Oxygen sorbent compositions and methods of using same
WO2005116081A2 (en) * 2004-05-24 2005-12-08 Genvault Corporation Stable protein storage and stable nucleic acid storage in recoverable form
US7993738B2 (en) * 2004-11-30 2011-08-09 The Regents Of The University Of Michigan Modified porous materials and method of forming the same
CA2622719A1 (en) * 2005-09-16 2007-07-26 The Regents Of The University Of California A colorimetric bio-barcode amplification assay for analyte detection
JP2007325562A (ja) 2006-06-09 2007-12-20 Fujifilm Corp 核酸抽出法
US20080026451A1 (en) * 2006-06-15 2008-01-31 Braman Jeffrey C System for isolating biomolecules from a sample
EP2407783A1 (en) * 2006-10-27 2012-01-18 Janssen Pharmaceutica, N.V. A method for pharmacologically profiling compounds
JP4340298B2 (ja) * 2007-03-01 2009-10-07 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸回収方法及び核酸回収装置
US9347055B2 (en) 2007-11-05 2016-05-24 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method and kit for preparation of sample for use in nucleic acid amplification
JP2010233579A (ja) * 2010-06-17 2010-10-21 Gl Sciences Inc Ｄｎａなどの分離精製機構
EP2699903B1 (en) * 2011-04-20 2018-07-18 Life Technologies Corporation Methods, compositions and systems for sample deposition

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000053807A1 (en) * 1999-03-11 2000-09-14 Whatman, Inc. Solid medium and process for the storage and rapid purification of nucleic acid
CN1616477A (zh) * 2003-10-13 2005-05-18 霍夫曼-拉罗奇有限公司 分离核酸的方法
US20070181482A1 (en) * 2004-02-12 2007-08-09 Gl Sciences Incorporated Mechanism of separating and purifying dna and the like
CN101103109A (zh) * 2005-02-04 2008-01-09 富士胶片株式会社 用于分离和纯化核酸的方法
CN1861800A (zh) * 2005-02-18 2006-11-15 英飞凌科技股份公司 用于化学扩增反应的大孔载体
CN101331227A (zh) * 2005-12-13 2008-12-24 日本烟草产业株式会社 使用粉体来提高转化效率的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRIAN J TAYLOR等: "Real-time PCR detection of Plasmodium directly from whole blood and filter paper samples", 《MALARIA JOURNAL》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6170154B2 (ja) 2017-07-26
CN104583397B (zh) 2018-05-25
US20180282717A1 (en) 2018-10-04
EP2891716A1 (en) 2015-07-08
JP2015526091A (ja) 2015-09-10
US20150252356A1 (en) 2015-09-10
US10837010B2 (en) 2020-11-17
EP2891716B1 (en) 2018-03-28
WO2014035090A1 (ko) 2014-03-06
EP2891716A4 (en) 2016-04-27
KR101365737B1 (ko) 2014-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104583397A (zh) 用于从生物样品迅速分离核酸扩增反应用生物分子的多孔性固体状及其用途
JP6837473B2 (ja) ハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置、並びに方法
CN112094948B (zh) 一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒
Capelli et al. Biogeography of bloom-forming microcystin producing and non-toxigenic populations of Dolichospermum lemmermannii (Cyanobacteria)
CN103814139A (zh) 用于检测无细胞的病原体特异性核酸的方法和试剂盒
JP2012511318A (ja) 分析を目的とするサンプル内に存在する微生物の溶解、ならびにこの微生物の核酸の抽出および精製のための自動システム
CN101144775B (zh) 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒
CN101363056A (zh) 一种高通量微生物鉴定方法
CN108559789A (zh) 猫冠状病毒荧光ema检测引物组、试剂盒和检测方法
JP2019520825A (ja) 磁性粒子を用いたハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置および方法
CN101974633B (zh) 一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品
CN106435007A (zh) 一种荧光定量pcr检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法
Bastos et al. Anatomical and molecular identification of “guaco” Mikania glomerata and Mikania laevigata (Asteraceae), two important medicinal species from Brazil
CN101906487A (zh) 一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法
CN103305616B (zh) 一种基于特异引物鉴定仓储书虱的试剂盒
CN102676678B (zh) 用于区分五种贝类饵料微藻的pcr引物组
KR101758609B1 (ko) 일본뇌염바이러스 검출 및 유전자형 판별용 조성물
CN110511928B (zh) 一种牡丹皮的转录组ssr分子标记体系及其应用
CN103881902B (zh) 多级pcr反应系统及其应用
CN105734162B (zh) Bol024541基因在鉴定植物菌核病抗性中的用途
KR101434832B1 (ko) 과수류, 또는 묘목에서 발생하는 파이토프토라속 균주를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 이를 이용한 검출키트 및 방법
CN109929811A (zh) 一种马铃薯品种中甸红中马铃薯x病毒毒株及其构建方法与应用
Hilwig et al. Characterization of insect cell lines by DNA content 1, 2
CN117025808A (zh) 一种病原微生物检测引物组合、试剂盒和检测方法
CN115725773A (zh) 鉴别或辅助鉴别九牛草和艾叶的方法及pcr引物对

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Pu Taihao

Inventor after: Shen Junsheng

Inventor after: Han Dingxian

Inventor after: Yin Jinshu

Inventor after: Jin Zhengzhu

Inventor before: Pu Taihao

Inventor before: Shen Junsheng

Inventor before: Han Dingxian

Inventor before: Yin Jinshu

Inventor before: Cui Hongxiu

Inventor before: Jin Zhengzhu

COR Change of bibliographic data
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant