KR20200086005A - 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법 - Google Patents

지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인할 수 있다. 또한, 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 포어(pore)로 신속하게 흡착시키는 다공성의 지르코니아를 포함함으로써 다양한 생물시료에 대하여 유전물질 추출 및 분리가 가능하고, 다양한 생물시료에 대한 유전물질 추출 및 분리를 간단한 공정으로 구현 가능하다는 장점이 있다.

Description

지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법{Method identifying existence of target sequence rapidly from biological sample using zirconia}
본 발명은 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법에 관한 것이다.
DNA 또는 RNA 등의 유전물질을 추출하는 현재의 방법으로는 페놀/클로로포름을 사용하는 방법, 염석하는 방법, 카오트로픽 염 및 실리카 수지를 사용하는 방법, 친화성 수지를 사용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피법 및 자성 비드를 사용하는 방법 등이 있다. 이 방법들은 미국 특허 제5057426호, 제4923978호, EP 특허 제0512767 A1호, 및 EP 제0515484B호, WO 제95/13368호, WO 제97/10331호, 및 WO 제96/18731호, 대한민국 공개특허 제2005-0088164호 등에 기술되어 있다. 이들 특허 및 특허출원들은 고체 지지체상에 핵산을 흡착시킨 후 핵산을 단리(isolation)하는 방법에 관하여 기재하고 있다. 이전에 사용되는 방법들은 핵산을 단리하기 위해서 일정 종류의 용매를 사용하는 것인데, 여기서 사용되는 용매들은 가연성, 연소성 또는 독성 등이 있는 유기 용매들로서, 핵산 추출방법이 복잡하고 유해 화학물질을 취급하는 등의 문제가 있다.
한편, 종래 선행기술로, 대한민국 등록특허 제1365737호는 생물학적 시료로부터 다공성 고체상을 이용하여 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 추출용매 없이 신속하게 분리하는 방법에 대해서 개시하고 있으나, 다양한 생물시료에 적용하기 어렵다는 한계가 있다. 예컨대, 쌀알과 녹두는 탄수화물이 핵산의 추출량을 낮게하는 문제점을 가지며, 청경채와 같은 엽채류의 노엽은 단위 면적당 세포수가 적어 농도가 낮게 추출되며, 감귤과 같은 나무는 2차 대사산물에 의한 증폭에 문제가 있는 것으로 알려지고 있다.
대한민국 등록특허 제1365737호 (2014.02.14)
따라서 본 발명의 목적은 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법을 제공하는데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 실시예에 따른 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법은 생물시료에 다공성의 지르코니아를 접촉시키는 단계(S10); 상기 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 상기 다공성의 지르코니아의 포어(pore)로 흡수시키는 단계(S20); 상기 유전물질을 흡수시킨 다공성의 지르코니아를 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법에 있어서, 상기 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 상기 다공성의 지르코니아의 포어(pore)로 흡수시키는 단계(S20) 이후에, 물로 세척하는 단계(30);를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법에 있어서, 상기 다공성의 지르코니아는 다공성 지르코니아 비드이고, 상기 다공성 지르코니아 비드의 크기는 2.0 ~ 3.0 mm인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 포어(pore)로 신속하게 흡착시키는 다공성의 지르코니아를 포함함으로써 다양한 생물시료에 대하여 유전물질 추출 및 분리가 가능하다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 다양한 생물시료에 대한 유전물질 추출 및 분리를 간단한 공정으로 구현 가능하다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 지르코니아 비드를 이용한 유전물질 추출용 팁(Tip)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전물질 추출용 팁(Tip)을 이용하여 생물시료로부터 유전물질을 분리하는 공정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 튜브 내경 크기에 적합한 지르코니아 비드 직경 크기를 설명하는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 지르코니아 펠트(Felt)를 이용하여 생물시료로부터 유전물질을 분리하는 공정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 메뉴얼 및 지르코니아 파쇄에 의한 핵산 추출 비교 실험 결과이다(M: 100bp ladder, C1,C2: 막자사발(pestle), A: 지르코니아 마쇄, B: 막자사발(pestle) 추출 후 지르코니아 바인딩 시험).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 지르코니아를 이용한 핵산 추출 후 세척(washing) 방법에 따른 증폭 비교 실험 결과이다(M: 100bp ladder, C: 막자사발(pestle) 40ng DNA, 1~2: 물 세척, 3~4: 70% 에탄올 세척)
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 RAPD(random amplified polymorphic DNA)를 이용한 다양한 시료의 지르코니아를 이용한 핵산 추출 후 PCR 반응을 확인한 결과이다(M: 100bp ladder, A: 쌀 1립, B: 녹두 1립, C: 청경채잎, D: 감귤잎, A01~D11: RAPD 프라이머).
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 지르코니아 비드의 크기에 따른 PCR 반응을 확인한 결과이다(M: 100bp ladder, C: 막자사발(pestle) 40ng DNA, A: 1.4mm, B: 2.0mm, 1: 고추, 2: 청경채).
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 명세서에 개시된 실시 예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 이하의 설명에서 사용되는 구성요소에 대한 접미사 "모듈" 및 "부"는 명세서 작성의 용이함만이 고려되어 부여되거나 혼용되는 것으로서, 그 자체로 서로 구별되는 의미 또는 역할을 갖는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 개시된 실시 예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 명세서에 개시된 실시 예의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 첨부된 도면은 본 명세서에 개시된 실시 예를 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 명세서에 개시된 기술적 사상이 제한되지 않으며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 출원에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명하기로 한다. 본 발명은 본 발명의 정신 및 필수적 특징을 벗어나지 않는 범위에서 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 지르코니아 비드를 이용한 유전물질 추출용 팁(Tip)이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전물질 추출용 팁(Tip)을 이용하여 생물시료로부터 유전물질을 분리하는 공정을 나타낸 모식도이며, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 튜브 내경 크기에 적합한 지르코니아 비드 직경 크기를 설명하는 모식도이다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 지르코니아 펠트(Felt)를 이용하여 생물시료로부터 유전물질을 분리하는 공정을 나타낸 모식도이다.
도 1 내지 4를 참조하면, 본 발명에 따른 조성물은 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 포어(pore)로 신속하게 흡착시키는 다공성의 지르코니아를 포함한다.
본 발명에 있어서, 생물시료는 동물, 식물, 세균 또는 곰팡이 유래일 수 있고, 바람직하게는 고추, 쌀, 녹두, 청경채 또는 감귤이 해당될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 유전물질은 유전적 기능단위를 포함하는 동·식물, 미생물 또는 기타 유전적 기원이 되는 물질로서, 종자, 잡수, 정자 혹은 개개의 유기물 등이 포함되며, 식물, 동물, 미생물에서 추출한 염색체, 유전인자, 박테리아, Plasmid와 같은 DNA도 포함되며 혹은 이러한 것들의 일부분도 포함되나, DNA를 갖고 있지 않는 생화학적 추출물은 포함되지 않는다.
지르코니아는 산화지르코늄(ZrO2)으로 내열성 세라믹의 재료로 사용되며, 치아, 세라믹 용기 등 다양한 산업용 재료로 이용되고 있고, 생명공학 연구에서는 주로 시료를 파쇄하는 비드(bead)로 사용하고 있다. 본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 다공성의 지르코니아는 지르코니아 비드일 수 있다.
지르코니아 비드를 직접 이용하여 PCR을 하면 용액상태의 경우와 달리 비드에 붙는 핵산의 량이 거의 일정하므로 핵산 정량없이 실험을 진행할 수 있어 시간 및 노력에 있어서 효율적인 장점이 있으며, 지르코니아는 흡착력이 강하여 물로 세척을 하더라도 증폭이 원할히 이루어지는 장점이 있다.
지르코니아 비드를 직접 PCR에 이용하는 경우 비드의 크기는 매우 중요하다. 본 발명에 있어서, 상기 지르코니아 비드의 직경 크기는 2.0 ~ 3.0 mm인 것이 바람직하다. 지르코니아 비드의 직경 크기가 1.4mm인 경우 결과의 균일성이 낮고, 2.0mm인 경우는 균일성이 높은 결과를 나타내므로, 지르코니아 비드의 직경 크기가 상기 범위의 하한치를 벗어나면 유전물질 추출율이 저하되어 정확성 및 재현성이 떨어진다. 한편, 일반적인 PCR 반응액의 높이가 4mm 정도이고 이 부위의 폭은 3.0mm이므로, 지르코니아 비드의 직경 크기가 3.0mm를 초과하는 경우는 지르코니아 비드가 반응액에 닿지 않거나 일부만 잠기게 되어 실험에 오차를 나타내게 된다.
이와 같은 본 발명에 따른 생물시료로부터 핵산 증폭 반응용 유전물질을 신속하게 분리하는 방법에 대해서 도 1 내지 4를 참조하여 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 생물시료로부터 핵산 증폭 반응용 유전물질을 신속하게 분리하는 방법은 생물시료에 다공성의 지르코니아를 접촉시키는 단계(S10); 및 상기 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 상기 다공성의 지르코니아의 포어(pore)로 흡수시키는 단계(S20)를 포함한다.
여기서, 상기 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 상기 다공성의 지르코니아의 포어(pore)로 흡수시키는 단계(S20) 이후에, 물로 세척하는 단계(30)를 더 포함할 수 있다.
상기 S10단계는, 상기 생물시료를 다공성의 지르코니아에 접촉시켜 그라인딩(grinding)하는 단계(S12)를 포함할 수 있다.
또한, 상기 S20단계는, 상기 생물시료 내에 존재하는 유전물질이 상기 다공성의 지르코니아의 포어(pore)에 흡착되는 단계(S22)를 포함할 수 있다.
상기 다공성의 지르코니아는 다공성 지르코니아 비드인 것이 바람직하고, 이때, 다공성 지르코니아 비드의 크기는 2.0 ~ 3.0 mm인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예로서, 생물시료에 다공성의 지르코니아를 접촉시키는 단계(S10); 상기 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 상기 다공성의 지르코니아의 포어(pore)로 흡수시키는 단계(S20); 및 상기 유전물질을 흡수시킨 다공성의 지르코니아를 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 지르코니아를 이용하여 생물시료로부터 표적서열을 증폭하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예로서, 생물시료에 다공성의 지르코니아를 접촉시키는 단계(S10); 상기 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 상기 다공성의 지르코니아의 포어(pore)로 흡수시키는 단계(S20); 상기 유전물질을 흡수시킨 다공성의 지르코니아를 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법을 제공한다.
한편, 본 발명의 실시예에 따른 키트는 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 포어(pore)로 신속하게 흡착시키는 다공성의 지르코니아를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 지르코니아 비드에 의한 파쇄 후 핵산의 추출 농도
고추 잎 시료를 일반적인 막자사발(pestle)과 지르코니아 비드를 이용하여 각각 파쇄 후 핵산의 추출농도를 비교한 결과(도 5 참조), 막자사발(pestle)이 가장 높은 핵산 추출 농도를 보였고, 지르코니아를 이용한 추출에서는 상당히 낮은 농도를 보이는 것을 확인하였다. 또한 막자사발(pestle)에 의한 추출 후 지르코니아 비드에 핵산의 바인딩을 시험한 결과 용출되는 핵산의 양이 상당히 낮은 것이 확인되었다. 따라서 상당한 량의 핵산이 지르코니아에 바인딩하는 것을 확인할 수 있는 결과이다.
실시예 2: 지르코니아를 이용한 핵산 추출 후 세척(washing) 방법에 따른 증폭 비교
도 5의 시험 결과를 참조하면, 막자사발(pestle)에 의한 추출 후 지르코니아 비드에 핵산의 바인딩을 시험한 결과 용출되는 핵산의 양이 상당히 낮은 것이 확인되어, 핵산이 물 및 1×TE buffer에 완전히 용출되지 않을 것으로 예측되어, 이러한 예측를 입증하기 위한 시험을 실시하였다(도 6 참조). 우선 고추 시료를 지르코니아 비드를 이용하여 핵산을 바인딩하고, 물과 70% 에탄올로 2회 세척한 후 지르코니아 비드를 PCR 튜브에 직접 넣은 다음 증폭을 실시하였다. 그 결과 대조구(C)를 포함한 모든 처리구에서 증폭이 고르게 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 증폭량으로 보면 대조구(C)에 비해 상당히 높은 증폭량이 확인되었으며 안정적임을 확인할 수 있다. 따라서 지르코니아는 핵산을 충분히 바인딩하는 물질이며 유전자 증폭에 직접 이용하여 정확성과 재현성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: RAPD를 이용한 다양한 시료의 지르코니아를 이용한 핵산 추출 후 PCR 반응 확인 결과
지르코니아를 이용한 다양한 식물체를 대상으로 핵산 추출에 대한 시험을 수행하였다. 실험에 이용된 시료는 쌀, 녹두, 청경채, 감귤이며, 증폭 프라이머는 다양한 식물체를 이용하는 경우이므로 임의적인(random) 프라이머를 이용하는 RAPD를 이용하여 수행하였다. 추출 방법은 고추와 동일하게 수행하였으며 추출 후 지르코니아를 직접 PCR 튜브에 넣어 증폭하였다.
그 결과 각기 다른 시료에서 모두 증폭이 이루어 지는 것을 확인하였다. 쌀알과 녹두는 탄수화물이 핵산의 추출량을 낮게하는 문제점을 가지며, 청경채와 같은 엽채류의 노엽은 단위 면적당 세포수가 적어 농도가 낮게 추출되며, 감귤과 같은 나무는 2차 대사산물에 의한 증폭에 문제가 있는 것으로 알려지고 있다. 따라서 이러한 시료의 특성에도 불구하고 본 발명에 의하면 원활한 증폭이 이루어졌음을 확인할 수 있고, 지르코나아를 이용한 핵산 추출은 다양한 생물시료에서 적용 가능함을 확인하였다.
실시예 4: 지르코니아 비드의 크기에 따른 PCR 반응 확인 결과
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 지르코니아 비드의 크기에 따른 PCR 반응을 확인한 결과이다(M: 100bp ladder, C: 막자사발(pestle) 40ng DNA, A: 1.4mm, B: 2.0mm, 1: 고추, 2: 청경채). 도 8을 참조하면, 지르코니아 비드의 크기에 따른 핵산 추출 정도는 2.0mm가 1.4mm 보다 안정적인 것으로 확인되었다.
한편, 이상의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (3)

  1. 생물시료에 다공성의 지르코니아를 접촉시키는 단계(S10);
    상기 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 상기 다공성의 지르코니아의 포어(pore)로 흡수시키는 단계(S20);
    상기 유전물질을 흡수시킨 다공성의 지르코니아를 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로 첨가하고, 표적 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계;
    를 포함하는 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생물시료 내에 존재하는 유전물질을 상기 다공성의 지르코니아의 포어(pore)로 흡수시키는 단계(S20) 이후에, 물로 세척하는 단계(30);
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 다공성의 지르코니아는 다공성 지르코니아 비드이고,
    상기 다공성 지르코니아 비드의 크기는 2.0 ~ 3.0 mm인 것을 특징으로 하는 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법.
KR1020190002071A 2019-01-08 2019-01-08 지르코니아를 이용하여 생물시료 내에서 표적 서열의 존재 여부를 신속하게 확인하는 방법 KR20200086005A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101365737B1 (ko) 2012-08-28 2014-02-20 한정헌 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 다공성 고체상 및 이의 용도

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101365737B1 (ko) 2012-08-28 2014-02-20 한정헌 생물학적 시료로부터 핵산 증폭 반응용 생물학적 분자를 신속하게 분리하기 위한 다공성 고체상 및 이의 용도

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