JP2023546179A - 分子ｐｏｃ診断システム内で統合された熱調節及びｐｃｒ - Google Patents

Abstract

本発明は、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）診断装置への分子検査方法の統合、並びに、当該統合に基づく分子検査システム及び方法に関する。より詳細には本発明は、ＰＯＣ診断装置内部で受けられ、かつ、ＰＣＲ抑制物質を除去するのに（ほとんど）処理を有しない生体試料を直接検査することが可能なマイクロ流体検査カセット又はチップに関する。本発明は、同一加熱領域を利用して複数の処理段階を行うことによって当該カセット／チップのサイズ領域内でのカセット上／チップ上処理を可能にする。【選択図】図２

Description

本発明は、POC（ポイント・オブ・ケア）診断装置およびシステムに分子検査手法を統合すること、並びに当該統合に基づく分子検査方法に関する。より詳細には本発明は、ＰＯＣ診断装置内で受けられ、かつ、ＰＣＲ阻害物質の効果を除去又は軽減する処理を要しない又はその処理が最小の生体試料を直接検査及び宿主病原体をも含む範囲の種類の試料の処理を、カセット上／チップ上での処理を前記カセット／チップのサイズ領域内で実行することによって可能なマイクロ流体検査カセット又はチップに関する。

POC（ポイント・オブ・ケア）診断システムは、中央検査室に検体を送ることを必要とせず、臨床現場（付近）又は患者の試料が採取された地点、すなわち「患者のそば」で診断検査を行うことを可能にする。初期のシステムは特定の検査技術に限られていたが、最近では、カセット又は同様の装置に組み込まれた分子検査方法が現実的なポイント・オブ・ケアの選択肢となってきている。このような分子POCシステムは一般的に、マイクロ流体検査装置－たとえばカセット－と、マイクロ流体検査装置が挿入される診断装置を備える。前記マイクロ流体検査装置は、患者試料を受け取り、流体ネットワークを通してその患者試料を輸送し、試料が検査されるカセット上の試薬などを運ぶことができる。前記診断装置は、カセットの周りで流体を動かすための様々な手段、検査装置に存在するバルブの開閉用のアクチュエータ、カセット上の材料の移動を促す手段、検査を行うためのソフトウェア、光学装置などを内蔵する。

分子ポイント・オブ・ケア（POC）診断システムは、DNAやRNAの形態をとる宿主の遺伝物質の存在又は病原体若しくは他の関心種の存在を、核酸を検出又は同定することによって試料内で同定する分子診断法を実施することができる。ほとんどの分子診断法では、関心核酸を検出及び/又は評価する前に増幅することが必要である。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、DNAの特定のセグメントのコピー（複数可）を指数関数的に増幅して、前記DNA配列の多数のコピーを生成するのに分子生物学で広く用いられている技術である。PCRは、感染症や遺伝性疾患の診断、及び、多種多様な試料の遺伝子解析に使用され得る。ポイント・オブ・ケア（POC）診断装置向けのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNAの増幅は、反応混合物が検査装置上に存在するマイクロ流体チャネルを通過する間にその反応混合物を加熱と冷却（熱サイクル）の反復循環にさらすことを必要とする。これは、カセット上に存在する1以上の静的チャンバに反応混合物を保持することを含み得る。したがってカセット内の反応混合物の温度は、PCRサイクルの間に変化しなければならない。例えばDNAの変性は通常90℃超の温度で、多くの場合98℃近くで起こる。その後、変性したDNAへのプライマーのアニーリングが通常45℃から70℃程度で行われるので、温度は下げられる必要がある。最後に、アニーリングしたプライマーをポリメラーゼで伸長させる工程は、通常70℃から75℃で行われるため、温度は再び上昇する。これを可能にする様々な機構が説明されてきた。そのようなシステムは、検査装置上に1つ以上の加熱領域を採用する。そのようなシステムでは、検査装置が機器に挿入されると、機器に存在するソフトウェアプログラムに従って、前記1つ以上の加熱領域は機器内の1つ以上のヒーターと位置合わせされ加熱される。あるいは、マイクロ流体チャンネル内の温度を急速に変化させる手段を採用することもできる。この場合も温度変化は通常、装置上のソフトウェアによって管理される。このような機構は既知である。

PCRのバリエーションには、RNAをテンプレートとして用いる（最初に逆転写酵素によってDNAに転写される）逆転写（RT-）PCRと、定量情報を提供するPCR生成物の検出に蛍光プローブを用いる等温PCR及び／又はリアルタイムPCRが含まれる。このようなバリエーションは、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」という用語に包含されることが理解されるであろう。PCR試薬は、たとえばDNAポリメラーゼ、プライマー（順方向及び逆方向）、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs）及びPCR緩衝液、並びに逆転写（RT-）PCRの場合には逆転写酵素などの試薬を含むことが当業者によって理解されるであろう。

PCRが直面する1つの課題は、それが酵素反応であるため、試料中に存在する可能性のある特定の阻害物質と検査される試料の粘度に敏感であることである。前述の阻害物質は、タンパク質、ペプチド、脂質、代謝物などの大きな生物学的分子、その他の低分子、イオンなどを含むと考えられ得る。例えば唾液や他の生物学的流体は、PCR反応に使用されるポリメラーゼ酵素を物理的に分解することができる様々な阻害性タンパク質－酵素の一種でプロテイナーゼが含まれる可能性がある－を含むことができる。他のPCR阻害物質は、酵素の活性部位に結合するか、さもなければアロステリックに結合するか、ポリメラーゼが正しく機能するために必要なイオンをキレート化することができる。阻害物質には、PCR増幅に悪影響を及ぼす全ての物質が含まれ得る。そのような物質には、試料自体に由来するもの、試料を安定させるために加えられるもの、試料の輸送、試料の処理－例えば濃縮手順又は核酸抽出－中に導入されるものがある。PCR阻害は、感度の低下や偽陰性の結果をもたらす可能性がある。従って生物学的試料を検査する際には、検査での問題を避けるためにPCR阻害物質を確実に除去又は低減することが重要である。PCR阻害物質を除去、変性、および/または減少させるための多くの機構が知られている。これらには、核酸が抽出される様々な抽出法、場合によっては濃縮法、濾過法、及び熱処理法が含まれる。また、PCR阻害物質を分解、変性、沈殿、あるいは封鎖するために添加物をも使用され得る。したがって被検査試料は、PCRステップの前に重要な処理を受けるのが一般的である。検査装置のサイズが限られているため、この多くは通常、試料が検査装置上／内に装填される前の前処理ステップとして行われる。しかしユーザーのワークフローを簡素化し、結果を得るまでの時間を短縮し、手動処理ステップから発生し得る誤りを減らすために、このようなステップは検査装置上で実行されることが好ましい。

本発明の目的は、POC診断装置で分子検査を可能にする、比較的費用対効果の高い検査装置および方法を提供することである。

本発明は、従来技術の1つ以上の制限を回避または軽減することを目的とする。

本願明細書において「マイクロ流体」とは、少なくとも1つの寸法が1ミリメートル以下であり、かつマイクロリットル以下の流体を扱うことができることを意味する。

本願明細書において、「カセット」とは、流体が流れ得るチャネル又はチャンバを有する1つ以上の基板を含む組立ユニットを意味する。これは、カセット、プレート、チップなどを包含することができる。

本願明細書において「チャネルのネットワーク」とは、流体－特に液体試料－が通過できる直線状、分岐状、ループ状、蛇行状、またはそれらの組み合わせであり得る1つ以上の流路を意味する。

「領域」という用語は、特定の活動が行われる流体チャネルの一部、又は特定の規定された特性を有する流体チャネルの一部を指称する。

「流体連通」という用語は、2つ以上の領域間で前記領域の一から前記領域の他への流体の流れを可能にする機能的な接続を指称する。

「流路」という用語は、液体試料がマイクロ流体チャネル又はマイクロ流体チャネルネットワークを通過する経路である。前記試料が前記チャネル内を往復し、様々な分岐点を経由して流れることがあるので、前記流路は直線的である必要はない。

「熱調節」、「熱調節された」等の用語は、他の化学物質や生物学的部位の添加の有無にかかわらず温度の上昇を利用することで、PCRに悪影響を及ぼす試料に含まれる阻害成分を除去若しくは低減し、および/またはウイルスを意図的に「殺す」または不活化することで安全性を向上させる操作を指称する。

本発明の態様によると、試料中の検体を検出する診断装置内部で受取可能な流体検査装置が供される。当該流体検査装置は、
本体と、
前記本体を貫通する流体チャネルと、
前記流体チャネルと流体連通する流入口と、
所望の距離及び方向の試料流路に沿った前記流体チャネルを介して液体試料を移動させる手段と、
第１加熱領域と、を備え、
前記試料流路の配置は、第１時点では試料が前記第１加熱領域の少なくとも一部内に位置すると共に熱調節温度にまで加熱され、第２時点では前記試料及び１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応試薬は前記第１加熱領域内に位置すると共に熱サイクルプロファイルの少なくとも一部分の一部として加熱されるようにされることを特徴とする。

有利となるように、単一の加熱領域が、試料中でのＰＣＲ阻害物質の効果を除去又は軽減する熱調節段階に用いられ、その後同一の加熱領域は、ＰＣＲ熱サイクルの少なくとも一部に用いられる。前記同一の加熱領域は、前記検査上で大きな追加空間をとることなく試料の熱調節を前記検査装置上で起こすことを可能にする。その結果として、追加のヒーター及び空間が機器から不要とされる。これによって、前記検査装置は、チップ外での前処理が最小（たとえば希釈のみ）又はなしで生体試料を受け入れることが可能となる。

顕著なことに熱調節が試料中のＰＣＲ阻害物質の効果を除去又は軽減するのに用いられ得るとしても、特定のウイルス－たとえばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を不活性にすることも可能である。英国では、危険病原体に関する諮問委員会（ＡＣＤＰ）が２０２０年初期に集まってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についての提案された災害群について議論した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が新規のコロナウイルスである一方、同様のＨＧ３コロナウイルス向けに作用する既存の安全システムが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の危険性を実効的に制御するのに用いられ得ることが予想された。現在の情報に基づき、ＡＣＤＰ委員会は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の仮の分類をＨＧ３病原体とすることで合意した。危険な病原体－たとえばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－は、非常に慎重な処理を強く求める。陽性又は陽性疑いのある患者からの試料を検査しながら安全性を向上させるため、検査処理中でのウイルスの不活性化は、大きな利点を提供し、そのような病原体の検査を適切に危険性が評価されたポイント・オブ・ケア又は患者の近くの設定で行うことを可能にする。

前記試料の流路の配置は、前記第１時点と前記第２時点との間では前記試料が前記第１加熱領域の外側にある（つまり前記第１加熱領域の内部に存在しない）ようになされる。

好適には前記流体チャネルは複数の流体チャネルのネットワークである。好適には前記流体チャネルのネットワークは、前記流路を構成するように開閉するように適合する１つ以上のバルブを備える。

好適には前記流体チャネルを通して液体を移動させる手段は、所望の方向、及び、前記マイクロ流体チャネルに沿った所望の距離の前記液体の所定の移動を可能にする。

前記第１加熱領域は、プログラムされたプロトコルに従って、診断機器内で受け取られるときに加熱されるように適合される。前記第１加熱領域内での前記温度は必要に応じて加熱及び冷却され得る。

前記第１加熱領域は、前記マイクロ流体チャネルの一部を含み、前記流路の一部に関連付けられる。

任意で第２加熱領域が存在する。

好適には前記流体チャネルのネットワーク内に阻害軽減試薬が存在する。

好適には前記阻害軽減試薬は試薬チャンバ内に供される。前記阻害軽減試薬は、乾燥若しくは凍結乾燥された材料として又は液状で供されてよい。

好適には前記阻害軽減試薬は、前記流路内の前記第１加熱領域の上流で前記試料と混合するような位置に設けられる。

好適には前記阻害軽減試薬は還元剤である。最も好適には前記阻害軽減試薬は、チオール還元剤である（当業者は、これがチオールを還元する試薬であることを理解する）。任意で前記チオール還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール（βＭＥ）、トリス(２－カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）のうちの一又はこれらの混合物である。ＴＣＥＰは特に好ましい。

好適には前記流体検査装置は、マイクロ流体カセットの形態をとる。

好適には前記検査装置は還元剤試薬をさらに含む。

本発明の第２態様によると、分子診断装置が供される。当該分子診断装置は、第１態様の流体検査装置と、前記検査装置を受ける診断機器を備える。前記診断機器は、該診断機器内において相対的に固定された方位で前記流体検査装置を受けるように構成される。

好適には前記診断機器は中央演算装置（ＣＰＵ）を備える。

前記ＣＰＵは、前記診断機器と前記検査装置との間での相互作用を制御する。

好適には前記診断機器は第１ヒータを備える。前記ヒータは、前記検査装置が前記診断機器内で受けられるときに前記検査装置の前記第１加熱領域を加熱するように構成される。

好適には前記診断機器は、前記マイクロ流体装置上での前記バルブの開閉を制御する１つ以上のバルブアクチュエータを備える。

好適には前記診断機器は、前記マイクロ流体装置の前記流体チャネルを通る液体を移動させる手段の作動を制御する１つ以上の移動アクチュエータを備える。

本発明の第３態様によると、分子診断システム内の検査装置上でのポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法が供される。当該方法は、
試料を取得する段階と、
流入口を介して前記試料を前記第１態様の検査装置へ搬入する段階と、
前記検査装置が診断機器に挿入されるときに、試料の少なくともアリコートを前記流体チャネルを介して前記第１加熱領域へ移動させる段階と、
前記第１加熱領域を熱調節温度にまで加熱することで熱調節された試料のアリコートを与える段階と、
前記熱調節された試料のアリコートと１つ以上のＰＣＲ試薬とを結合させる段階と、
前記熱調節された試料のアリコートと１つ以上のＰＣＲ試薬とが結合した試料のアリコートを、少なくとも一部が前記加熱領域で起こる熱サイクルに曝す段階、
を有する。

有利となるように当該方法は、費用対効果の良い装置上での検体の分子識別及び／又は評価を、（希釈となり得るもの以外の）ＰＣＲ阻害を除去又は最小にする装置外での試料の前処理を最小にして又はなしで行うことを可能にする。さらに、試料中のＰＣＲ阻害物質の除去又は減少のための熱調節と、その後の前記ＰＣＲ熱サイクルの少なくとも一部の両方に同一の加熱領域を用いることによって、前記カセットの占める面積は小さくて費用対効果がよいままとなり、同様に前記診断機器はより小さく、複雑でなく、費用対効果が良くなり得る。

任意で前記第１加熱領域を熱調節温度にまで加熱して熱調節された試料のアリコートを与えた後、前記熱調節された試料は、前記第１加熱領域外へ（つまり前記第１加熱領域内に存在しないように）移動する。

好適には前記第１加熱領域を熱調節温度にまで加熱して熱調節された試料のアリコートを与えるとき、前記試料のアリコートは、所定期間前記第１加熱領域内に保持される。

好適には前記期間は１～１０分である。

最も好適には前記期間は２分である。

好適には前記熱調節温度は４０℃～１００℃である（１００℃は、前記カセットを事前加圧するできる場合に適用可能）。

より好適には前記熱調節温度は８０℃～９９℃である。

一般的に上限は、前記試料の沸騰をぼうしするように設定される。温度が高くなれば、前記試料が保持されなければならない時間は短くなるので、迅速な処理を求めている場合には有利となり得る（とはいえこれは、温度を上げるのに要する時間とのバランスがとられることになる）。

より好適には前記熱調節温度は９０℃～９９℃である。

最も好適には前記熱調節温度は９５℃である。

前記熱調節温度は、前記試料中に存在し得るＰＣＲ阻害物質の効果を除去又は軽減し、存在する病原体を不活性化し、かつ／あるいは、粘性を減少させるように選ばれる。前記阻害物質は、前記試料自身中に存在するか、あるいはチップ上での処理中に前記試料へ加えられる上流成分中に存在し得る。

前記試料の加熱はまた、試料の粘性を減少させるのを容易にし得る。

好適には前記熱調節された試料のアリコートと１つ以上のＰＣＲ試薬とを結合させる段階は、前記熱調節された試料のアリコートをＰＣＲ試薬チャンバへ移動させる段階と、前記熱調節された試料のアリコートと前記ＰＣＲ試薬とを結合させる段階と、前記の結合された熱調節された試料のアリコートとＰＣＲ試薬を前記第１加熱領域へ戻すように移動させる段階を含む。

好適には少なくとも試料のアリコートを前記流体チャネルのネットワークを通って第１加熱領域へ移動させる前に、前記試料は、阻害軽減試薬に結合される。

好適には前記阻害軽減試薬は還元剤である。最も好適には前記阻害軽減試薬はチオール還元剤である。任意で前記チオール還元剤はトリス(２－カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。ＴＣＥＰは、前記試料が唾液を含むか、あるいは鼻腔スワブ及び／又は咽頭スワブから得られるときに特に好ましい。ＴＣＥＰは、前記ポリメラーゼン連鎖反応が、ＣＯＶＩＤ１９検査の一部としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子物質の一部を増幅するために実行されるときに特に好ましい。

好適には前記分子診断システムはポイント・オブ・ケア分子診断システムである。

好適には前記分子診断システムは第２態様のシステムである。

本発明の様々な他の特徴及び態様は請求項中で規定される。

本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、他に定義されない限り、この発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。

本発明の実施形態は、次に、同種の部品が対応する参照数字で提供され、その中にある添付の図面を参照して、単なる例示目的で説明される。
本発明によるカセットテスト装置の断面平面図であり、カセット内のマイクロ流体チャネルネットワークを示している。 本発明によるマイクロ流体チャネルを有するカセットの概略平面図を示している。 様々な温度のサーマルサイクラーで5分間加熱した異なるムチン濃度の人工膣液の阻害プロファイルを示す未編集のリアルタイムPCR増幅曲線のグラフを示す。図中、Aは2%ムチンのAVFで、Bは1.5％ムチンAVFで、Cは1％ムチンAVFで、Dは0.5％ムチンAVFである。 本発明の態様による診断器具の斜視図を示している。

マイクロチャネル2とバルブ3（図2に示す）の内部マイクロチャネルネットワークを示すマイクロ流体カセット1の断面が、図1に一般的に描かれている。カセットの要素を示す概略図が、図2に示されている。マイクロチャネル2とバルブ3のマイクロチャネルネットワークは、液体試料が移動できる流路を規定する。 マイクロチャネルは、マイクロ流体カセットの内部に、試料、好ましくは液体形式の生物学的試料、および／または試薬（その一部または全部がフロースルー中にカセット上に組み込まれることがある）を、流体流路に沿って、様々な活動を可能にする様々な区域または領域を通して通過できるよう、望ましい長さと形状で形成されている。様々なバルブおよび分流を使用して、混合、洗浄、除去、および他の動作が必要に応じて起こるようにすることができる。チャネル2は、典型的には、この実施形態ではポリプロピレンである実質的に平面的で実質的に剛性のある基板である第1の基板の第1の表面に形成されている。第1の基板は、この実施形態ではポリプロピレンフィルムである第2の基板と重ねられている。第1の基板をフィルムに、例えばレーザー溶接を用いて接着することにより、実質的に閉じたチャネル2が提供される（必要に応じて、入口および出口を含めることができる）。 第1の基板が上面および下面を有する平面部材である場合、マイクロチャネルの大部分は上面または下面に形成できることが理解されよう。しかしながら、第2基板－すなわちフィルム－が、使用時にマイクロチャネル2の上壁を形成することが大抵の場合には望まれる。

あるいは、この実施形態では第2の基板をフィルムとしているが、第2の基板は別の材料であってもよく、それ自体、第1の基板のチャネルと位置合わせできる溝またはチャネルがその表面に形成されていてもよいことは理解されよう。 基板を一緒に接着することにより、実質的に閉じたチャネル2が提供される（再び入口と出口を必要に応じて含めることができる）。 カセットの本体内に流路を形成するための他の方法、例えば3Dプリントも想定される。

必要に応じて、第1および第2の基板は、接合前に位置合わせすることができる。 チャネル2の長さ及び断面形状は、試料及び試薬の所望の輸送及び処理を可能にするために、任意の適切な形状とすることができる。チャネル2に流体が流れるように接続するカセット上の貯蔵部、及び廃棄物チャンバ又は流出口が存在し得る。流路2の個別の部分は、適切なタイプのバルブを使用して開閉することができ、流体、特に液体試料の1つ以上のスラグは、容積式ポンプを含む様々な機構を使用してカセットの周りを移動することができる。このような「ラボオンチップ」タイプのマイクロ流体システムは当技術分野でよく知られている。

バルブとそれを作動させる方法は当技術分野で知られており、POCシステムの製造当業者であれば、利用可能な様々な選択肢を理解できることが理解されるであろう。これは、マイクロチャネルのネットワークの周りで流体を移動させるための手段についても同様であり、当業者は、ベローズポンプ、シリンジポンプ等を含む様々なタイプの容積式ポンプ等の利用可能な様々な選択肢を理解しているであろう。

図2により明確に示されているように、マイクロ流体チャネル2は、必要に応じてチャネル2の所望の領域への流体の流れを保証するように作動させることができる多数のバルブ3を有する。流れはどちらの方向でもよく、流路は試料が時間をかけて通る道として説明されるが、これはマイクロ流体チャネル内での往復運動、または双方向の運動を含むことができる。このような方法で物質の流れを制御することは、ラボ・オン・チップ又は診断用カセット装置の使用や製造に携わる当業者には知られている。

カセット1には、液体試料をマイクロ流体チャネル2に受け入れるための流入口4が設けられている。典型的には、これは、痰、唾液、鼻、咽頭スワブ試料、子宮頸部および／または子宮膣スワブ試料、血液、血漿、脳脊髄液などのようなヒトからの生体試料である。注入口はキャップで閉鎖可能であり、試料が挿入された後に密閉することができる。 特に、本カセットは、阻害物質を除去するための重要な前処理（任意に希釈する以外）を受けていない試料を直接受け入れることができる。多数の圧縮性ベローズ5が、マイクロ流体チャネルと流体連通して存在する。 ベローズ5の圧縮および減圧運動は、バルブ3の開閉と組み合わせて、マイクロ流体チャネル2を通して試料を所望の方向および距離に移動させる。

また、カセット1には、複数の試薬チャンバ6（抗阻害試薬チャンバ6a、PCR試薬チャンバ6bを含む）および廃液チャンバ7が設けられている。 また、マイクロ流体フィルム2のマイクロチャネルネットワークに沿って、流体試料の存在を検出することができる流体検出ポイント8がある。 本実施例における流体検出ポイントは、少なくとも1つの表面が透明なフィルムで形成されており、これにより、流体検出のための診断機器10におけるエミッタ／レシーバ光学センサの使用が許可される。

カセット1はPCR領域を有する。前記PCR領域はカセットの指定部分であり、この指定部分では、加熱及び冷却（熱サイクル）の繰り返しが起こることで、この領域内のマイクロチャネルネットワークを移動する試料は、目的のDNAが存在する場合には、変性、アニーリング及び伸長の複数の循環を受ける。PCR領域には、使用時にマイクロ流体ネットワークの一部を加熱（および/または冷却）することができる多数の加熱領域9が含まれる。図2に示されているように、温度を適切に変化させることができるアニーリングおよび伸長加熱領域すなわち第1加熱領域9aと、変性加熱領域すなわち第2加熱領域9bがある（しかし、領域内の温度を適切に変化させれば、単一の加熱領域をアニーリング、伸長および変性に使用できること、あるいはアニーリング、伸長および変性用に3つの別々の加熱領域が存在し得ることは当業者に理解できるだろう）。

この例では、加熱領域は、カセット1が、カセットを受け取ることができるベンチトップ型またはハンドヘルド型のアクチュエータおよび分析装置などの診断機器10に挿入されたときに、診断機器10のヒータと位置合わせされて近接させるカセット1の領域である。加熱領域内の温度は、正確に変化させることができる。しかし、チャネル内またはカセット内の加熱部材を利用することも可能であることが理解されよう。

重要なことは、マイクロ流体ネットワークの流路すなわち液体試料が移動する経路（直線的であってもよいが、図2に示す実施形態のように、バルブ位置および流れ方向の作動に依存して逆流または往復運動を有してもよい）は、試料が、任意のPCR試薬6bが収集される前の第1の時点において、チャンバ6aからの抗阻害試薬を再懸濁させて、第1の温度領域9を通過するようにする。これにより、第1の温度領域9は、試料の熱調整に使用されることになる。その後、試料とPCR試薬6bは混合され、同じ温度領域9がPCR熱サイクルの少なくとも一部に使用される。図2に示す例では、第1の温度領域9aは、PCR試薬の添加前の熱調整と、PCR試薬の添加後のアニーリングおよび伸長の両方に使用される。

マイクロチャネル、特に第1の加熱領域9aに存在するマイクロチャネルの形状は、液体試料がそこに保持され、適切な方法で加熱され得るように選択される。理想的には、試料は、相対的に均一な方法で、または少なくとも、どの部分もより高い閾値温度を超えることなく、すべてが少なくとも必要最小限の温度に加熱されるように、十分に加熱されるであろう。より大きな試料体積は、温度が平衡化するためにより多くの時間を要する可能性があり、そのような時点で、より高い温度は、流体全体にわたって著しい温度勾配で有害である可能性があり、これは、第1の加熱領域9aのマイクロチャネルのより長い長さおよび／または試料が第1の加熱領域9aに長い時間保持されることを必要とし得ることは、理解されるであろう。一般に、試料量は500uL以下（より好ましくは50uL以下）であることが好ましく、第一の加熱領域9aに大きな長さのマイクロチャネルを必要とせずに相対的に迅速な加熱時間を与えることができる。

カセット1は、カセット1を受け取るように適合されたマイクロ流体診断機器10も含む診断システムの一部として、テストまたはアッセイを実施することができる。診断機器10は、概略的に図4に描かれている。このような診断機器は当技術分野でよく知られており、必要な部材は、分子POC診断デバイスの製造技術に精通した当業者に知られているだろう。診断機器10は、カセット1が診断機器10に挿入され、診断機器10と相互作用することを可能にするカセット受取領域11を含む。受取領域は、検査カセットに記憶された情報を読み取り、機器10上に転送することを可能にするバーコード又はチップリーダを含む。このような情報は、機器に存在するバルブ及びベローズアクチュエータの動きを制御するとともに、患者データ等を確認することによって、正しい検査が実施されるようにするために使用される。診断機器10は、カセット1と相互作用し、カセットに含まれる流体試料の診断テストを実行することを可能にする構成要素をさらに含んでいる。図4に示す装置では、診断機器10は、ユーザにデータ及び指示を表示するための表示画面12も含んでおり、これは、ユーザから指示及び情報を受け取るために用いられるタッチスクリーンでもある。診断機器10はまた、流体試料（図示せず）に対して診断的センシング及び／又はイメージングを行うための1つ以上の診断センシング及び／又はイメージング用部材を含む。診断機器10は、流体試料を加熱及び／又は冷却する部材をも含む。加熱部材は、単純なカートリッジまたは抵抗ヒータ、カプトンまたはカプトン様ヒータ、または管若しくはチャネル内の加熱液体の使用を含む領域に熱を供給するための他の方法であってよい。冷却は、周囲または冷却された空気／液体の積極的な移動の有無にかかわらず、能動的／受動的対流、ヒートシンク、熱伝導性ラジエーター／フィンによって達成することができる。好ましい実施形態は、単一のコンパクトな部材として加熱と冷却の両方を組み合わせることができるペルチェヒーターを使用することである。

診断装置10は、1つ以上のアクチュエータを含む。1つ以上のアクチュエータはこの例では、カセット上に存在するベローズを作動させることができる、ベローズバルブの外面に物理的に圧力を加えて圧縮し、または前記圧力を除去して押し下げる機械式アクチュエータである。またカセットにあるバルブを開閉するためにバルブアクチュエータを使用することができる。これも物理的なものだが、Bluetooth（登録商標）で作動するバルブなど他のメカニズムも想定される。事前にプログラムされた指示に従ってベローズとバルブを作動させることで、マイクロ流体ネットワークを通して試料を正確に移動させることができる。上記のように、特定の検査のための正しい指示を持つプログラムの開始は、ユーザーが情報を入力することによって、および/または検査カセット1に存在する情報を読むことによって開始することができる。診断のための事前プログラムされた命令は、通常、診断機器内のCPUによって処理される。

［例-唾液試料または鼻および/または咽頭スワブ試料におけるSARS-CoV-2の検出］
SARS-CoV-2と呼ばれる新規の重症急性呼吸器症候群（SARS）様コロナウイルスは、最近、ヒトの感染症の原因物質として出現し、COVID-19は世界中に急速に広がっている。

本発明は、患者試料中のSARS-CoV-2の存在を、試料の前処理を必要とせず、RT-PCRを用いて迅速に検出するのに使用できる。これは、唾液試料、鼻腔および/または咽頭スワブ試料が一般的にRT-PCRに対する多くの阻害物質を含むため、PCR反応を実行する前に処理を必要とすることに特に関連している。そのため、このような試料に基づく分子検査の大部分は、研究所での中央検査に回され、患者が試料を提供してから、試料にSARS-CoV-2が存在する（COVID 19の陽性であることを示唆する）か否かについての結果が出るまでに時間がかかることになる。その結果、追跡調査が困難になり、潜在的な感染者がウイルスに感染しているかどうかが不明な期間が発生する可能性がある。COVID-19の急速な拡大、WHOによるパンデミックの指定を考えると、POC検査の提供は大きな利益をもたらす可能性がある。

また、危険な病原体に関する諮問委員会（ACDP）委員会は、SARS-CoV-2をHG3病原体に暫定的に分類することに合意したことも注目されています。SARS-CoV-2のような危険な病原体は、非常に慎重な取り扱いが必要です。 陽性または陽性の疑いのある患者からの検体を検査する際の安全性を高めるために、検査工程でウイルスを不活性化することは大きな利点であり、このような病原体の検査を適切にリスク評価されたポイントオブケアまたは患者に近い環境で実施することができます。

図2を見てみると、400μlの患者唾液試料がカセット1の流入口4に装填されています。この段階では、すべてのバルブ3は開いている。その後、キャップ（図示せず）を使用して、カセット1に試料が装填された状態で流入口を閉じる。カセット1は、図4に示す診断装置10に装填される。カセット1は、光学系が関連する視認部と位置合わせされ、装置10の加熱部材がカセット1に存在する第1の加熱領域9aおよび第2の加熱領域9bと位置合わせされる（または近接する）ように、一定の向きで装置10に受け取られる。カセット1上に存在するバーコードまたはデータチップは、機器10内の受信機によって読み取られる。任意の関連データがユーザによって画面12に入力され、CPUは、提供された情報及び記憶している予め定義された検査命令に従って、検査を始動させるプロセスを開始する。

バルブ3a、3b、3c及び3fは閉じられる。ベローズ5aは機器10内の機械的アクチュエータによって圧縮される。その結果ポイント8aで流体が検出される際に決定されるように、試料のスラグ又はアリコートはチャネル2の入口に近い部分から移動する。試料のアリコートが移動するとき、それは、凍結乾燥された形態の阻害防止試薬TCEPを含む試薬チャンバ6Aを通過する。TCEPは試料によって再懸濁される。試料の分量（今はTCEPを含む）は移動を続け、流体検出ポイント8bによって検出される。 TCEPを含むことは、好ましいが、オプションのステップである。

ベローズ5aはさらに圧縮され、流体検出ポイント8gによって検出され、その時点でバルブ3dは閉じられる。任意でバルブ3cを開き、ベローズ5aを使用して残りの試料を廃棄物チャンバ7に送ることができる。

加熱領域9aに近接する装置10内の第1のヒーターは、加熱領域9a内のマイクロチャネル2の温度を95℃まで上昇させる（これは熱調整温度である）。加熱領域9bに近接している機器10内の第2のヒーターは、任意にこの段階でオンにされない。バルブ3eは閉じられ、バルブ3fは開かれる。ベローズポンプ5bは、試料が検出点8fおよび8hで検出されるまで、アクチュエータによって押し下げられる。その後、試料は、設定された時間（この場合、熱調整時間である2分間）、加熱領域1に保持される。熱調整は、PCR阻害剤を除去または低減し、および／または粘度を低減し、および／または試料中に存在する生きたウイルスを不活性化するように作用するはずである。

第1の加熱領域9a内のマイクロチャネル2の寸法は、幅0.7mm、深さ0.4mm、長さ225.42mmで、ドラフトと半径も考慮すると、第1の加熱領域9a境界内のこの蛇行形マイクロチャネルの総容量は、60uLである。この第1の加熱領域内の50ulの液体試料のスラグは、187.85mmの長さを持つことになる。

その後、第1の加熱領域9aに関連するヒーターを冷却して、マイクロチャネル2内の温度が50℃に低下するようにする。また、試料を移動させる前に、試料を一緒に、例えば55℃以下まで冷却させることもでき、あるいは、冷却前に試料を移動させることも可能である。 ベローズ5bおよび5cは、次に、流体検出点8cで流体が検出されるまで、PCR試薬を含む試薬チャンバ6bを通して、今や熱的に調整された試料を制御された速度で移動させるように作動される。 PCR試薬は試薬チャンバ6bの表面で乾燥され、試料が試薬チャンバを通過する際に試料によって再水和される。

ベローズポンプ5bとベローズポンプ5cの更なる作動と解放により、試料（現在は熱的に調整され、PCR試薬を含む）を第1の加熱領域9aに戻す。この段階で、試料は、RT（逆転写）を実施するために一定期間、第1の加熱領域9aに保持される。SARS-CoV-2のようなRNAウイルスを識別しようとする場合に必要となる逆転写ステップは、試料中のDNAを識別または評価するアッセイには必要ないことが理解されるであろう。

近接する機器10の第2のヒーター、第2の加熱領域9bがオンにされ（ただし、RTステップの前または間にオンにすることもできる）、第2の加熱領域9bのマイクロチャネル2内の温度が95℃に取られる-これは変性温度である。

ベローズポンプ5bとベローズポンプ5cの往復作動と解放は、次に、試料を第1の加熱領域9aと第2の加熱領域9bの間で往復移動させる。 試料は、必要な活動が行われるように（すなわち、第2の加熱領域9bにおけるDNAの変性のため、および加熱領域9aにおけるプライマーおよび伸長のアニーリングのため）、各領域で一定時間保持される。 加熱領域間の試料の移動は、設定されたサイクル数の間行われる（サーモサイクリング）。試料は、同定または特性評価が行われる領域に移動させるか、またはこの例のように、流体センサー8eと8fの間のチャネル領域に位置するリーダー部分を通過することによって、各サイクル中に監視することができる。 この例では、増幅プロセス中に付着するようになったプローブの加水分解による蛍光の発生を検出するために既知の光学系が使用されているが、試料中の分析物の存在を決定するための検出または特性評価（例えば、配列決定）の他の方法を使用できることがよく理解されるであろう。

子宮頸部および子宮膣部スワブ試料におけるHPVの検出は、ダイレクトPCRの前に熱処理を行うことでPCRの阻害を減らすことができることを示しています。

子宮頸部および子宮頸管スワブ試料からのダイレクトPCRは常に困難であることがわかっている。これは、粘液に含まれるムチンやその他の糖タンパク質が原因であると考えられ、スワブベースの検体採取では、その採取量に差があることが分かっている。

そこで、試料を加熱して熱処理することで、PCRの阻害が軽減されるかどうかを調査しました。 当初は、膣粘液の状態を模倣した生体内模擬物質が使用された。模擬液は人工膣液（AVF）と名付けられ、下表のように構成された。

胃ブタムチンタイプIIIの濃度を変更し、高い抑制効果が得られる試料を作成した。最終的なムチン含有量は、0%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%とした。

KAPA3GとD4 PCRバッファーを用いたウシ阻害アッセイで、各シミュラント12.5μｌを二重測定し、試料50%、PCR試薬50%の反応を行った。アッセイには、以下が使用された。フォワードプライマー：TCTCCCCCATGTTCCTTGAG、リバースプライマー：GGCCCTGTTACTGCCTGTTC、FAMプローブ：AGGTCTGAGACTAGGGC、X50サイクル、アニーリング：60℃、ゲイン：6.8、閾値：0.1。

各PCRで実行され、AVFを含まないTEのみのコントロールと比較した、複製反応全体の平均CTと標準偏差を以下に示す。この表は、図3の未編集の増幅曲線と直接相関している。
［ムチン濃度が異なる人工膣液をサーマルサイクラーで5分間加熱し、様々な温度で測定した平均CT］

上記のデータ（および図3）は、40～95℃の加熱により、0.5%ムチンを含む人工膣シミュラントから観察される阻害が改善されることを示している（図3D）。2%ムチンAVF（図3A）または1.5%ムチンAVF（図3B）の存在下では熱によるPCRの回復は見られないが、1%ムチンAVFを60℃～90℃で加熱すると信号が検出された（図3C）。先に述べたように、フロッキースワブは約200 μlの粘液を採取し、これを1.2mLの緩衝液に再懸濁すると、最終濃度は0.3-0.8%のムチンということになる。したがって、PCRの前に試料を加熱すると、増幅が回復し、信号が得られる可能性がある。

さらなる実験により、変性ステップ中の加熱ステップを増やしても、観察される阻害は改善されないことが示された。このことから、加熱はリアルタイムPCRの前に行う必要があり、PCR試薬の存在下では行わないことが示唆された。このように、本発明の診断システム内及び診断検査カセット上の流体の流れは、試料の熱調整のための加熱ステップがPCRの前に実施されるように配置される。

本明細書（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示された全ての特徴、および／またはこのように開示された任意の方法またはプロセスの全てのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書（添付の請求項、要約および図面を含む）に開示された各特徴は、明示的に別段の記載がない限り、同一、同等または類似の目的を果たす代替的な特徴で置き換えることができる。したがって、明示的に別段の記載がない限り、開示された各特徴は、同等または類似の特徴の一般的なシリーズの一例のみである。本発明は、前述の実施形態（複数可）の詳細に限定されるものではない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせ、あるいはこのように開示された任意の方法またはプロセスのステップの任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに及ぶ。

本明細書における実質的に任意の複数および／または単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または適用に適切であるように、複数から単数へ、および／または単数から複数へ翻訳することができる。様々な単数／複数の順列は、明確化のために本明細書で明示的に規定されることがある。

一般に、本明細書、特に添付の特許請求の範囲で使用される用語は、一般に「開かれた」用語として意図されることが当業者によって理解されるであろう（例えば、用語「含む」または「備える」は、「含むが限定しない」と解釈すべきである、用語「有する」は、「少なくとも有する」と解釈すべきである、用語「含む」は、「含むが限定しない」と解釈すべきである、など）。導入された請求項の繰り返しの特定の数が意図される場合、そのような意図は請求項において明示的に繰り返され、そのような繰り返しがない場合、そのような意図は存在しないことが当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の請求項は、請求項の説明を導入するために、導入フレーズ「少なくとも1つ」および「1つ以上」の使用を含むことができる。しかしながら、このようなフレーズの使用は、不定冠詞「a」または「an」によるクレーム記載の導入が、同じクレームが導入フレーズ「1つ以上」または「少なくとも1つ」および「a」または「an」などの不定冠詞を含む場合でも、このように導入したクレーム記載を含む任意の特定のクレームを、1つしか含まない実施形態に限定すると示唆するものと解釈してはならない（例えば、「a」及び/又は「an」は、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味すると解釈すべきである）、請求項の繰り返しの導入に用いられる定冠詞の使用についても同じことが言える。さらに、導入された請求項の記載の特定の数が明示的に記載されている場合でも、当業者は、かかる記載は、少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを認識するであろう（例えば、他の修飾語なしの「2つの記載」のありのままの記載は、少なくとも2の記載、または2以上の記載を意味する）。

本開示の様々な実施形態が、例示の目的で本明細書に記載されており、本開示の範囲から逸脱することなく様々な変更がなされ得ることが理解されよう。したがって、本明細書に開示された様々な実施形態は、限定することを意図しておらず、真の範囲は、以下の特許請求の範囲によって示される。

Claims (31)

1. 試料中の検体を検出する診断装置内部で受取可能な流体検査装置であって、
   本体と、
   前記本体を貫通する流体チャネルと、
   前記流体チャネルと流体連通する流入口と、
   所望の距離及び方向の試料流路に沿った前記流体チャネルを介して液体試料を移動させる手段と、
   第１加熱領域と、を備え、
   前記試料流路の配置は、第１時点では試料が前記第１加熱領域の少なくとも一部内に位置すると共に熱調節温度にまで加熱され、第２時点では前記試料及び１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応試薬は前記第１加熱領域内に位置すると共に熱サイクルプロファイルの少なくとも一部分の一部として加熱されるようにされることを特徴とする、
   流体検査装置。
2. 請求項１に記載の流体検査装置であって、前記流体チャネルは、前記流路を構成するように開閉するように適合する１つ以上のバルブを備える複数の流体チャネルのネットワークである、流体検査装置。
3. 請求項１又は２に記載の流体検査装置であって、前記流体チャネルを通して液体を移動させる手段は、所望の方向、及び、前記流体チャネルに沿った所望の距離の前記液体の所定の移動を可能にする、流体検査装置。
4. 請求項１～３のいずれかに記載の流体検査装置であって、前記流体チャネルを通して液体を移動させる手段は、複数の容積式ポンプを含む、流体検査装置。
5. 請求項１～４のいずれかに記載の流体検査装置であって、前記第１加熱領域は、プログラムされたプロトコルに従って、診断機器内で受け取られるときに加熱されるように適合される、流体検査装置。
6. 請求項１～５のいずれかに記載の流体検査装置であって、前記第１加熱領域は、前記流体チャネルの一部を含み、前記流路の一部に関連付けられる、流体検査装置。
7. 請求項１～６のいずれかに記載の流体検査装置であって、第２加熱領域が存在する、流体検査装置。
8. 請求項１～７のいずれかに記載の流体検査装置であって、前記流体チャネルのネットワーク内に阻害軽減試薬が存在する、流体検査装置。
9. 請求項８に記載の流体検査装置であって、前記阻害軽減試薬は試薬チャンバ内に供される、流体検査装置。
10. 請求項８又は９に記載の流体検査装置であって、前記阻害軽減試薬は、乾燥若しくは凍結乾燥された材料として又は液状で供される、流体検査装置。
11. 請求項８～１０のいずれかに記載の流体検査装置であって、前記阻害軽減試薬は、前記流路内の前記第１加熱領域の上流で前記試料と混合するような位置に設けられる、流体検査装置。
12. 請求項８～１１のいずれかに記載の流体検査装置であって、前記阻害軽減試薬は還元剤である、流体検査装置。
13. 請求項８～１２のいずれかに記載の流体検査装置であって、前記阻害軽減試薬は、チオール還元剤である、流体検査装置。
14. 請求項１３に記載の流体検査装置であって、前記チオール還元剤は、トリス(２－カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、流体検査装置。
15. 請求項１～１４のいずれかに記載の流体検査装置であって、前記流体検査装置は、マイクロ流体カセットの形態をとる、流体検査装置。
16. 請求項１～１５のいずれかに記載の流体検査装置と、該検査装置を受ける診断機器を備える分子診断システムであって、前記診断機器は、該診断機器内において相対的に固定された方位で前記流体検査装置を受けるように構成される、分子診断システム。
17. 請求項１６に記載の分子診断システムであって、前記診断機器は中央演算装置（ＣＰＵ）を備える、分子診断システム。
18. 請求項１６又は１７に記載の分子診断システムであって、前記診断機器は、前記検査装置が前記診断機器内で受けられるときに前記検査装置の前記第１加熱領域を加熱するように構成される第１ヒータを備える、分子診断システム。
19. 請求項１６～１８のいずれかに記載の分子診断システムであって、前記診断機器は、前記流体検査装置上での前記バルブの開閉を制御する１つ以上のバルブアクチュエータを備える、分子診断システム。
20. 請求項１６～１９のいずれかに記載の分子診断システムであって、前記診断機器は、前記流体検査装置の前記流体チャネルを通る液体を移動させる手段の作動を制御する１つ以上の移動アクチュエータを備える、分子診断システム。
21. 分子診断システム内の検査装置上でのポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、
    試料を取得する段階と、
    前記流入口を介して前記試料を請求項１～１５のいずれか記載の検査装置へ搬入する段階と、
    前記検査装置が診断機器に挿入されるときに、試料の少なくともアリコートを前記流体チャネルを介して前記第１加熱領域へ移動させる段階と、
    前記第１加熱領域を熱調節温度にまで加熱することで熱調節された試料のアリコートを与える段階と、
    前記熱調節された試料のアリコートと１つ以上のＰＣＲ試薬とを結合させる段階と、
    前記熱調節された試料のアリコートと１つ以上のＰＣＲ試薬とが結合した試料のアリコートを、少なくとも一部が前記加熱領域で起こる熱サイクルに曝す段階、
    を有する方法。
22. 請求項２１に記載のポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、前記第１加熱領域を熱調節温度にまで加熱して熱調節された試料のアリコートを与えるとき、前記試料のアリコートは、所定期間前記第１加熱領域内に保持される、方法。
23. 請求項２１又は２２に記載のポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、前記所定期間は１～１０分である、方法。
24. 請求項２１～２３のいずれかに記載のポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、前記所定期間は２分である、方法。
25. 請求項２１～２４のいずれかに記載のポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、前記熱調節温度は４０℃～９８℃である、方法。
26. 請求項２１～２５のいずれかに記載のポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、好適には前記熱調節温度は９５℃である、方法。
27. 請求項２１～２６のいずれかに記載のポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、
    前記熱調節された試料のアリコートと１つ以上のＰＣＲ試薬とを結合させる段階は、
    前記熱調節された試料のアリコートをＰＣＲ試薬チャンバへ移動させる段階と、
    前記熱調節された試料のアリコートと前記ＰＣＲ試薬とを結合させる段階と、
    前記の結合された熱調節された試料のアリコートとＰＣＲ試薬を前記第１加熱領域へ戻すように移動させる段階、
    を含む方法。
28. 請求項２１～２７のいずれかに記載のポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、少なくとも試料のアリコートを前記流体チャネルのネットワークを通って第１加熱領域へ移動させる前に、前記試料は、阻害軽減試薬に結合される、方法。
29. 請求項２１～２８のいずれかに記載のポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、前記阻害軽減試薬は還元剤である、方法。
30. 請求項２１～２９のいずれかに記載のポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、前記阻害軽減試薬は前記チオール還元剤で、好適にはトリス(２－カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、方法。
31. 請求項２１～３０のいずれかに記載のポリメラーゼ連鎖反応を実行する方法であって、前記分子診断システムはポイント・オブ・ケア分子診断システムで、好適には請求項１６～２０に記載の分子診断システムである、方法。
    

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