CN113493823A

CN113493823A - 一种基于超速pcr与功能核酸的可视化检测方法

Info

Publication number: CN113493823A
Application number: CN202010765006.3A
Authority: CN
Inventors: 许文涛; 黄昆仑; 田晶晶; 李舒婷; 杜再慧
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2021-10-12
Also published as: CN111154844A; CN111154844B

Abstract

本发明提供一种基于超速PCR与功能核酸的可视化检测方法，采用优化的超速PCR反应体系进行检测，比传统方法更快捷、更灵敏，具备特异性强、灵敏度高、检测结果可靠等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使长度为600bp‑2000bp或更长的DNA长靶标片段检测成为可能，便于携带和野外作业，在包括食品安全和快速检测领域的微生物检测领域，具有非常好的应用前景。

Description

一种基于超速PCR与功能核酸的可视化检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种致病菌长靶标序列的快速比色传感新方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)作为一种用于放大扩增特定的DNA靶标片段的分子生物学技术，广泛应用于食品安全、环境监测与临床诊断领域。随着检测时效性需求的增加，超速PCR技术应运而生，将数小时的PCR扩增时间减少至数分钟。然而，受制于PCR反应动力学因素，超速PCR技术仅用于扩增较短的靶标序列，对于待测DNA长度较长的靶标无法扩增。

另外，对于扩增产物的检测，传统的凝胶电泳方法，耗时长、易形成气溶胶污染，电泳所用的化学品对人体危害较大；而实时荧光检测中使用DNA双链荧光嵌入剂，如SYTO9、SYBRGreenI、GelRed等，通过计算Ct值的大小间接表征核酸扩增情况。上述方法均成本较高，耗时长，不利于便捷化使用，其结果不可视，不容易分析。

本课题组为了解决极速PCR检测的便捷化应用问题，提供了一种超速PCR可视化检测方法(Visual single cell detection of dual-pathogens based on multiplexsuper PCR (MS-PCR) and asymmetric tailing HCR (AT-HCR), 《Sensors andActuators B: Chemical》Volume 260, Pages 870-876)，具体为：设计特异性上游引物，并在上游引物的5’末端加入修饰有oxyethyleneglycol化学修饰、且能够发生自身互补的接头序列(AGAGAGAGAGAGGGAAAGAGAGAG-oxyethyleneglycol-CTCTCTCTTTCCCTCTCTCTCTC)与间隔序列(TTTTTT)。在超速PCR扩增靶标序列的同时，利用oxyethyleneglycol化学修饰阻断ExTaq DNA聚合酶延伸，使PCR扩增子携带有单链DNA突出末端；而该单链DNA突出末端作为杂交链式反应的激发序列，启动了自组装反应，形成了大量带有3’端突出粘性末端的DNA双链结构；进一步，大量存在的3’端突出粘性末端作为末端脱氧核酸转移酶的催化位点，形成富含鸟嘌呤G的单链DNA，在氯高铁血红素的诱导下，由末端脱氧核酸转移酶催化形成富G单链组装形成G-四联体，发挥辣根过氧化物酶活性，完成显色。即采用“超速PCR扩增-杂交链式反应-末端脱氧核酸转移酶-G-四联体显色”的4个环节完成超速PCR并显色。

但上述技术仍有可以改进之处。

发明内容

定义：

本发明中的“超速PCR”指通过两个温控体系完成一个循环，进而完成PCR的扩增，区别于常规PCR中由退火、复性、延伸三步骤完成一个循环的PCR扩增方法，同时在常规意义理解上超速PCR用时要短于普通PCR方法。

本发明中的“G-多联体”指被胡斯特氢键稳定的、能够形成富含鸟嘌呤的多层构象的功能核酸高级构象。“G-多联体”可以是G-二联体、G-三联体、G-四联体，还可以是5'-GGTTGGTGTGG-3'。本发明中的“G-多联体”以及“G-二联体”、“G-三联体”、“G-四联体”均指能够与氯高铁血红素（hemin）结合发生显色反应的由氢键稳定、富含鸟嘌呤的多层构象功能核酸。

G-二联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-Z；

Y表示0-2个核苷酸残基，α表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3。

G-三联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-β-（G）n-Z

Y表示0-2个核苷酸残基，α和β表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3。

G-四联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-β-（G）n-γ-（G）n -Z

Y表示0-2个核苷酸残基， α、β和γ表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3。

上述G-二联体、G-三联体、G-四联体的具体结构说明仅作为举例，并不作为对G-二联体、G-三联体、G-四联体具体结构的限制。

本发明中的“核苷酸残基”指常规的核苷酸残基，如A、T、C、G、U等，也包括经过修饰而不影响与显色剂结合、不影响序列特异性的其他核苷酸残基。

本发明中的“特异性引物序列”为依据靶标设计的特异性引物，能够和靶标的对应序列完全互补，也可以基本互补；“基本互补”是指引物与靶标对应序列可以有若干个碱基的差异，但仍能特异性结合靶标；“若干个碱基的差异”包括若干碱基的缺失、增加、替换等。

本发明中的“连接臂”为可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增反应过程中新链延伸的结构；具体的，连接臂可以为oxyethyleneglycol，oxyethyleneglycol的化学结构为：

。

本发明为了克服现有通过PCR扩增的核酸检测耗时长，需配用设备要求高，操作精度控制严格，成本高等缺陷，提供一种基于超速PCR与功能核酸的可视化检测方法。

另一方面，本发明的超速PCR可视化核酸快速检测方法，为了提高超速PCR的检测靶标范围，延长靶标序列长度和检测精度，进一步进行改进。

1、本发明的一个实施方式是提供一种超速PCR可视化核酸快速检测方法，其特征在于使用超速PCR方法扩增靶标序列，并包括显色反应；

PCR反应体系中包括上游引物、下游引物；

所述上游引物包括：序列A、连接臂和特异性引物序列B的核苷酸序列；所述下游引物包括：序列A’、连接臂和特异性引物序列B’的核苷酸序列；所述连接臂位于所述序列A/A’和特异性引物序列B/B’之间，所述特异性引物序列B或B’位于上、下游引物的3’端，与对应靶标互补或基本互补；所述连接臂包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增反应过程中新链延伸的结构；

序列A或序列A’是G-多联体的一种；序列A与序列A’可以相同或不同；

所述序列A与所述特异性引物序列B的核苷酸序列有部分互补和/或反向互补，所述序列A’与所述特异性引物序列B’的核苷酸序列有部分互补和/或反向互补；当检测体系中不存在检测靶标时，所述上游引物和下游引物经过超速PCR的热循环过程、可各自形成发卡结构，无法发生显色反应；当检测体系中存在检测靶标时，所述上游引物和下游引物经过超速PCR的热循环过程，经过退火解链后暴露序列A或A’的全部或部分序列，从而不再与除DNA聚合酶以外的酶接触，直接与显色剂反应显色。

2、在上述实施方式1的检测方法中，显色反应是在氯高铁血红素（hemin）的诱导下，能催化2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（ABTS^2-）与过氧化氢（H₂O₂）生成使反应液呈蓝绿色的物质ABTS^-。

3、在上述实施方式1或2的检测方法中，靶标序列长度可以是80bp以上、100bp以上、200bp以上、400bp以上、600bp以上、800bp以上、1000bp以上、2000bp以上、3000bp以上、4000bp以上或5000bp以上，或50-500bp、80-600bp、600-2000bp、600-3000bp或600-5000bp、50-5000bp。

4、在上述实施方式1-3之一的检测方法中，所述超速PCR的反应过程包括： 95-98℃，0-30s；50-60℃，0-20s；共25-40个循环；具体的，95-98℃下处理时长为0-15s、0-10s、0-5s、1-10s或1-5s，50-60℃下处理时长为0-15s、0-10s、0-5s、1-10s或1-5s；共25-40个循环；更具体的可以是95-98℃，0-5s；50-60℃，0-5s；共25-40个循环。

5、在上述实施方式1-4之一的检测方法中，所述PCR反应体系中，还可以包含纳米金颗粒。

更具体的，包含0.01-20μM的上游引物、0.01-20μM的下游引物、0.01-50 U/μL的聚合酶、0.01-10nM的金纳米颗粒；

更具体的，含有0.5-10μM的上游引物、0.5-10μM的下游引物、0.2-10 U/μL的聚合酶、0.1-1 nM的金纳米颗粒；

更具体的，含有1-5μM的上游引物、1-5μM的下游引物、1-5 U/μL的聚合酶、0.1-0.5 nM的金纳米颗粒；

更具体的，含有2.5μM的上游引物、2.5μM的下游引物、2 U/μL的聚合酶、0.32 nM的金纳米颗粒。

6、在上述实施方式1-5之一的检测方法中，所述超速PCR体系中还包括聚合酶，聚合酶可以是可用于体外核酸扩增技术的KAPA2G FAST聚合酶；所述DNA聚合酶的浓度可以为普通PCR浓度的2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上或80倍以上。

7、在上述实施方式5或6的检测方法中，所述球形金纳米颗粒的直径为5nm、10nm、15 nm、20nm、30nm、35nm及以上，更具体的为15 nm；球形金纳米颗粒的浓度为0.01-10nM，更具体的为0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.5nM、0.7nM、1nM、1.5nM、3nM、5nM、8nM、10nM，更具体的为 0.32 nM。

8、在上述实施方式1-7任意之一的检测方法中，所述连接臂为oxyethyleneglycol，oxyethyleneglycol的化学结构为：

。

9、在上述实施方式1-8任意之一的检测方法中， G-多联体是由氢键稳定、富含鸟嘌呤的多层构象功能核酸；进一步的， G-多联体可以是G-二联体、G-三联体、G-四联体，还可以是5'-GGTTGGTGTGG-3'；进一步的，上述G-多联体、G-二联体、G-三联体或G-四联体之一为能够与氯高铁血红素（hemin）结合发生显色反应的由氢键稳定、富含鸟嘌呤的多层构象功能核酸；

进一步的，G-二联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-Z；Y表示0-2个核苷酸残基，α表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3；

进一步的，G-三联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-β-（G）n-Z

Y表示0-2个核苷酸残基，α和β表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3；

进一步的，G-四联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-β-（G）n-γ-（G）n –Z；Y表示0-2个核苷酸残基， α、β和γ表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3。

还具体的，所述G-三联体包括现有技术或公知常识所定义的G-三联体功能核酸序列；具体的，所述G-三联体功能核酸序列包括所述序列经自组装后能形成具有类辣根过氧化物酶活性的G-三联体功能核酸，所述G-三联体功能核酸在氯高铁血红素（hemin）的诱导下，能催化ABTS^2-与H₂O₂生成使反应液呈蓝绿色的物质ABTS^-。

10、在上述实施方式1-9任意之一的检测方法中，本发明还可以是提供一种长靶标序列的检测方法，所述方法还包括下述1）-2）中的至少一种：

1）所述的长靶标超速PCR的反应过程包括：95-98℃，0-5s；50-60℃，0-5s；共25-40个循环;

具体的，所述超速PCR的反应过程包括：96℃，1s；50℃,2s，共30个循环；

2）所述超快速PCR反应的反应体系中上游引物和下游引物的浓度为普通PCR浓度的10倍以上；还具体的，为15倍以上、20倍以上或25倍以上；所述超速PCR的反应体系中还包括KAPA2G FAST DNA聚合酶，所述DNA聚合酶的浓度为普通PCR浓度的2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上或80倍以上，还具体的为80倍；所述超速PCR的反应体系中还包括金纳米颗粒，还具体的，球形金纳米颗粒的直径为5nm、10nm、15 nm、20nm、30nm、35nm及以上，更具体的为15 nm；球形金纳米颗粒的浓度为0.01-10nM，更具体的为0.01nM、0.02nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.5nM、0.7nM、1nM、1.5nM、3nM、5nM、8nM、10nM，更具体的为 0.32 nM。

11、在上述实施方式1-10任意之一的检测方法中，可选用以下任一种引物组合：

1）所述连接臂包括具长链结构的化合物；

2）所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；

3）所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；

4）所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；

5）所述下游引物包括：将序列表中SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；

6）序列A或A’是构成G-三联体功能核酸序列的全部或部分核苷酸序列，位于所述引物序列的5’端；

7）所述上游引物包括：将序列表中SEQ ID NO：1（序列中n代表oxyethyleneglycol）与SEQ ID NO：3（序列中n代表oxyethyleneglycol）所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：3所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列通过连接臂连接后得到的引物；

8）所述下游引物包括将序列表中SEQ ID NO：2（序列中n代表oxyethyleneglycol）与SEQ ID NO：4（序列中n代表oxyethyleneglycol）所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

所述功能包括可实现特异性扩增或检测待测目标。

更具体的，所述上游引物SEQ ID NO：1为：

GGGATGGGCGGGTT-oxyethyleneglycol-GGCATGTCTGCGCACTTC；

或所述上游引物SEQ ID NO：3为：

GGGATGGGCGGGTT-oxyethyleneglycol-GTGCTCGTTTACGACCTGA；

所述下游引物SEQ ID NO：2为：

GGGCGGGTTGGGTT-oxyethyleneglycol-TCCGCCCTGTCTACTTAT；

或所述下游引物SEQ ID NO：4为：

GGGCGGGTTGGGTT- oxyethyleneglycol-CCCTTTGCGAATAACATCC。

12、本发明的另一个目的是提供一种靶标序列的快速检测装置，其特征在于内置上述1-11任意之一的检测方法包含的PCR反应体系组分，还包括下述1）-4）中的至少一种：

1）所述的超速PCR装置由控制主机、步进电机、机械臂、实时温度监测器、快速热传导功能的反应器与温差容器组成；

2）所述的控制主机通过遥控步进电机控制机械臂运动操控反应温度；

3）所述的步进电机通过携带机械臂、驱动反应器中的反应样品在不同的温度容器之间左右摇摆；反应器内的实时温度监控器能够快速导热，实时感知反应温度；

4）所述的超速PCR装置实现了10分钟内完成30个热循环扩增。

13、本发明的另一个目的是提供一种长靶标序列的比色检测方法，所述方法包括核酸自组装显色反应，使用上述1-11具体实施方式之一PCR反应体系, 其特征在于，所述方法还包括通过最终反应体系的颜色变化判断待测物中是否含有待测目标；

具体的，当反应体系的颜色发生变化时，判断待测物中含有待测目标；再具体的，当反应体系的颜色为蓝绿色时，判断待测物中含有待测目标；

14、本发明的另一个目的是提供一种诊断箱和/或生物传感器，其特征在于使用上述1-11具体实施方式之一PCR反应体系，所述诊断箱和/或生物传感器包括下述1）-4）组成中的一种及以上：

1）金纳米颗粒；

2）上游引物和下游引物，所述上游引物包括：G-三联体序列A、连接臂和特异性引物序列B的核苷酸序列；所述下游引物包括：G-三联体序列A’、连接臂和特异性引物序列B’的核苷酸序列；所述连接臂位于所述G-三联体序列A和特异性引物序列B之间，所述特异性引物序列B或B’位于上、下游引物的3’端；所述G-三联体序列A和所述特异性引物序列B及B’的核苷酸序列有部分互补和/或反向互补；所述连接臂包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增过程中新链延伸的结构；

3）超速PCR装置，其特征在于，由控制主机、步进电机、机械臂、实时温度监测器、反应器与温差容器组成；

4）核酸自组装显色反应体系；

更具体的，包含0.01-20μM的上游引物、0.01-20μM的下游引物、0.01-50 U/μL的聚合酶、0.01-10nM的金纳米颗粒；进一步的，还包含氯高铁血红素（hemin）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（ABTS^2-)和过氧化氢（H₂O₂）；具体的，含有0.5-10μM的上游引物、0.5-10μM的下游引物、0.2-10 U/μL的聚合酶、0.1-1 nM的金纳米颗粒；更具体的，含有1-5μM的上游引物、1-5μM的下游引物、1-5 U/μL的聚合酶、0.1-0.5 nM的金纳米颗粒；更具体的，含有2.5μM的上游引物、2.5μM的下游引物、2 U/μL的聚合酶、0.32 nM的金纳米颗粒。

具体的，所述聚合酶包括可用于体外核酸扩增技术的KAPA2G FAST聚合酶；

更具体的，所述上游引物SEQ ID NO：1为：

GGGATGGGCGGGTT-oxyethyleneglycol-GGCATGTCTGCGCACTTC

或所述上游引物SEQ ID NO：3为：

GGGATGGGCGGGTT-oxyethyleneglycol-GTGCTCGTTTACGACCTGA；

还具体的，所述下游引物SEQ ID NO：2为：

GGGCGGGTTGGGTT-oxyethyleneglycol-TCCGCCCTGTCTACTTAT

或所述下游引物SEQ ID NO：4为：

GGGCGGGTTGGGTT- oxyethyleneglycol-CCCTTTGCGAATAACATCC。

本发明的另一个目的是提供本发明前述任一所述方法、本发明任一所述诊断箱和/或生物传感器的应用，

具体的，所述应用包括下述1）-2）中的至少一种应用：

1）检测长度在600 bp-2000bp的长靶标片段；

2）制备检测基因片段大小为600 bp-2000bp的产品；

具体的，所述长靶标片段来自于沙门氏菌。

本发明的最后一个目的是建立一种基于长靶标超速PCR的功能核酸比色传感器，使用前述任一实施方式所述的检测方法。

（1）该方法建立了长靶标超速PCR反应体系，将超速PCR的待测靶标序列从600bp增加至2000bp及其以上，拓宽了超速PCR的靶标检测范围；

（2）将超速PCR体系搭载核酸显色模块，放大了反应信号、有利于实现致病菌的超灵敏检测；并实现可视化检测；同时优化了反应体系，使检测方法更精准、更快速。

本发明的一个具体实施例是根据沙门氏菌的毒力基因，设计超速聚合酶链式反应的扩增引物，结合核酸自组装显色模块，整合建立一种基于超速PCR的长靶标序列比色传感新方法，用于沙门氏菌的超灵敏检测。

为进一步理解本发明，简述优化检测方法原理如下：

本课题组之前提出的超速PCR可视化检测方法中，通过超速PCR扩增结合杂交链式反应以及自组装反应形成3’端突出粘性末端，经由末端脱氧核酸转移酶催化形成富含鸟嘌呤G的单链DNA，发生显色反应。概括而言，对致病菌的检测经历了“超速PCR扩增-杂交链式反应-末端脱氧核酸转移酶-G-四联体显色”的4个环节。为了进一步改进上述超速PCR可视化检测方法，本发明针对以下几点进一步进行了改进，包括：

一、引物

上游引物由G-三联体序列A、连接臂和特异性引物序列B的核苷酸序列组成；

下游引物由G-三联体序列A’、连接臂和特异性引物序列B’的核苷酸序列组成；

G-三联体序列A和G-三联体序列A’可以相同或不同；

连接臂位于G-三联体序列A和特异性引物序列B之间；连接臂位于G-三联体序列A’和特异性引物序列B’之间；特异性引物序列B或B’位于上、下游引物的3’端；连接臂包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增过程中新链延伸的结构；

G-三联体序列A与所述特异性引物序列B的核苷酸序列有部分互补和/或反向互补；G-三联体序列A’与所述特异性引物序列B’的核苷酸序列有部分互补和/或反向互补；

二、聚合酶

选用具有超速延伸功能的KAPA2G FAST DNA聚合酶，并优化对应的PCR扩增反应体系。

三、添加纳米金颗粒

添加纳米金颗粒提高针对长靶标的检测精度。

从原理上讲，本发明为了实现长靶标核酸序列的可视化检测的目标，在特异性上游引物的5’末端添加G-三联体功能核酸接头形成功能上游引物，在特异性下游引物的5’末端添加G-三联体功能核酸接头形成功能下游引物。功能上游引物与功能下游引物在没有检测靶标时，会各自形成发卡，具有较低的显色背景；当存在检测靶标时，由于连接臂能够阻断DNA聚合酶的延伸，因此经过超速PCR扩增的同时，双链DNA扩增子两侧5’端分别暴露出不同的G-三联体功能核酸接头。该接头结构在氯高铁血红素的诱导下，暴露的G-三联体功能核酸接头序列组装形成G-三联体，发挥辣根过氧化物酶活性，发生显色反应表征靶标的含量。即本发明中对靶标的检测仅经历了“超速PCR扩增 -G-三联体显色”的2个环节。因而通过优化反应体系、选择超速延伸功能的DNA聚合酶以及添加金纳米颗粒能够实现长靶标序列的可视化检测，且保证检测方法的特异性和精确度。

本发明具有下述有益技术效果：

1）本发明所建立的检测方法和生物传感器比传统方法更快捷、更灵敏，具备特异性强、灵敏度高、检测结果可靠等优点，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，更重要的是使长度为600bp-2000bp或更长的DNA长靶标片段检测成为可能，便于携带和野外作业，在包括食品安全和快速检测领域的微生物检测领域，具有非常好的应用前景。

2）引物设计更简洁，具有更高的扩增效率；在特异性引物的5’端添加具有显色潜力的G-三联体功能核酸序列。相比于G-四联体序列，G-三联体的功能核酸序列在组成上减少了一组鸟嘌呤三联序列(GGG)，能够在氯高铁血红素的诱导下、发挥与G-四联体同样的类辣根过氧化物酶活性。同时，G-三联体作为引物接头的组成元件，与特异性扩增序列组成的引物自身形成功能核酸发卡，且上下游引物之间难以形成引物二聚体，改善了因引物接头过长导致扩增效率的损失，兼顾了PCR的高扩增效率与后续显色功能。

3）选择具有超速延伸功能的KAPA2G FAST DNA聚合酶，实现使用超速PCR检测长靶标的可能。其延伸速度达到1000bp/s，扩增900bp与1790bp的长靶标序列3秒即可完成1个循环，完成30个循环仅仅需要90秒。显著缩短了反应时间，实现长靶标序列的超速PCR扩增。同时添加金纳米颗粒，提高长靶标序列的检测精度。

4）本发明所建立的检测方法和生物传感器可实现对长基因片段靶标的特异性检测，检测的特异性好、灵敏度高，检测结果可靠、肉眼即可辨别，检测过程快捷方便，在日常监控或市场筛查等方面具有重要意义。特别是，对沙门氏菌检测的检测灵敏度分别为1.5×10⁰ 拷贝数/微升；并验证了本申请的方法对志贺氏杆菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌无交叉反应，特异性好。

附图说明

图1 优化引物对超速PCR背景显色影响。1、2号样品为900bp扩增子(扩增引物为Primer 1+ Primer 2)的超速PCR的显色图像，其中1号样为阴性扩增(加入RNase-freewater作为扩增模板)； 3、4号样品为1790bp扩增子(扩增引物为Primer 3+ Primer 4)的超速PCR的显色图像，其中3号样为阴性扩增(加入RNase-free water作为扩增模板)。

图2 优化引物对超速PCR扩增效率影响。

图3 使用金纳米颗粒提高超速PCR检测精度。图3A是靶标为900bp扩增子(扩增引物为Primer 1+ Primer 2)的熔解曲线分析，分别为未加入金纳米颗粒和加入金纳米颗粒；图3B是靶标为1790bp扩增子(扩增引物为Primer 3+ Primer 4)的熔解曲线分析，分别为未加入金纳米颗粒和加入金纳米颗粒。

图4 G-多联体显色功能比较。图4A中寡核苷酸的终浓度为2.5μm；图4B中寡核苷酸的终浓度为500nM。

图5 引物浓度和DNA聚合酶浓度对超速PCR可视化检测显色效果的影响。图5A为引物浓度的优化；图5B为DNA聚合酶浓度的优化。

图6为超速PCR装置的结构示意图。由控制主机1、步进电机2、机械臂3、实时温度检测器4、具有疏水涂层5的快速热传导反应器6、制热温差容器8、制冷温差容器9和实时荧光监测光纤7组成。

图7为长靶标超速PCR反应的扩增效果验证对比图；其中，泳道1为D2000 Marker；泳道2为80bp的短靶标超速PCR的阳性对照（添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）；泳道3为80bp的短靶标超速PCR的阴性对照（不添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）；泳道4为不添加金纳米颗粒的285bp的短靶标超速PCR的阳性对照（添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）；泳道5为不添加金纳米颗粒的285bp的短靶标超速PCR的阴性对照（不添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）；泳道6为添加金纳米颗粒的900bp的长靶标超速PCR的阴性对照（不添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）；泳道7为添加金纳米颗粒的900bp的长靶标超速PCR的阳性对照（添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）。

图8为不同浓度范围的沙门氏菌的检测数值与显色图片。

图9为特异性实验结果图。

图10 为本发明中使用引物的二级结构分析图。图10A和10B是900 bp扩增子的引物（Primer 1、Primer 2）二级结构分析图；图10C和10D是1790bp扩增子的引物（Primer 3、Primer 4）二级结构分析图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验材料

本实施例所采用的菌株信息见表1。

表1

本实施例中所用试剂包括KAPA2G Fast DNA 聚合酶, 5×KAPA2G Buffer (7.5 mMMg²⁺Plus)购自KAPA Biosystmes公司，dNTP Mixture (2.5 mM)均购自宝生物公司（TAKaRa）。氯高铁血红素（Hemin）与2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（ABTS2-)购自阿拉丁试剂（Sigma-Aldrich Chemical Co.）。实验用水均来自Milli-Q纯水系统。其他试剂均购自国药集团。

实施例1、优化引物设计对超速PCR反应显色反应背景的影响。

（一）引物设计

表2

引物名称	序列 (from 5’ to 3’)	编号
			Primer 1	GGGATGGGCGGGTT-oxyethyleneglycol-GGCATGTCTGCGCACTTC	SEQ ID NO:1
Primer 2	GGGCGGGTTGGGTT-oxyethyleneglycol-TCCGCCCTGTCTACTTAT	SEQ ID NO:2
			Primer 3	GGGATGGGCGGGTT-oxyethyleneglycol-GTGCTCGTTTACGACCTGA	SEQ ID NO:3
Primer 4	GGGCGGGTTGGGTT-oxyethyleneglycol-CCCTTTGCGAATAACATCC	SEQ ID NO:4

依据表2设计引物序列。上游引物Primer 1的连接臂（oxyethyleneglycol bridge）左侧的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，连接臂右侧的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，连接臂的化学结构为：

。

表2中，下游引物Primer 2的连接臂（oxyethyleneglycol bridge）左侧的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，连接臂右侧的核苷酸序列为序列表中SEQID NO：8所示的核苷酸序列。

表2中，上游引物Primer 3的连接臂（oxyethyleneglycol bridge）左侧的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，连接臂右侧的核苷酸序列为序列表中SEQID NO：10所示的核苷酸序列。

表2中，下游引物Primer 4的连接臂（oxyethyleneglycol bridge）左侧的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，连接臂右侧的核苷酸序列为序列表中SEQID NO：10所示的核苷酸序列。

表2中所列的序列均为人工合成。

（二）构建超速PCR反应体系

如表3所示，构建超速PCR反应体系。

表3

反应组分	浓度
		模板	2 μL
KAPA2G FAST DNA聚合酶	2 U/μL
		Primer 1/Primer 3	2.5 μM
Primer 2/Primer 4	2.5 μM
		dNTP	250 μM
5×KAPA2G Buffer	1×KAPA2G Buffer
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 10 μL

将沙门氏菌在LB培养基中过夜培养活化，采用New Industry公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取沙门氏菌菌液中的基因组DNA，将提取到的基因组DNA各取2 μL混合，作为表3中的模板。

（三）超速PCR反应

按照表3，在冰上配制10微升反应体系，迅速置于步骤（二）搭建的超速PCR装置中进行温度控制，温度控制及循环数见表4：

（四）显色反应

将完成反应后的10μL反应体系，加入1μL氯高铁血红素（hemin）储液（10 μM），73 μL G-三联体诱导缓冲液 (100 mM 2-吗啉乙磺酸,2-(4-morpholine) ethanesulfonic acid(MES)）, 40 mM KCl, 与体积百分数为0.05% Triton X-100, pH 5.5) ；于 37°C 孵育 20min；加入8 μL的 ABTS^2-储液 (20 mM) 与 8 μL的过氧化氢 (H₂O₂) 储液 (20 mM) 于室温避光孵育5min，使用单反相机拍摄显色如图1所示的显色图片；之后，加入50 μL的H₂SO₄ (2M) 终止显色反应，利用分光光度计检测反应液在450nm处的OD值。

（五）显色结果

如图1所示，1号样品为900bp扩增子(扩增引物为Primer 1+ Primer 2)的超速PCR阴性扩增(加入RNase-free water作为扩增模板)的显色图像；加入硫酸终止液后，OD₄₅₀=0.2722；

2号样品为900bp扩增子(扩增引物为Primer 1+ Primer 2)的超速PCR阳性扩增(加入沙门氏菌作为扩增模板)的显色图像；加入硫酸终止液后，OD₄₅₀=0.8667；

3号样品为1790bp扩增子(扩增引物为Primer 3+ Primer 4)的超速PCR阴性扩增(加入RNase-freewater作为扩增模板)的显色图像；加入硫酸终止液后，OD₄₅₀=0.3289；

4号样品为1790bp扩增子(扩增引物为Primer 3+ Primer 4)的超速PCR阳性扩增(加入沙门氏菌作为扩增模板)的显色图像；加入硫酸终止液后，OD₄₅₀=0.9196。

结果显示，使用引物在不存在靶标进行阴性PCR扩增时，部分富G序列形成功能发卡，因此无法形成G-三联体构象、进而无法发挥类辣根过氧化物酶的催化活性，具有很低的显色背景。由此说明，长靶标超速PCR的引物在扩增后具有显色良好的能力，但在不存在检测靶标作为扩增模板时，优化的引物设计使该检测方法具有极低的显色背景。

实施例2、优化引物设计对超速PCR反应扩增效率的影响

（一）基因组提取

将沙门氏菌在LB培养基中过夜培养活化，采用New Industry公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取沙门氏菌菌液中的基因组DNA，使用nanodrop对沙门氏菌的基因组进行定量测定，得到基因组浓度为417.806 ng/ uL。

（二）实时定量PCR检测扩增效率

之后进行10倍系列梯度稀释后，各取1 μL添加到real time PCR扩增体系中，反应试剂与反应体系参照天根生化科技（北京）有限公司FP205的产品使用说明，反应程序参照FP-205的三步法反应程序。

不同反应中引物选择：

图2A中使用引物上游引物序列为：AGAGAGAGAGAGGGAAAGAGAGAG- oxyethyleneglycolbridge-CTCTCTCTTTCCCTCTCTCTCTCTTTTTTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA；下游引物序列为：Biotin-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC。该引物特异性扩增沙门氏菌基因组中285bp的靶标片段；

图2B 中使用引物：primer 1与primer 2，扩增900bp靶标；

图2C 中使用引物：primer 3与primer 4，扩增1790bp靶标。

（三）扩增效率计算

终止显色反应后，根据不同扩增模板浓度的Ct值绘制Ct-Log(copy number)的标准曲线，根据标准曲线的斜率计算不同引物扩增时的扩增效率E：E=10^-1/斜率 – 1

结果显示，图2A中，扩增285bp靶标片段的扩增效率为67.70%；图2B中扩增900bp靶标片段的扩增效率为78.24%；图2C中扩增1790bp靶标片段的扩增效率为75.39%。因此，优化设计的引物相比于扩增285bp靶标片段的引物，在反应体系中体现更高的扩增效率。

实施例3、金纳米颗粒对超速PCR检测精度的优化

（一）反应体系建立

配制如实施例1相同的长靶标超速PCR反应体系（表3）和反应条件（表4）进行反应。其中加入直径为15nm、终浓度为0.32 nM的金纳米颗粒；对照样品用超纯水替代。最终反应体系用超纯水补至10ul。

引物选择扩增900bp靶标的上下游引物Primer 1、 Primer 2；以及扩增1790bp靶标的上下游引物Primer 3、 Primer 4。

（二）溶解曲线分析：

在长靶标超速PCR的反应终产物中加入终浓度为0.5×的Eva green染料，使用Bio-Rad的real time PCR的溶解曲线分析功能（melt curve analysis）对长靶标超速PCR的反应终产物进行溶解曲线分析。比较加入金纳米颗粒前后，对长靶标超速PCR扩增后的终产物熔解曲线的影响。

结果如图3所示，图3A为900 bp的长靶标超速PCR扩增子的熔解曲线分析，分别为未加入金纳米颗粒和加入金纳米颗粒；图3B为1790 bp的长靶标超速PCR扩增子的熔解曲线分析，同样分别为未加入金纳米颗粒和加入金纳米颗粒。与加入金纳米颗粒后的扩增子的单主峰相比，未加入金纳米颗粒的长靶标超速PCR扩增子具有杂峰，900bp靶标和1790bp靶标均是如此，1790bp靶标的前端显出突出的杂峰，即靶标越长在超速反应PCR中出现杂峰的可能性越高。杂峰意味着非特异性产物的增加，可能影响检测精度。因此认为金纳米颗粒能够增强了长靶标超速PCR反应的反应特异性与灵敏度，提高检测精度。

实施例4、引物设计中G-多联体显色功能比较

（一）G-多联体序列选择与显色反应体系

选择不同的G-多联体，比较它们的显色效果。选用的G-多联体序列如下：

样品1与样品5使用的核酸序列：5’- AGGGTTGGGCGGGATGGG-3’

样品2与样品6使用的核酸序列：5’- AGGGTTGGG-3’

样品3与样品7使用的核酸序列：5’-GGGATGGGCGGGTT-3’

样品4与样品8使用的核酸序列：5’-GGGCGGGTTGGGTT-3’

将10μL的25 μM上述寡核苷酸母液加入1μL氯高铁血红素（hemin）储液（10 μM），73 μLG-三联体诱导缓冲液 (100 mM 2-吗啉乙磺酸,2-(4-morpholine) ethanesulfonic acid(MES)）, 40 mM KCl, 与体积百分数为0.05% Triton X-100, pH 5.5) ；于 37°C 孵育 20min；加入8 μL的 ABTS^2-储液 (20 mM) 与 8 μL的过氧化氢 (H₂O₂) 储液 (20 mM) 于室温避光孵育5min，此时不同寡核苷酸的终浓度为2.5 μM；之后，加入50 μL的H₂SO₄ (2 M) 终止显色反应，使用单反相机拍摄显色图片（图4A），利用分光光度计检测反应液在450nm处的OD值。

图4B中显色步骤与图4A完全相同，差别仅在于使用10μL的0.5μM寡核苷酸母液加入显色体系，则不同寡核苷酸的终浓度为500 nM。

（二）显色结果比较

选用鸟嘌呤三联体(GGG)为核心，设计出不同的富G多联体序列，经显色反应后OD₄₅₀数值见表5：

表5

因此，无论是2.5 μM的高浓度还是500 nM的低浓度，G-三联体同样能够完成与G-四联体相似的显色任务。同时，G-二联体由于结构的缺失，与氯高铁血红素（hemin）结合显色效果要低于G-三联体或G-四联体。

而考虑到G-三联体功能核酸序列在组成上比G-四联体序列减少了一组鸟嘌呤三联序列(GGG)，作为引物接头的组成元件，减少了上下游引物之间难以形成引物二聚体的可能。因此认为G-三联体功能核酸序列，能够改善因引物接头过长并形成二聚体导致扩增效率的损失，并兼顾了PCR的高扩增效率与显色功能。

实施例5、引物浓度和DNA聚合酶浓度对超速PCR可视化检测显色效果的影响

超速PCR可视化检测方法是在完成长靶标超速PCR扩增后直接显色，显色体系中含有高浓度的引物与蛋白酶。为了达到最佳的显色效果，使高浓度的引物与蛋白酶不影响显色精度，对引物浓度与蛋白酶的浓度进行优化。

（一）反应体系建立

使用primer 1与Primer 2扩增900bp的靶标序列。配制如实施例1相同的长靶标超速PCR反应体系（表3）和反应条件（表4）进行反应，并添加直径为15nm、终浓度为0.32 nM的金纳米颗粒，最终反应体系用超纯水补至10ul。之后加入50 μL的H₂SO₄ (2 M) 终止显色反应，使用单反相机拍摄显色图片，利用分光光度计检测反应液在450nm处的OD值。

探索最佳的引物浓度时，固定KAPA2G FAST DNA聚合酶的浓度为2 U/μL；探索最佳的KAPA2G FAST DNA聚合酶的浓度时，固定primer 1与Primer 2的浓度各为2.5 μM。

引物浓度分别设为0.25、0.625、1.25、2.50和5.00μM；

KAPA2G FAST DNA聚合酶浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、4.0U/μL。

结果显示在0.25-5.00μM的引物浓度下以及0.5-4.0U/μL的KAPA2G FAST DNA聚合酶浓度下，本发明中的显色反应体系都可以很好的显色，更佳的显色浓度是0.625-5.00μM的引物浓度下以及1.5-4U/μL的KAPA2G FAST DNA聚合酶。

实施例6、一种用于检测沙门氏菌的基于长靶标超速PCR的功能核酸比色传感新方法的建立

（一）实验材料

本实施例所采用的菌株信息见表1，所设计的引物的核苷酸序列见表2和序列表。

（二）超速PCR装置的搭建

超速PCR装置的主要结构如图6所示，其具体的结构、连接方式和工作原理、工作过程包括：

超速PCR装置采用Light Cycler型号的毛细管（20uL，04 929 292 001，Roche）作为反应器，通过快速离心的方式，样品会分别聚集到各个毛细管一端，离心完成后带有样品的毛细管被固定在机械臂上。机械臂连接到步进电机（42JSF630AS-1000，Just MotioinControl）上，由该步进电机带动固定在机械臂上的反应器在96℃与50℃的温差容器之间循环转换，实现超速PCR过程中的反应温度变化及控制。所述步进电机由开关电源（S-100-24，Elecall）进行供电，采用直流伺服电机驱动器（YZ-ACSD60，Moving）以及Labview（version2014）实现步进电机的上述循环转换的频率或时间的控制。温度测量利用封装在反应器中的实时温度监测器（BD-TC-SP）来实现。热电偶信号的放大及线性化处理过程则利用温度变送器（SBWR-2260，K，Yuancheng）进行传递并采用Arduino UNO v1.0芯片进行处理。ArduinoUNO芯片将接收到的温度的模拟信号转换成数字信号，然后由Arduino IDE（version1.8.1）模块执行运算。

（三）长靶标超速PCR反应

1）配制长靶标超速PCR反应体系，具体见表3：

将沙门氏菌在LB培养基中过夜培养活化，采用New Industry公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取沙门氏菌菌液中的基因组DNA，将提取到的基因组DNA各取2μL混合，作为表3中的模板。添加直径为15nm、终浓度为0.32 nM的金纳米颗粒，对照用超纯水代替，最终反应体系用超纯水补至10ul。

各样品所用引物序列为：

80bp的短靶标使用引物序列为（泳道2、3）：

上游引物：gtaaagct ggctttccctttcc；下游引物：tgatgcggatgccgcgcgcgcgaa

285bp的短靶标使用引物序列为（泳道4、5）：

上游引物：gtgaaattatcgccacgttcgggcaa；285-下游引物：tcatcgcaccgtcaaaggaacc；

900bp的短靶标使用引物序列为（泳道6、7）：Primer 1、Primer 2。

2）长靶标超速PCR反应过程：

按照表3，在冰上配制10微升反应体系，迅速置于步骤（二）搭建的超速PCR装置中进行温度控制，温度控制及循环数见下表（同表4）：

3）长靶标超速PCR反应的扩增效果验证：

完成上述长靶标超速PCR反应过程后，使用2%溴化乙锭预染色的琼脂糖凝胶电泳验证长靶标超速PCR反应体系的扩增效果，电泳条件：130 V for 25 min，拍照系统：MolecularImager Gel Doc XR (Bio-Rad)。

其中，泳道1为D2000 Marker；泳道2为80bp的短靶标超速PCR的阳性对照（添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）；泳道3为80bp的短靶标超速PCR的阴性对照（不添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）；泳道4为不添加金纳米颗粒的285bp的短靶标超速PCR的阳性对照（添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）；泳道5为不添加金纳米颗粒的285bp的短靶标超速PCR的阴性对照（不添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）；泳道6为添加金纳米颗粒的900bp的长靶标超速PCR的阴性对照（不添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）；泳道7为添加金纳米颗粒的900bp的长靶标超速PCR的阳性对照（添加沙门氏菌的超速PCR反应体系）。

长靶标超速PCR反应的扩增效果验证对比图见图7，图7结果表明：含有金纳米颗粒参与的长靶标超速PCR反应体系实现了沙门氏菌900bp的长靶标基因序列的有效扩增，并且具有较高的扩增效率与特异性。

（四）核酸自组装显色模块的建立与沙门氏菌长靶标序列的可视化检测

1）灵敏度实验

沙门氏菌的标准曲线的绘制：

将沙门氏菌在LB培养基中过夜培养活化，将梯度稀释、经过平板计数，浓度分别为1.5×10⁰拷贝数/微升, 1.5×10¹拷贝数/微升，1.5×10²拷贝数/微升，1.5×10³拷贝数/微升，1.5×10⁴拷贝数/微升，1.5×10⁵拷贝数/微升，1.5×10⁶拷贝数/微升的沙门氏菌菌液采用New Industry公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组。将从相同浓度的沙门氏菌菌液中提取到的基因组取2uL后作为模板，按照上述步骤（三）所述的长靶标超速PCR反应进行超速PCR反应。将完成反应后的10μL反应体系，加入1μL氯高铁血红素（hemin）储液（10 μM），73 μL G-三联体诱导缓冲液 (100 mM 2-吗啉乙磺酸,2-(4-morpholine) ethanesulfonicacid (MES)）, 40 mM KCl, 与体积百分数为0.05% Triton X-100, pH 5.5) ；于 37°C 孵育 20 min；加入8 μL ABTS^2-储液 (20 mM) 与 8 μL过氧化氢 (H₂O₂) 储液 (20 mM) 于室温避光孵育5min。

反应完成后利用分光光度计检测反应液在450nm处的OD值，减去阴性对照（无沙门氏菌作为扩增模板）在450nm处的OD值，得到△OD450的数值（如图8）。发现当沙门氏菌的菌液浓度大于等于1.5×10⁰拷贝数/微升时，裸眼观察到的半定量结果与利用分光光度计监测得到的数值与空白对照相比均存在明显差别，因此确定沙门氏菌的检测限为：1.5×10⁰拷贝数/微升，说明本发明所建立的检测新方法灵敏度高。

2）准确度实验

加标回收检测实验：

将浓度为1.5×10¹拷贝数/微升的沙门氏菌菌液用传统的平板检测法和本发明建立的新方法进行检测，检测结果如表6所示，本发明所建立的检测新方法（检测过程同上述灵敏度实验过程一致，不同的地方只是提取的是浓度均为1.5×10¹拷贝数/微升的沙门氏菌菌液的基因组DNA，提取后，取2μL混合后作为模板）所检测出的平均菌落数接近于传统平板检测法检测出的平均菌落数，说明本发明所建立的检测新方法准确度高。

表6

3）特异性实验

将沙门氏菌、志贺氏杆菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌在LB培养基中过夜培养活化，制备成1.5×10⁰拷贝数/微升的沙门氏菌菌液、1.5×10²拷贝数/微升的志贺氏杆菌菌液、1.5×10²拷贝数/微升的副溶血弧菌菌液、1.5×10²拷贝数/微升的大肠杆菌菌液、1.5×10²拷贝数/微升的金黄色葡萄球菌菌液与1.5×10²拷贝数/微升的蜡样芽胞杆菌菌液，采用New Industry公司的细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取不同菌液中的基因组DNA，各取2μL混合作为模板,计为反应体系，按照上述步骤（三）所述的长靶标超速PCR反应（除模板做相应的替换外，其它均一致）进行长靶标超速PCR反应。

将各自的10μL反应体系，加入1μL氯高铁血红素（hemin）储液（10 μM），73 μL G-三联体诱导缓冲液 (100 mM 2-吗啉乙磺酸,2-(4-morpholine) ethanesulfonic acid(MES)）, 40 mM KCl, 与体积百分数为0.05% Triton X-100, pH 5.5) ；于 37°C 孵育 20min；加入8 μL ABTS^2-储液 (20 mM) 与 8 μL过氧化氢 (H₂O₂) 储液 (20 mM) 于室温避光孵育5min。

实验结果如图9所示，本发明所建立的检测方法对志贺氏杆菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌无交叉反应，可实现沙门氏菌的特异性检测。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种基于超速PCR与功能核酸的可视化检测方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggatgggcg ggttnggcat gtctgcgcac ttc 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggcgggttg ggttntccgc cctgtctact tat 33

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggatgggcg ggttngtgct cgtttacgac ctga 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggcgggttg ggttnccctt tgcgaataac atcc 34

<210> 5

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggatgggcg ggtt 14

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcatgtctg cgcacttc 18

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggcgggttg ggtt 14

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccgccctgt ctacttat 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgctcgttt acgacctga 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccctttgcga ataacatcc 19

Claims

1.一种基于超速PCR与功能核酸的可视化检测方法，其特征在于使用超速PCR方法扩增靶标序列，并包括显色反应；

PCR反应体系中包括上游引物、下游引物；

所述上游引物包括：序列A、连接臂和特异性引物序列B的核苷酸序列；所述下游引物包括：序列A’、连接臂和特异性引物序列B’的核苷酸序列；所述连接臂位于所述序列A/A’和特异性引物序列B/B’之间，所述特异性引物序列B或B’位于上、下游引物的3’端，与对应靶标互补或基本互补；所述连接臂包括可抑制聚合酶结合的结构和/或可抑制体外核酸扩增反应过程中新链延伸的结构；序列A或序列A’是G-多联体的一种；序列A与序列A’可以相同或不同；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其技术特征在于，所述显色反应是在氯高铁血红素hemin的诱导下，催化2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐ABTS^2-与过氧化氢H₂O₂生成使反应液呈蓝绿色的物质ABTS^-；

所述连接臂为oxyethyleneglycol，oxyethyleneglycol的化学结构为：

,所述PCR反应体系中使用KAPA2G FAST DNA聚合酶。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，靶标序列长度可以是80bp以上或600bp以上，还可以是50-5000bp或600-3000bp； PCR反应的反应过程包括： 95-98℃，0-30s；50-60℃，0-20s，共25-40个循环；更具体的可以是95-98℃，0-5s；50-60℃，0-5s，共25-40个循环。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系中，还可以包含纳米金颗粒；

优选的，包含0.01-20μM的上游引物、0.01-20μM的下游引物、0.01-50 U/μL的聚合酶、0.01-10nM的金纳米颗粒；

更优选的，含有1-5μM的上游引物、1-5μM的下游引物、1-5 U/μL的聚合酶、0.1-0.5 nM的金纳米颗粒；

更优选的，含有2.5μM的上游引物、2.5μM的下游引物、2 U/μL的聚合酶、0.32 nM的金纳米颗粒。

5.根据权利要求1-4任一所述的检测方法，其特征在于，所述G-多联体是能够与氯高铁血红素hemin结合发生显色反应的由氢键稳定、富含鸟嘌呤的多层构象功能核酸；优选的，G-多联体可以是G-二联体、G-三联体、G-四联体，还可以是5'-GGTTGGTGTGG-3'；

更优选的，G-二联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-Z；Y表示0-2个核苷酸残基，α表示1-3个核苷酸残基,Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3；

G-三联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-β-（G）n-Z

G-四联体结构可以为：Y-（G）n-α-（G）n-β-（G）n-γ-（G）n –Z；Y表示0-2个核苷酸残基，α、β和γ表示1-3个核苷酸残基，Z表示0-3个核苷酸残基；n表示鸟嘌呤的数量，n值为2或3；

更优选的，G-多联体是SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或5'-GGTTGGTGTGG-3'。

6.根据权利要求5的检测方法，其特征在于，所述PCR反应的反应过程包括：96℃，1s；50℃,2s，共30个循环；

所述上游引物为：

GGGATGGGCGGGTT-oxyethyleneglycol-GGCATGTCTGCGCACTTC；

或所述上游引物为：

GGGATGGGCGGGTT-oxyethyleneglycol-GTGCTCGTTTACGACCTGA；

所述下游引物为：

GGGCGGGTTGGGTT-oxyethyleneglycol-TCCGCCCTGTCTACTTAT；

或所述下游引物为：

GGGCGGGTTGGGTT- oxyethyleneglycol-CCCTTTGCGAATAACATCC。

7.一种靶标序列的快速检测装置，其特征在于，使用权利要求1-6任一所述的检测方法进行检测，还包括：

1）所述的快速检测装置由控制主机、步进电机、机械臂、实时温度监测器、快速热传导功能的反应器与温差容器组成；

4）所述的超速PCR反应装置能够实现10分钟内完成30个热循环扩增。

8.一种诊断箱和/或生物传感器，其特征在于，使用权利要求1-6任一所述的检测方法进行检测，依据靶标序列设计扩增引物，结合核酸自组装显色模块，用于靶标的超灵敏检测；优选的，靶标长度在600-3000bp之间，检测时间在10分钟以内。