CN116479175A - 用于检测人副流感病毒核酸的检测系统、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测人副流感病毒(HPIV)I型、II型和/或III型的检测系统、试剂盒、方法及应用。该检测系统包括Cpf1检测系统，其中，所述Cpf1检测系统包含分别针对HPIV‑I、HPIV‑II和/或HPIV‑III的特异性crRNA。该方法含有适用于HPIV‑I、HPIV‑II和HPIV‑III的等温扩增体系和Cpf1荧光检测体系，能够快速地同时检测人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，且具有灵敏度高、特异性强、可视化等优点，在人副流感病毒的临床分型诊断和疾病监测等方面具有极大的应用前景。

Description

用于检测人副流感病毒核酸的检测系统、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人副流感病毒核酸的检测系统、试剂盒及方法。
背景技术
人副流感病毒(Human parainfluenza virus，HPIV)是单链RNA病毒，病毒表面含有溶合酶蛋白(F)和红血球凝聚素-神经氨酸苷酶蛋白(HN)，常引起儿童下呼吸道感染。据统计，大约30％-40％的婴幼儿急性呼吸道感染都是HPIV引起的，其潜伏期一般在1-7天左右。HPIV存在于呼吸道分泌物中，通过直接接触和飞沫传播，可造成反复发作的上呼吸道感染和严重的下呼吸道疾病，特别是在老年人中和有免疫缺陷人群中。血清学上，HPIV可分为4型(I型至IV型)，各亚型具有不同的临床和流行病学特征。其中，I型和II型的最常造成儿童喉气管支气管炎；III型常导致肺炎和细支气管炎；IV型很难检出。
HPIV引起的感染症状与流感病毒相似，难以通过临床症状及常规的检测方法确定病毒病原。因此，感染早期的快速诊断可在临床治疗中提供合理选择抗病毒药物的依据。目前，呼吸道病毒感染病毒学诊断方法主要包括病毒培养、免疫荧光技术、血清学试验、常规分子生物学方法等。其中，病毒分离培养过去常作为金标准，但该方法耗时耗力，不能及时指导临床治疗；电镜检测可直接观察到病毒颗粒，但操作复杂昂贵，不适用于临床；病毒核酸检测灵敏度高，但容易被污染；病毒特异性抗体阳性不能用于早期感染判断和疗效监测。因此，急需开发快速准确检测HPIV的方法。
发明内容
本发明的目的在于基于CRISPR-Cas12a(Cpf1)提供一种可同时快速准确检测，适用于各种环境、简便易用的用于检测HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III的方法。
为了实现上述目的，在第一方面，本发明提供了用于检测人副流感病毒(HPIV)I型、II型和/或III型的检测系统，该检测系统包括Cpf1检测系统，其中，所述Cpf1检测系统包含由SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示的第一crRNA、由SEQ ID NO:6的核苷酸序列所示的第二crRNA和由SEQ ID NO:11的核苷酸序列所示的第三crRNA中的至少一种crRNA。
在一些实施方式中，所述Cpf1检测系统包含由SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示的第一crRNA、由SEQ ID NO:6的核苷酸序列所示的第二crRNA和由SEQ ID NO:11的核苷酸序列所示的第三crRNA。本申请中，所述第一crRNA为针对HPIV-I的特异性crRNA，所述第二crRNA为针对HPIV-II的特异性crRNA，所述第三crRNA为针对HPIV-III的特异性crRNA。
在一些实施方式中，所述Cpf1检测系统还包含Cpf1蛋白和ssDNA报告探针。
在一些实施方式中，所述ssDNA报告探针含有荧光标记和淬灭标记。
在一些实施方式中，所述ssDNA报告探针选自6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA。优选地，所述ssDNA报告探针选自：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/。
在一些实施方式中，所述的检测系统还包括扩增系统，所述扩增系统用于扩增样品中HPIV I型、II型和/或III型靶基因。优选地，所述扩增系统选自等温扩增系统；
在一些实施方式中，所述等温扩增系统包含如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20的核苷酸序列所示的第一引物对、如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27的核苷酸序列所示的第二引物对和如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34的核苷酸序列所示的第三引物对中的至少一对引物对。
在一些实施方式中，所述等温扩增系统包含如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20的核苷酸序列所示的第一引物对、如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27的核苷酸序列所示的第二引物对和如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34的核苷酸序列所示的第三引物对中的至少一对引物对。本申请中，所述第一引物对为针对HPIV-I的特异性引物，所述第二引物对为针对HPIV-II特异性引物，所述第三引物对为针对HPIV-III的特异性引物。
所述检测系统用于HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III亚型的分型检测，可以实现HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III亚型的一罐式等温扩增和后续CRISPR分型检测。
在第二方面，本发明提供了一种用于检测人副流感病毒(HPIV)I型、II型和/或III型的试剂盒，该试剂盒包含第一方面所述的检测系统。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括检测装置，所述检测装置包括至少2个各自独立的荧光反应腔，每个荧光反应腔中分别含有一种crRNA。
在协议额实施方式中，所述Cpf1反应腔还预设有Cpf1蛋白和ssDNA报告探针。优选地，所述ssDNA报告探针含有荧光标记和淬灭标记。优选地，所述ssDNA报告探针选自6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA。优选地，所述ssDNA报告探针选自：/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/。
在一些实施方式中，所述检测装置包括至少3个各自独立的Cpf1反应腔，Cpf1反应腔中分别预设针对HPIV I型、II型或III型的crRNA。
在一些实施方式中，所述检测装置还包括阴性对照腔和/或阳性对照腔。
在一些实施方式中，所述检测装置还包括至少一个扩增反应腔，所述扩增反应腔分别与每个Cpf1反应腔可操作地连通。例如，可以通过挤压的方式将所述扩增反应腔中的扩增产物转移至所连通的Cpf1反应腔中。
在一些实施方式中，所述扩增反应腔为1个，所述扩增反应腔分别与每个荧光反应腔可操作地连通。
在一些实施方式中，所述扩增反应腔预设用于扩增HPIV I型、II型和/或III型靶基因的引物对。优选地，所述引物对选自等温扩增引物对。优选地，所述等温扩增引物对选自如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20的核苷酸序列所示的第一引物对、如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27的核苷酸序列所示的第二引物对和如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34的核苷酸序列所示的第三引物对中的至少一对引物对。
在一些实施方式中，每个Cpf1反应腔各自独立地连接有用于盛装分型检测产物的容器。在一些实施方式中，所述容器选自离心管。
在第三方面，本发明提供了一种用于检测人副流感病毒(HPIV)I型、II型和/或III型的方法，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括如下步骤：将疑似含有HPIV I型、II型和/或III型的样品在Cpf1检测系统中进行Cpf1分型检测，所述Cpf1检测系统包含由SEQ IDNO:4的核苷酸序列所示的第一crRNA、由SEQ ID NO:6的核苷酸序列所示的第二crRNA和由SEQ ID NO:11的核苷酸序列所示的第三crRNA中的至少一种crRNA。
在一些实施方式中，所述Cpf1检测系统包含由SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示的第一crRNA、由SEQ ID NO:6的核苷酸序列所示的第二crRNA和由SEQ ID NO:11的核苷酸序列所示的第三crRNA。本申请中，所述第一crRNA为针对HPIV-I的特异性crRNA，所述第二crRNA为针对HPIV-II的特异性crRNA，所述第三crRNA为针对HPIV-III的特异性crRNA。
在一些实施方式中，在Cpf1分型检测之前，还包括对样品进行扩增获得含有HPIVI型、II型和/或III型靶基因的步骤。
在一些实施方式中，所述扩增包括将样品与HPIV I型、II型和/或III型的引物对在同一扩增反应腔中进行等温扩增反应，得到扩增产物。本申请中，等温扩增可由一次加样，实现HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III在同一反应腔内的等温扩增。
在一些实施方式中，所述引物对包括如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20的核苷酸序列所示的第一引物对、如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27的核苷酸序列所示的第二引物对和如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34的核苷酸序列所示的第三引物对中的至少一对引物对。
在一些实施方式中，所述引物对包括如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20的核苷酸序列所示的第一引物对、如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27的核苷酸序列所示的第二引物对和如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34的核苷酸序列所示的第三引物对中的至少一对引物对。本申请中，所述第一引物对为针对HPIV-I的特异性引物，所述第二引物对为针对HPIV-II特异性引物，所述第三引物对为针对HPIV-III的特异性引物。
在一些实施方式中，将所述扩增产物分别在含有不同crRNA的各自独立的Cpf1反应腔中进行分型检测。在一些实施方式中，所述荧光反应腔包括含有第一crRNA的第一荧光反应腔、含有第二crRNA的第二荧光反应腔和含有第三crRNA的第三荧光反应腔。优选地，所述Cpf1检测系统还包括阴性对照腔和/或阳性对照腔。
在一些实施方式中，所述扩增反应腔分别与每个Cpf1反应腔可操作地连通。例如，可以通过挤压的方式将所述扩增反应腔中的扩增产物转移至所连通的Cpf1反应腔中。
在一些实施方式中，所述Cpf1检测系统还包含Cpf1蛋白和ssDNA报告探针。
在一些实施方式中，所述ssDNA报告探针含有荧光标记和淬灭标记。
在一些实施方式中，所述ssDNA报告探针选自6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA。优选地，所述ssDNA报告探针选自：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/。
在一些实施方式中，所述每个Cpf1反应腔各自独立地连接有用于盛装分型检测产物的容器。在一些实施方式中，所述容器选自离心管。
在一些实施方式中，所述方法还包括对分型检测产物进行蓝光仪下目测观察，或者酶标仪读取荧光值。
在一些实施方式中，所述特异性crRNA的制备方法包括：针对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III的HN基因，寻找包含Cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计crRNA。设计完成后，合成oligo，构建到载体pUC57-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA，再通过Cpf1检测获得反应性最佳的crRNA用于方法建立。
在一些实施方式中，所述ssDNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQreporter。其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQreporter/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/。
本发明提供的方法，通过目测或者使用酶标仪检测荧光时，Cpf1反应体系中的ssDNA报告探针为ssDNAFQ reporter。在使用酶标仪检测荧光时，HPIV特异性核酸激活后的Cpf1蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以获得荧光读数。相对应的，待检测样品中不存在特异性核酸时，不会有荧光读数。所述方法用于HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III亚型的分型检测，可以实现HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III亚型的一罐式等温扩增和后续CRISPR分型检测。
在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：
S1：特异性crRNA的制备。针对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III设计包含Cpf1识别序列TTTN的crRNA，构建载体后体外转录获得crRNA；
S2：RT-RPA扩增。利用等温扩增引物在扩增反应腔中进行等温重组酶聚合酶扩增反应(RT-RPA)，(例如在39℃反应20分钟)；
S3：分型检测。将S2步骤获得的扩增样品挤入至荧光反应腔(包括HPIV-I、HPIV-II和/或HPIV-III特异性crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA报告系统)，使激活的Cpf1切割探针(例如在37℃反应15分钟)。再将Cpf1检测后产物挤入离心管，蓝光仪下目测观察，或者酶标仪读取荧光值。
本发明的基于“等温扩增-CRISPR”技术的人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三重检测方法。首先从待检样品中提取HPIV RNA，反转录成cDNA，然后在检测体系中进行重组酶聚合酶等温扩增(RPA)及Cpf1反应(激活ssDNA的反式切割活性，使ssDNA偶联的荧光报告分子产生荧光信号)。本发明的检测方法能够快速地同时检测人副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，且具有灵敏度高、特异性强、可视化等优点，在人副流感病毒的临床分型诊断和疾病监测等方面具有极大的应用前景。
在第四方面，本发明提供了第一方面所述的检测系统、第二方面所述的试剂盒或第三方面所述的方法在检测人副流感病毒(HPIV)I型、II和/或III型中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明利用Cpf1可特异识别核酸序列的特征，实现对HPIV核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。以HPIV高保守性的HN基因作为检测靶序列。可以分别实现对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III低至1e3、1e1和1e1拷贝的检测。
(2)本发明设计的检测方法可实现一罐法RPA与基于Cpf1的分型检测流程，能实现方便快捷的结果判读。
(3)本发明基于设计的序列差异性crRNA，可实现对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III亚型的鉴定，且证明人DNA不会影响HPIV的检出，同时与其他病毒，具有准确、快速、简便的特点。
附图说明
图1示出了HPIV核酸快速检测反应原理图。
图2示出了HPIV核酸快速检测系统示意图。
图3示出了质粒样品HPIV靶基因检测及亚型区分的荧光检测结果。
图4示出了HPIV-I灵敏度验证结果。
图5示出了HPIV-I特异性验证结果。
图6示出了HPIV-II灵敏度验证结果。
图7示出了HPIV-II特异性验证结果。
图8示出了HPIV-III灵敏度验证结果。
图9示出了HPIV-III特异性验证结果。
图10示出了咽拭子样品HPIV靶基因检测及亚型区分的荧光检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
定义
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
CRISPR-Cas是细菌的一种适应性免疫系统，可靶向降解外来核酸。其中，可特异性识别胸腺嘧啶(Thymine，T)的间隔区相邻基序(PAM)，当其序列特异性切割双链DNA(dsDNA)时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。
CRISPR-Cas12a是第二类(V型)用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas系统。Cas12a(Cpf1)蛋白具有类似于Cas9的RuvC内切核酸酶结构域。此外，Cpf1不具有HNH内切酶结构域，并且Cpf1的N-末端不具有Cas9的α-螺旋识别叶。Cpf1执行剪切后的DNA双链断裂引入了4或5个核苷酸突出的粘性末端，研究表明Lb Cpf1-crRNA复合物与互补单链DNA或者双链DNA的结合释放出强大的非特异性ssDNA反式切割活性。Cpf1的靶基因是ssDNA和dsDNA，并且Cpf1引导链需要识别PAM序列。Cpf1酶的附加DNA酶切功能，可以切割特定单链DNA探针(例如，荧光和淬灭标记)，实现核酸检测。双链DNA在crRNA的引导下Cpf1可以切割双链模板DNA和荧光标记探针，探针被水解后释放出荧光信号，通过检测荧光信号便可知道是否有靶DNA。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物通常是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR引物的设计那样成熟，需要进行大量条件摸索的工作，从而对RPA的引物进行优化。
人副流感病毒(Human parainfluenza virus，HPIV)是单链RNA病毒，病毒表面含有溶合酶蛋白(F)和红血球凝聚素-神经氨酸苷酶蛋白(HN)，常引起儿童下呼吸道感染。血清学上，HPIV可分为4型(I型至IV型)，各亚型具有不同的临床和流行病学特征。其中，I型和II型的最常造成儿童喉气管支气管炎；III型常导致肺炎和细支气管炎；IV型很难检出。
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明的检测原理如图1所示，包括以下4部分：特异性crRNA的制备、样品核酸提取、核酸等温扩增与Cpf1荧光检测。
在一些实施方式中，本发明采用如图2所示的检测装置进行HPIV核酸快速检测，其包括以下步骤：
S1：特异性crRNA的制备。针对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III设计包含Cpf1识别序列TTTN的crRNA，构建载体后体外转录获得crRNA；
S2：RT-RPA扩增。利用等温扩增引物在扩增反应腔中进行RT-RPA扩增(例如在39℃反应20分钟)；
S3：分型检测。将S2步骤获得的扩增样品挤入至Cpf1反应腔(包括HPIV-I、HPIV-II和/或HPIV-III特异性crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA报告系统)，使激活的Cpf1切割探针(例如在37℃反应15分钟)。再将Cpf1分型检测后产物挤入离心管，蓝光仪下目测观察，或者酶标仪读取荧光值。
实施例1：针对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III检测最优crRNA筛选验证
本实施例中，针对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III设计crRNA，见下表1，并交由南京金斯瑞公司合成，命名为SEQ ID NO：1～12。
表1
序列编号 crRNA名称 crRNA sequence(含PAM，5'to 3')
SEQ ID NO：1 HPIV1-crRNA1 TTTGATGAATACGCATATATTGCAT
SEQ ID NO：2 HPIV1-crRNA2 TTTCCTGTTGTCGTTGATGTCATAG
SEQ ID NO：3 HPIV1-crRNA3 TTTGTATCGATGAGATTTGGTCTTT
SEQ ID NO：4 HPIV1-crRNA4 TTTGACCATCCTTTTTCTGCAATGT
SEQ ID NO：5 HPIV2-crRNA1 TTTCCAATCTTCAGGACTATGAAAA
SEQ ID NO：6 HPIV2-crRNA2 TTTACCTAAGTGATGGAATCAATCG
SEQ ID NO：7 HPIV2-crRNA3 TTTCTCAGATCTTGTAGCTACATAG
SEQ ID NO：8 HPIV2-crRNA4 TTTATTGAAAGAGTCATATCTCTTC
SEQ ID NO：9 HPIV3-crRNA1 TTTCGGAGTCGAACACAGTTGATAT
SEQ ID NO：10 HPIV3-crRNA2 TTTCATCAACTTTCGGAGTCGAACA
SEQ ID NO：11 HPIV3-crRNA3 TTTGATCAACCATATGCGGCATTAT
SEQ ID NO：12 HPIV3-crRNA4 TTTGTAGTATATCCCTGGTCCAACA
本实施例中，针对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III筛选crRNA检测采用20μL体系如下，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：
检测体系依次加入2μL缓冲液、1μL RNA酶抑制剂、1μL Cas12蛋白、1μL DNAreporter、5μL样品、1μL crRNA和9μL H2O。各组分混合均匀后于37℃反应15min。其中，上述反应体系中RNA酶抑制剂浓度为40U/μL，Cas12蛋白为200ng/μL，DNA reporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1nM/μL。其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应15min，对上述反应产物进行结果检测判定。
本实施例成功筛选到能准确及灵敏检测鉴定HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III最优crRNA，包括序列为SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，和SEQ ID NO：11。
实施例2：针对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III特异性CRISPR检测最优等温扩增反应引物筛选
为更高效灵敏地进行核酸检测，本发明中所述利用等温核酸体外扩增技术(RPA)对目标基因核酸片段进行扩增，进行CRIPSR检测，实现灵敏高效核酸检测。
针对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III设计并合成包含特异性的RPA扩增引物组，序列为SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:36，具体序列信息如下表2所示。所述引物片段交由南京金斯瑞公司合成。
表2
RPA primers name Sequence(5'to 3')
SEQ ID NO：13 HPIV1-RPA-F1 AACCCCAATATCTCATTATTACCTGGACCA
SEQ ID NO：14 HPIV1-RPA-F2 ATTATTACCTGGACCAAGTCTACTTTCTGG
SEQ ID NO：15 HPIV1-RPA-F3 ACTTTCTGGATCCACCACAATTTCAGGATG
SEQ ID NO：16 HPIV1-RPA-F4 TCAGGATGTGTTAGACTACCTTCATTATCA
SEQ ID NO：17 HPIV1-RPA-R1 AGTTGTTAAGCCACCGTACCCTAGGAAAAT
SEQ ID NO：18 HPIV1-RPA-R2 ACCGTACCCTAGGAAAATGAGTGTATTTTC
SEQ ID NO：19 HPIV1-RPA-R3 TGAGTGTATTTTCAATTTTTATCCCACTTCC
SEQ ID NO：20 HPIV1-RPA-R4 AATTTTTATCCCACTTCCTACACTCGGATA
SEQ ID NO：21 HPIV2-RPA-F1 CTTGGAGATTGCCTCGATTTCACGACATCT
SEQ ID NO：22 HPIV2-RPA-F2 CACGACATCTAATCAGTATTTAGCAATGGG
SEQ ID NO：23 HPIV2-RPA-F3 TTTAGCAATGGGGATAATACAACAATCTGC
SEQ ID NO：24 HPIV2-RPA-F4 ACAATCTGCTGCAGCATTTCCAATCTTCAGG
SEQ ID NO：25 HPIV2-RPA-R1 ACCACCATATACAGGAAATAAAATAAAGCC
SEQ ID NO：26 HPIV2-RPA-R2 AATAAAGCCTAGATGATAGATCCCGCTTCC
SEQ ID NO：27 HPIV2-RPA-R3 ATCCCGCTTCCAACTGCAGGATTGATTGTG
SEQ ID NO：28 HPIV2-RPA-R4 GGATTGATTGTGGCCCATTGCCCTGTTGTA
SEQ ID NO：29 HPIV3-RPA-F1 TTAAATCCTAGGATCTCTCATACCTTCAAC
SEQ ID NO：30 HPIV3-RPA-F2 TACCTTCAACATAAATGACAATAGAAAGTC
SEQ ID NO：31 HPIV3-RPA-F3 TGACAATAGAAAGTCATGTTCTCTAGCACTCC
SEQ ID NO：32 HPIV3-RPA-F4 ATGTTCTCTAGCACTCCTAAATACAGATGTA
SEQ ID NO：33 HPIV3-RPA-R1 TGCAGATTGCATTCTCATTTATTGGATGTTC
SEQ ID NO：34 HPIV3-RPA-R2 ATTTATTGGATGTTCAAGACCTCCATACCC
SEQ ID NO：35 HPIV3-RPA-R3 ACCTCCATACCCGAGAAATATTATTTTGCC
SEQ ID NO：36 HPIV3-RPA-R4 TATTATTTTGCCTTTGTAGTATATCCCTGG
经验证，针对HPIV-I较佳引物对SEQ ID NO：16和20，针对HPIV-II较佳引物对SEQID NO：24和27，针对HPIV-III较佳引物对SEQ ID NO：32和34。该三对引物的阴性对照组不会出现假阳性，且整体效率良好，皆可应用于后续检测中。
实施例3：质粒中HPIV靶基因检测及亚型区分
(1)样品制备
根据合成HPIV质粒的原始浓度，使用无RNA酶水将含有HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III HN基因的质粒均稀释至1000拷贝数/μL。
(2)RT-等温扩增(RT-RPA扩增)
RT-等温扩增反应体积为50μL，包括：25.0μL缓冲液(Buffer 3.1,New EnglandBiolabs)、2.4μL RPA上游引物(SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32各0.8μL)、2.4μLRPA下游引物(SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:34各0.8μL)、7.7μL无RNA酶水和2.5μL乙酸镁。以上组分预装至RPA反应腔。
将10.0μL“(1)样品制备”步骤样品(1000拷贝数/μL的HPIV-I、HPIV-II和HPIV-IIIHN基因的质粒溶液各5.0μL)分别在3个检测单元上从加样孔加入至等温扩增反应腔，39℃孵育20分钟。
(3)Cpf1荧光检测
Cpf1检测反应腔体积为20μL，包括：7.9μL无RNA酶水、2.0μL缓冲液(Buffer 3.1,New England Biolabs)、2.0μL LbCpf1蛋白(10001272)、1.0μL crRNA(SEQ ID NO:4、SEQID NO:6和SEQ ID NO:11各1.0μL，分别预分装至独立反应腔)、0.1μL RNA酶抑制剂(10006981)、1.0μL ssDNA FQ reporter(FAM-TTTATTT-BHQ1)、5.0μL等温扩增产物。以上组分预装至Cpf1反应腔。
挤入“(2)RT-等温扩增”步骤产生的约5.0μL产物至Cpf1反应管，37℃反应15分钟，反应产物挤出至离心管，用于蓝光仪下目测观察，结果如图3所示。图3的结果表明，本实施例能够实现质粒样品中HPIV靶基因检测及亚型区分。
实施例4：HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III的灵敏度和特异性验证
(1)灵敏度验证
本实施例进行HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III检测灵敏度测试。本实施例中，所用不同浓度核酸样品(1E5拷贝至1E0拷贝)，检测步骤同实施例3。该过程中应用全波长多功能酶标仪监测反应过程的荧光动力学变化，记录荧光数值，判读结果。
结果如图4、图6和图8所示，可以看出，以HPIV高保守性的HN基因作为检测靶序列。可以分别实现对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III低至1e3、1e1和1e1拷贝的检测。
(2)特异性验证
本实施例进行HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III特异性反应测试。本实施例中，所用不同病毒样品(Human Adenovirus、Human metapneumovirus、Human parainfluenza virus 1～2、Influenza A Virus、Influenza B Virus、Human Respiratory Syncytial Virus A、Human Respiratory Syncytial Virus B、Human Boca Virus)，检测步骤同实施例3。该过程中应用全波长多功能酶标仪监测反应过程的荧光动力学变化，记录荧光数值，判读结果。
结果如图5、图7和图9所示，可以看出，本发明基于设计的序列差异性crRNA，可实现对HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III亚型的鉴定，且证明人DNA不会影响HPIV的检出，同时与其他9种病毒(Human Adenovirus、Human metapneumovirus、Human parainfluenza virus 1～2、Influenza A Virus、Influenza B Virus、Human Respiratory Syncytial Virus A、Human Respiratory Syncytial Virus B、Human Boca Virus)无交叉反应。
实施例5：咽拭子样品中HPIV靶基因检测及亚型区分
(1)样品制备
取HPIV-I、HPIV-II和HPIV-III阳性咽拭子样品，分别将其置于含0.5mL PBS的1.5ml管中，充分混匀后再离心，取10μL产物用于等温扩增。
(2)等温扩增
参照实施例1中“(2)RT-等温扩增”所述操作进行。
(3)Cpf1荧光检测
参照实施例1中“(3)Cpf1荧光检测”所述操作进行，最终使用酶标仪读取反应管内产物的荧光值，结果如图10所示。图10的结果表明，本实施例能够实现咽拭子样品中HPIV靶基因检测及亚型区分。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于检测人副流感病毒(HPIV)I型、II型和/或III型的检测系统，包括Cpf1检测系统，其中，所述Cpf1检测系统包含如SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示的第一crRNA、如SEQ IDNO:6的核苷酸序列所示的第二crRNA和如SEQ ID NO:11的核苷酸序列所示的第三crRNA中的至少一种crRNA。
2.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述Cpf1检测系统还包含Cpf1蛋白和ssDNA报告探针；
优选地，所述ssDNA报告探针含有荧光标记和淬灭标记；
更优选地，所述ssDNA报告探针选自6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA；
更优选地，所述ssDNA报告探针选自：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/。
3.根据权利要求1或2所述的检测系统，其特征在于，所述的检测系统还包括扩增系统，所述扩增系统用于扩增样品中HPIV I型、II型和/或III型靶基因；
优选地，所述扩增系统选自等温扩增系统；
更优选地，所述等温扩增系统包含如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:20的核苷酸序列所示的第一引物对、如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27的核苷酸序列所示的第二引物对和如SEQID NO:32和SEQ ID NO:34的核苷酸序列所示的第三引物对中的至少一对引物对。
4.用于检测人副流感病毒(HPIV)I型、II型和/或III型的试剂盒，包含权利要求1-3任一项所述的检测系统。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测装置，所述检测装置包括至少2个各自独立的Cpf1反应腔，每个Cpf1反应腔中分别含有一种crRNA；
优选地，所述Cpf1反应腔还预设有Cpf1蛋白和ssDNA报告探针；
优选地，所述检测装置包括至少3个各自独立的Cpf1反应腔，Cpf1反应腔中分别预设针对HPIV I型、II型或III型的crRNA；
优选地，所述检测装置还包括阴性对照腔和/或阳性对照腔。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测装置还包括至少一个扩增反应腔，所述扩增反应腔分别与每个Cpf1反应腔可操作地连通；
优选地，所述扩增反应腔为1个，所述扩增反应腔分别与每个荧光反应腔可操作地连通；
更优选地，所述扩增反应腔预设用于扩增HPIV I型、II型和/或III型靶基因的引物对；
更优选地，所述引物对选自等温扩增引物对；
更优选地，所述等温扩增引物对选自权利要求3定义的引物对；
更优选地，每个Cpf1反应腔各自独立地连接有用于盛装分型检测产物的容器。
7.用于检测人副流感病毒(HPIV)I型、II型和/或III型的方法，所述方法用于非诊断目的，其包括如下步骤：将疑似含有HPIV I型、II型和/或III型的样品在Cpf1检测系统中进行Cpf1分型检测，所述Cpf1检测系统包含由SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示的第一crRNA、由SEQ ID NO:6的核苷酸序列所示的第二crRNA和由SEQ ID NO:11的核苷酸序列所示的第三crRNA中的至少一种crRNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在Cpf1分型检测之前，还包括对样品进行扩增获得含有HPIV I型、II型和/或III型靶基因的步骤；
优选地，所述扩增包括将样品与针对HPIV I型、II型和/或III型的引物对在同一扩增反应腔中进行等温扩增反应，得到扩增产物；
更优选地，所述引物对选自权利要求3定义的引物对；
更优选地，将所述扩增产物分别在含有不同crRNA的各自独立的Cpf1反应腔中进行分型检测；更优选地，所述扩增反应腔分别与每个Cpf1反应腔可操作地连通；
更优选地，所述方法还包括对分型检测产物进行蓝光仪下目测观察，或者酶标仪读取荧光值。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述Cpf1检测系统还包含Cpf1蛋白和ssDNA报告探针；
优选地，所述ssDNA报告探针含有荧光标记和淬灭标记；
更优选地，所述ssDNA报告探针选自6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA；
更优选地，所述ssDNA报告探针选自：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/。
10.权利要求1-3中任一项所述的检测系统、权利要求4-6中任一项所述的试剂盒或权利要求7-9中任一项所述的方法在检测人副流感病毒(HPIV)I型、II和/或III型中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
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