CN1824805A - 污水中细菌的基因芯片检测方法 - Google Patents

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CN1824805A
CN1824805A CN 200510111330 CN200510111330A CN1824805A CN 1824805 A CN1824805 A CN 1824805A CN 200510111330 CN200510111330 CN 200510111330 CN 200510111330 A CN200510111330 A CN 200510111330A CN 1824805 A CN1824805 A CN 1824805A
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bacteria
biotin
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何池全
胡永隽
肖华胜
缪金明
张庆华
徐高田
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SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd
Shanghai University
University of Shanghai for Science and Technology
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SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd
University of Shanghai for Science and Technology
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Abstract

本发明涉及一种污水中细菌的基因芯片检测方法。本发明该方法步骤包括：目的细菌的选择、根据所选取的不同目的细菌的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR引物和种、属检测探针、根据所设计的检测探针，制备基因芯片、目的细菌的DNA的抽提、PCR扩增反应、PCR扩增反应产物的杂交、杂交后的产物清洗、干燥后扫描。本发明根据所选取的不同细菌的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR引物和种、属检测探针，所设计的引物具有良好的特异性，对目的细菌扩增效果良好，无非特异性扩增。纯细菌DNA的抽提方法简单易行，2h内即可抽提目的细菌的DNA且得率较高；PCR扩增和杂交方法、条件易于实施，杂交检测结果稳定，有利于该技术的实际应用。

Description

污水中细菌的基因芯片检测方法
技术领域
本发明涉及一种细菌的基因芯片的检测方法，特别是一种污水中细菌的基因芯片检测方法。
背景技术
在现有技术中，污水中细菌的检测主要是利用传统微生物学方法、生物化学方法、血清学方法和PCR方法(Santiago F.Gonzalez，Melissa J.Krug，MichaelE.NIelsen，et al.2004；Call，D.，M.Borucki，and T.Besser.200)。这些方法有一些限制：(1)由于需要培养，所需时间长；(2)不能区别亲缘关系相近的细菌；(3)不能鉴定未知的细菌；(4)交差反应和其他假阳性；(5)灵敏度问题(假阴性)。而利用基因芯片技术快速检测细菌对环境、人体、动植物的污染和危害，可高效地探测到由细菌引起的污染，还能帮助研究人员找到并合成具有解毒和消化污染物功能的天然酶基因。我们都知道，环境的变化会引起细胞发生基因表达水平的变化，基因芯片是高效的监测基因表达变化的手段。所以，国外许多实验室纷纷探索用DNA微阵列技术监测环境污染和提高环境保护技术水平。
与传统方法相比，基因芯片技术的先进性主要体现在：(1)基因芯片可以对污水中细菌实现高通量、并行检测，一次实验即可得出多个结果；能提高测试样品数量5～10倍，另外测试成本能下降约10倍；(2)操作简便、快速，整个检测在数小时内可以完成，而传统的方法一般需要4～7天的时间；(3)特异性强、敏感性高，可以检测污水中常见的致病菌；(4)可以区分到细菌的属和种。目前多数基因芯片研究中大都在16SrRNA恒定区中设计细菌通用引物，在可变区设计检测探针，虽然可以通过一次PCR反应将所有细菌的相应基因片段扩增出来，但是由于肠道致病菌(沙门氏菌、支贺氏菌和大肠杆菌等)探针所在的16SrRNA序列基本相同，所以只能作为一类细菌被检出。
发明内容
本发明的目的在于提供一种污水中细菌的基因芯片检测方法，该方法以不同细菌的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR引物和种、属检测探针，所设计的引物对目的细菌具有良好的扩增效果，无非特异性扩增。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种污水中细菌的基因芯片检测方法，其特征在于该方法步骤如下：
a)目的细菌的选择；
b)所选细菌的特异引物和种、属检测探针的设计：根据所选取的不同目的细菌的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR引物和种、属检测探针；
c)根据所设计的检测探针，制备基因芯片；
d)目的细菌的DNA的抽提；
e)PCR扩增反应：用所抽提的目的细菌的DNA作为PCR扩增反应的模板，进行线性扩增：
f)PCR扩增反应产物的杂交：按以下配方配制杂交体系，混匀，避光备用，
  试剂   体积
  6×杂交液   2μ
  Cy3(生物素)   1μl
  SACy3   1μl
其中，杂交液的为：20×SSC 30ml，50×Denhart’s 10ml，10％SDS 5ml，10mg/mlSalmon DNA 1ml，去离子水54ml，充分混匀后，用0.45um滤膜去杂质；
g.杂交后的产物清洗、干燥后扫描。
上述的目的细菌为：肠球菌、肺炎克雷白菌、荧光绿脓杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠O-157和大肠杆菌；所述的PCR引物为：
  细菌名称   引物名称   序列
  大肠O-157   EC-hlyA-F3   AAGCCGGAACAGTTCTCTCA
  EC-hlyA-R3B   Biotin-CACTTGCAGCTGTTGTCGAT
  沙门氏菌   Sa-InvA-F3   AGCCGCTCAGTATTGAGGAA
  Sa-InvA-R3B   Biotin-GTTGTACCGTGGCATGTCTG
  志贺氏菌   Sh-IpaH-F4   CTTTCCGATACCGTCTCTGC
  Sh-IpaH-R4B   Biotin-CAGTCTCACGCATCACCTGT
  大肠杆菌   EC-CadC-F3   TTTTCTGCTCTCGCGTAGGT
  EC-CadC-R3B   Biotin-AGCTGGCGATTCAAAATGAT
  肠球菌   Ent-F2   TTGATGGTCCTATGCCTCAAA
  Ent-R2B   Biotin-CGATTTCAACTTCGTCACCA
  肺炎克雷白菌   KP16S-F   AGCGGTAGCACAGAGAGCTTG
  KP16S-RB   Biotin-CCCACTTTGGTCTTGCGAC
  荧光绿脓杆菌   OprI-F2   GGGGAGATTGCTGTTATGGA
  OprI-R2B   Biotin-TATTACTTGCGGCTGGCTTT
  细菌通用   23SRNA-FB   Biotin-CGGCGGCCGTAACTATAAC
  23SRNA-R   AGACCGCCCCAGTCAAAC；
所述的种、属检测探针为：
  探针名称   序列   长度
  EHEC-HlyA-R3TPN   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAATATATTCTGGCTCAGAGAATGGCACAGGGGTT 36
  ST-InvA-R3TPN   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTGGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCT 40
  Shig-ipaH-R4TPN   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGATGCGCAGAGGGAAGCCGGTGC 24
  EC-CadC-R2TPN   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGATTGAACAATCTCACCTAATAATTCACTGGCACGA 40
  Ent-P   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCAATCACTGGACGTGGTACTGTTGCTAC 32
  KP16S-P   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 31
  PS-OprI-RTPN   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTAACGAGCGTGCCCTGCGCATG 25
  23SRNA-FTPN   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACAAGGAATTTCGCTACCTTAGGACC 27
探针的浓度为10μmol/l。
所述目的细菌的DNA的抽提的方法为：
1.将污水中的细菌进行微生物培养；
2.将培养出的菌株接种于LB液体培养基中，摇床培养16h后，吸取培养液500μl于1.5ml的离心管中；
3.将离心管置于100℃水浴锅中15分钟左右，加速细胞的破裂，有助于提高DNA抽提的效率；
4.取出离心管，室温下放置5min左右使变性的DNA复性，加入1000μl的细胞裂解液：异硫氰酸胍CH5N3·CHNS 47.264g，醋酸钠C2H3O2Na·3H2O 1.36g，N-Lauroylsarosine Sodium Salt 0.2g，异丙醇C3H8O 17ml，以双蒸水定容至100ml，放置20分钟，加入之后要用震荡器震荡完全，使细胞壁能够完全裂开，核酸和蛋白质将保留在溶液里；
5.4℃、13000rpm离心5分钟，使细胞碎片可以沉淀下来除去；
6.取含DNA的上清液800μl加入到二分之一体积即400μl的冰无水乙醇于-20℃中，再剧烈震荡，使之充分混合，否则会出现结晶；然后放置在-20℃的冰箱中20分钟或者过夜，使溶液中的DNA能充分沉淀；
7.取出，以15000rpm的速度在4℃下离心20分钟；这时在离心管底部可以看见白色的DNA沉淀；
8.小心倒去上清，注意不能回流，可用40度左右的温度烘干剩余的无水乙醇；溶解沉淀的DNA，控制DNA的浓度为0.2-2μmol/l.
上述的扩增反应体系为：
  试剂   体积，50μl
  10×pCR Buffer，Mg2+Free   5μl
  Mgcl2 25mM   3μl
  DNTP 10mM   1μl
  rTaq 2500U，5U/μl   0.25μl
  引物   2μl
  模板   2μl
  灭菌水   36.75μl；
所述的扩增反应条件为：
  步骤   温度(℃)   时间   返回   循环数
  初始DNA变性   94℃   3min
  变性   94℃   30sec
  退火   54℃   1min
  延伸   72℃   1min   步骤2   35
  变性   94℃   30sec
  退火   52℃   30sec   步骤5   5
  保留   4℃   Forever。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：本发明根据所选取的不同细菌的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR引物和种、属检测探针，所设计的引物具有良好的特异性，对目的细菌扩增效果良好，无非特异性扩增。纯细菌DNA的抽提方法简单易行，2h内即可抽提目的细菌的DNA且得率较高；PCR扩增和杂交方法、条件易于实施，杂交检测结果稳定，有利于该技术的实际应用。本发明方法基于基因芯片技术的检测方法体现出了高通量、高效率、并行化处理的特点，对于一份食品工业污水水样，可以在4h之内完成目的菌种的检测。这种检测技术为以后更大规模的检测研究奠定了良好的技术基础，可以推广应用于环境监测、食品卫生监督、商品检验检疫等许多领域。
附图说明
图1是本发明实施例的芯片点阵位置图。
图2是本发明实施例混合PCR引物扩增单链DNA图，图中1~4泳道为加入引物I扩增的，依次为肺克、0-157、沙门和志贺，其中志贺条带比较浅，这与扩增效率有关。5~7泳道为加入引物II的，依次为大肠杆菌、绿脓和肠球菌，由于引物中混和了23SrRNA的引物，所以各泳道中在358bp处都可见条带。泳道8为阴性对照，阴性无污染。
图3是本发明实施例目的细菌DNAPCR扩增反应产物的杂交示意图
图4是本发明实施例目的细菌DNA模板扩增产物杂交扫描结果
具体实施方式
实施例一：本实施例以食品加工污水水样中选取肠球菌、肺炎克雷白菌、荧光绿脓杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠0-157和大肠杆菌这7种细菌作为目的细菌。
1.细菌特异引物和种、属检测探针的特异性设计：
首先登陆GeneBank( http：//ncbi.nlm.nih.gov/entrez)，存核酸数据库中检索，得到与上述7种细菌的16SrRNA基因序列。应用Mac Vector6.5.1软件包的ClustalW Alignment程序进行序列对齐，得到碱基对齐图和聚类分析的结果。根据碱基对齐图划分出16SrRNA基因的恒定区和可变区。在可变区用Primer5.0软件设计双链引物，将得到的侯选双链引物进行BLAST比较，筛选出针对细菌特异性最好引物进行合成，并进行5’端Cy3荧光标记，即作为上述7种细菌的PCR引物。再根据这7种细菌的PCR引物设计检测探针，经过筛选后在GeneBank进行BLAST对比，找出特异性最好的进行合成，即作为种、属检测探针，PCR引物和种、属检测探针见附表1和表2。
                      表1 特异PCR引物序列
  细菌名称   引物名称   序列
大肠O-157   EC-hlyA-F3   AAGCCGGAACAGTTCTCTCA
  EC-hlyA-R3B   Biotin-CACTTGCAGCTGTTGTCGAT
沙门氏菌   Sa-InvA-F3   AGCCGCTCAGTATTGAGGAA
  Sa-InvA-R3B   Biotin-GTTGTACCGTGGCATGTCTG
  志贺氏菌   Sh-IpaH-F4   CTTTCCGATACCGTCTCTGC
  Sh-IpaH-R4B   Biotin-CAGTCTCACGCATCACCTGT
大肠杆菌   EC-CadC-F3   TTTTCTGCTCTCGCGTAGGT
  EC-CadC-R3B   Biotin-AGCTGGCGATTCAAAATGAT
肠球菌   Ent-F2   TTGATGGTCCTATGCCTCAAA
  Ent-R2B   Biotin-CGATTTCAACTTCGTCACCA
肺炎克雷白菌   KP16S-F   AGCGGTAGCACAGAGAGCTTG
  KP16S-RB   Biotin-CCCACTTTGGTCTTGCGAC
荧光绿脓杆菌   OprI-F2   GGGGAGATTGCTGTTATGGA
  OprI-R2B   Biotin-TATTACTTGCGGCTGGCTTT
细菌通用   23SRNA-FB   Biotin-CGGCGGCCGTAACTATAAC
  23SRNA-R   AGACCGCCCCAGTCAAAC
               表2 种、属检测探针
  探针名称   序列   长度
  EHEC-HlyA-R3TPN(大肠O-157)   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAATATATTCTGGCTCAGAGAATGGCACAGGGGTT 36
  ST-InvA-R3TPN(沙门氏菌)   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTGGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCT 40
  Shig-ipaH-R4TPN(志贺氏菌)   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGATGCGCAGAGGGAAGCCGGTGC   24
  EC-CadC-R2TPN(大肠杆菌)   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGATTGAACAATCTCACCTAATAATTCACTGGCACGA 40
  Ent-P(肠球菌)   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCAATCACTGGACGTGGTACTGTTGCTAC 32
  KP16S-P(肺炎克雷白菌)   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 31
  PS-OprI-RTPN(荧光绿脓杆菌)   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTAACGAGCGTGCCCTGCGCATG   25
  23SRNA-FTPN(细菌通用)   NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACAAGGAATTTCGCTACCTTAGGACC   27
2.基因芯片制备：采用基因芯片点样仪进行点样，参见图1，点样后的芯片经过封闭、60℃烘干后4℃保存，制成10*8阵列，每块玻片上6个阵列。探针的浓度为10μmol/l。
3.基因芯片检测的步骤
A.水样来源：分别从三家企业取得生产废水处理前后水样进行编号，见下表3，放入4℃的冰箱冷藏室待用。
                           表3 水样编号表
  序号   采样时间   采样地点   编号
  1   05-08-08上午9:00   上海绿苑淀粉有限公司  进水   A
  2   05-08-08上午9:00   上海绿苑淀粉有限公司  出水   a
  3   05-08-08下午16:00   上海绿苑淀粉有限公司  进水   B
  4   05-08-08下午16:00   上海绿苑淀粉有限公司  出水   b
  5   05-08-08上午10:00   上海梅林食品有限公司  进水   C
  6   05-08-08上午10:00   上海梅林食品有限公司  出水   c
  7   05-08-08下午15:00   上海梅林食品有限公司  进水   D
  8   05-08-08下午15:00   上海梅林食品有限公司  出水   d
  9   05-08-08上午11:30   上海冠生园华光酿酒药业江湾药酒厂  进水   E
  10   05-08-08上午11:30   上海冠生园华光酿酒药业江湾药酒厂  出水   e
  11   05-08-08下午17:00   上海冠生园华光酿酒药业江湾药酒厂  进水   F
  12   05-08-08下午17:00   上海冠生园华光酿酒药业江湾药酒厂  出水   f
  13   05-08-09上午10:00   上海嘉味食品厂  进水   G
  14   05-08-09上午10:00   上海嘉味食品厂  出水   g
  15   05-08-09下午15:00   上海嘉味食品厂  进水   H
  16   05-08-09下午15:00   上海嘉味食品厂  出水   h
  17   05-08-09下午15:00   上海海天豆类食品厂  进水   I
  18   05-08-09下午15:00   上海海天豆类食品厂  出水   i
  19   05-08-09下午16:30   上海亚太食品厂  进水   J
  20   05-08-09下午16:30   上海亚太食品厂  出水   j
B.水样中细菌DNA的抽提
(1)培养基的制作和灭菌：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏0.75克，蛋白胨1.5克，氯化钠0.75克，琼脂3克，蒸馏水150mL，pH7.6。取300mL的烧杯一个，装150mL的蒸馏水。在药物天平上依次称取上述配方中的各成分，放入水中溶解，待琼脂完全融化后停止加热，补充蒸发损失的水量。用10％的NaOH调整pH值为7.6。将培养基分装5只试管中，其余的全部倒入250mL的锥形瓶中，分别塞上棉塞，包上报纸待灭菌。配置无菌稀释水：取250mL的锥形瓶装90mL的蒸馏水，放30颗玻璃珠，塞棉塞，包扎，待灭菌。本实验中使用高压灭菌锅进行灭菌：将需消毒灭菌的物品放入加好水的高压灭菌锅中，旋紧锅盖，通电，关上安全阀，打开放气阀。待冷空气放出后，关上放气阀，维持气压在1.05kg/cm2(约126℃)30min后，关电源，放气，打开盖子取出已灭菌物品放入无菌室内。无菌室内紫外灯打开照射30min灭菌，以下操作均在无菌室中进行。
(2)纯细菌DNA的抽提
a.将菌株接种于LB液体培养基中，摇床培养16h后，吸取培养液500μl于1.5ml的离心管中。
b.将离心管置于100℃水浴锅中15分钟左右，加速细胞的破裂，有助于提高DNA抽提的效率。
c.取出离心管，室温下放置5min左右使变性的DNA复性，加入1000μl的细胞裂解液(异硫氰酸胍(CH5N3·CHNS)47.264g，醋酸钠(C2H3O2Na·3H2O)1.36g，N-Lauroylsarosine Sodium Salt 0.2g，异丙醇(C3H8O)17ml，以双蒸水定容至100ml)，放置20分钟，加入之后要用震荡器震荡完全，使细胞壁能够完全裂开，核酸和蛋白质将保留在溶液里。
d.4℃、13000rpm离心5分钟，使细胞碎片可以沉淀下来除去。
e.取上清液800μl(含DNA)加入到二分之一体积即400μl的冰无水乙醇(-20℃)中，再剧烈震荡，使之充分混合，否则会出现结晶。然后放置在-20℃的冰箱中20分钟或者过夜，使溶液中的DNA能充分沉淀。
f.取出，以15000rpm的速度在4℃下离心20分钟。这时在离心管底部可以看见白色的DNA沉淀。
g.小心倒去上清，注意不能回流，可用40度左右的温度烘干剩余的无水乙醇。
h.可以用100μl左右的8mM/L NaOH溶解沉淀的DNA，普通蒸馏水也可以，但弱碱性的溶剂更佳。控制DNA的浓度为1μmol/l。
C.PCR扩增反应及混合引物：将7菌和23SrRNA的引物分成两组进行PCR反应，引物I为(Kp+HlyA+InvA+ipaH)；引物II为(Cadc+OprI+Ent+23SrRNA)，用所抽提的DNA作为PCR反应的模板，按一定的扩增体系(见表4)和反应条件(见表5)线性扩增，之后再将两组扩增产物进行混合，参见图2。
        表4 PCR引物扩增体系
  试剂   体积(50μl)
  10×PCR Buffer(Mg2+Free)   5μl
  Mgcl2(25mM)   3μl
  dNTP(10mM)   1μl
  rTaq(2500U，5U/μl)   0.25μl
  Primer(引物)   2μl
  Template(模板)   2μl
  Q-Solution(自配)   10μl
  灭菌水   26.75μl
                表5 PCR引物扩增反应条件
  步骤   温度(℃)   时间   返回   循环数
  初始DNA变性   94℃   3min
  变性   94℃   30sec
  退火   54℃   1min
  延伸   72℃   1min   步骤2   35
  变性   94℃   30sec
  退火   52℃   30sec   步骤5   5
  保留   4℃   Forever
D.PCR扩增产物的杂交和扫描，参见图3及图4
a.用表5配方配制杂交体系，混匀，避光备用。其中杂交液为：取20×SSC 30ml，50×Denhart’s 10ml，10％SDS 5ml，10mg/ml Salmon DNA 1ml，去离子水54ml，充分混匀后，用0.45um滤膜去杂质后备用。
b.预热杂交炉或水浴锅至杂交温度，将干燥的杂交仓取出向仓内加入80μl无菌水以保持杂交时仓内的湿度。
c.吸取4μl杂交混合液注入纯化好PCR产物的离心管中，小心加入以免产生过多气泡，溶解管内的DNA，静置1h，使DNA充分溶解。
d.取一张点好探针的芯片，放置在标准位置纸上，对准纸上的点阵位置，将混合液小心点于探针阵列区域，盖上盖玻片后立即放入杂交仓内，拧紧螺丝，放入水浴锅中，48℃杂交2h。
e.杂交后的芯片要经过严谨条件下的洗涤，以除去未杂交的一切残留物。取出杂交仓，旋松螺丝，取出芯片。放入洗液A(0.1％SDS，2×SSC)洗8min，然后连架子取出，倾斜，使残留洗液A流尽，之后连架子放入洗液B(2×SSC)洗8min。
f.取出芯片，放入装有吸水纸的50ml离心管中，4℃、2000rpm离心2min甩干芯片并放入干燥盒内，干燥后即可进行扫描。采用美国Parkard公司的ScanArray4000激光共聚焦扫描仪扫读芯片，扫读后，分析图谱，根据信号的强弱，可确定待测细菌的存在。
    表5 杂交体系
  试剂   体积
  6×杂交液   2μl
  Cy3(生物素)   1μl
  SACy3   1μl
从图中可以看出，亮点的位置都准确清晰，与PCR反应的结果一致。由此确定所采水样中所含细菌见表6。
                    表6 水样中所含细菌基因表
  水样编号   所含细菌基因   水样编号   所含细菌基因
  A   Kp   a   /
  B   HlyA   b   未培养出细菌
  C   /   c   Kp
  D   InvA   d   Kp
  E   Kp、OprI   e   Kp、OprI
  F   Kp、Ent   f   Kp
  G   Kp、Cadc   g   Kp
  H   Kp、ipaH   h   Kp
I Ent i /
J Kp、Cadc j /

Claims (4)

1.一种污水中细菌的基因芯片检测方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
a.目的细菌的选择；
b.所选细菌的特异引物和种、属检测探针的设计：根据所选取的不同目的细菌的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR引物和种、属检测探针；
c.根据所设计的检测探针，制备基因芯片；
d.目的细菌的DNA的抽提；
e.PCR扩增反应：用所抽提的目的细菌的DNA作为PCR扩增反应的模板，进行线性扩增：
f.PCR扩增反应产物的杂交：按以下配方配制杂交体系进行杂交，
                 试剂                            体积
                 6×杂交液                       2μ
                 Cy3(生物素)                     1μl
                 SACy3                           1μl
其中，杂交液的为：20×SSC 30ml，50×Denhart’s 10ml，10％SDS 5ml，
10mg/ml Salmon DNA 1ml，去离子水54ml，充分混匀后，用0.45um滤膜去杂质；
g.杂交后的产物清洗、干燥后扫描。
2.根据权利要求1所述的污水中细菌的基因芯片检测方法，其特征在于所述的目的细菌为肠球菌、肺炎克雷白菌、荧光绿脓杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠0-157和大肠杆菌；所述的PCR引物为：
细菌名称     引物名称      序列
大肠0-157    EC-hlyA-F3     AAGCCGGAACAGTTCTCTCA
             EC-hlyA-R3B    Biotin-CACTTGCAGCTGTTGTCGAT
沙门氏菌     Sa-InvA-F3     AGCCGCTCAGTATTGAGGAA
             Sa-InvA-R3B    Biotin-GTTGTACCGTGGCATGTCTG
志贺氏菌     Sh-IpaH-F4     CTTTCCGATACCGTCTCTGC
             Sh-IpaH-R4B    Biotin-CAGTCTCACGCATCACCTGT
大肠杆菌     EC-CadC-F3     TTTTCTGCTCTCGCGTAGGT
             EC-CadC-R3B    Biotin-AGCTGGCGATTCAAAATGAT
肠球菌          Ent-F2       TTGATGGTCCTATGCCTCAAA
                Ent-R2B      Biotin-CGATTTCAACTTCGTCACCA
肺炎克雷白菌    KP16S-F      AGCGGTAGCACAGAGAGCTTG
                KP16S-RB     Biotin-CCCACTTTGGTCTTGCGAC
荧光绿脓杆菌    OprI-F2      GGGGAGATTGCTGTTATGGA
                OprI-R2B     Biotin-TATTACTTGCGGCTGGCTTT
细菌通用        23SRNA-FB    Biotin-CGGCGGCCGTAACTATAAC
                23SRNA-R     AGACCGCCCCAGTCAAAC；
所述的种、属检测探针为：
探针名称           序列                                           长度
EHEC-HlyA-R3TPN    NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
                   GCAATTATTCTGGCTCAGAGAATGGCACAGGGGTT            36
ST-InvA-R3TPN      NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
                   AACTGGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCT       40
Shig-ipaH-R4TPN    NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
                   GGATGCGCAGAGGGAAGCCGGTGC                       24
EC-CadC-R2TPN      NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
                   GATGATTGAACAATCTCACCTAATAATTCACTGGCACGA        40
Ent-P              NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
                   TCTCAATCACTGGACGTGGTACTGTTGCTAC                32
KP16S-P            NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
                   CGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT                 31
PS-OprI-RTPN       NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
                   GGCTAACGAGCGTGCCCTGCGCATG                      25
23SRNA-FTPN        NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
                   GACAAGGAATTTCGCTACCTTAGGACC                    27
探针的浓度为10μmol/l。
3.根据根利要求1所述的污水中细菌的基因芯片检测方法，其特征在于所述目的细菌的DNA的抽提的方法为：
A.将污水中的细菌进行微生物培养；
B.将培养出的菌株接种于LB液体培养基中，摇床培养16h后，吸取培养液500μl于1.5ml的离心管中；
C.将离心管置于100℃水浴锅中15分钟左右，加速细胞的破裂，有助于提高DNA抽提的效率；
D.取出离心管，室温下放置5min左右使变性的DNA复性，加入1000μl的细胞裂解液：异硫氰酸胍CH5N3·CHNS 47.264g，醋酸钠C2H3O2Na·3H2O 1.36g，N-Lauroylsarosine Sodium Salt 0.2g，异丙醇C3H8O 17ml，以双蒸水定容至100ml，放置20分钟，加入之后要用震荡器震荡完全，使细胞壁能够完全裂开，核酸和蛋白质将保留在溶液里；
E.4℃、13000rpm离心5分钟，使细胞碎片可以沉淀下来除去；
F.取含DNA的上清液800μl加入到二分之一体积即400μl的冰无水乙醇于-20℃中，再剧烈震荡，使之充分混合，否则会出现结晶；然后放置在-20℃的冰箱中20分钟或者过夜，使溶液中的DNA能充分沉淀；
G.取出，以15000rpm的速度在4℃下离心20分钟；这时在离心管底部可以看见白色的DNA沉淀；
H.小心倒去上清，注意不能回流，可用40度左右的温度烘干剩余的无水乙醇；溶解沉淀的DNA，控制DNA的浓度为0.2-2μmol/l。
4.根据根利要求1所述的污水中细菌的基因芯片检测方法，其特征在于所述的扩增反应体系为：
试剂                                        体积，50μl
10×PCR Buffer，Mg2+Free                   5μl
Mgcl2 25mM                                 3μl
DNTP 10mM                                   1μl
rTaq 2500U，5U/μl                          0.25μl
引物                                        2μl
模板                                        2μl
灭菌水                                      36.75μl；
所述的扩增反应条件为：
步骤                   温度(℃)    时间         返回         循环数
初始DNA变性            94℃        3min
变性                   94℃        30sec
退火                   54℃        1min
延伸                   72℃        1min         步骤2        35
变性                   94℃        30sec
退火                   52℃        30sec        步骤5        5
保留                   4℃         Forever。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101748192B (zh) * 2008-12-05 2012-09-26 南开大学 饮用水中主要病原微生物的基因芯片及检测用试剂盒
WO2016193846A3 (en) * 2015-05-29 2017-02-02 Koninklijke Philips N.V. Degenerate primer sets
CN108866215A (zh) * 2017-12-01 2018-11-23 苏州百源基因技术有限公司 一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒

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