CN1286986C - 饮用水中大肠杆菌快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种饮用水大肠杆菌的快速检测方法。应用分子生物学中的聚合酶链式反应，用PCR方法检测大肠杆菌，包括以下几个步骤：水样中微生物的收集、微生物基因组DNA的提取、PCR扩增、产物观察。采用上述方法与传统方法相比，时间短，从水样送到实验室开始到检测完毕，大约需要4～5个小时；灵敏度高，可以检测到1～10个大肠杆菌/mL水样。而传统检测方法至少需要48h。
Description
技术领域：
本发明属于饮用水水质研究、水处理技术领域，具体涉及一种饮用水大肠杆菌的分子生物学快速检测方法。
背景技术：
饮用水的微生物学指标与人们的健康息息相关，是饮用水水质检测十分关注的指标。目前普遍采用的饮用水微生物检测方法包括直接计数(显微计数)法、活菌计数(ColonyForming Units，CFU)法以及最可能数(MPN)法等，这些方法对控制饮用水的细菌学指标发挥了巨大的作用。但传统检测方法不可避免的会存在一定的缺陷：(1)由于种种原因(如培养基成分、培养条件等)，现在可培养的微生物还不到微生物总数的1％，使得检测结果颇不准确。例如多管发酵法(MUG)很难检测到E.coli 0 157：H7；(2)检测时间长，至少需要48h，根本不能满足现代社会对水传疾病快速发现、快速检测的要求。
发明内容：
本发明应用分子生物学中的聚合酶链式反应，建立了饮用水大肠杆菌分子生物学检测方法。本发明的反应引物：上游引物：5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’
下游引物：5’-taa tcg ata tac ccg ctc-3’
用PCR方法检测大肠杆菌，包括以下几个步骤：水样中微生物的收集、微生物基因组DNA的提取、PCR扩增、产物观察等四个步骤。
1、水样中微生物的收集及
采用灭菌后的滤膜或滤器过滤水样，在装有无菌水的EP管中，洗涤滤膜，离心，弃上清液，备用；
2、样中微生物基因组DNA的提取：
A、向上述EP管中加入TE缓冲液，使之重悬；
B、加入SDS和蛋白酶K，混匀，温育45min～1h；
C、加入氯仿/异戊醇，混匀，离心，将上清液转入一个新EP管中；
D、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心，将上清液转入一个新EP管中；
E、加入异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心；
F、弃上清，沉淀物用乙醇洗涤，晾干；
G、将沉淀重溶于TE缓冲液，摇匀；
H、用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA模板的OD值，计算其DNA浓度，
计算方法为：
DNA浓度(μg/μL)＝OD值260nm×样品稀释倍数×50/1000
J、将基因组DNA模板做好标记，贮存，备用；
3、PCR扩增；
50μL反应体系：
10×PCR缓冲液 5μL
Tag酶 2U/μL 1μL
MgCl2(25mM) 5μL
dNTP(2.5mM) 5μL
ddH2O 29μL
上游引物 10μM 2μL
上游引物 10μM 2μL
模板DNA 1.5μg/μL 1μL
4、产物观察：
A、凝胶的准备：先配置琼脂糖溶液，加热，使其充分溶解，再加入溴化乙锭溶液；
B、配置TAE电泳液；
C、倒胶：将配置好的琼脂糖溶液倒入胶板中，待其凝固后，放入电泳槽中；
D、电泳：将扩增好的PCR产物与缓冲液按比例混合，加入到凝胶加样孔中，同时加入DNA分子量标准，接通电源，设定电压和电流，开始电泳。
E、观察；将扩增产物在紫外光下观察，拍摄图片。
采用上述饮用水大肠杆菌生物分子学检测方法与传统方法相比，时间短，从水样送到实验室开始到检测完毕，大约需要4～5个小时；灵敏度高，可以检测到1～10个大肠杆菌/mL水样。而传统检测方法至少需要48h。
附图说明
图1和图2是水样PCR扩增产物的凝胶电泳图象
图中：1DNA分子量标准；2-15均为水样微生物的PCR扩增产物
具体实施方式
以下以重庆市市政管网的15个水样为例，详细说明本方法的具体实施过程：
第一步：水样中微生物的提取：
1我国的饮用水水质指标规定，饮用水中大肠菌群的标准为＜1个/100mL，因此取水样100mL。
2滤膜和滤器的灭菌和安装。滤器用高压蒸汽121℃灭菌20min。用无菌的镊子夹取已经灭菌的0.22μm滤膜的边缘，粗糙面向上，贴放在灭菌滤床上。
3将100mL水样注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在负50KPa下抽滤。
4用酒精棉球擦拭剪刀，用无菌镊子夹取滤膜边缘，将滤膜用剪刀剪成宽0.5mm的细条，放入装有2.5mL无菌水的EP管中，轻轻摇动EP管，洗涤滤膜。
5将EP管15000r/m离心5分钟，弃上清，备用。
第二步：提取水样中微生物的基因组DNA：
微生物基因组DNA的提取方法：
1药品：EDTA、I mol/L Tris-Cl、TE缓冲液(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，4℃贮存)、10％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、5mol/L NaCl、LB(Luria-Bertani)培养基(4℃贮存)，上述试剂均需高压灭菌；20mg/mL蛋白酶K(分成单次使用的小份贮存于-20℃)、24∶1氯仿/异戊醇、25∶24∶1酚/氯仿/异戊醇、异丙醇、70％乙醇
2设备和器材：PTC-100型PCR仪、PB-20型pH计、ME 215S电子天平、TGL-15G高速台式高心机、生化培养箱1台、OD260和OD280紫外分光光度计1台、冰箱1台、水浴锅1台、高压消毒锅1台、1000μL可调移液枪1个、200μL可调移液枪1个、10μL可调移液枪1个、10μL、200μL和5000μL移液枪头若干、培养皿20个、一次性塑胶手套若干、EP管及PCR管若干、20L酸缸1个
3器皿处理方法：
所有的玻璃器皿在使用前，均用重铬酸钾洗液浸泡6小时以上，然后依次用自来水、蒸馏水、超纯水冲洗干净，晾干，然后消毒备用。EP管及PCR管等为一次性使用，高压消毒后备用。
4操作步骤：
取一株大肠杆菌在LB培养基中培养至饱和状态，取1.0mL的培养物于EP管中，12000转/min离心2min。
弃上清，沉淀物加入567μL的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30μL 10％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育45min～1h。
加入等600μL的氯仿/异戊醇，混匀，12000转/min离心5分钟，将上清液转入一个新EP管中。
加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12000转/min离心5分钟，将上清液转入一个新EP管中。
加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，5000转/min离心2分钟。
弃上清，沉淀物用1mL的70％乙醇洗涤，晾干。
将沉淀重溶于100μL的TE缓冲液，摇匀。
用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA模板的OD值，从而计算其DNA浓度。计算方法为：
DNA浓度(μg/μL)＝OD值260nm×样品稀释倍数×50/1000
将基因组DNA模板做好标记，4℃条件下贮存，备用。
按上述方法提取微生物的基因组DNA作为模板DNA，进行PCR扩增。
第三步：PCR扩增：
50μL反应体系：
10×PCR缓冲液 5μL
Tag酶2U/μL 1μL
MgCl2(25mM) 5μL
dNTP(2.5mM) 5μL
ddH2O 29μL
上游引物 10μM 2μL
上游引物 10μM 2μL
模板DNA 1.5μg/μL 1μL
本方法应用分子生物学中的聚合酶链式反应，反应引物：
上游引物：5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’
下游引物：5’-taa tcg ata tac ccg ctc-3’
第三步：产物观察：
1所需的试剂和器材：DNA分子量标准(DNA marker：800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp)、琼脂糖粉、溴化乙锭(10mg/mL)溶液、Tris、EDTA、冰乙酸、电脑多用电泳仪、胶模、微波炉、1000mL玻璃瓶2个、500mL磨口三角烧瓶1个、1000mL量筒1个、一次性手套若干；
2凝胶的准备。先配置1.5％琼脂糖溶液，在微波炉中加热，使其充分溶解，不要有颗粒物质，以免影响产物的观察。按2.0μL溴化乙锭溶液：15mL琼脂糖溶液的比例向琼脂糖溶液中加入澳化乙锭。溴化乙锭的作用是使扩增的DNA染色，以便在紫外灯下观察。溴化乙锭有剧毒，因此所有接触溴化乙锭的操作必须带手套。
3TAE电泳液的配置。称量4.84g Tris、2mL0.5mol/LEDTA、1.14mL冰乙酸，定容到1000mL，一般需配置2000mL电泳液。
4倒胶。将配置好的琼脂糖溶液倒入胶板中，待其凝固后，放入电泳槽中。
5电泳。将扩增好的PCR产物与缓冲液按1∶1的比例混合，加入到凝胶加样孔中，同时加入DNA分子量标准(Marker，试剂盒中自带)，接通电源，设定电压和电流，开始电泳。
6观察。将扩增产物在紫外光下观察，拍摄图片。
本申请人利用本发明方法，共检测了15个水样，水样2-8取自自来水龙头水；水样9-12取自市政二次管网贮水池中的贮存水，贮水时间约为24小时；水样13-15取自水厂的清水池。各水样大肠杆菌PCR法的检测结果如图1和图2所示，图1和图2表明，用PCR法检测饮用水的大肠杆菌，水样2、5-8、9-12大肠杆菌的检测结果均为阳性，水样3-4、13-15大肠杆菌的检测结果为阴性。
Claims (1)
1、饮用水中大肠杆菌快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)水样中微生物的收集及其DNA的提取：
采用灭菌后的滤膜或滤器过滤水样，在装有无菌水的EP管中，洗涤滤膜，离心，弃上清液，备用；
(2)水样中微生物DNA的提取：
A、向EP管中加入TE缓冲液，使之重悬；
B、加入SDS和蛋白酶K，混匀，温育45min～1h；
C、加入氯仿/异戊醇，混匀，离心，将上清液转入一个新EP管中；
D、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心，将上清液转入一个新EP管中；
E、加入异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心；
F、弃上清，沉淀物用乙醇洗涤，晾干；
G、将沉淀重溶于TE缓冲液，摇匀；
H、用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA模板的OD值，计算其DNA浓度，计算方法为：
DNAμg/μL浓度＝OD值260nm×样品稀释倍数×50/1000
I、将基因组DNA模板做好标记，贮存，备用；
(3)PCR扩增；
反应引物：
上游引物：5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’
下游引物：5’-taa tcg ata tac ccg ctc-3’
50μL反应体系：
10×PCR缓冲液 5μL
Tag酶 2U/μL 1μL
MgCl2 25mM 5μL
dNTP 2.5mM 5μL
ddH2O 29μL
上游引物10μM 2μL
上游引物10μM 2μL
模板DNA 1.5μg/μL 1μL
(4)产物观察：
A、凝胶的准备：先配置琼脂糖溶液，加热，使其充分溶解，再加入溴化乙锭溶液；
B、配置TAE电泳液；
C、倒胶：将配置好的琼脂糖溶液倒入胶板中，待其凝固后，放入电泳槽中；
D、电泳：将扩增好的PCR产物与缓冲液按比例混合，加入到凝胶加样孔中，同时加入DNA分子量标准，接通电源，设定电压和电流，开始电泳。
E、观察；将扩增产物在紫外光下观察，拍摄图片。
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