CN103333946A

CN103333946A - 创伤弧菌和哈氏弧菌快速检测方法

Info

Publication number: CN103333946A
Application number: CN2013101112156A
Authority: CN
Inventors: 陈福艳; 黄婷; 陈晓汉; 杨学明; 梁万文; 程光平; 韦友传; 欧阳贤华; 陈明; 余晓丽; 王瑞; 李莉萍; 雷爱莹
Original assignee: GUANGXI INSTITUTE OF FISHERIES
Current assignee: GUANGXI INSTITUTE OF FISHERIES
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2033-03-29
Also published as: CN103333946B

Abstract

本发明提供了一种创伤弧菌和哈氏弧菌快速检测方法，目的是为了有利于控制创伤弧菌和哈氏弧菌在海水养殖动物中传播与爆发，采用了现代先进双重聚合酶链反应技术，设计创伤弧菌和哈氏弧菌特异性引物V₁和H₁，通过特异性地扩增相应细菌DNA片段，然后检测特异性DNA片段，从而达到快速、准确、便捷的检测创伤弧菌的哈氏弧菌的目的。本发明具有特异性强、敏感性高，省时、省力、快速和高效等优点，使原来病原菌诊断时间由原来的3-7天缩短到3-4小时,提高细菌诊断的时效性，本方法可用于海产品及水产养殖动物创伤弧菌和哈氏弧菌的检测或病害监测，为两种弧菌快速诊断提供科学依据，提高病害防治能力。

Description

创伤弧菌和哈氏弧菌快速检测方法

技术领域

本发明涉及两种细菌的快速检测方法，具体涉及创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和哈氏弧菌（Vibrio harveyi）的检测方法。

背景技术

创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和哈氏弧菌（Vibrio harveyi）广泛存在于海洋环境中，是海水养殖动物常见的致病性弧菌，主要引起鳗鲡（Anguilla japonica）、石斑鱼（Epinephelus）、中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）、虹鳟（Salmo gairdneri）等养殖动物发病，可引起海水养殖动物急性败血症及组织功能衰退等病症，暴发性强，死亡率高，影响广泛，曾给海水养殖动物带来了较大的经济损失。创伤弧菌还是一种人与动物共患的致病菌，近年来在美国、韩国、日本等沿海地区引起数例急性败血病，也具有发病快、死亡率高，危害大的特点，引起社会广泛关注，据报道患者多为带伤作业或生吃了带菌海鲜引发急性感染。

海水养殖动物弧菌类病菌一但暴发，难于控制，因此在养殖过程中有必要进行病害监测，一但发现细菌性病害佂兆，及时诊断，然后采取相应防治措施，将病害消灭在萌芽状态，有效降低经济损失。可见，快速准确的诊断方法是把握最佳治疗时机的关键；本研究采用分子生物学检测中的双重聚合酶链反应（duplex polymetase chain reaction DPCR）的检测方法，通过设计及合成特异性引物，优化聚合酶链反应（PCR）扩增程序，建立了创伤弧菌和哈氏弧菌的双重PCR快速检测方法，是一种良好的特异性、敏感性，并具有省时、省力、快速和高效的检测方法，对提高海产食品安全和海水养殖动物病害防治具有积极意义。

创伤弧菌和哈氏弧菌的快速诊断方法，从公开报道所知，如：1.【题名】六种弧菌多重PCR快速检测方法的建立；【作者】李贵阳、肖鹏、郭养浩、莫照兰；【刊名】现代生物医学进展，2011 年23卷23期 4748-4752,4766页；【文摘】目的:检测鳗弧菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌六种水产常见病原菌。方法:以toxR-toxS为靶基因设计引物,建立了一种多重PCR(multiplex PCR,mPCR)快速检测方法。结果:本研究设计的mPCR引物特异性强,与其他弧菌及非弧菌无交叉反应,每次反应的敏感性为10-100 CFU(cell forming unit)/每个反应。2、【题名】快速检测哈氏弧菌的试剂盒及检测方法；【专利号】：03146928, 专利申请日：2003-09-25 ；【摘要】本发明涉及检测哈氏弧菌的试剂盒及检测方法。试剂盒包括：（ａ）ＤＮＡ提取试剂：含缓冲试剂Ａ和细胞裂解试剂Ｂ，（ｂ）聚合酶链式反应试剂：包括反应预混试剂Ｃ和反应引物试剂Ｄ，试剂Ｄ中的特异引物对ＶＰ↓［０１］为５′－ＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＡＡＡＡＧＣＣＧＣＴ、ＶＰ↓［０２］为５′－ＡＧＡＧＡＡＣＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＣＧ　　ＴＧＧＴＴＣ，（ｃ）电泳和显色试剂，包括试剂Ｅ和试剂Ｆ；检测方法包括（ａ）．样品处理，（ｂ）．ＤＮＡ提取，（ｃ）．ＰＣＲ扩增，（ｄ）．电泳和显色检测，在紫外光下检测有一条４８０核苷酸对条带的为有哈氏弧菌感染或污染，反之则没有。3. 【题名】用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒及方法 , 专利号：201210336013，公开（公告）日：2012.12.26；【摘要】一种用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其组成为：反应液A，1支，其组成为：10×Lampbuffer，dNTP，硫酸镁水溶液，甜菜碱水溶液，引物vh-F3、vh-B3、vh-FIP、vh-BIP，BstDNA酶，10×荧光染料SYBRGreenⅠ，阳性对照试样，阴性对照试样和超纯水。本发明还涉及应用该试剂盒进行检测的方法。

以上检测方法都采用了现代先进生物学技术，能准确、便捷的诊断出相应弧菌类病原菌，但检测操作步骤多，诊断所需时间长。

发明内容

本发明的目的是为了有利于控制创伤弧菌和哈氏弧菌在海水养殖动物中传播与爆发，提供一种快速检测创伤弧菌和哈氏弧菌的方法，特别是提供二对创伤弧菌和哈氏弧菌特异性引物V₁ 和H₁ ，可应用于海产品及海水养殖动物创伤弧菌和哈氏弧菌的检测或监测，为两种弧菌快速诊断提供科学依据。

本发明的主要原理为：样品中的细菌在PCR仪中进行高温裂解，释放出细菌DNA，细菌DNA在试剂中进行多聚酶链式反应，进行特异性扩增，因引物的特异性，当样品中含有创伤弧菌或哈氏弧菌时，它们的DNA的特异片段得到扩增，浓度可达到10⁸cfu/ml以上，然后在加了I核酸染料的电泳凝胶中电泳，产物在紫外光照射下，可以检测到一定分子量DNA片段的目的条带。如果没有创伤弧菌或哈氏弧菌，则不能扩增到同样分子量的DNA片段，则不能检测到相应的目的条带。

引物设计：

一、哈氏弧菌引物设计：

哈氏弧菌根据 GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）toxR基因序列设计引物H :

2条523bp的序列同源性达99%；

根据523bp的序列设计的引物：

上游：5`-TCAAGCGATCTCTACACTGC-3`,Tm=60

下游：5`-TGTGGTAGCTTCAGCAAATTG-3`,Tm=60

Genbank上的登录号及其序列。如下：

（1）Vibrio harveyi strain LMG 16829 transmembrane regulatory protein (toxR) gene, partial cds

523 bp linear DNA

Accession: JF930623.1 GI: 350999747

（2）Vibrio harveyi strain LMG 16863 transmembrane regulatory protein (toxR) gene, partial cds

523 bp linear DNA

Accession: JF930621.1 GI: 350999743

二、创伤弧菌引物设计：

创伤弧菌根据 GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）特异性基因溶细胞毒素（hemolysin/cytolysin）序列设计引物V：

2条1924bp的序列同源性达96%；

上游：5`-AACAGTGTGGTGCGAACTTAG-3`,Tm=60

下游：5`- GGTTACTTGAACATTACGACC-3`,Tm=60

Genbank上的登录号及其序列。如下：

（1）Vibrio vulnificus vvhB, vvhA genes for hypothetical protein, hemolysin/cytolysin, complete cds, strain:L-180

1,924 bp linear DNA

Accession: AB124802.1 GI: 37857715

（2）Vibrio vulnificus vvhB, vvhA genes for hypothetical protein, hemolysin/cytolysin, complete cds, strain:CDC B3547

1,924 bp linear DNA

Accession: AB124803.1 GI: 37857718

本发明的目的是这样实现的：

一种创伤弧菌和哈氏弧菌快速检测方法，其特征是其中包括两种特异性引物和细菌的特异基因序列的扩增程序；其中两种特异性引物为：创伤弧菌特异引物V_，上游序列：5`-AACAGTGTGGTGCGAACTTAG-3`,下游序列：5`- GGTTACTTGAACATTACGACC-3`；哈氏弧菌特异引物H：上游序列：5`-TCAAGCGATCTCTACACTGC-3`,下游序列5`-TGTGGTAGCTTCAGCAAATTG-3`；细菌的特异基因序列的扩增程序：置于PCR仪上进行DNR扩增，95℃预变性8min，95℃变性35s，64℃退火30s、72℃延伸45s，32个循环，72℃温育10min，-4℃保存5m-2h。

所使用的试剂及说明：

灭菌ddH₂O（双蒸水），经超纯净过滤和120℃高温高压的自来水。

10×loading buffer（10倍聚合酶链式反应缓冲液）,包含:Tris-HCl（PH8.3）100mM、KCl500 mM、MgCl₂15 mM；购于TaKaRa公司。

Taq酶（耐热DNA聚合酶）（5U/μl）；购于TaKaRa公司。

4×dNTP混合物（四种脱氧核苷酸的混合物）；由dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5摩尔的混合物；购于TaKaRa公司。

V（创伤弧菌特异引物）（各20μM），包括两管：上游序列V₁：5`-AACAGTGTGGTGCGAACTTAG-3`,下游序列V₂：5`- GGTTACTTGAACATTACGACC-3`；由引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

H（哈氏弧菌特异引物）（各20μM），包括两管：上游序列H₁：5`-TCAAGCGATCTCTACACTGC-3`,下游序列H₂： 5`-TGTGGTAGCTTCAGCAAATTG-3`；引物V和引物H由宝生物工程(大连)有限公司合成。

5×TBE（5倍的电泳缓冲液）；购于上海双螺旋生物科技有限公司。

琼脂糖，100g/瓶，购于Sigma 公司。

I核酸染料——荧光染料（1ml/瓶），购于北京索莱宝科技有限公司。

DL2000DNA Marker，约400ng/5μl，购于TaKaRa公司。

创伤弧菌和哈氏弧菌标准菌株，购于中国科学院水生生物研究所。

无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌和美人发光杆菌由广西水产研究所鱼病室分离并保种。

每管特异引物扩增时最佳试剂组合：

(a) 2.5 ul 10×loading buffer，0.25 μl Taq酶， 19.75μlddH₂O，0.25μl V_1-1T，0.25μl V_1-2，0.25μl ，H_1-1 0.25μl， H_1-2,0.5μl 4×dNTP混合物。

(b) 5.0ul 10×loading buffer，0.5 μl Taq酶， 35.7μlddH₂O,0.5μl V_1-1T，0.5μl V_1-2，0.5μl H_1-1 ，0.5μl H_1-2,1.0μl 4×dNTP。

使用上述试剂检测创伤弧菌和哈氏弧菌的方法包括下列步骤：

(a)菌液制备：将创伤弧菌标准菌株、哈氏弧菌标准菌株、无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌和美人发光杆菌接种于TSA（大豆酪蛋白琼脂培养基），33～35℃培养20-24小时，置-4℃保存备用。

(b)样品处理：分别取含有0.5-1.0g创伤弧菌和哈氏弧菌样品，加100μl灭菌ddH₂O，将样品捣烂混匀，抽取液体20μl备用；另取创伤弧菌和哈氏弧菌混合标准菌液、无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌、美人发光杆菌菌液备用；

(c)PCR扩增：取1.25μl待测液体及无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌、美人发光杆菌菌液为模板；依次加入试剂：2.5 ul 10×loading buffer，0.25 μl Taq酶， 19.75μlddH₂O，0.25μl V_1-1T、0.25μl V_1-2、0.25μlH_1-1、 0.25μl H_1-2和0.5μl 4×dNTP，混合均匀；置于PCR仪上进行DNR扩增，95℃预变性8min，95℃变性35s，64℃退火30s、72℃延伸45s，32个循环，72℃温育10min，-4℃保存5m-2h，扩增完毕，获得特异DNA片段，能扩增到10⁸cfu/ml以上；

（d）电泳和检测：取4-10μl扩增后的产物，另取4-10μl DL2000DNA Marker作为分子量目的对照条件，加入4μl/ml的I型核酸染料的琼脂糖（２％）作为凝胶，进行电泳，电压为80-100V，时间为30-40m，结果在紫外光下检测目的条带。

（e）结果: 在紫外光下可检测到DNA目的条带（见图1），如创伤弧菌和哈氏弧菌混合双样可得到两条目的条带（图1注2）（分子量分别为128bp和211bp），哈氏弧菌的目的条带见图1注2（分子量211bp），创伤弧菌的目的条带见图1注3（分子量128bp），而其它细菌（无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌、美人发光杆菌）没有条带。

本发明的优点和积极效果：

基于核酸的检测技术，与以往弧菌类检测方法相比较，本方法有几个显著的优点：首先，该方法简单快速，省略细菌裂解和增加培养两个步骤，因此3-4小时可得知检测结果，而以往的检测方法至少需要1天至7天；其次，该方法特异性强、灵敏度高，检测下限低到10个细菌；另外，该方法可以同时检测两种弧菌，省时、省力、快速，有效提高工作效率。

本方法可用于海产品及水产养殖动物创伤弧菌和哈氏弧菌的检测或病害监测，为两种弧菌快速诊断提供科学依据，提高病害防治能力。

附图说明

图1　创伤弧菌和哈氏弧菌双重PCR特异性扩增结果；注：M　DL2000DNA　Marker;1创伤弧菌和哈氏弧菌混合样品；2哈氏弧菌样品；3创-----伤弧菌样品；4海豚链球菌样品；5无乳链球菌样品；6美人发光杆菌样品；7副溶血弧菌样品。

图2　待测菌样A检测结果；注：M　DL2000DNA　Marker;1标准菌株（创伤弧菌的哈氏弧菌混合菌样）；2待测菌液A。

图3　待测菌样B检测结果；注：M　DL2000DNA　Marker;1标准菌株（创伤弧菌的哈氏弧菌混合菌样）；2待测菌液B。

图4　待测菌样C检测结果；注：M　DL2000DNA　Marker;1标准菌株（创伤弧菌的哈氏弧菌混合菌样）；2待测菌液C。

具体实施方式

实施例1：

(b)样品处理：取鱼组织0.5-1.0g样品A，加100μl灭菌ddH₂O，置于灭菌1mlEP管中用灭菌牙签将样品捣烂混匀，移液枪抽取液体20-50μl备用；另取标准菌株（创伤弧菌和哈氏弧菌混合）菌液备用；

(c)PCR扩增：分别取1.25μl待测液体A及标准菌株为模板；依次加入试剂：2.5 ul 10×loading buffer，0.25 μl Taq酶， 19.75μlddH₂O，0.25μl V_1-1T、0.25μl V_1-2、0.25μl 、H_1-1 0.25μl H_1-2和0.5μl 4×dNTP，混合均匀；置于PCR仪上进行DNR扩增，95℃预变性8min，95℃变性35s，64℃退火30s、72℃延伸45s，32个循环，72℃温育10min，-4℃保存5m-2h，扩增完毕，获得特异DNA片段，能扩增到10⁸cfu/ml以上；

(d)电泳和检测：取4-10μl扩增后的产物，另取4-10μl DL2000DNA Marker作为分子量目的对照条件，加入4μl/ml的I型核酸染料的琼脂糖(２％）作为凝胶，进行电泳，电压为80-100V，时间为30-40m，结果在紫外光下检测目的条带。

（e）结果：在紫外光下可检测到DNA目的条带（见图2），标准菌株有两条带(图2注1)：创伤弧菌（分子量128bp）和哈氏弧菌（分子量211bp）；待测菌液A得到一条带(图2注2)（分子量128bp），说明待测样品A中含有创伤弧菌。

实施例2：

(b)样品处理：取鱼肝脏0.5-1.0g样品B，加100μl灭菌ddH₂O，置于灭菌1mlEP管中用灭菌牙签将样品捣烂混匀，移液枪抽取液体20-50μl备用；另取标准菌株（创伤弧菌和哈氏弧菌混合）菌液备用；

(c)PCR扩增：取2.5μl待测液体B及标准菌株为模板；依次加入试剂：5 ul 10×loading buffer，0.5 μl Taq酶，35.5μlddH₂O，0.5μl V_1-1T、0.5μl V_1-2、0.5μl 、H_1-1 0.5μl H_1-2和1.0μl 4×dNTP，混合均匀；置于PCR仪上进行DNR扩增，95℃预变性8min，95℃变性35s，64℃退火30s、72℃延伸45s，32个循环，72℃温育10min，-4℃保存5m-2h，扩增完毕，获得特异DNA片段，能扩增到10⁸cfu/ml以上；

（e）结果：在紫外光下可检测到DNA目的条带（见图3），标准菌株有两条带(图3注1)：创伤弧菌（分子量128bp）和哈氏弧菌（分子量211bp）；待测菌液得到一条带(图3注2)（分子量211bp），说明待测样品中含有哈氏弧菌。

实施例3：

(b)样品处理：取鱼肝胰脏0.5-1.0g样品C，加100μl灭菌ddH₂O，置于灭菌1mlEP管中用灭菌牙签将样品捣烂混匀，移液枪抽取液体20-50μl备用；另取标准菌株（创伤弧菌和哈氏弧菌混合）菌液备用；

(c)PCR扩增：取2.5μl待测液体C及标准菌株为模板；依次加入试剂：5 ul 10×loading buffer，0.5 μl Taq酶，35.5μlddH₂O，0.5μl V_1-1T、0.5μl V_1-2、0.5μl 、H_1-1 0.5μl H_1-2和1.0μl 4×dNTP，混合均匀；置于PCR仪上进行DNR扩增，95℃预变性8min，95℃变性35s，64℃退火30s、72℃延伸45s，32个循环，72℃温育10min，-4℃保存5m-2h，扩增完毕，获得特异DNA片段，能扩增到10⁸cfu/ml以上；

（e）结果：在紫外光下可检测到DNA目的条带（见图4），标准菌株有两条带(图4注1)：创伤弧菌（分子量128bp）和哈氏弧菌（分子量211bp）；待测菌液得到二条带(图4注2) ，分别为创伤弧菌（分子量128bp）和哈氏弧菌（分子量211bp），说明待测样品C中都含有创伤弧菌和哈氏弧菌。

Claims

1.一种创伤弧菌和哈氏弧菌快速检测方法，其特征是其中包括两种特异性引物和细菌的特异基因序列的扩增程序；其中两种特异性引物为：创伤弧菌特异引物V_，上游序列：5`-AACAGTGTGGTGCGAACTTAG-3`,下游序列：5`- GGTTACTTGAACATTACGACC-3`；哈氏弧菌特异引物H：上游序列：5`-TCAAGCGATCTCTACACTGC-3`,下游序列5`-TGTGGTAGCTTCAGCAAATTG-3`；细菌的特异基因序列的扩增程序：置于PCR仪上进行DNR扩增，95℃预变性8min，95℃变性35s，64℃退火30s、72℃延伸45s，32个循环，72℃温育10min，-4℃保存5m-2h。

2. 根据权利要求1所述的创伤弧菌和哈氏弧菌快速检测方法，其特征是包括下列步骤：

(a)菌液制备：将创伤弧菌标准菌株、哈氏弧菌标准菌株、无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌和美人发光杆菌接种于大豆酪蛋白琼脂培养基，33～35℃培养20-24小时，置-4℃保存备用；

（d）电泳和检测：取4-10μl扩增后的产物，另取4-10μl DL2000DNA Marker作为分子量目的对照条件，加入4μl/ml的I型核酸染料的琼脂糖作为凝胶，进行电泳，电压为80-100V，时间为30-40m，结果在紫外光下检测目的条带；

（e）结果: 在紫外光下可检测到DNA目的条带，如创伤弧菌和哈氏弧菌混合双样可得到两条目的条带，分子量分别为128bp和211bp，哈氏弧菌的目的条带分子量211bp，创伤弧菌的目的条带分子量128bp，而其它细菌如无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌、美人发光杆菌则没有条带。